Sự sản xuất các hợp chất thơm trong quá trình lên men rượu vang bởi saccharomyces cerevisiae ảnh hưởng của nitơ đồng hóa bởi nấm men lên hai chủng mô hình

Production of fermentation
aroma
compounds
by
Saccharomyces
cerevisiae
wine yeasts: effects of yeast
assimilable nitrogen on two
model strains
Abstract
The
contribution
of
yeast
fermentation metabolites to the
aromatic profile of wine is well
documented;
however,
the
biotechnological application of this
knowledge, apart from strain
selection, is still rather limited and
often contradictory. Understanding
and modeling the relationship
between nutrient availability and
the production of desirable aroma
compounds by different strains
must be one of the main
objectives in the selection of
industrial yeasts for the beverage
and food industry. In order to

overcome the variability in the
composition of grape juices, we
have used a chemically defined
model medium for studying yeast
physiological
behavior
and
metabolite production in response
to nitrogen upplementation so as
to identify an appropriate yeast
assimilable nitrogen level for strain
differentiation. At low initial nitrogen
concentrations, strain KU1 produced higher
quantities of esters and fatty acids whereas
M522 producedhigher concentrations of
isoacids,-butyrolactone, higher alcohols and
3-methylthio-1-propanol. We propose that
although strains KU1 and M522 have a
similar nitrogen consumption profile, they

represent useful models for the chemical
characterization of wine strains in relation
to wine quality.


Sự sản xuất các hợp chất
thơm trong quá trình lên men
rượu
vang
bởi

Saccharomyces
cerevisiae:
ảnh hưởng của nitơ đồng hóa
bởi nấm men lên hai chủng
mô hình
Tóm tắt
Sự đóng góp của các chất chuyển hóa lên
men nấm men đến hương thơm của rượu
vang là dẫn chứng tốt; Tuy nhiên, việc áp
dụng công nghệ sinh học vào vấn đề này,
ngoài việc lựa chọn chủng vi khuẩn, vẫn
còn nhiều mặt khá hạn chế và mâu thuẫn.
Để hiểu và mô hình hóa mối liên hệ giữa
lượng dinh dưỡng và việc sản xuất các hợp
chất hương thơm mong muốn bởi các
chủng khác nhau là một trong những mục
tiêu chính để lựa chọn của ngành công
nghiệp nấm men phục vụ cho các ngành
công nghiệp nước giải khát và thực phẩm.
Để khắc phục những biến đổi trong thành
phần của các loại nước ép nho, chúng tôi đã
sử dụng một chủng mô hình xác định về
mặt hóa học cho việc nghiên cứu hoạt động
sinh lý nấm men và sản xuất chất chuyển
hóa, đáp ứng với sự bổ sung đạm để xác
định một mức men nitơ đồng hóa thích hợp
cho các chủng khác nhau. Ở nồng độ nitơ
ban đầu thấp, chủng KU1 sản xuất với số
lượng lớn các este và acid béo trong khi
M522 sinh nhiều isoacids,-butyrolactone,

rượu và 3-methylthio-1-propanol. Chúng
tôi đề xuất rằng mặc dù chủng KU1 và
M522 có lượng tiêu thụ nitơ như nhau,
nhưng chúng tiêu biểu cho mô hình hữu ích
về các đặc tính hóa học của các chủng loại
rượu liên quan đến chất lượng rượu.

The differential production of aroma
compounds by the two strains is discussed
in relation to their capacity for nitrogen
usage and their impact on winemaking. The
results obtained here will help to develop
targeted metabolic footprinting methods for
the discrimination of industrial yeasts.

Introduction
The role of yeasts in the fermentation of
sugars into alcohol and carbon dioxide has
been known for more than two centuries
(Anderson, 1989). However, well over a
half century elapsed before the role of yeast
strain in the production of different wines
was established by Pasteur in 1866
(Pasteur, 1866). While the principal yeast
used in today’s food and alcoholic beverage
industries for the production of bread, beer,
spirits, cider and wine is classified as
Saccharomyces cerevisiae, it is well
recognized that not all S. cerevisiae strains
are suitable for the fermentation process

and the ability to produce quality foods and
beverages differs significantly among them.
Because classical, physiological and genetic
methods are of limited use in the
characterization of wine-making yeast
strains, researchers in wine biotechnology
have been searching for new methods to
reveal the genetic adaptations of industrial
yeast strains of the same species, i.e. S.
cerevisiae (Pretorius & Hoj, 2005). On the
other hand, it is well established that S.
cerevisiae produces different concentrations
of aroma compounds as a function of
fermentation
conditions
and
must
treatments, for example, temperature, grape
variety, micronutrients, vitamins and
nitrogen composition of the must.
Moreover, many commercial yeasts
produce undesirable off-flavors, such as S,
and a high concentration of higher alcohols,


acetic acid and ethyl acetate, depending on
the concentration of
Việc sản xuất các hợp chất hương thơm
khác nhau từ hai chủng được thảo luận liên
quan đến khả năng sử dụng nitơ và tác động

đến sản xuất rượu vang. Các kết quả thu
được ở đây sẽ giúp phát triển các phương
pháp footprinting trao đổi chất mục tiêu để
phân biệt nấm men công nghiệp.

Giới thiệu
Vai trò của nấm men trong quá trình lên
men đường thành rượu và đã được biết đến
từ hơn hai thế kỷ (Anderson, 1989). Tuy
nhiên, hơn một nửa thế kỷ trôi qua trước
khi vai trò của nấm men trong sản xuất các
loại rượu vang khác nhau được tìm ra bởi
Pasteur vào năm 1866 (Pasteur, 1866).
Trong khi các men chính được sử dụng
trong ngành công nghiệp thực phẩm và đồ
uống có cồn hiện nay để sản xuất bánh mì,
bia, rượu mạnh, rượu táo và rượu vang
được phân loại như Saccharomyces
cerevisiae, nó cũng được công nhận rằng
không phải tất cả các chủng S. cerevisiae là
thích hợp cho quá trình lên men và khả
năng sản xuất thực phẩm chất lượng cùng
đồ uống khác nhau đáng kể trong số đó. Bởi
vì phương pháp cổ điển, sinh lý và di truyền
bị hạn chế sử dụng do đặc tính của các
chủng nấm men rượu vang, các nhà nghiên
cứu công nghệ sinh học trong rượu vang đã
tìm kiếm các phương pháp mới để thích
nghi di truyền của chủng nấm men công
nghiệp của cùng một loài, tức là S.

cerevisiae (Pretorius & Hoj, 2005). Mặt
khác, nó được thiết lập tốt để S. cerevisiae
sản xuất nồng độ hợp chất thơm khác nhau
dựa trên điều kiện lên men và nghiên cứu,
ví dụ: nhiệt độ, giống nho, vi chất dinh
dưỡng, vitamin và thành phần nitơ cần
thiết. Hơn nữa, nhiều nấm men thương mại
ngoài hương vị còn tạo ra sản phẩm không
mong muốn, chẳng hạn như S, alcohol bậc

cao, acid acetic và ethyl acetate, tùy thuộc
vào


assimilable nitrogen present in the grape
must
(Bell
&
Henschke,
2005).
Additionally, slow, sluggish and stuck
fermentations have often been related to
nitrogen deficiency (Bisson, 1999). In the
late 1970s, these fermentation problems
were partially solved by the addition of
ammoniumsalts to deficient musts, which
not only increased fermentation rate but
also the sensory desirability of the wines
(Bell & Henschke, 2005). As a
consequence, the routine addition of

ammoniacal nitrogen to musts to correct
nitrogen limitation is widely used by
enologists in most wine regions of the
world. Although today some useful
methods are accessible for measuring the
yeast assimilable nitrogen (YAN) content of
grape musts inwineries, they are not
commonly used, and so the cause and effect
relationship that results in wines with an
undesirable flavor is not usually correlated.
Initial studies have attempted to relate the
yeast nitrogen demand concept with the
profile of aroma compounds in wines.
Paradoxically, the various studies reported
to characterize the yeast aroma compounds
of wines made with various wine yeasts
have not considered the importance of
nitrogen level of the grape must or the
fermentation medium utilized (Rankine,
1967; Rankine & Pocock, 1969; Daudt &
Ough, 1973; Di Stefano et al., 1981;
Cabrera et al., 1988; Cavazza et al., 1989;
Giudici et al., 1990; Herraiz et al., 1990;
Mateo et al., 1991; Delteil & Jarry, 1992;
Longo et al., 1992; Lurton et al., 1995;
Lema et al., 1996; Zoecklein et al., 1997;
Antonelli et al., 1999; Vila et al., 2000;
Romano et al., 2003). Moreover, many
studies were conducted under conditions of
excess nitrogen, above 300 mgN/L

(Houtman & Du Plessis, 1986; Carrau,
2003). This experimental approach has,
however, not proved to be suitable because

nồng độ nitơ đồng hóa trong nho (Bell &
Henschke, 2005). Ngoài ra, quá trình lên
men chậm và khó khăn thường liên quan
đến thiếu hụt nitơ (Bisson99). Vào cuối
những năm 1970, những vấn đề lên men đã
được giải quyết một phần bằng cách cho
thêm muối amoni, điều đó không chỉ tăng
tốc độ quá trình lên men mà còn tạo mùi vị
mong muốn của các loại rượu vang (Bell &
Henschke, 2005). Như một hệ quả, việc bổ
sung thường xuyên nitơ amoniac để cung
cấp nitơ được sử dụng rộng rãi bởi các nhà
làm rượu ở hầu hết các vùng sản xuất rượu
vang của thế giới. Mặc dù ngày nay một số
phương pháp hữu ích có thể sử dụng để đo
hàm lượng nitơ có thể được đồng hóa bởi
nấm men (YAN) của nho trong sản xuất,
nhưng chúng không được sử dụng phổ biến,
và đó là nguyên nhân ảnh hưởng kết quả
sản xuất rượu với một hương vị không
mong muốn.

