các enzyme sử dụng trong sinh học phân tử

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PH ẨM TP.HCM

KHOA CNSH & KTMT
CÁC ENZYME SỬ DỤNG TRONG
SINH HỌC PHÂN TỬ

GVHD: Th.S Trần Quỳnh Hoa
NHÓM 4


Enzim Giới Hạn (Restriction
enzyme)


Lịch sử phát hiện

O RE được phát hiện lần đầu tiên bởi Werner Arber(Thụy Điển).
O Ông cho rằng: Có những enzyme đặc biệt, hoạt động trong tế bào vi

khuẩn, chúng có thể phân biệt được DNA của mình và DNA lạ của
phage.
O Những enzyme này hạn chế khả năng sinh sản của phage trong tế bào
vi khuẩn bằng cách cắt DNA của phage thành những đoạn nhỏ.


Định nghĩa
Enzyme giới hạn (restriction enzyme, RE)
O Là một enzyme thuộc enzyme endonuclease có vị trí nhận biết điểm
cắt DNA đặc hiệu.
O Phân huỷ liên kết phosphodieste của bộ khung DNA mạch đôi mà
không gây tổn hại đến bases

O Cắt AND ở những đoạn xác định thành những đoạn ngắn


Thí nghiệm có thể mô tả như sau:
Cho phage xâm nhiễm vào hai chủng vi khuẩn A và B, các vi khuẩn
này được nuôi cấy trong môi trường thích hợp. Sau khi thu hồi và
phân tích DNA của phage
 Ở chủng vi khuẩn A: xuất hiện nhiều AND của phage còn nguyên
vẹn nhưng tế bào của vi khuẩn bị phá vỡ (do sự nhân lên của
phage trong tế bào vi khuẩn).


 Ở chủng B: Tế bào vi khuẩn không bị phá vỡ nhưng AND phage bị
cắt thành những đoạn có kích thước xác định. (Trong trường hợp
này, AND của phage bị một hệ thống bảo vệ của vi khuẩn tiêu
diệt khi vừa mới xâm nhập vào vi khuẩn).
=> Phần lớn các loài vi khuẩn có hệ thống chuyên biệt hạn chế biến
đổi để bảo vệ tế bào khỏi sự xâm nhập của AND lạ.


Phân loại
RE chia thành 3 loại:

O Loại I: Khi Enzime nhận biết trình tự, nó sẽ di chuyển trên
phân tử DNA, dao động từ 1.000 đến 5.000 nucleotid.

O Loại II: Enzime nhận biết trình tự và cắt ngay trên vị trí đó
O Loại III: Enzime nhận biết một trình tự và cắt DNA ở vị trí
cách đó khoảng 20 nucleotid.

Các loại RE trong nhóm II
a)Trình tự nhận biết của RE
Mỗi một enzim nhận một đoạn nucleotid khác nhau gọi là trình tự
nhận biết,đoạn đọc ngược xuôi.
Chúng có cấu trúc đối xứng nghịch đảo (palinromic), hai mạch hoàn
toàn giống nhau khi chúng được đọc theo chiều từ 5’ đến 3’ở mỗi sợi
đơn.
 Ví dụ: Restriction endonuclease EcoR I (từ Ecoli) có trình tự nhận
biết:
…..G A A T T C….. ….G… …A A T T C…
…...C T T A A G…. …C T T A A… …G…



Các kiểu cắt

Cắt có đầu bằng:
RE cắt 2 mạch DNA tại cùng một điểm => đoạn DNA có đầu
bằng (blunt ends) không có khả năng kết hộ trở lại, nối các đoạn
DNA bằng enzyme T4 ligase.
Ví dụ, enzyme Sma I nhận biết đoạn đặc hiệu có 6 cặp
nucleotid, cắt ở giai đoạn nhận biết tạo đầu bằng:


Các kiểu cắt

 Cắt đầu so le hay đầu dính(cohevse ends)
O RE cắt mạch DNA ở vị trí lệch, có thể tự nối lại với nhau không cần sự
có mặt của enzim nối DNA ligase.

O Ví dụ : enzim EcoR I nhận biết đoạn đặc hiệu có 6 căp nucleotid , cắt
ở các vị trí khác nhau ở hai mạch đơn DNA tạo các đầu cắt sole.


Điều kiện hoạt động của RE

O Mỗi loại RE có hoạt tính cao ở những điều kiện nhất định
về nhiệt độ, pH…

O Điều kiện để phản ứng cắt tối ưu là:
Mg2+ làm xúc tác.
nhiệt độ 370C.
pH từ 7,2 đến 7,8.
thời gian phản ứng từ 1 đến 2 giờ.


MỘT SỐ QUY TẮC CẦN LƯU Ý KHI THIẾT LẬP MỘT PHẢN ỨNG THỦY GIẢI BỞI
RE

O Mỗi RE hoạt động tối ưu các dung dịch đệm,
khác nhau ở nồng độ NaCl.
O Nếu chúng hoạt động tốt trong cùng một dung
dịch đệm thì sử dung đồng thời

RE giữ hoạt tính 50% Glycerol,bảo quản ở-20oC.Khi tiến hành thủy giải chỉ lấy
RE vào phút chót sau khi đã cho đủ các thành phần khác.

