TẠO DÒNG PHÂN tử và PHÂN TÍCH CHỨC NĂNG của ENZYME BERGAPTOL o METHYLTRANSFERASE từ cây BẠCH CHỈ (ANGELICA DAHURICA) và ỨNG DỤNG TRONG sản XUẤT một CÁCH HIỆU QUẢ CHẤT BERGAPTEN TRONG e COLI (shu chin LO, pei en chung và co sh

TẠO DÒNG PHÂN TỬ VÀ PHÂN TÍCH CHỨC NĂNG CỦA ENZYME
BERGAPTOL-O-METHYLTRANSFERASE TỪ CÂY BẠCH CHỈ (ANGELICA
DAHURICA) VÀ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT MỘT CÁCH HIỆU QUẢ CHẤT
BERGAPTEN TRONG E.COLI (Shu-chin LO, pei-en Chung và Co-shine Wang)
Shu-Chin LO1,2,Pei-En CHUNG2, vàCo-Shine WANG1,*
1

Học việnCông nghệ sinh học, Đạihọcquốc gia ChungHsing, Taichung40.227, Đài Loan
SởPhòngHóa họcNông nghiệp, Việnnghiên cứu nông nghiệpĐàiLoan, Taichung41.362,
Đài Loan
2


TÓM TẮT.Bạch chỉ từ lâu đã được sử dụng làm kem dưỡng trắng da, do có chứa hợp
chất 8-hydroxybergapten, là sản phẩm hydroxylate từ chất bergapten nhờ enzyme 5-omethyltransferase (BMT) phân cắt chất bergaptol trong cây bạch chỉ. DNA bổ sung mã
hoá BMT được dòng hoá từ rễ cây bằng cặp mồi thoái biến ở vùng chứa mã bảo tồn cao
của O-methyltransferase từ những cây khác. phân tích RT-PCR đã chỉ ra mảnh đơn DNA
phù hợp cho trình tự AdBMT thu được. đoạn liên tục 5’ và 3’ nhanh chóng khuếch đại tạo
cDNA thông qua phương pháp PCR sử dụng để thu đựơc đoạn cDNA đầy đủ. cDNA của
AdBMT chứa một ORF dài 1080bp mã hóa cho polypêptide của 359aa và khối lượng là
39kDa, pI là 5.9 . phương pháp sắp gióng trình tự đã tiết lộ sự tương đồng của AdBMT so
với OMTs của những loài khác. Đoạn AdBMT chứa vùng bảo tồn I-V tương tự như
OMTs của những loài khác. Liên kết His-AdBMT được biểu hịên ở E.coli và được làm
sạch bằng cách tủa trong ammonium sulfate. Đoạn tái tổ hợp của AdBMT hầu hết hoạt
động ở trong môi trường có chứa đệm kali phosphate ở pH 7.5 và iử 35độC. enzyme
không cần ion cofactor hoá trị 2 để hoạt động, mặt khác, nồng độ ion của Cu2+, Ni2+,
Co2+ dù chỉ rất thấp (0.1mM) đủ gây ức chế hoàn toàn enzyme. Cách sản xuất bergapten
đơn giản và hiệu quả là biểu hiện vượt mức AdBMT trong nuôi cấy vi khuẩn E.coli.
lượng bergapten thu được cao gấp 13 lần lượng hợp chất thu từ sản phẩm làm sạch mảnh
vỡ trong ammoni sulfate. Bằng cách bổ sung bergaptol trong môi trường nuôi cấy E.coli
đã hứa hẹn một phương pháp đầy tiềm năng trong việc sử dụng bioreactor để sản xiất

bergapten. (tìm hình cây bạch chỉ)
Từ khóa:Bạch chỉ; Bergapten; Bergaptol5-O-methyltransferase, nhân bản cDNA, hoạt
động củaenzyme.
Viết
tắt:BMT,bergaptol5-O-methyltransferase,
cDNA,
DNA
bổ
sung;
EDTA,axitethylenedi-aminetetraacetic; IPTG, isopropyl β-D-thiogalactopyranoside;
NTA, axitnitrilotriacetic; OMT,O-methyltransferases; PAGE,điện dipolyacrylamide;
RT-PCR, phản ứng chuỗipolymerasesao chép ngược, RACE, khuếch đạinhanh
chóngcủa điểm kết thúccDNA; SAM,S-adenosyl-L-methionine, SDS-PAGE, sodium
dodecylsulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis, UPLC, siêusắc ký lỏnghiệunăng.