Nghiên cứu ban đầu đã cố gắng liên hệ các
khái niệm nhu cầu men nitơ với các hợp
chất thơm trong rượu vang. Nghịch lý thay,
nhiều nghiên cứu đã báo cáo mô tả các hợp

chất thơm được tạo ra từ nấm men trong
các loại rượu vang khác nhau, có hàm
lượng nitơ trong nho hoặc môi trường lên
men không được xem xét (Rankine, 1967;
Rankine & Pocock, 1969; Daudt & ough,
1973; Di Stefano et al., 1981; Cabrera et al.,
1988; Cavazza et al., 1989; Giudici et al.,
1990; Herraiz et al., 1990; Mateo et al.,
1991; Delteil & Jarry, 1992; Longo et al.,
1992; Lurton et al., 1995; Lema et al.,
1996; Zoecklein et al., 1997; Antonelli et
al., 1999; Vila et al., 2000; Romano et al.,
2003 ). Hơn nữa, nhiều nghiên cứu đã được
tiến hành trong điều kiện nitơ dư thừa, trên
300 mgNL-1 (Houtman & Du Plessis, 1986;
Carrau, 2003). Cách tiếp cận này, tuy nhiên,
không được xem là phù hợp vì


S. cerevisiae yeast strains that show similar
profiles
of
assimilable
nitrogen
consumption can nevertheless produce very
different profiles of fermentation rate and
aromatic compounds under industrial
conditions of lower initial nitrogen levels
(Jiranek et al., 1991; Carrau, 2003;
Taillandier et al., 2007). There are few

reports of investigations into the sensory
characteristics of wines made with different
strains under low nitrogen fermentation
conditions (Carrau et al., 1993; Medina et
al., 1997; Carrau, 2003). Only recently,
have the first chemometric studies provided
data on the significance of yeast aroma
compounds to perceived flavor in wine
(Smyth et al., 2005).
From the chemical point of view, only a
few studies have investigated the yeast
aroma compounds of wines prepared under
defined conditions of YAN contents similar
to winemaking conditions (Bosso, 1996;
Guitart et al., 1999; Nicolini et al., 2000a,
b; Carrau, 2003; Bell & Henschke, 2005;
Beltran et al., 2005; Carrau et al., 2005;
HernandezOrte et al., 2006; Vilanova et al.,
2007). Nevertheless, it is difficult to draw
any firm conclusions concerning the
relationship between YAN and the different
aroma compounds produced by the yeast
strains studied due to the different
experimental conditions used.
The aim of this study was to characterize S.
cerevisiae strains for the production of key
yeast aroma compounds (esters, alcohols,
acids and lactones) after fermentation of a
chemically defined medium, which models
the nutrient composition of grape must

covering a wide range of initial nitrogen
concentrations. The model yeast strains
used in this study were selected from a
wide group of strains because both showed
similar nitrogen consumption when tested
under different nitrogen conditions,

chủng nấm men S. cerevisiae tiêu thụ nitơ
đồng hóa như nhau vẫn có thể tạo ra sự
khác nhau về tỷ lệ lên men và các hợp chất
thơm trong điều kiện công nghiệp của
lượng nitơ ban đầu thấp hơn (Jiranek et al.
1991; Carrau, 2003; Taillandier et al. 2007).
Có vài báo cáo về đặc tính của các loại
rượu vang được thực hiện với các chủng
khác nhau trong điều kiện lên men nitơ thấp
(Carrau et al. 1993; Medina et al., 1997;
Carrau, 2003). Chỉ mới gần đây, có những
nghiên cứu về mặt hóa học đầu tiên cung
cấp dữ liệu đáng kể về tầm quan trọng của
các hợp chất thơm đối với hương vị rượu
(Smyth et al. 2005).

Từ quan điểm hóa học của vấn đề, chỉ có
một vài nghiên cứu về các hợp chất thơm từ
nấm men được chuẩn bị dưới điều kiện
lượng YAN được xác định tương tự như
điều kiện sản xuất rượu vang (Bosso, 1996;
Guitart et al, 1999; Nicolini et al., 2000a, b;
Carrau, 2003; Bell & Henschke, 2005;

Beltran et al., 2005; Carrau et al., 2005;
Hernandez-Orte et al., 2006; Vilanova et al.,
2007). Tuy nhiên, rất khó để rút ra bất kỳ
kết luận chắc chắn về mối quan hệ giữa
YAN và các hợp chất thơm khác nhau được
sản xuất bởi các chủng nấm men sử dụng
nghiên cứu ở các điều kiện thí nghiệm khác
nhau.
Mục đích của nghiên cứu này là để mô tả
các chủng S. cerevisiae sản xuất các hợp
chất men hương thơm chính (este, rượu,
axit và lactones) sau khi lên men trên một
môi trường được xác định về mặt hóa học,
trong đó thành phần dinh dưỡng của nho
phải bao gồm một loạt các nồng độ nitơ ban
đầu. Các chủng nấm men được sử dụng
trong nghiên cứu này đã được lựa chọn từ
một nhóm lớn các chủng bởi vì chúng cho
thấy việc tiêu thụ nitơ tương tự khi được
thử nghiệm trong điều kiện nitơ khác nhau,


but from a sensory and chemical point of
view they produced different wines at a low
nitrogen concentration (75 mgN/L). The
differential behavior of yeast strains at
different initial nitrogen concentrations was
examined for a better understanding of this
phenomenon in our model system.
Application of these results for future

discrimination of industrial yeast strains in
relation to the type of aroma compounds
produced will allow the development of
data models for metabolic footprinting
methods (Kell et al., 2005; Carrau et al.,
2008).

Materials and methods
Yeast strains
Saccharomyces cerevisiae strains utilized
were: Montrachet UCD 522 (University of
California, Davis), referred to as M522 in
this work, and KU1 [Uruguayan selected
strain, (Carrau et al., 1993; Medina et al.,
1997)]. Both strains are used in the
commercial production of wine. Inocula
were prepared in the same synthetic
medium by incubation for 12h in a rotary
shaker at 150r.p.m. and 25. Inoculum size
was 5.105 cells/mL of medium for both
strains. The widely studied wine yeast
strains, S. cerevisiae M522 and KU1, were
characterized as strains having similar
nitrogen demands (i.e. consuming a similar
amount of nitrogen under 50–400mgN/L of
YAN).

Fermentation conditions
Chemically defined fermentation medium
(nutrient components of grape juice) was

prepared as described previously (Henschke
& Jiranek, 1993), but modified as follows:
the total nitrogen content was adjusted to a
basic amount of 50mgN/L with each amino
acid and ammonium component added in

nhưng từ một điểm cảm quan và hóa học
của vấn đề, chúng sản xuất các loại rượu
vang khác nhau ở nồng độ nitơ thấp (75
mgN/L). Các hoạt động khác biệt của các
chủng nấm men ở nồng độ nitơ ban đầu
khác nhau đã được kiểm tra cho thấy sự
hiểu biết tốt hơn về hiện tượng này trong hệ
thống mô hình của chúng tôi.
Áp dụng các kết quả phân tích trong tương
lai của các chủng nấm men công nghiệp
liên quan đến các loại hợp chất thơm được
sản xuất sẽ cho phép sự phát triển của mô
hình dữ liệu của các phương pháp
footpriting trao đổi chất (Kell et al., 2005;
Carrau et al., 2008).

Vật liệu và phương pháp
Chủng nấm men
Chủng Saccharomyces cerevisiae được sử
dụng là: Montrachet UCD 522 (Đại học
California, Davis), được gọi là M522 trong
nghiên cứu này, và KU1 (Carrau et al,
1993; Medina et al., 1997). Cả hai chủng
đều được sử dụng trong sản xuất thương

mại rượu vang. Chủng đã được chuẩn bị
trong môi trường tổng hợp tương tự bằng
cách ủ trong máy lắc 12 giờ tại 150 r.p.m.
và 25. Hàm lượng chung cho tất cả các
chủng là 5.105 tế bào/mL. Các chủng nấm
men rượu vang được nghiên cứu rộng rãi,
S. cerevisiae M522 và KU1, được mô tả
như là các chủng có nhu cầu nitơ tương tự
(nghĩa là tiêu thụ một số lượng tương tự của
nitơ dưới 50-400 mgN/L của YAN).