 Thể tích càng nhỏ tạo thuận lợi cho sự tiếp xúc giữa Enzim- cơ chất

Ứng dụng của enzim giới hạn trong công
nghệ gen

O Cho phép cắt bỏ BNST khổng lồ thao tác gen dễ dàng hơn
O Tạo ra một số lượng lớn các bản sao của một trình tự DNA
xác định.


CÁC ENZYME THÔNG DỤNG KHÁC

 Các polymerase
 Các ligase
 Các nuclease


I. CÁC POLYMERASE:
- Là các enzyme xúc tác cho quá trình lắp ráp các nucleotide A,T,G,C vào mạch DNA mới đang
hợp.

•

-

DNA polymease I (DNA pol I)
Có vai trò trong cơ chế sữa sai trong sao chép vi khuẩn, tổng hợp theo chiều
3’-5’.

•

T4 DNA polymerase:

- Có nguồn gốc từ phage T4 xâm nhiễm vi khuẩn

•
-

Taq polymerase:

Là một enzyme được tách chiết từ một vi khuẩn từ suối nước nóng .Không bị phá
hủy ở nhiệt độ biến tính và xúc tác sự tổng hợp từ đầu đến cuối quá trình phản
ứng.


•

Enzyme phiên mã ngược (Reverse transcriptase)

- Do retrovirus sản sinh nhằm sao chép bộ gen RNA của chúng trong tế bào kí chủ

- Tổng hợp nên một mạch DNA bổ sung(cDNA) từ khuôn RNA theo chiều 5’- 3’ khi có
mặt mồi

• Terminal transferase
- Được trích ly từ tuyến ức của bê.
- Phản ứng xúc tác gắn các deocxynucleotidevafo đầu 3’OH tự do của phân tử DNA

•

Các RNA polymerase

- Xúc tác tổng hợp RNA từ một mạch của một DNA mạch đôi theo chiều 5’-3’.Tổng hợp
không cần mồi nhưng khuôn DNA phải mang 1 promoter đặc trưng


II. CÁC LIGASE
Các enzym xúc tác sự hình thành liên kết nối hai đoạn DNA (DNA ligase) hay
RNA (RNA ligase). Được sử dụng kết hợp hai enzym khác là T4 polynucleotide
kinase và Alkaline phosphatase.


• E.coli DNA ligase
- Emzym được trích ly từ E.coli và xúc tác phản ứng nối 2 trình tự DNA có đầu so le.


• T4 DNA ligase
Có nguồn gốc từ phage T4 xâm nhiễm E.coli. Ngoài chức năng với ligase trích từ E. coli
còn có khả năng nối hai trình tự DNA đầu bằng.


•

T4 RNA ligase

Được trích từ phage T4 xâm nhiễm E.coli, xúc tác sự nối 2 trình tự RNA bằng liên kết
phosphodiester. Sử dụng để đánh dấu phóng xạ đầu 3’ của các phân tử RNA dùng làm mẫu
dò phân tử.


•

T4 Polynucleotide kinase

•

Alkaline phosphate

Có nguồn gốc từ phage T4 xâm nhiễm E.coli.
Enzym này xúc tác cho sự chuyển nhóm
γ- phosphate của ATP cho đầu 5’ của DNA hay RNA.

Được ly trích từ E.coli hay ruột bê, enzym xúc tác sự loại bỏ nhóm 5’ phosphate của
DNA, RNA và các nucleotide tự do


III.CÁC NUCLEASE
Đây là nhóm enzyme phân cắt DNA (Dnase) và RNA (RNase).

•

DNase 1

- Enzyme có nguồn gốc từ tụy tạng bò, có vai trò xúc tác các phản ứng thủy giải liên kết
nằm ngay sau một pyrimidine trên chuỗi DNA mạch đơn hay mạch đôi.

•

nuclease s1

- Enzyme được trích ly từ Aspergillus oryzae, có khả năng phân hủy các DNA mạch đơn.
DNA mạch đôi, phân tử lai DNA : RNA không bị enzyme phân cắt, trừ những đoạn mạch đơn

trên các phân tử này


•

Exonuclease iii

- Là enzyme tách chiết từ E.coli, xúc tác các phản ứng thủy giải tuần tự các nucleotide từ
đầu 3’OH tự do của một DNA, theo chiều 3’ → 5’  hình thành nên một vòng mạch đơn dài
trên một DNA mạch đôi

•

rnase a

- Là loại enzyme có hoạt tính rất cao, hiện diện ở mọi nơi và cực kì bền vững. Enzyme
thương mại được trích li từ tụy bò. RNase A cắt một cách đặc trưng liên kết
phosphodiester nằm ngay sau một pyrimidine của một RNA mạch đơn.


•

rnase h

- Có khả năng loại bỏ RNA trong một phân tử lai RNA : DNA và thường được dùng để loại
bỏ RNA sau phản ứng phiên mã ngược để tiếp tục tổng hợp mạch thứ 2 của cDNA hình
thành một DNA mạch đôi.