GIỚI THIỆU
Sự Methyl hoá các hợp chất tự nhiên bằng S-adenosyl-L-methionine (SAM) phụ thuộc
O-methyltransferases (OMTs) là cách chuyển đổi phổ biến trong các phản ứng tổng hợp
trong tự nhiên. Trong thực vật, O-methyl hoá cần thiết cho sự tổng hợp furanocoumarin
mạch thẳng. furanocoumarin được tổng hợp từ con đường phenylpropanoid được xem
như một phytoalexin hoặc là sự phòng thủ chống lại vi sinh vật tấn công ((Tietjen et al,
1983;Kueteet al, 2007;. Alexandervà cộng sự, 2008) các hợp chất mạch thẳng phong phú
của furanocoumarin có thể kể đến là psolaren, bergapten, xanthotoxin và isopimpinellin,
tất cả các chất trên đều là các chất có hoạt tính sinh học. con đường tổng hợp của các hợp
chất furanocoumarin được phát hoạ bởi…. mặc dù những nghiên cứu về trình tự mã hoá
cho quá trình hydroxyl hoá và O-methyl hoá psoralen để tạo thành chất isopimpinellin
vẫn chưa được phát hiện. bergaptol được BMT chuyển thành bergapten, tương tự với sự
biến đổi OMTs bằng cách xử lý với elicitor của tế bào Ammi majus, và gần đây là với tb
nuôi cấy của Glehnia littoralis. Vì BMT được biểu hiện chủ yếu trong tế bào nuôi cấy của

G.littoralis, người ta cho rằng tế bào nuôi cấy có thể sử dụng như một bioreactor đầy tiềm
năng để sản xuất bergapten bằng cách cung cấp psolaren. Bergapten hơn nữa đựơc
chuyển thành 8-hydroxybergapten có thể ức chế tyrosinase của nấm, sự sức chế đó mạnh
hơn cả kojic acid và arbutin – hai chất ức chế tyrosinase được sử dụng rộng rãi trong mỹ
phẩm trắng da. (Piao etal, 2004)
OMT của cây được phân loại thành 2 nhóm lớn (…)
-

Nhóm I: gồm các loại OMT có trọng lượng phân tử thấp (13-27kDa), hoạt động
phụ thuộc Mg2+
Nhóm II: gồm các loại OMT có trọng lượng cao (38-43 kDa) và họat động không
cần Mg2+

Hầu hết các OMT đều thuộc nhóm 2 bao gồm acid caffeic, flavonoid, coumarin và
alkaloid OMT (Kutchan, 1999; Donget al, 2003), trong đó enzyme BMT thuộc về
OMT nhóm II. Một số gene OMT thực vật mã hoá cho toàn thể cấu trúc của OMT
chứa 5 vùng bảo tồn, 2 vùng trong đó (I và IV) được cho rằng có liên quan đến sự liên
kết với ion kim loại và SAM tương ứng. (tìm hình

-

Rễ khô của Angelica dahurica (Umbeliferae) tên là bạch chỉ là một vị thúôc quan
trọng trong trung y, nhiều coumarin được chiết từ rễ bạch chỉ thể hiện tính kháng
vi sinh vật (Kwon etal, 1997). Chất 8-hydroxybergapten có bản chất là
furanocoumarin có tiềm năng ức chế tyrosinase từ nấm (Piao etal, 2004). do đó rễ


của nó được dử dụng để chữa các chứng bệnh về rối loạn sắc tố trên cơ thể và
đựơc ứng dụng nhiều vào ngành công nghiệp mỹ phẩm. vì chất 8hydroxybergapten có tác dụng làm trắng da nên các nghiên cứu hiện nay tập trung
định dạng enz BMT từ bạch chỉ để sản suất chất tiền phản ứng bergapten để tạo

chất 8hdxbgt làm trắng da. Việc nghiên cứu E.coli làm bioreactor để sản xuất
bergapten là cách nuôi cấy tuyệt vời đang được nghiên cứu nhiều hơn cả.