Điều kiện lên men
Môi trường lên men được xác định thành
phần hóa học (thành phần dinh dưỡng của
nước ép nho) được chuẩn bị như mô tả
trước đó (Henschke & Jiranek, 1993) nhưng
biến đổi như sau: tổng hàm lượng nitơ đã
được điều chỉnh lượng cơ bản là 50 mgN/L
với mỗi amino acid và amonium thành phần
được thêm vào với tỉ lệ


the same proportions as indicated
previously (Henschke & Jiranek, 1993).
Media with YAN concentrations of 75, 125,
180, 250 and 400mgN/L were made by
increasing the basic concentration by
supplementation
with
diammonium

phosphate (DAP). None of these YAN
amounts was a limiting concentration for
complete fermentation of sugars by the
yeast strains used. The final pH of each
medium was adjusted to 3.5 with HCl.
Equimolar concentrations of glucose and
fructose were added to reach 120g/L and
the mixed vitamins and salts as described
previously (Henschke & Jiranek, 1993).
Tween 80 was excluded from the medium
because it was not found to be necessary for
complete fermentation and it had a negative
impact on the sensory characteristics of the
resultant wines. Ergosterol was added as the
only supplemented lipid at a final
concentration of 10 mg/L. Fermentations
were carried out in 125 mL of medium
contained in 250mL Erlenmeyer flasks,
closed with Muller valves, filled with pure
sulfuric acid. YAN was chosen as the
variable for this investigation because it
was found previously that this factor
significantly affected production of
fermentation aroma compounds by these
yeasts
under
similar
experimental
conditions (Carrau, 2003). Static batch
fermentation conditions were conducted at

20 in triplicate, simulating winemaking
conditions. Fermentation activity was
measured as C weight loss and expressed in
grams per 100 mL, and total residual sugars
were analyzed using the Fehling method
(Zoecklein et al., 1995). Once a day,
samples were taken to measure cell growth
in an improved Neubauer chamber.
Samples for sensory and GC-MS analysis
were taken 2 days after the end of
fermentation, filtered through 0.45- pore
membranes and S was added as

giống như được mô tả trước đó (Henschke
& Jiranek, 1993). Môi trường với nồng độ
YAN là 75, 125, 180, 250 và 400 mg N/L
được làm tăng nồng độ cơ bản bởi sự cung
cấp diamonium phosphate (DAP). Không
có nồng độ YAN nào trong những nồng độ
trên là nồng độ giới hạn trong quá trình lên
men hoàn toàn đường bởi chủng nấm men
được sử dụng. PH cuối của mỗi môi trường
được điều chỉnh 3.5 với HCl. Nồng độ đẳng
phân tử của glucose và fructose được thêm
vào để đạt 120g/L và hỗn hợp vitamin và
muối như được mô tả trước đó (Henschke
& Jiranek, 1993). Tween 80 được loại trừ
khỏi môi trường vì nó không cần thiết cho
quá trình lên men hoàn toàn và nó có tác
động tiêu cực lên đặc tính cảm quan của

rượu thành phẩm. Ergosterol được thêm
vào như là nguồn bổ sung lipid duy nhất ở
nồng độ cuối là 10mg/L. Sự lên men đã
được thực hiện trong 125mL môi trường
chứa trong bình Erlenmeyer 250 mL, đóng
lại bằng van Muller, đầy nguyên chất. YAN
đã được chọn như là biến số cho nghiên
cứu này vì nó được nhận thấy rằng yếu tố
này ảnh hưởng đáng kể đến sản lượng của
các hợp chất lên men thơm của chủng nấm
men này dưới điều kiện thí nghiệm tương tự
(Carrau, 2003). Điều kiện lên men tĩnh
được tiến hành ở 20oC trong 3 lần, kích
thích các điều kiện làm rượu. Hoạt động lên
men được đo bởi hàm lượng mất đi, tính
bằng g/100mL và tổng lượng đường còn lại
được phân tích bằng phương pháp Fehling
(Zoecklein et al., 1995). Mỗi ngày, mẫu
được lấy đi đo sự tăng trưởng tế bào trong
phòng Neubauer được cải tiến. Mẫu cho
phân tích cảm quan và phân tích GC-MS
được lấy sau khi kết thúc quá trình lên men
2 ngày, lọc qua màng lọc lỗ 0,45 và được
thêm vào là


50mg/L of sodium metabisulfite.

50mg/L sodium metabisulfite.

Sensory analysis

Phân tích cảm quan

Fermentation products were subjected to
sensory analysis through a paired
preference test. Fermentations at 75 mgN/L
were presented to a trained panel of 12–15
persons, in order to determine the
significance of the sensory differences
between the strains. Samples fermented
with both strains with or without addition of
YAN in the chemically defined medium
containing the basic concentration of
nitrogen (75 mgN/L) were presented to a
group of five winemakers so as to evaluate
aroma defects and positive characteristics.
A free description of desirability and aroma
characteristics was presented in the tasting
sheet.

Sản phẩm lên men được phân tích cảm
quan thông qua một bài kiểm tra kết hợp ở
75mgN/L trình bày bởi một nhóm 12-15
người, để xác định ý nghĩa cảm quan khác
nhau giữa các chủng. Mẫu lên men với cả
hai chủng có hoặc không có thêm YAN
trong môi trường đã xác định thành phần
hóa học chứa nồng độ nitơ cơ bản (75
mgN/L) được trình bày bởi một nhóm 5

người làm rượu để đánh giá sự thiếu mùi
thơm và các đặc tính tốt được trình bày
trong bảng thử.

GC and GC-MS analysis
Higher alcohols
Higher alcohol and ethyl acetate analysis
was performed by distillation of 50 mL of
sample and direct injection of 0.5 of
sample of the distillate and analyzed using
the GC-FID with a glass column (2m x 2
mm; Carbopack C, 60–80 mesh, 0.2% CW
1500, Supelco) in a Shimatzu C-17,
equipped with EZ-CHROM software. The
experimental conditions were as follows:
program temperature 65 (5 min), 60–150 at
4/min; injector temperature 200; and
detection temperature, 250. The carrier gas
was nitrogen (20 mL/min)

Phân tích GC và GC-MS
Acohol bậc cao
Phân tích alcohol bậc cao và ethyl acetate
được thực hiện bởi chưng cất 50ml mẫu và
phun trực tiếp 0,5mẫu sản phẩm chưng cất
và phân tích bằng GC-FID với một cột thủy
tinh (2m x 2mm, Carbopack C, 60-80 mắt
lưới 0.2% CW 1500, Supelco) trong một
Shimatzu C-17, được trang bị phần mềm
EZ-CHROM. Điều kiện thí nghiệm như

sau: nhiệt độ quá trình 65oC ( 5 phút), 60–
150 oC tại 4/phút; nhiệt độ phun 200. Và
nhiệt độ phát hiện là 250oC. Khí mang là
nitơ (20 mL/phút).

Aroma volatile compounds
Extraction of aroma compounds was
performed using adsorption and separate
elution from an Isolute (IST Ltd, Mid
Glamorgan, UK) ENV1 cartridge packed
with 1g of a highly cross-linked styrenedivinyl
benzene
(SDVB)
polymer.
Treatment of samples and GC analysis were

Hợp chất thơm dễ bay hơi
Tách chiết hợp chất thơm được thực hiện
bằng hấp phụ và ly giải từ một Isolute(IST
Ltd, Mid Glamorgan, UK) ENV + hạt được
đóng gói với 1g SDVB ( nhiều liên kết chéo
styrene-divinyl benzene polymer). Xử lí
mẫu và phân tích GC được thực hiện


performed as described previously (Boido
et al., 2003).

KU1 and unpleasant (soapy and sweaty) for
M522, confirming our previous work with

như mô tả trước đó(Boido et al., 2003).

Identification and quantification

Nhận biết và định lượng

The components of wine aromas were
identified by comparison of their linear
retention indices, with pure standards or
data reported in the literature. Comparison
of mass spectral fragmentation patterns
with those stored on databases was also
performed.
GC-FID
and
GC-MS
instrumental procedures using an internal
standard (1-heptanol) were applied for
quantitative
purposes,
as
described
previously (Boido et al., 2003).

Thành phần của các hương liệu rượu được
nhận biết bằng cách so sánh chỉ số duy trì
tuyến tính của nó với tiêu chuẩn thuần hoặc
dữ liệu được ghi lại. So sánh các mẫu phân
mảnh quang phổ khối lượng với dữ liệu
được lưu trữ trong cơ sở dữ liệu. Phương

pháp GC-FID và GC-MS sử dụng một tiêu
chuẩn nội bộ (1-heptanol) được áp dụng
cho mục đích định lượng như được mô tả
trước đó (Boido et al., 2003).

Statistical analysis
A stepwise discriminant analysis was
carried out with the aroma compounds
analyzed of the 12 wines produced using
both strains in triplicate in a basic
fermentation medium containing a initial
YAN of 75 mgN/L, with and without an
extra YAN addition of 63 mgN/L as DAP.
ANOVA for initial YAN concentration,
yeast strain and aroma compounds were
determined with STATISTICA 5.1.
Differences of free volatile compounds
were evaluated; the mean rating and least
significant differences for initial YAN
concentrations for each strain were
calculated from an ANOVA.

Phân tích thống kê
Phương pháp phân tích từng bước một được
thực hiện với việc phân tích hợp chất thơm
của 12 loại rượu được sản xuất sử dụng cả 2
chủng 3 lần trong môi trường lên men cơ
bản chứa một nồng độ YAN ban đầu 75
mgN/L, có hoặc không có thêm vào 63
mgN/L DAP.

