Sự tái sinh trong in vitro của hypericum preforatum l sử dụng thidiazunron và phân tích ổn định gene tái sinh

SỰ TÁI SINH TRONG IN VITRO CỦA HYPERICUM PREFORATUM L. SỬ
DỤNG THIDIAZUNRON VÀ PHÂN TÍCH ỔN ĐỊNH GENE TÁI SINH.
Arpita Banerjee, Subhendu Bandyopadhyay and Sarmistha Sen Raychaudhuri.
Plant Tissue Culture and Molecular Biology Laboratory Department of Biophysics, Molecular Biology and Bioinformatics
University of Calcutta, Kolkata 700 009, India
Received 7 August 2010; revised 21 December 2010; accepted 12 February 2011


NỘI DUNG:
Hypericum preforatum L.
1.

Mục tiêu.
2.

Vật liệu – phương pháp.
3.

Kết quả.
4.

Kết luận.
5.


1. Hypericum preforatum L.

• Hypericum preforatum L. có khả năng chống vi rút, chống bị
nhiễm, chống ung thư, và chống suy nhược.

• Sống ở vùng có độ cao 1000 – 2500m.

2. Mục tiêu.



Khảo sát tác dụng của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong quá trình tái sinh H. preforatum.

 Đánh giá ổn định gen của cây tái sinh đang phát triển có sự hiện diện TDZ sử dụng RAPD và PCR-PFLP.


2. Phương pháp và vật liệu.

 vật liệu:
Trong tái sinh cây con.

Vùng hạ diệp của cây con nuôi cấy trên môi
trường MS với 3% sucrose từ hạt giống.

Trong phân tích ổn định gen.

Mô lá được cô lập từ một phần ngẫu nhiên của cây mẹ và 10
cây tái sinh trong môi trường MS bổ sung 1 mg/l TDZ




Phương pháp:

 TÁI SINH H.preforatum.

1: MS + 1mg/l 2,4D + 1mg/l Kn

2: MS + 1mg/l 2,4D + 0,5mg/l Kn

Tạo
mô
sẹo:

3: MS + 0,5mg/l 2,4D + 1mg/l Kn

4: MS + 0,5mg/l NAA + 1mg/l BAP

5: MS + 1mg/l NAA + 1mg/l BAP

6: MS + 1mg/l NAA + 0,5mg/l BAP

Với 5 lần lặp lại và toàn bộ thí nghiệm làm 2 lần. Sau 4 lần cấy chuyền, mô sẹo được chuyển sang môi trường tạo chồi.


Tạo chồi
1: MS +1mg/l TDZ
2: MS +1mg/l TDZ +1 mg/l IAA
3: MS +1mg/l BAP
4: MS +1mg/l BAP + 1 mg/l IAA

Nhiệt độ 25± 2oC,

Tạo rễ
1: MS + 1 mg/l IAA

độ ẩm
55 ± 2% dưới ánh sáng

2: MS + 2 mg/l IAA

cường độ 326108 mol/sm,

3: MS + 4 mg/l IAA

chiếu 16/8h sáng/ tối.

4: MS + 1 mg/l NAA
5: MS + 2 mg/l NAA
6: MS + 4 mg/l NAA




Trong phân tích ổn định gen:

Phân tích đa hình bằng kỹ thuật PCR-RAPD:

25µl {1x PCR dung dịch đệm, 2 mM MgCl2, 0,2 mM hỗn hợp dNTP, 0,2 mM RADP primer và 0,5 U Taq DNA polymerase
và 25 ng mẫu H. preforatum }

94oC trong 5 phút
94oC trong 1 phút
36oC trong 1 phút
72oC trong 2 phút

45 chu kỳ

72oC trong 5 phút

Điện di trên agar 1.5 % trong 1 x TAE đệm. Và ethidium bromide làm thuốc nhộm phát huỳnh quang.


Phân tích ITS:

Khuếch đại bằng PCR

25 µl {dung dịch hỗn hợp đệm gồm 1x PCR phản ứng đệm, 2 mM MgCl2, 0,1 mM hỗn hợp dNTP, 5 mM primer và 1.0 U
Taq DNA polymerase và 25 ng mẫu DNA }

o
98 C trong 2 phút
o
94 C trong 1 phút
o
58 C trong 30 giây
o
72 C trong 1 phút

35 chu kỳ

o
72 C trong 5 phút

Tinh chế PCR-Clean up kit

Cắt bởi enzyme (REs): EcoRV, ClaI và HpaII

Phân loại sản phẩm bằng điện di trên gel Agar 2% với dòng điện 65V, phẩm màu ethidium bromide và chụp
ảnh lại.


Chọn vùng ITS của cây mẹ và cây tái sinh từ cảm ứng với 1 mg/L TDZ đã được nhân lên gắn vào

•

Chọn dòng nhân lên và tiến hành tách chiết DNA plasmid

•

Xác định trình tự bằng cách sử dụng máy phân tích trình tự tự động ABI3130 và mồi M13.

•

vector pTZ57R / T bằng cách sử dụng Ins T/Aclone

TM

PCR Cloning Kit biến nạp vào E.coli XL1-

Nhân dòng và trình tự của vùng ITS:

Blue.