Vật liệu và phương pháp
Nguyên liệu thực vật
Vật liệu: cây bạch chỉ Angelica dahurica (Fish.) BENTH. Et HOOK đuợc trồng trên
ruộng. rễ được thu và đựơc bảo quản lạnh ngay trong nitơ lỏng và tất cả phần vật liệu
được sử dụng phải cất trữ ở -80oC.
Hình 1. Con đường sinh tổng hợpcủabergaptenvà8-hydroxybergapten
Nhân bản cDNA
Tổng số RNA được phân lập từrễ 3tháng tuổicủaA.Dahurica. Những đoạncDNAđược tạo
ra
bởiphản
ứngphiên
mã
ngược
chuỗipolymerase
(RT-PCR)
khuếch
đạibằngcáchsửdụngmột cặpmồithoái hóađược thiết kế từhai trình tựbảo tồn
caocủaOMTsthực vật. Mồi5'-(5'-gtg/tgatgttggc/tggtggg/a/cactgga/t-3') nằm trongvùng
được bảo vệtrongkhimồi3' – primer (5'-ggg/atgcatcg/t/cc/tca/gac/tg/a/cacgtga/ggg-3')
trongvùng được bảo vệIInhư được chỉ ratrong hình 2.Những đoạncDNAtạo rađượcnhân
bản vô tínhởpGEM-T Easyvector (Promega, Madison, WI, Mỹ) vàđược sắp xếp theo
trình tựđể xác nhậndanh tính của chúng. Sự khuếch đại nhanh chóng 2 mạch song song5'và 3'- của điểm kết thúc trên cDNA
(RACE) thôngquaphản ứng chuỗi polymerase(PCR)đã được thực hiệntheohướng dẫn sử
dụngbộkhuếch đạiRACESMARTTMcDNA(các phòng thí nghiệmCLONTECH,Inc,
Mountain View,CA, USA) .Trình tự DNAhoàn chỉnh đã đượcxác định từcả hai
sợichènnhânbảnvớimộtmáy phân tíchABI3730XLDNA(FosterCity, CA, USA)bởi Sứ

mệnhCông ty TNHHMission Biotech(Đài Bắc, Đài Loan). Sự liên kếtchuỗiđượcđạt được
bằng cách sử dụngVectorNTISuite 8chương trình (InforMax, Inc, Bethesda, MD, USA)
vàtìm kiếmtương đồngđã được thực hiệnvới chương trìnhBLAST(Altschul etal, 1997).
Biểu hiện vượt mức AdBMT và động năng chuyển hoá từ bergaptol thành bergapten
trong E.coli
Đoạn cDNAAdBMTmã hóakích thước đầy đủbao gồm một mẫuvàmột cặpmồi đặc hiệu
chogenAdBMT-over-f
(5
GTCGACCATATGGCAGAAATGAAAACTAG-3)có
chứamộtvị tríSalI, vàAdBMT-over-r (5-GCGGCCGCCTTCGAAAATTCCATAATC-3’)
cóchứamột vị tríNotIđãđượcsử dụng đểkhuyếch đạiPCR. MảnhAdBMT1,077bpdo đóđã
đượctạo dòngbằng trình tự cắt giới hạnSalI/NotIvào vectorbiểu hiệnpET32a(Novagen,
Madison, WI, USA). Saukhixử lývớiNdeI, mảnh6,5kb được tinh lọcvàtự nối lạiđể tạo
plasmid biểu hiện pET32a-AdBMT chứa gene AdBMTvới His-tag tạiđầu C-terminus.
PET32a-AdBMTa đã được chuyểnvàoE. coliBL21. Saukhibiến nạp,các tế


bàovikhuẩnđược nuôi cấytrong môi trườngLB(1% Bactotryptone, 0,5%chiết xuất từnấm
menBacto, và 170mMNaCl, pH 7.0) có chứaampicillin (50 µg/ml)ở 37°Ccho đến
khiOD600đạt từ0,6-0,8.Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) sau đó đã đượcthêm
vào để chonồng độ cuối cùng1mMvà các tế bàosau đó đượcủ ởđiều kiện nhiệt
độkhácnhaucho thêm trong 16 h.các tế bàothu đượcbằng cách ly tâmvà được dùng để
tách chiết proteinvà tinh chếenzymehoặchuyền phù trong25mlmôi trườngLBcó
chứaampicillin(50mg/ml) và100µMbergaptolvàủthêm24 giờở 25°C.Sau khily tâm, phần
nổiđượcsửdụngđể trích xuấtbergaptencho đo bằngphương pháp sắc kýlỏngsiêuhiệu suất
(UPLC).Bergaptenthu được đượcchuẩn hóatrên cơ sởcủacácphần bằng nhaucủa các tế
bàovi khuẩn E. coli(trọng lượng ướt). Chỉ cóE. colimang gene biểu hiện vựơt mức
AdBMT phát triểnở nhiệt độcảm ứngtối ưuđã được thực hiệnđể phân tíchđộng học. Thời
gianủbệnhkéodàitừ24đến48h. (tìm hình vector ET32a,)