ANOVA (phân tích phương sai) cho nồng
độ YAN ban đầu, chủng nấm men và hợp
chất thơm được xác định với STATISTICA
5.1 (phép thống kê). sự khác nhau của hợp
chất dễ bay hơi được đánh giá; đánh giá
trung bình và sự khác biệt đáng kể nhất cho
nồng dộ YAN ban đầu của mỗi chủng được
tính toán từ một ANOVA.

Results
A preference sensory test was performed
where significant differences were found
between fermentations of KU1 and M522
(P < 0.01) at a low nitrogen concentration
(75 mgN/L), while no significant
differences were found between them at a
higher nitrogen concentration (400 mgN/L).
At a low nitrogen concentration, wines
were described as fruity and pleasant for

Các kết quả
Một thử nghiệm cảm quan được thực hiện
nhiều nơi tìm thấy sự khác biệt giữa quá
trình lên men của KU1 và M522 (P < 0.01)
ở nồng độ nitơ thấp (75 mgN/L), trong khi
không có sự khác biệt đáng kể nào được tìm
thấy giữa chúng ở nồng độ nitơ cao hơn
(400 mgN/L). Ở nồng độ nitơ thấp, rượu

vang được mô tả như trái cây và dễ chịu
cho KU1 và không dễ chịu cho M522, được
xác nhận trong những kết quả nghiên cứu
trước đây

strains have a very different behavior at this
nitrogen concentration. On the other hand,
addition of YAN to the low nitrogen
concentration (75 mgN/L) of 63 mgN/L as

these two strains (Carrau, 2003). Table 1
shows the odor active values (OAV) of the
main aroma compounds analyzed for these
two nitrogen concentrations.

của chúng tôi về hai chủng này(Carrau,
2003). Bảng 1 cho thấy các giá trị nồng độ
mùi (OAV) của các hợp chất thơm chính
được phân tích ở hai nồng độ nitơ.

Table 1. Average OAV for the studied
fermentations with the model strains at two
YAN levels (75 and 400 mgN/L)

Bảng 1. OAV trung bình của nghiên cứu
quá trình lên men với chủng mô hình tại hai
nồng độ YAN (75 và 400 mgN/L)

On the left side, it can be seen that from the
7 compounds that resulted in higher OAVs

for KU1 at a low YAN level, four were
described as fruity (esters) and the others
were mediumchain fatty acids, considered
as precursors of fruity esters. Conversely,
seven compounds that resulted in lower
OAVs for KU1 at this YAN level were the
higher alcohols and isoacids, corresponding
to unpleasant aroma descriptions. At the
higher nitrogen concentration, although
wines could not be differentiated by the
sensory analysis, M522 produced high
concentrations (OAVs) of practically all the
compounds, indicating that chemically,

Ở bên trái, có thể thấy rằng từ 7 hợp chất
trong OAVs của KU1 cao hơn ở mức YAN
thấp, bốn hợp chất cho mùi trái cây (este)
và những loại khác là các chuỗi axit béo
trung bình, được coi là tiền thân của các
este có mùi trái cây. Ngược lại, bảy hợp
chất của KU1 cho kết quả OAVs thấp hơn ở
mức YAN này là alcohol bậc cao và
isoacids, cùng với mùi hương khó chịu. Ở
nồng độ nitơ cao hơn, mặc dù các loại rượu
vang không thể được phân biệt bởi các
phân tích cảm quan, nồng độ cao (OAVs)
của tất cả các hợp chất được sản xuất bởi
M522, chỉ ra rằng về mặt hóa học, các
chủng có biểu hiện khác nhau ở nồng độ

nitơ khác nhau. Mặt khác, việc bổ sung
YAN (75 mgN/L) với các nồng độ nitơ thấp
63 mgN/L
DAP (resulting in a final YAN of 138
mgN/L) shows that the M522 strain
requires a higher nitrogen concentration to
produce a similar aroma profile when
compared with KU1, as shown in Fig. 1.

Fig. 1. In the following experiment, the two
selected strains were fermented with and
without the addition of 63 mgN/L of YAN.
The graph shows the discriminant analysis,
where 28 compounds determined using GCMS were used. The compounds that were
discriminant in this analysis were:phenylethyl alcohol,-phenylethyl acetate,
the isobutanoic and isovaleric acids, ethyl
octanoate and 2-ethyl hexanol.
A discriminant analysis using 28
compounds determined using GC-MS
shows a clear discrimination in three
fermentation groups. The discriminant
compounds in this analysis were:phenylethyl alcohol, -phenylethyl acetate,
the isobutanoic (isoC4) and isovaleric acids
(isoC5), ethyl octanoate and 2-ethyl
hexanol. The YAN addition to M522
resulted in fermentations with a response
similar to that of unsupplemented KU1, as
the discriminant analysis could not separate
these two cases.

Conditions of growth and fermentation
activity could affect the profile of volatile
yeast metabolites that contribute to wine
aroma. The growth and fermentation
như DAP (kết quả 138 mgN/L là kết quả
cuối cùng của YAN) cho thấy chủng M522
đòi hỏi phải có một nồng độ nitơ cao hơn
để sản xuất một lượng chất thơm tương tự

với KU1, như trong hình. 1
Hình 1. Theo như trong thí nghiệm, hai
chủng được chọn để lên men và không bổ
sung 63 mgN/L của YAN. Đồ thị biểu thị
vùng phân tích riêng biệt, nơi 28 hợp chất
được xác định bằng GC-MS. Những hợp
chất được phân biệt trong phân tích này là:
-phenylethyl alcohol, -phenylethyl acetate,
the isobutanoic và isovaleric acids, ethyl
octanoate and 2-ethyl hexanol.
Phương pháp phân biệt 28 hợp chất sử dụng
GC-MS cho thấy một sự khác biệt rõ ràng
trong ba nhóm lên men. Các hợp chất khác
nhau trong phân tích này là: -phenylethyl
alcohol,
-phenylethyl
acetate,
các
isobutanoic (isoC4) và các acid isovaleric
(isoC5) ethyl octanoate và 2-ethyl hexanol.

YAN được thêm vào M522 dẫn đến lên
men với một phản ứng tương tự như của
KU1, phương pháp phân tích không thể
phân biệt hai trường hợp này.


Điều kiện của sự phát triển và quá trình lên
men có thể ảnh hưởng đến các chất chuyển
hóa men dễ bay hơi tạo hương thơm rượu.
Sự tăng trưởng và động học quá trình lên
men
kinetics of the two strains were first
characterized over the wide range of
nitrogen concentrations utilized in this
study (50–400 mgN/L). No significant
differences in cell growth were found
between strains (Fig. 2a), but a significantly
smaller total population was found for both
strains in fermentations at an initial YAN of
75 mgN/L.

Fig. 2. (a) Growth response to different
nitrogen concentrations for M522 and KU1
strains. Results are the average of duplicate
fermentations.

(b) Fermentation rate curves, determined by
culture weight loss due to CO2 evolution
for M522 and KU1 at low YAN
concentrations (50–125 mgN/L). Results

are the average of duplicate fermentations
and SEs of the mean < 5%.
của hai chủng này là hình mẫu đầu tiên
được nghiên cứu trong phạm vi nồng độ
nitơ rộng (50-400 mgN/L). Không có sự
khác biệt đáng kể trong tăng trưởng tế bào
được tìm thấy giữa các chủng (Hình 2a).,
nhưng tổng sinh khối nhỏ hơn đáng kể
được nhận thấy giữa hai chủng trong lên
men với nồng độ YAN ban đầu là 75
mgN/L.

Hình 2. (a) Đáp ứng tăng trưởng với nồng
độ nitơ khác nhau của các chủng M522 và


KU1. Kết quả là mức trung bình của quá
trình lên men trùng lặp.
(b) Đường cong tỷ lệ lên men, xác định bởi
lượng môi trường mất đi do quá trình tạo
CO2 của M522 và KU1 ở nồng độ YAN
thấp. Kết quả là trung bình của quá trình lên
men trùng lặp và SEs có nghĩa < 5%.
Fermentation activity (C evolution rate) of
the two strains was found to depend on the
initial YAN concentration up to 125
mgN/L, (Fig. 2b). All fermentations were
completed (final residual sugars below 2
g/L) at low nitrogen concentrations and
fermentation curves were not significantly

different for strains at higher YAN
concentrations (data not shown).

Production of higher alcohols and
isoacids in response to initial nitrogen
concentration

Fig. 3. Relationship between the accumulation
of higher alcohols and isoacids in wines made

with two Saccharomyces cerevisiae yeast
strains in response to the initial nitrogen
concentration.
(a) Sum of 2-methyl-1- propanol, 2-methyl-1butanol and b-phenylethyl alcohol.
(b) Sum of the isobutanoic and isovaleric acids


Hoạt động lên men ( tăng) của hai chủng
phụ thuộc vào nồng độ YAN ban đầu lên
đến 125 mgN/L, (Hình 2b.). Tất cả các quá
trình lên men đã được hoàn thành (lượng
đường dư dưới 2 g/L) ở nồng độ nitơ thấp
và đường cong lên men là khác nhau không
đáng kể giữa hai chủng ở nồng độ YAN cao
hơn (dữ liệu không được thể hiện).