4. Kết quả:

 Cây tái sinh trong in Vitro.
Tỷ lệ cytokinin/auxin cao ảnh hưởng đến tăng trưởng mô sẹo.

Tạo mô sẹo

Tạo chồi


TẠO RỄ

Mô sẹo tăng trưởng cao nhất đã được quan sát trong môi trường có chứa 0,5 mg/ L 2,4-D và 1 mg/L Kn.
1 mg/l TDZ được chứng minh là PGR tốt nhất trong số các nồng độ để tạo chồi.
Tạo rể 2 mg/l IAA là nồng độ hiệu quả nhất, theo sau 4 mg/l IAA.





Nghiên cứu tính ổn định di truyền.

RAPD ( random aplified polymorphic DNA): kĩ thuật khuếch đại ngẫu nhiên đa hình DNA.
RFLP ( restriction fragment length polymorphism): kĩ thuật nghiên cứu tính đa hình chiều dài đọan DNA dựa trên điểm cắt các enzyme giới
hạn.
Enzyme cắt giới hạn (REs) EcoRV, ClaI và HpaII.
Vùng nrITS ( nuclear ribosomal internal transcribed spacer) ( bao gồm vùng ITS1, 5.8S và ITS2) là vùng gen dùng cho sự phân loại các cấp loài
thậm chi trong loài bởi cấp độ cao của biến dị.
Mồi dùng cho RAPD : mồi xuôi 17SE (5’ ACG AAT TCA TGG TCC GGT GAA GTG TTC G 3’) và mồi ngược 26SE (5’ TAG AAT TCC CCG
GTT CGC TCG CCG TTA C 3’).

*Phản ứng khuếch đại RAPD.

15 đoạn mồi RAPD sử dụng khuếch đại DNA cây
mẹ và các cây tái sinh từ môi trường bổ sung 1 mg/l
TDZ được chọn ngẫu nhiên



* Phân tích ITS.

Toàn bộ vùng nrITS,bao gồm ITS1, 5.8S và ITS2, đã
được khuếch đại bằng cách sử dụng mồi 17SE và 26SE,
mỗi đoạn có kích thước khoảng 930 bp. Chiều dài vùng
nrITS của cây mẹ và cây tái sinh được so sánh không
khác nhau(Hình b).


Sử dụng PCR-RFLP để phân tích
vùng nrITS.


Sử dụng các enzyme cắt giới hạn:

•EcoRV

•HpaII

• ClaI

BLAST cho thấy sự tương đồng giữa hai
trình tự là 99%.
Nucleotides từ cả hai mẫu cũng cho thấy tương
đồng gần như hoàn hảo vùng ITS1 và ITS2 trong
quá trình phân tích trình tự bằng CLUSTAL W
(Hình a & b).


Thảo luận:

Sự điều hoà in vitro của thực vật có thể dẫn đến sự sinh sản vô tính đồng nhất với kiểu hình và kiệu gen cây mẹ. Tuy nhiên, trong
một số trường hợp chất điều hoà thực vật tỏ ra lệch hướng so với cây mẹ gọi là biến thể soma
TDZ cũng có vai trò tổng hợp polyphenyl urea như là 1 cytokinin mạnh.Dưới sự ảnh hưởng cùa chất điều hoà sinh trưởng thực
vật có một số khả năng gây ra sự biến đổi di truyền trong cây con tái sinh.
Vì vậy trong những nghiên cứu gần đây, những DNA của cây mẹ cũng như các cây con tái sinh được nghiên cứu bằng cách sử
dụng các phân tử đánh dấu như các kĩ thật RAPD và PCR-RFLP. Kĩ thuật RADP marker được nghiên cứu về biến dị DNA trong nuôi cấy
tăng trưởng thực vật.


Vùng nrITS ( bao gồm vùng ITS1, 5.8S và ITS2) là vùng gen dùng cho sự phân loại các cấp loài thậm chí trong loài bởi
cấp độ cao của biến dị nên được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu biến dị thậm chí trong các loài gần nhau.
Trong nghiên cứu hiện nay, sự khuếch đại và PCR-RFLP vùng nrITS của cây mẹ và cây tái sinh với 3 enzyme cắt giới hạn
EcoRV, ClaI và HpaII, tạo ra 1 chuỗi mẫu.
Phân tích chuỗi đa hình bằng CLUSTAL W của cây mẹ và cây tái sinh cũng cho thấy tính tương đồng trong vùng ITS1 và
ITS2.


Kết luận

Sử dụng các kĩ thuật RAPD và RFLP đối với vùng nrITS cho thấy không có sự khác nhau

trong gen của cây mẹ và cây tái sinh.
Phân tích chuỗi đa hình bằng CLUSTAL W cho thấy sự tương đông trong vùng ITS1 và
ITS2 của cây mẹ và cây tái sinh
→ Chứng minh sự bền của DNA trong cây con tái sinh


Click
Clickicon
iconto
toadd
addpicture
picture

Tài liệu tham khảo:

Arpita B, Subhendu B & Sarmistha S R, 2011. In vitro regeneration of Hypericum perforatum L. using thidiazuron and
analysis of genetic stability of regenerants.


Cám ơn thầy và các bạn đã theo dõi.

The end.