Hình 2.Nucleotide và chuỗi amino acid dự
đoáncủacDNA AdBMT xác định từ A.dahurica.(A)Số
lượng của chuỗinucleotidevàchuỗi axit aminđượcchỉ
raở
bên
phải.Cácchữ
in
đậm
trongchuỗinucleotidechothấycác codonmở đầu và kết
thúc. Haimồithoái hóađược chỉ địnhbằng các mũi tên.
Các tín hiệupolyadenylationđượcgiả địnhbởi gạch
chân đôi.Điểm kết thúcdịchmã được đánh dấu
bằngdấu hoa thị(B)RT-PCRđược thực hiện trêntổng số
RNAđượcphânlậptừrễA.dahurica.
Trình
tựcủaAdBMTđượckhuếch đạibằng cách sử dụng
mộtcặpmồi thoái hóa được chỉ định.
sắc ký lỏngsiêu giới hạn (tìm hình về hệ thống này)
Sau khi ly tâm, 5 mldịch nổi được thu nhậnvàtrộnlẫnvới etyl axetat(1 ml)vàly tâm
ở16.000vòng trong 2 phút. Sau khidư lượngđượchòa tan trongmethanol(0,3 ml), đem


dịch bay hơi trong chân không và thu lấy chất rắn. Bergaptolvàbergaptensau đó
đượcđotrongcáckhoảng thời gianchỉ địnhbởiUPLC.
Sản
phẩm
phản
ứng
đượcphântíchbằnghệ

thốngWatersACQUITYTMUPLC(WatersCrop,Milford,MA,USA)chứa mộtcực góp tự
độnglàm mát, một cột chứa thiết bị làm nóngchophépkiểm soát nhiệt độcủa
cộtphântíchvàmột đầu dò mẫuphotodiode. Mỗi lần tiêm5μlsản phẩmđược hoà tan trong
methanol nạpvàomột cộtBEH(2,1mm ×18 cm, 1,7 μm)C18vàgiải hấp vớimột hỗn
hợpnước/axetonitril(70/30) bằng máy bơmUPLCở tốc độ dòng chảylà 0,25ml/
phút.Cộtđược duy trì trongmột cái lò ở40ºC.Phát hiệnởbước sóng 254 nm. Sản phẩm
phản ứngđược xác địnhvàđếm số lượngthành 2 bản. Bergaptoltinh khiết (Xác thực)
(ChromaDex, Inc, Irvine, CA,USA)vàbergapten(Sigma-Aldrich Chemical Co, St
Louis,MO,USA)đãđượcsử dụng như lànhững hóa chất tiêu chuẩn. Dữ liệu đượcthuthậpvà
xử lý bởiphần mềmsắc kýMassLynx(Waters cây trồng, Milford,MA,USA).
SDS-PAGE và phương pháp miễn dịchthấm
Đối vớiphân đoạnprotein, các tếbàođượcthuthậptừ16°C đượccố địnhtrong200mMđệmkali
photphat(pH7,5)cóchứa10mMaxitethylenediaminetetraacetic(EDTA), phá màng bằng
sóng âmvàly tâm16.000vòng trong 5phút ở4ºC.Tổngproteintrongnổiđã được trộn lẫnvới
bộ đệmmẫu2x[2% (w/v)sodiumdodecylsulfate (PAGE) và 4% (v/v) 2mercaptoethanol]
vàphân đoạn[12%(w/v)SDS-polyacrylamide gel(PAGE). Sau khi điện di, gel đượcnhuộm
màu với0,25%xanh CoomassieR-250, 10%acetic acid, và5%ethanoltrong 4 giờ, và khử
màuvới
axit
axetic10%
và20%ethanolhoặcelectroblottedlênnitrocellulose(0,45
μm,SartoriusStedim, Biotech, Goettingen, Germany). Màng tế bàobị chặnở 37°Ctrong 1
giờtrongmột dung dịch chứa10 mMTris-HCl, pH7,5, 0,05%Tween-20, 150 mM
NaClvà5%sữa bộtkhông có chất béo.Màng đượcủ vớikháng thể khángHis-tag với pha
loãng1:1,000trong 2 hở 4°Csau đómàngđượcrửa sạch, ủ với kháng thểthứ
cấpphosphataseliên hợpkiềmtrong1 h ở4°C.Các điểm củaphức hợpkháng nguyên-kháng
thể hiện màu lên bởi sự phân tách bởialkaline phosphatasevới cơ chấtphosphate5-bromo4-chloro-3 indolylvà nitrobluetetrazoliumtrong một bộ đệmcarbonate(100mMNaHCO3, 1
mMMgCl 2, pH9,8). Nồng độ proteinđượcxácđịnhtheoBradford(1976)vớitiêu chuẩn của
albuminhuyết thanh bò (chả biết làm chi??)
Tinh chế enzyme vàthử hoạt tính