Sản xuất alcohol bậc cao và isoacids
tương ứng với nồng độ nitơ ban đầu

Hình 3. Mối quan hệ giữa sự tích lũy các

alcohol bậc cao và isoacid trong rượu bởi hai
chủng Saccharomyces cerevisiae tương ứng với
nồng độ nitơ ban đầu.
(a) Tổng 2-methyl-1- propanol, 2-methyl-

1-butanol và b-phenylethyl alcohol.
(b) Tổng isobutanoic và isovaleric acids.

(c) the major alcohol 3-methyl-1- butanol.
These compounds were produced by yeast
strains M522 () and KU1 () in an artificial
grape must medium and measured using GC
and GC-MS as described in Material and
methods. Letters at each point indicate the
significant differences (P < 0.05) according to
an LSD test of ANOVA calculated for each
strain. Error bars indicate SD.

The sum of the higher alcohols, 2-methyl-1propanol,
2-methyl-1-butanol
and
-phenylethyl alcohol is depicted in Fig. 3a.
Both strains produced a similar profile for
higher alcohols in relation to initial
nitrogen, except that at each nitrogen
concentration, strain M522 produced

significantly higher concentrations of these
compounds. At low initial nitrogen
concentrations (50–75 mg/L), a direct

relationship was observed whereas at higher
initial nitrogen concentrations an inverse
relationship existed. Above c. 250 mgN/L,
the production of higher alcohols reached a
plateau. 3-Methyl-1-butanol, which was
produced at a considerably higher
concentration than the remaining alcohols,
showed a slightly different production
profile (Fig. 3c) in that its concentration
slightly changed up to 200 mgN/L and
above this concentration an inverse
relationship existed up to the highest
nitrogen concentration tested (400 mg/L).
The production of isoacids by the two yeast
strains in response to initial nitrogen was
also studied. Figure 3b, which shows the
sum of isobutanoic (isoC4) and isovaleric
(isoC5) acids, indicates a behavior similar
to higher alcohols for both strains. Strain
M522 produced significantly higher
concentrations of these compounds than
KU1. Interestingly, an inverse relationship
(c) Alcohol

quan

trọng

3-methyl-1-

butanol.
Những hợp chất này được tạo bởi chủng
M522 () và KU1 () trong môi trường dịch
lên men nho tổng hợp và phân tích bằng
GC & GC-MS được mô tả ở phần nguyên
liệu và phương pháp. Mỗi điểm là sự khác
nhau đáng kể (PL < 0.05) theo kiểm tra
LSD của phép tính ANOVA cho mỗi chủng.
Đường sai số hiển thị SD.

Tổng của alcohol bậc cao, 2-methyl-1propanol,
2-methyl-1-butanol
và
-phenylethyl alcohol được mô tả trong hình.
3a. Cả hai dòng sản xuất một lượng alcohol
bậc cao tương tự nhau tương ứng với lượng
nitơ ban đầu, ngoại trừ tại mỗi nồng độ
nitơ, chủng M522 sản xuất các hợp chất này
với nồng độ cao hơn đáng kể. Tại nồng độ


nitơ ban đầu thấp (50-75 mg/L), một mối
liên hệ trực tiếp đã được quan sát trong khi
ở nồng độ nitơ ban đầu cao thì trái ngược.
Hơn 250 mgN/L, việc sản xuất alcohol bậc
cao không thay đổi. 3-metyl-1-butanol,
được sản xuất tại một nồng độ cao hơn
đáng kể so với các rượu còn lại, cho thấy
hàm lượng sản xuất ít khác nhau (Hình. 3c)
trong đó nồng độ của nó ít thay đổi tới 200

mgN/L và trên nồng độ này thì thay đổi cho
tới nồng độ nitơ cao nhất được kiểm tra
(400 mg/L).

Việc sản xuất isoacids bởi hai chủng nấm
men trong đáp ứng với lượng nitơ ban đầu
cũng đã được nghiên cứu. Hình 3b, cho
thấy tổng lượng isobutanoic (isoC4) và
isovaleric (isoC5) axit, biểu hiện sự đáp
ứng tương tự như alcohol bậc cao của hai
chủng này. Chủng M522 sản xuất các hợp
chất này ở nồng độ cao hơn đáng kể so với
KU1. Điều đáng quan tâm là, một mối quan
hệ trái ngược
between growth (Fig. 2a) and higher
alcohols and isoacids profiles (Fig. 3a and
b) was shown.

Production of 1-propanol in response
to different initial YAN concentrations

Fig. 4. Relationship between 1-propanol
production and initial YAN concentration for
M522 () and KU1 (◊) yeast strains. Letters at
each data point indicate the level of significant
difference (P < 0.05) according to an LSD test
of ANOVA calculated for each strain. Error
bars indicate SD of the mean value.

A clear exception among the higher

alcohols is 1-propanol as shown in Fig. 4.
In this case, a positive relationship between
1-propanol production and initial YAN was
observed across the whole range of nitrogen
concentrations studied. In contrast to the
trends shown by the other higher alcohols,
the behavior of each strain is significantly
different at moderate to high YAN
concentrations exceeding c. 150 mgN/L.
Strain KU1 produced higher concentrations
of 1-propanol at moderate to higher
concentrations of YAN.

giữa tăng trưởng (Hình. 2a) và alcohol bậc
cao (Hình 3a và b) và isoacids được sinh ra.

Sự sản xuất 1-propanol tương ứng với
các nồng độ YAN ban đầu khác nhau
Hình 4. Mối quan hệ giữa sản xuất 1-propanol
và nồng độ YAN ban đầu của hai chủng nấm
men M522 () và KU1 (◊). Mỗi điểm dữ liệu là


mức độ khác nhau (P < 0.05) theo thử nghiệm
LSD của phép tính ANOVA cho mỗi chủng.
Đường sai số cho thấy SD của khoảng có
nghĩa.

Một ngoại lệ rõ ràng giữa các alcohol bậc
cao là 1-propanol như Hình. 4. Trong

trường hợp này, một mối quan hệ tích cực
giữa lượng 1-propanol sinh ra và nồng độ
YAN ban đầu đã được quan sát thấy trên
toàn bộ phạm vi của nồng độ nitơ được
nghiên cứu. Ngược lại với xu hướng thể
hiện bởi các alcohol bậc cao khác, sự biểu
hiện của mỗi dòng là khác nhau đáng kể với
nồng độ YAN từ trung bình đến lớn hơn c.
150 mgN/L. Chủng KU1 sản xuất nồng độ
cao 1-propanol ứng với nồng độ từ trung
bình đến cao của YAN.

strains. (a) Sum of esters (isoamyl acetate,
ethyl hexanoate, ethyl octanoate and ethyl
decanoate); (b) sum of fatty acids (C4, C6, C8
and C10); and (c) ethyl acetate. Letters at each
data point indicate the level of significant
difference (P < 0.05) according to an LSD test
of ANOVA calculated for each strain. Error
bars indicate SD of the mean value.

The production of esters (sum of isoamyl
acetate, ethyl hexanoate, ethyl octanoate
and ethyl decanoate) and fatty acids (C4,
C6, C8 and C10) by the two strains M522
and KU1 is shown in Fig. 5. These results
indicate a similar behavior for the two
groups of compounds; however, the two
strains produced different patterns in
relation to the initial YAN concentration.

KU1 produced a higher concentration of
these compounds at lower YAN

Production of esters and fatty acids in
response to different initial YAN
concentrations

Sự sản xuất các este và acid béo tương
ứng với các nồng độ YAN ban đầu
khác nhau

Fig. 5. Relationship between the production of
esters and fatty acids and initial YAN
concentration for M522 () and KU1 (◊) yeast

Hình 5. Mối quan hệ giữa sản xuất este và acid
béo với nồng độ YAN ban đầu của hai chủng
nấm men M522 () và KU1 (◊). (a) Tổng este


(isoamyl acetate, ethyl hexanoate, ethyl
octanoate and ethyl decanoate); (b) Tổng acid
béo (C4, C6, C8 và C10); và (c) ethyl acetate.
Mỗi điểm dữ liệu cho thấy mức độ khác nhau
đáng kể (P < 0.05) theo thử nghiệm LSD của
phép tính ANOVA cho mỗi chủng. Đường sai
số cho thấy SD của khoảng có nghĩa.

Việc sản xuất các este (tổng isoamyl
acetate, ethyl hexanoate, ethyl octanoate và

ethyl decanoate) và các axit béo (C4, C6,
C8 và C10) của hai chủng M522 và KU1
được trình bày trong hình.5. Những kết quả
này cho thấy biểu hiện tương tự của hai
nhóm hợp chất; Tuy nhiên, hai chủng sản
xuất những lượng khác nhau liên quan đến
nồng độ YAN ban đầu. ở nồng độ YAN thấp
hơn
concentrations relative to M522 up to 125
mgN/L, beyond which signifi cantly lower
concentrations of volatiles were produced
by KU1. Although ethyl acetate showed a
profile similar to those observed for the
other esters studied, it was produced at a
relatively higher concentration and so its
response pattern is presented separately in
Fig. 5c. Interestingly, as can be seen, the
behavior of esters and fatty acids, mainly
the ethyl acetate, is the reverse of that
observed for 1-propanol for each strain (see
Fig. 4). KU1 showed a reverse behavior
compared with M522 in these compounds.

Other esters and alcohols

Fig. 6. Production of other volatile compounds
that show variability in response to the initial
YAN concentration by M522 () and KU1 (◊)
yeast strains. (a) -phenylethyl ester and (b) the
3-methylthio-1-propanol. Letters at each data

point indicate the level of significant difference
(P < 0.05) according to an LSD test of ANOVA
calculated for each strain. Error bars indicate
SD of the mean value.

Phenylethyl acetate is presented separately
because its formation pattern, in response to
the initial nitrogen concentration in the
medium, differed from that for the other
esters, showing a more similar profile to
those of the higher alcohols.
so với M522 thì KU1 sản xuất các hợp chất
này với nồng độ cao hơn lên đến 125
mgN/L, và hàm lượng các chất bay hơi thấp
hơn đáng kể. Mặc dù etyl acetate biểu hiện
tương tự như các este khác được nghiên
cứu, nó được sản xuất ở nồng độ tương đối
cao và mô hình phản ứng của nó được trình
bày riêng trong hình.5c. Đáng quan tâm là
biểu hiện của các este và axit béo, chủ yếu
là ethyl acetate, là sự trái ngược của 1propanol được quan sát ở từng dòng (xem
Hình. 4). Ở các hợp chất KU1 cho thấy sự
biểu hiện trái ngược so với M522.

Các este và rượu khác


Hình 6. Sự sản xuất các hợp chất dễ bay hơi
cho thấy sự khác nhau tương ứng với các nồng
độ YAN ban đầu của hai chủng M522 () và

KU1 (◊). (a) -phenylethyl ester; (b) 3methylthio-1-propanol. Mỗi điểm dữ liệu cho
thấy mức độ khác nhau đáng kể (P < 0.05) theo
thử nghiệm LSD của phép tính ANOVA cho
mỗi chủng. Đường sai số cho thấy SD của
khoảng có nghĩa.

Phenylethyl acetate được trình bày riêng
biệt bởi vì mô hình biểu hiện của chúng với
nồng độ nitơ ban đầu trong môi trường,
khác với các este khác, nhưng tương tự với
các alcohol bậc cao.

While 3-methylthio-1- propanol showed a
response profile similar to the other higher
alcohols, as shown in Fig. 2a, the behavior
of the two strains was significantly different
for these compounds as, shown in Fig. 6.
KU1 produced lower concentrations of
these compounds at all initial YAN
concentrations.

Production of γ-butyrolactone and
ethyl-4- hydroxybutanoate in response
to initial YAN concentrations

Fig. 7. Production of γ-butyrolactone (a) and
ethyl 4-hydroxybutanoate (b) in response to the
initial YAN concentration by M522 () and KU1
(◊) yeast strains. Letters at each data point
indicate the level of significant difference (P <

0.05) according to an LSD test of ANOVA

calculated for each strain. Error bars indicate
SD of the mean value.

Figure
7a
shows
g-butyrolactone
production, one of the main lactones
present in wines, which showed a behavior
similar to the higher alcohols. M522
produced higher concentrations of this
lactone at all YAN concentrations, with a
maximum of 125 mgN/L compared with 75
mgN/L for the higher alcohols. Figure 7b
shows
the
behavior
of
ethyl-4hydroxybutanoate, a compound that could
be metabolically related to g-butyrolactone
as discussed below. The profile of lactone
production by M522 was consistent with
Trong khi 3-methylthio-1-propanol biểu
hiện tương tự như các alcohol bậc cao khác,
thể hiện trong Hình. 2a, sự biểu hiện của
hai chủng là khác nhau đáng kể với các hợp
chất được thể hiện trong Hình. 6. KU1 sản
xuất hàm lượng thấp các hợp chất này với

mọi nồng độ YAN ban đầu.

Sự sản xuất γ-butyrolactone and ethyl
- 4 - hydroxybutanoate tương ứng với
các nồng độ YAN ban đầu khác nhau

Hình 7. Sự sản xuất γ-butyrolactone (a) và
ethyl 4-hydroxybutanoate (b) tương ứng với
nồng độ YAN ban đầu của hai chủng nấm men
M522 () và KU1 (◊). Mỗi điểm dữ liệu cho
thấy mức độ khác nhau đáng kể (P < 0.05) theo
thử nghiệm LSD của phép tính ANOVA cho


mỗi chủng. Đường sai số cho thấy SD của
khoảng có nghĩa.

Hình. 7a cho thấy sự sản xuất γbutyrolactone, một trong những lactone
chính hiện nay trong các loại rượu vang, chỉ
ra sự tương tự như các alcohol bậc cao.
M522 sản xuất được nồng độ cao của
lactone này ở mọi nồng độ YAN, tối đa ở
125 mgN/L so với 75 mgN/L của alcohol
bậc cao. Hình. 7b cho thấy biểu hiện của
etyl-4-hydroxybutanoate, một hợp chất
trong quá trình trao đổi chất liên quan đến γ
-butyrolactone như thảo luận dưới đây. Sự
sản xuất lactone của M522 là phù hợp với

this similar metabolic relationship between

the two compounds. However, this is not
the case for KU1, where a reverse behavior
is observed at a YAN of 125 mgN/L.

Discussion
Researches on the chemical identification
of aroma compounds in wine derived from
the metabolic activity of yeasts have been
reported widely in the literature during the
last decades (Houtman & Du Plessis, 1986;
Rapp & Versini, 1996; Lambrechts &
Pretorius, 2000; Swiegers et al., 2005).
From these studies, it can be concluded that
various fermentation products, including
ethyl esters, acetates, higher alcohols, fatty
acids and thiols, are especially important to
the sensory perception of different wine
types (Ferreira et al., 1996; Guth & Sies,
2002; Smyth et al., 2005; Cozzolino et al.,
2006). While this research provides
important information on the sensory
significance of yeast volatile compounds,
more focused research is required on the
physiological
regulation
of
these
compounds for the benefit of the alcoholic
beverage industries, such as wine and beer
production.

A lack of recognition of the importance of
defining the nitrogen content of media in
relation to aroma compounds has produced
considerable
discrepancies
and
misunderstandings in the literature. The
results presented in this work will facilitate
a better understanding of the importance of
the appropriate YAN concentration for
yeast characterization in relation to aroma
compounds.
Table 1 shows the OAV of the compounds
that are shown in the different figures.
Although most of the compounds studied
showed significant chemical and OAV
differences between strains,


mối quan hệ trao đổi chất tương tự giữa hai
hợp chất. Tuy nhiên, điều này không phù
hợp cho KU1, nó có biểu hiện trái ngược
được quan sát thấy ở nồng độ YAN 125
mgN/L.
Thảo luận
Các nghiên cứu về nhận biết hóa học của
các hợp chất thơm trong rượu có nguồn gốc
từ các hoạt động trao đổi chất của nấm men
đã được công khai rộng rãi trên tạp chí
trong những thập kỷ qua (Houtman & Du

Plessis, 1986; Rapp & Versini, 1996;
Lambrechts & Pretorius, 2000; Swiegers et
al., 2005). Từ những nghiên cứu này, có thể
kết luận rằng các sản phẩm lên men khác
nhau, bao gồm ethyl esters, acetates, higher
alcohols, các axit béo và thiol, đặc biệt
quan trọng đối với nhận thức cảm quan của
các loại rượu khác nhau (Ferreira et al,
1996; Guth & SIES, 2002; Smyth et al,
2005; Cozzolino et al, 2006…). Trong
nghiên cứu này cung cấp thông tin quan
trọng về các cảm quan trọng yếu của các
hợp chất dễ bay hơi của nấm men, nghiên
cứu tập trung hơn vào yêu cầu về quy tắc
sinh học của các hợp chất này trong lợi ích
của các ngành công nghiệp đồ uống có cồn,
chẳng hạn như sản xuất rượu và bia.
Sự thiếu hiểu biết về tầm quan trọng của
xác định hàm lượng nitơ trong môi trường
có liên quan đến việc sản xuất các hợp chất
thơm làm khác biệt đáng kể và gây những
hiểu lầm trong khoa học. Các kết quả được
trình bày trong nghiên cứu này sẽ tạo điều
kiện cho sự hiểu biết tốt hơn về tầm quan
trọng của nồng độ YAN thích hợp cho đặc
tính của nấm men liên quan đến các hợp
chất thơm.
Bảng 1 cho thấy OAV của các hợp chất
được thể hiện trong các dữ liệu khác nhau.
Mặc dù hầu hết các nghiên cứu cho thấy

các hóa chất trọng yếu và sự khác biệt OAV
giữa các chủng,

some of them may not contribute to the
sensory characteristics of a wine at the
studied concentrations. This is the case for
ethyl
decanoate,
1-propanol
and
gbutyrolactone. However, from the
chemical point of view some interesting
changes in the behavior of both strains for
all the compounds studied may contribute
to chemical yeast discrimination if an
appropriate nitrogen concentration is used
in a chemically defined medium. In the case
of higher alcohols’s production, except for
1-propanol, the response to the initial
nitrogen concentration varies between
reports, but, in general, is described by an
inverse relationship. However, a nitrogendependent biphasic response pattern of
higher alcohol production involving a direct
positive relationship at low initial nitrogen
concentrations and an inverse relationship
at higher initial concentrations was
described for beer yeasts many years ago by
Ayrapaa (1967, 1968, 1971). Interestingly,
little attention has been directed toward this
phenomenon since these studies were