Để tinh sạch enzyme, các tế bào thu thập từ 16°C được cố định trong 200 mM đệm
phosphate kali (pH 7,5) có chứa 10 mM axit ethylenediaminetetraacetic (EDTA), phá
màng bằng sóng âm và ly tâm 16.000 vòng trong5 phút ở 4°C. vì cột Ni-nitrilotriacetic


acid (NTA) không thích hợp cho tinh chế BMT (Hehmann et al, 2004) nên tổng số
protein trong dịch nổi được phân đoạn bằng sự tủa ammonium sulfate mà từ đó
phầnprotein được thu thập ở độ bão hòa 40-50%. Protein trong phân đoạn này được hòa
tan trong 200 mM đệm phosphate kali (pH 7,5) và khử muối qua cột PD-10 (Amersham
Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA). Protein phân đoạn ammonium sulfate được
tiếp tục cô đặc bởi centricon-30 (Millipore, Billerica, MA, USA) và nồng độ của nó đã
được xác định. Mỗi phần nhỏ phải chịu sự thử nghiệm tính của enzyme.
Khảo nghiệm hoạt tính củaBMT (EC 2.1.1.69) như 1 báo cáo trước đó (Hehmann et al,
2004) với một số sửa đổi. Một cách ngắn gọn, hoạt tính củaBMT trong ống nghiệm được
đo thường xuyên ở 35oC trong một thể tích 200 μl đệm có chứa mM 200 phosphate kali,
pH 7,5, 1,25 mM bergaptol như một chất nền (Indofine Chemical Co, Somerville, NJ,
USA), và 9,6 μg protein tinh khiết tương ứng với hoạt động của 2,0 nkat BMT (hoạt động
cụ thể 0,21 kat/kg). Phản ứng được bắt đầu với việc bổ sung của SAM (5 mM) và chấm
dứt sau 90 phút ủ bằng cách thêm 30 μl HCl 1N. Hỗn hợp phản ứng được chiết xuất với
etyl axetat (0,5 ml) và ly tâm 16.000 vòng trong 2 phút. Lớp hữu cơ được thu thập và bốc
hơi trong chân không sau đó, dư lượng đã được hòa tan trong methanol (0,3 ml). Sản
phẩm phản ứng (bergapten) sau đó đã được xác định và đếm số lượng sử dụng UPLC ở
cả 2 bản. Các chiết xuất của các tế bào với vector trống đã được sử dụng như một điều
khiển thụ động.
pH và nhiệt độ tối ưu và yêu cầu kim loại của AdBMT
Độ pH tối ưu cho hoạt động của enzyme được xác định bằng ủ ở 35°C trong 90 phút
trong các hệ đệm khác nhau (200 mM), giữa 4,0 và 10,0 (acetate, pH 4,0-5,5; phosphate,
pH 5,5-9,0; Tris-HCl, pH 7,0 -8,5; cacbonat, pH 8,5-10,0). Nhiệt độ tối ưu cho hoạt động
của enzyme được xác định từ 16°C và 42°Ctrong 200 mM đệm phosphate kali (pH 7,5)
trong 90 phút. Ảnh hưởng của các ion kim loại khác nhau ở nồng độ 0,1 và 1,5 mMlên

hoạt động của enzyme được xác định ở 200 mM đệm phosphate kali (pH 7,5) ở 35°C
trong 90 phút. Việc bổ sung 5.4 mM EDTA trong bộ đệm đã được sử dụng như một điều
khiển. Ba thí nghiệm độc lập trong bản sao đã được thực hiện để phân tích mỗi trường
hợp.
Phản ứng được khảo nghiệm trong điều kiện trong đó sản phẩm hình thành tuyến tính cho
cả 2 thời gian (15-120 phút) và nồng độ của protein tinh khiết (1,8-16 μg). Rõ ràng giá trị
Km và Vmax được xác định bởi các lô Lineweaver-Burk bằng cách sử dụng khoảng 9,6
μg chiết xuất protein khử muối và sự điều chỉnh của một quá trình pha loãng nối tiếp của
các chất nền cả bergaptol (0,625 ~ 7 mM) và SAM (1,25 mM ~ 7,5 mM) trong phản ứng
enzyme như mô tả ở trên.


Các kết quả
Tạo dòng và đặc tính củacDNABMTtừ Bạch chỉ
Để có được cDNABMTtừ Bạch chỉ, RNA tổng sốđượcphânlậptừrễđược sử dụnglàm
khuôn. Một cặpmồithoái hóaoligonucleotideđược thiết kếtừ các vùngbảo tồn caocủa
chuỗiBMTthực vật khácnhư đãtrình bàytrongHình2A. Sửdụngkhuyếch đại RT-PCR, một
dảiduy nhất củađoạn DNA107bptương ứng vớitrình tựAdBMTthu được(Hình2B). Bởi
vìkích thướccDNAchỉ làmột phần,phương pháp5’ - và3’-RACE PCRđược sử dụngđể có
đượctoàn bộ chiều dài1.259bpcDNAAdBMT(accession no. JN585954) ngoại
trừđuôipoly(A).
cDNAAdBMTchứamộtkhung
đọcmở
1080bpmã
hóa
mộtpolypeptide359axit
amin(Hình2A) vớimột khối lượng phân tử đượctính toánlà 39kDavàpIlà 5,9.Đánh giáhồ
sơthủy liệu phápcủanó(Kyte vàDoolittle, 1982) chothấyrằngpolypeptideAdBMTkhông
cómột vùngkỵ nướcmạnhmẽgầnđầu N-terminus, có thể chỉ rasự vắng mặt củamột tín
hiệupeptide(dữ liệukhông hiển thị). Trongvùng 3’ không được dịch, mộtbiến thể