published. In fact, most of the recent studies
were performed using higher concentrations
of nitrogen (exceeding 100 mgN/L), with
which only an inverse response is usually
observed.
Moreover, we believe that our report is the
first to describe comprehensively the
behavior of isoacid production in response
to different initial nitrogen concentrations.
The nitrogen-dependent common trend for
production of isoacids and higher alcohols
suggests that their metabolism and
production may be coordinated as reported
previously (Nordstrom, 1964; Reazin et al.,
1970). On the other hand, we suggest that
the significantly higher production of
higher alcohols and isoacids by M522 could
reflect a less efficient usage of nitrogen,
resulting in an increase of carbon flux
related to branched-chain amino acid


một số chúng có thể không góp phần vào
các đặc điểm cảm quan của loại rượu ở
nồng độ nghiên cứu. Đây là trường hợp của
ethyl decanoate, 1-propanol và γ
-butyrolactone. Tuy nhiên, từ quan điểm
hóa học, một số thay đổi đáng quan tâm
trong biểu hiện của cả hai chủng cho tất cả
các hợp chất được nghiên cứu có thể đóng

góp cho sự phân biệt hóa học nấm nem nếu
nồng độ nitơ thích hợp được sử dụng trong
môi trường hóa học xác định. Trong trường
hợp sản xuất alcohol bậc cao, ngoại trừ 1propanol, phản ứng với nồng độ nitơ đầu có
sự khác nhau giữa các báo cáo, nhưng, nói
chung, được mô tả bởi một mối quan hệ
nghịch đảo. Tuy nhiên, một mô hình phản
ứng hai giai đoạn phụ thuộc vào nitơ của
sản xuất alcohol bậc cao bao gồm một mối
quan hệ tích cực trực tiếp của nồng độ nitơ
ban đầu thấp và một mối quan hệ nghịch
đảo ở nồng độ ban đầu cao hơn đã được mô
tả cho nấm men sản xuất bia nhiều năm
trước bởi Ayrapaa (1967, 1968, 1971). Điều
đáng quan tâm là sự chú ý đã ít được hướng
về hiện tượng này khi những nghiên cứu
này được công bố. Trong thực tế, hầu hết
các nghiên cứu gần đây được thực hiện với
nồng độ nitơ cao hơn (vượt 100 mgN/L),
mà chỉ là một phản ứng nghịch mới quan
sát thấy.
Hơn thế nữa, chúng tôi tin rằng báo cáo của
chúng tôi là báo cáo đầu tiên mô tả toàn
diện các biểu hiện sản xuất isoacid để đáp
ứng với nồng độ nitơ ban đầu khác nhau.
Xu hướng chung của sản xuất isoacids và
alcohol bậc cao phụ thuộc vào nitơ cho thấy
rằng sự trao đổi chất và sản xuất của chúng
có thể được phối hợp như báo cáo trước
(Nordstrom, 1964; Reazin et al, 1970). Mặt

khác, chúng tôi cho rằng việc sản xuất cao
hơn đáng kể của alcohol bậc cao và isoacids
bởi M522 phản ánh việc việc sử dụng nitơ
kém hiệu quả, dẫn đến sự gia tăng của khí
carbon liên quan đến chuyển hóa chuỗi
nhánh amino acid

metabolism by this strain. These model
strains would be useful for further studies
for a better understanding of the different
genetic (BAT and ARO genes) and/or
physiological
[NAD(P)H/NAD(P)
balances] adaptations that could explain the
differences found here. Our results suggest
that KU1, which produces less higher
alcohols and isoacids at all the nitrogen
concentrations tested, when compared with
M522, might regulate more effectively the
carbon flux at any given nitrogen
availability–resulting in the excretion of
less quantities of ‘carbon metabolic wastes’
(Ribereau-Gayon et al., 2000) from the cell
at all initial nitrogen concentrations.
In addition, the direct positive relationship
of these compounds at a low initial
concentration could be explained by the
very low yeast fermentation activity in this
situation, as shown in Fig. 2, which is
induced by the low biosynthetic capacity of

the cell. These results are in agreement with
the first gene expression analysis conducted
in an industrial strain (Backhus et al.,
2001), where, at a low nitrogen level (53
mgN/L) compared with a high nitrogen
level (400 mgN/L), cultures display greater
expression of genes involved in translation
and in oxidative carbon metabolism,
suggesting that respiration is more nitrogen
conserving than fermentation (Backhus et
al., 2001).
In contrast to other higher alcohols, 1propanol is known to be formed by the
condensation of pyruvic acid and acetyl
CoA (Nykanen, 1986). Our results are in
agreement with previous studies (Ayrapaa,
1968; Margheri et al., 1984); however, the
formation of 1-propanol varied in relation
to nitrogen level for the two strains (Fig. 4).
Strain M522 produced relatively higher
concentrations of 1-propanol at lower
nitrogen concentrations but relatively less at


của dòng này. Những chủng mô hình sẽ hữu
ích cho các nghiên cứu tiếp theo cung cấp
một sự hiểu biết tốt hơn về di truyền khác
nhau (gen BAT và ARO) và / hoặc đáp ứng
sinh học [cân bằng NAD(P)H / NAD(P)] có
thể giải thích sự khác biệt tìm thấy ở đây.
Kết quả của chúng tôi cho thấy rằng, KU1

sản xuất alcohol bậc cao và isoacids ít hơn
ở tất cả các nồng độ nitơ thử nghiệm, khi so
sánh với M522, có thể điều chỉnh hiệu quả
hơn sự chuyển đổi cacbon tại bất kỳ nồng
độ nitơ có sẵn-kết quả là lượng “chất thải
chuyển hóa carbon” (Ribereau-Gayon et al.,
2000) tạo ra ít hơn từ các tế bào ở tất cả các
nồng độ nitơ ban đầu.
Ngoài ra, mối quan hệ tích cực trực tiếp của
các hợp chất này ở nồng độ ban đầu thấp có
thể được giải thích bằng các hoạt động lên
men của nấm men rất thấp trong tình huống
này, được thể hiện trong Hình. 2, gây ra bởi
năng lực sinh tổng hợp thấp của các tế bào.
Các kết quả này phù hợp với các phân tích
biểu hiện gen đầu tiên được tiến hành trong
một chủng công nghiệp (Backhus et al.,
2001), ở mức nồng độ nitơ thấp (53
mgN/L) so với mức độ nitơ cao (400
mgN/L), dòng cho thấy sự biểu hiện cao
hơn của gen trong dịch mã và trong quá
trình chuyển hóa carbon oxy hóa, cho thấy
hô hấp bảo tồn nitơ hơn lên men (Backhus
et al., 2001).
Ngược lại với alcohol bậc cao khác, 1propanol được hình thành bởi sự ngưng tụ
của acid pyruvic và acetyl CoA (Nykanen,
1986). Kết quả của chúng tôi đồng thuận
với các nghiên cứu trước đó (Ayrapaa,
1968; Margheri et al., 1984); Tuy nhiên, sự
hình thành 1-propanol của hai chủng thay

đổi liên quan đến lượng nitơ (Hình. 4).
Chủng M522 sản xuất được lượng 1propanol tương đối cao ở nồng độ nitơ thấp
nhưng sản xuất tương đối ít hơn ở

higher nitrogen levels. This reversal in
production in relation to nitrogen
availability does not appear to have been
reported before. Moreover, fact that the
relative concentration of 1-propanol
produced in response to nitrogen is
generally reversed for ethyl acetate with
respect to each of the strains would be an
interesting topic for further research.
In addition, our results indicated an indirect
relationship between higher alcohol and
isoacid production and growth (see Figs 2a
and 3a). The effect of some aromatic
alcohols, such as tryptophol, isoamyl
alcohol and b-phenylethyl alcohol, acting as
auto-signaling molecules capable of
stimulating morphogenesis in S. cerevisiae
(Hazelwood et al., 2008), may explain this
behavior. Furthermore, a quorumsignaling
pathway linking environmental sensing and
entry into the stationary phase in S.
cerevisiae has been described recently
(Chen & Fink, 2006). As can be seen in our
data, these results might help to explore the
occurrence of other putative quorumsensing molecules in S. cerevisiae.

Production of esters and fatty acids
Yeasts synthesize fatty acids by the
hydrolysis of the acylCoA derivatives and
esters by esterification of activated fatty
acids and alcohols. The results obtained
here showed a clear metabolic correlation
between these compounds (Fig. 5). Acetate
esters are described as having fruity aromas
and are considered as pleasant flavors from
a sensory point of view (Smyth et al.,
2005). The results obtained in the present
work may provide an explanation for the
more pleasant sensory character of the
wines obtained with KU1 at a low nitrogen
concentration compared with M522, which
are also in agreement with the OAVs shown
in Table 1.


mức độ nitơ cao. Sự đảo ngược trong sản
xuất liên quan đến khí nitơ sẵn có này
không xuất hiện ở các báo cáo trước. Hơn
thế nữa, thực tế là các nồng độ tương đối
của 1-propanol sản xuất để đáp ứng với
nồng độ nitơ thường ngược với ethyl
acetate ở mỗi chủng sẽ là một chủ đề thú vị
để nghiên cứu thêm.
Ngoài ra, kết quả của chúng tôi cho thấy
một mối quan hệ gián tiếp giữa sản xuất
alcohol bậc cao và isoacid với tăng trưởng

(xem các Hình 2a và 3a). Tác dụng của một
số loại rượu thơm, như tryptophol, isoamyl
alcohol và b-phenylethyl, hoạt động như
các phân tử tự động phát tín hiệu có khả
năng kích thích hình thái trong S. cerevisiae
(Hazelwood et al., 2008), có thể giải thích
hiện tượng này. Hơn nữa, con đường phân
tử tín hiệu kết nối cảm biến môi trường và
đi vào pha tĩnh trong S. cerevisiae đã được
mô tả gần đây (Chen & Fink, 2006). Như
có thể thấy trong dữ liệu của chúng tôi,
những kết quả này có thể giúp khám phá sự
xuất hiện của các phân tử tín hiệu cảm ứng
giả định khác trong S. cerevisiae.