AATAACvà2 môtiftương đồng giả địnhAATAAAcủapolyadenylationđược đặttại vùng
thượng nguồn130, 113, và102bptừvị trí củapolyadenylation.
Chuỗi axit amin được dự đoán củaAdBMTđãđượcsử dụng đểtìmkiếmcơ sở dữ liệuprotein.
Chuỗiliên kếttiếtlộrằngpolypeptideAdBMT,trong đó tất cảnăm vùngđược bảo
tồnIV(Ibrahim etal, 1998) đã được tìm thấy, chiasẻ28%-91% sự tương
đồngvớiOMTsthựcvật. và xác địnhít nhất là đối vớiOMTcủa người(13%) (Hình 3).
AdBMTthể
hiệnsự
tương
đồng
vềtrìnhtựcao
vớiGlBMT(91%giống
nhau)vàAmBMT(84%giống nhau). Vùng I vàIVđãđược chứng minhbởinhiễu xạ tia
Xđểđược tham gia vàoSAMvàliên kết kim loạitương ứng (Vidgren etal, 1994). Ngoàiký
tựphổbiếncủa các vùngbảo tồncao(vùng IV)đặctrưngchoSAM-phụthuộcvàoOMTs, các
motifA và Bđược xem xét đểchi phối cácđặc trưngchất nền (Joshi vàChiangnăm 1998;
Schröder etal, 2002).
Hình 3.Liênkết amino acid của chuỗiproteinAdBMTvớicácBMTskhácvà các proteinliên
quan đếnOMT. Một dấu gạch ngangtrong chuỗichỉramột khoảng trốngđượcđưa rađể duy
trìsự liên kếttốt. Năm vùngbảo tồn cao(vùng I-V)được kí hiệu bằngmột khung. Các motif
A và Bđược ký hiệu bằngmột gạch dưới. Hai BMTslàGlBMT(AB363638), một
bergaptolO-methyltransferase Glehnialittoralis, và AmBMT(AY443006), một
bergaptolO-methyltransferase
MajusAmmi.Các
protein
liên
quan
đếnOMTbaogồmAtOMT(NM_124796), quercetin3-O-methyltransferase của Arabidopsis
thaliana,
ObOMT(AB530137),

chavicolO-methyltransferase


củaOcimumbasilicumvàHsOMT(Z26491), mộtcatecholO-methyltransferase của Homo
sapiens.


Biểu hiện vượt mức AdBMTtrong E. Colitái tổ hợp
Trình tự khung đọc mởcủaAdBMTđượcbiến nạpvào mộtvector biểu hiện,pET32a,và được
biểu hiện vượt mứctrong E. coli. Để xác địnhcác điều kiện chosự biểu hiệnAdBMT chức
năng cao, sự nhân bảnthông quabiến nạpđã tạo ratrong 16 giờở nhiệt độkhácnhautrongsự
hiện diệncủa1mMIPTG. Các tế bàoE. coliđã được thu hoạchbằng cách ly tâmvàcố
địnhtrong môi trườngLBủ24 giờvới100μMbergaptol, và sự hình thànhcủa sản
phẩm(bergapten) đã đượcđịnh lượng bằngUPLCnhưlàmột thử nghiệmchuyển đổi sinh
họccho hoạt độngAdBMTtrong tế bào. Biểu hiện quá mức AdBMTtrong tế bàocó thể
chuyển đổitừ bergaptolthànhbergapten, mà có thể đượcxácđịnhvàquantitatedbởiUPLC.
Sự sản xuấtbergaptentăng đáng kểkhinhiệt độcảm ứnggiảm(Hình 4). Số
lượngtốiđacủabergaptenđượctạo rakhiủở 16°C, cho thấy các thiết lậpphù hợp nhấtchohoạt
độngAdBMTcao nhấttrongsốcác nhiệt độđã thửnghiệm. Vì vậy, 16ºCđã được lựa chọnđể
điều tra thêm. Kiểmsoátvới mộtvectorrỗngđã được tiến hànhmột cáchsongsongtạimỗi
nhiệt độủbệnh; bergaptenkhôngđược phát hiện trongbấtkỳcác thí nghiệmkiểm soát(Hình
4).

Hình 4.Ước tínhcủaAdBMTchứcnăngbiểu hiện quá mứcởE. coli. 50mlnuôi cấy tế
bàobiểu hiệnAdBMTvà một vecto rỗngđược tạo ratrongsự hiện diện của1mMIPTGở
những nhiệt độchỉ địnhtrong 16 giờ.Các tế bào từmỗisự chuẩn bịđượcthuhoạchbằng cách


ly tâm, cô đặctrong25 mlLBvà ủở 25 ° Ctrong 24 giờvới việc bổ sungcủabergaptolđể đạt
được mộtnồng độ cuối cùngcủa 100μΜ.Các sản phẩm (bergapten) trong môi trường phản

ứngđượcướctínhbởiUPLC. Bergaptenđược chuẩn hóatrêncơ sởmột số lượng E. colitế
bào.Ba thí nghiệmđộclập được tiến hành 2 lầnđã được thực hiệncho mỗi phân tích.
Các protein từmỗisự chuẩn bịđượcngăn cách bởiSDS-PAGE (hình5A). Mộtprotein39kDa đã được quan sát thấytrong các tế bàochứa pET32a-BMT (các tuyếnA2), ngược lại
nó không đượcpháthiệntrong các tế bàochứa pET32atrống(tuyếnA1), cho thấy
rằngAdBMTtái
tổ
hợp(với
His-tag)
đã
biểu
hiện
thành
côngởE.
coli.ProteinAdBMTđượcpháthiệnmiễn dịchbằngcáchsửdụngkháng thể kháng His-tag,
như được chỉ rabởi một mũi tên(Hình 5B, tuyến2). Các kích thướccủa các proteinđược
phát hiệntất cả đềuđồng thuận tuyệt vờivớikích thước dự kiến 39kDađược dự đoántừ các
trình tựAdBMT. Băng17,5kDađược sản xuấtbởi một vectorpET32ađã được sử dụngnhư
một điều khiển(Hình 5, tuyến1).

Hình 5. Sự biểu hiện quá mức của AdBMTtrong E. coli. Các tế bào chứa khoảng
trốngpET32a(1) hoặcpET32a-BMT (2)plasmidđược biểu hiệntrongsự hiện diện
của1mMIPTGtrong16 giờở 16°C. Protein tổng số được chiết xuấttừ mỗi khâu chuẩn bị.
Một khối lượng bằngnhaucủaproteinđược tách rabởiSDS-PAGE vàhoặcnhuộm với xanh
Coomassie(A)
hoặcelectroblottedlênnitrocellulosevàphát
hiệnmiễn
dịchbằngcáchsửdụngkháng
thểchốngHis-tag(B).
Mcho
thấyproteinmarker(70,

53,41,30,22,và 14kDa). Cácmũi tên chỉAdBMTbiểu hiện quá mức.
Đặc tính của AdBMT


Bởi vì Hehmannetal.(2004)báo cáo rằngcác hoạt độngBMTcủa A. Majustrong các chất
chiết xuất từvikhuẩnlàrấtkhông ổn địnhvà không thểkíchhoạttínhnăngtinh chếrộngrãi,
chiết xuấtAdBMTphânlậptừ các tế bàovi khuẩn E. colicũng vậy, phân đoạnammonium
sulfate(40% -50 %bão hòa)vàsau đókhử muốivàcô đặcchocác đặc tínhsinh hóa.
Hình 6.Sản xuất bergapten là tuyếntính cho cả hainồngđộchỉ định của proteintinh
khiếtvàkhoảng thời giancủa phản ứng. Bergapten ước tínhtrong một thể tích200μlở
35°C(A)trong 90 phútvớiviệc bổ sung cáclượngkhác nhau củaproteintinh khiếthoặc(B)
chocác khoảng thời giankhácnhauchỉ địnhvới9.6μgproteintinh khiết(hoạt động cụ
thể0,21kat/kg) phân lập từ các tế bàovi khuẩn E. coli biểu hiện quá mứcAdBMT.
Bergapten được chuẩn hóatrên cơ sởcủamột số lượng bằng sốtếbàovi khuẩn E. coli.
Như thể hiện tronghình 6, bergaptenhình thànhtuyến tính trongcả 2 thời gianchỉ định(15120 phút)và nồng độ của cácproteintinh chế (1,8-16 μg). Vì vậy,9,6μgprotein tinh
khiết(hoạt động cụ thể0,21kat/kg) và thời gian phản ứng90 phút ở35ºCđãđượcthực hiện
đểđo độ pHtối ưu của cáchoạt độngAdBMT. Cần lưu ýrằng việc sản xuấtbergaptenđạt
đến mộtmức tối đa(36μg) sau 2h ủ bệnh(Hình6B). Hoạt động đáng kểcủacácAdBMTtái
tổ hợpđã được quan sát thấytừpH6,5-9,0với pHtối ưu khoảng 7,5trong hệ đệm
phosphatekalihoặc hệ đệm Tris-HCl(Hình7A). Ở pH7.5, hoạt động AdBMTtrong hệ
đệmphosphatekalilà hoạt độngtrên mộtnhiệtđộrộngtừ16đến42°Cvới nhiệt độtối ưu
củakhoảng 35°C(Hình7B). Cần lưu ýrằng nếu không cósự bổ sung củaSAM(5mM),
bergaptenkhôngđược quan sát thấytronghỗn hợp phản ứng. Phân tíchđộng họccho
thấyrằng
giá
trịKmcủaAdBMTvớibergaptollà0,56mMtrongkhigiá
trịKmcủaAdBMTvớiSAMlà10,68mM.
Hình 7. Ảnh hưởng của pH,nhiệt độ,vàion
kim loạivàohoạtđộng của AdBMTtái tổ hợp.
Xấp xỉ 9.6μgproteinamonisulfatphân đoạnđã