Sự sản xuất este và các acid béo
Nấm men tổng hợp các acid béo bằng thủy
phân các dẫn xuất của acyl-CoA, tổng hợp
các este bằng este hóa các acid béo và
alcohol đã hoạt hóa. Các kết quả ở đây cho
thấy một cách rõ ràng sự chuyển hóa tương
quan giữa các hợp chất (hình 5). Este
acetate có mùi hương của trái cây và được
xem là một mùi hương dễ chịu theo cảm
quan (Smyth et al., 2005). Những kết quả
thu được trong nghiên cứu hiện nay có thể
đưa ra lời giải thích cho những đặc tính dễ
chịu của các loại rượu thu được với KU1 so
với M522 ở nồng độ nitơ thấp, điều này
đúng với OAVs thể hiện trong bảng 1.

The behavior of strain KU1, in which
higher concentrations of these compounds
are produced when nitrogen availability is
low, contradicts the concept raised in many
reports stating that the increase in ester
production is directly related to the increase
of nitrogen in the must. On the other hand,
this contradictory behavior of KU1 could
also explain why several studies did not
observe a consistent correlation between
YAN grape musts and esters and fatty acid
concentration (Rapp & Versini, 1996;
Lambrechts & Pretorius, 2000). Esters and
fatty acids have also been considered
‘metabolic wastes’ with a potentially toxic
effect on the cell (Peddie, 1990). A limited
production of these compounds by KU1 at a
high nitrogen concentration compared with
M522 can be understood as an efficient
behavior of this strain in relation to nitrogen
usage. More interestingly, the profiles of
fatty acids and esters obtained with KU1
are quite similar to the higher alcohol and
isoacid profiles shown in Fig. 3a, b.

Production of -butyrolactone, 3methylthio-1- propanol and ethyl 4hydroxybutanoate
Limited information about the production
of these compounds by yeast can be found
in the literature. Although -butyrolactone

was characterized as being negatively
related to YAN level in grape must (Bosso,
1996), our results, which were obtained
over a very wide range of nitrogen
concentrations, showed a direct relationship
with low nitrogen levels. Such low nitrogen
levels have not been considered in other
reports. The profile of -butyrolactone
production also resembles that of higher
alcohols and isoacids. The relation of
-butyrolactone
with
ethyl-4hydroxybutanoate production was proposed
previously (Muller et al., 1973) however, an
important strain difference was observed


Những hoạt động của dòng KU1, trong đó
các hợp chất được tạo ra với nồng độ cao
khi nitơ có sẵn thấp, mâu thuẫn với khái
niệm được nêu ra trong các bản báo cáo nói
rằng sự tăng các sản phẩm este chắc chắn
liên quan trực tiếp với sự tăng của nitơ. Mặt
khác, những biểu hiện mâu thuẫn này của
KU1 cũng có thể giải thích tại sao một số
nhà nghiên cứu đã không quan sát mối
tương quan thích hợp giữa YAN trong nước
ép nho với este và nồng độ acid béo (Rapp
& Versini, 1996; Lambrechts & Pretorius,
2000). Este và acid béo cũng được xem là

“chất thải chuyển hóa” có khả năng gây độc
cho tế bào (Peddie, 1990). Sự hạn chế sản
xuất các hợp chất bởi KU1 tại nồng độ nitơ
cao so với M522 có thể được hiểu như là
biểu hiện hiệu quả của chúng trong việc sử
dụng nitơ. Đáng quan tâm hơn, những cấu
hình của acid béo và este thu được ở KU1
khá tương tự alcohol bậc cao và nồng độ
của isoacid được thể hiện trong hình 3a,b.

Sự sản xuất -butyrolactone, 3methylthio-1-propanol and ethyl 4hydroxybutanoate
Thông tin hạn chế về việc sản xuất các hợp
chất bởi nấm men có thể được tìm thấy
trong tài liệu. Mặc dù đặc trưng
-butyrolactone không liên quan đến mức độ
YAN trong nước ép nho (Bosso, 1996),
theo kết quả của chúng ta, thu được trên
phạm vi nồng độ nitơ rộng, cho thấy mối
quan hệ với nồng độ nitơ thấp. Lượng nitơ
thấp như vậy đã không được xem xét trong
các bài báo khác. Các thông tin về việc sản
xuất -butyrolactone cũng giống với các
alcohol bậc cao và isoacid. Mối quan hệ
giữa việc sản xuất -butyrolactone và ethyl
4-hydroxybutanoate đã được đề xuất trước
đây (Muller et al., 1973); tuy nhiên, một sự
khác biệt quan trọng đã được quan sát

for KU1 in ethyl-4-hydroxybutanoate
production.

Recently,
3-methylthio-1propanol production was described to be
negatively related to the nitrogen
concentration of the medium (Moreira et
al., 2002). However, our results showed a
different behavior for M522 at lower
nitrogen levels, indicating a positive
relation with this thioalcohol (Fig. 6b),
which is more consistent with the general
behavior of higher alcohols shown in Fig. 3.
In summary, depending on the yeast strain
utilized, the formation of aroma compounds
presented different responses when nitrogen
was added to the medium. Nitrogen
addition could also decrease ester and fatty
acid concentration during fermentation of a
strain, such as KU1, a phenomenon not
described previously to the best of our
knowledge.
From a chemical point of view, in our
artificial medium, it was possible to obtain
a clear discrimination between both model
strains evaluated through the analysis of
key
compounds
produced
after
fermentation like higher alcohols, fatty
acids, ethyl esters and lactones. Major
differences between strains in relation to

aroma compound concentrations were
obtained at a higher nitrogen level (400
mgN/L). Based on these two strains and the
appropriate conditions determined in this
work, our results will allow the
development of data models for metabolic
footprinting methods for industrial yeast
strain discrimination.
From a biotechnological point of view, the
results obtained had shown a better
adaptation of strains such as KU1 for the
fermentation of grape varieties with
considerably variable character such as
most of the red Vitis vinifera and some
white grapes such as Sauvignon Blanc,
Chardonnay, Riesling and Muscats.


ở KU1 trong sản xuất ethyl 4hydroxybutanoate. Gần đây, sản xuất 3methylthio-1-propanol được biết là không
liên quan đến nồng độ nitơ trong môi
trường (Moreira et al., 2002). Tuy nhiên,
kết quả của chúng tôi cho thấy một biểu
hiện khác của M522 tại nồng độ nitơ thấp,
chỉ ra một mối liên quan với thioalcohol
(hình 6b), phù hợp hơn với các biểu hiện
chung của alcohol bậc cao trong hình 3.
Tóm lại, tùy thuộc vào chủng nấm men sử
dụng, sự hình thành các hợp chất thơm đã
đưa những câu trả lời khác nhau cho việc
nitơ được thêm vào môi trường. Nitơ được

thêm vào cũng có thể làm giảm nồng độ
este và acid béo trong suốt quá trình lên
men của chủng, như KU1, một biểu hiện
không được mô tả trước đây đem đến kiến
thức tốt nhất cho chúng tôi.
Từ tầm nhìn của hóa học, trong môi trường
nhân tạo của chúng tôi, đã có thể có được
sự phân biệt rõ ràng giữa việc đánh giá mô
hình 2 chủng thông qua việc phân tích các
hợp chất quan trọng được sản xuất sau quá
trình lên men như alcohol, acid béo, ethyl
ester và lactone. Sự khác nhau chủ yếu giữa
các chủng liên quan đến nồng độ các hợp
chất thơm được tạo ra tại mức nitơ cao (400
mgN/L). Dựa trên 2 chủng và các điều kiên
thích hợp được xác định trong nghiên cứu
này, kết quả của chúng tôi sẽ cho phép sự
phát triển các mô hình dữ liệu cho các
phương pháp đã có trước đó của ngành
công nghiệp phân biệt các chủng nấm men.

Từ tầm nhìn công nghệ sinh học, kết quả
thu được cho thấy một sự thích nghi tốt hơn
của các chủng như KU1 cho quá trình lên
men của nhiều loại nho với các đăc tính
biến đổi như phần lớn Vitis vinifera đỏ và
một vài nho trắng như Sauvinon Blanc,
Chardonnay, Riesling và Muscaft.

On the contrary, strains like M522 would be

more suitable for fermentation of neutral
varieties, in which fermentation aromas
such as esters and fatty acids would
contribute toward improving the fruity
intensity of the wine when the nitrogen
level of these grape musts is increased.

Acknowledgements
We would like to thank Prof. Patrick Moyna
and Dr Carina Gaggero. for the critical
comments made for this manuscript.
We would also thank PDT, INIA and CSIC
of UdelaR for financially supporting this
project.