được thêm vào(A) 200 mMcác hệ đệmchỉ
định khácnhautrong đó bao gồmmộtphạmvipH rộngpH từ4,0đến 10,0,
(B)vào200mMđệmphosphatekali (pH 7,5)vàủ ở nhiệt độchỉ định từ16đến42°C,hoặc
(C)vào200mMđệmphosphatekali (pH 7,5), tất cả đều chứacác ion kim loạikhácnhauở
nồng độ 0,1và 1,5mM, và ủở 35°C tương ứng. EDTA, mộtchelatorkim loại,đã được bổ
sungvào hệ đệmnhư kiểm soát.Bergapten được chuẩn hóatrên cơ sởcủamột số lượng bằng
sốtếbàovi khuẩn E. coli. Ba thí nghiệm độclập2 lầnđã được thực hiệncho mỗi phân tích.
Dấu hoa thị chothấytầm quan trọng củasự khác biệtcủa giá trịđiềukhiểnđượcxácđịnhbằng
Student’s t-test (* P <0,01).Các thanhlỗiđại diện choSD.


OMTsthực vật có thểđược phân loại thànhhai loại chính, loại Ivà loạiII. Loại Iphụ thuộc
Mg2+,trongkhiloại IIkhông yêu cầuMg2+cho hoạt độngxúctác(Joshi vàChiangnăm 1998;
Kopyckiet al, 2008). Hiệu lực ở nồngđộ0,1hoặc 1,5mMcủa Mg2+lên hoạt độngenzymeđã
được kiểm tratrong hệ đệmphosphatekali (pH 7,5)ở 35°Ctrong 90 phút. DùMg2+đã được
áp dụngđểủ bệnh ở nồng độ nào, sự sản xuấtbergapten tương tự như trong môi
trườngcóchứaEDTA,mộtchelatorkim loại,như một chất kiểm soát, cho thấy rằng
AdBMTkhông yêu cầuMg2+. Kết quả nàyphù hợpvới điều vừa nói trên củaAmBMT, điều
mà hoạt độngxúc tác của nó được báo cáo làMg2+-độc lập (Hehmann etal,2004.)
Ảnh hưởng củamộtsốion kim loạikhác (Cu2+, Ni2+,Co2+, Fe2+,Fe3+,Mn2+,Zn2+,Ca2+)vàohoạt
động
của
enzymecũng
được
kiểm
tra.
Sự
ức
chếđáng
kểhoạt

2+
2+
độngAdBMTđượcquansátthấytrongsự hiện diện củaCu (99% và 100%), Ni (71% và
100%), vàCo2+ (50% và 64%) (Hình 7C). Bổ sungCu2+và Ni2+lênđến 1,5mMức chế hoàn
toànhoạtđộngAdBMT. Fe2+vàZn2+chỉ ảnhhưởngnhẹ đếnhoạt độngAdBMTở nồng độ
0,1mm. Tuynhiên, bổ sungMn2+,Fe3+,Ca2+hầu như ítbị ảnh hưởngbởi hoạt độngxúc
tácAdBMT (Hình7C).
Hiệu quả sảnxuấtcủabergaptentrongnuôi cấy biểu hiện quá mức AdBMT
Động học chuyển đổitừ bergaptolthànhbergaptentrongnuôi cấy biểu hiện quá
mứcAdBMTđã được tiếp tụckiểm tra.Saukhicác tế bàoE. coliđược nuôiở 16°Ctrong 16
giờ, các tế bào đã được thu hoạchbằng cách ly tâmvàcô đặctrong môi trườngLB, Khi
bergaptolđãđượcthêm vào để đạt đượcnồng độ cuối cùnglà 100µM, các tế bào được ủ
ở25°C trong48 giờ(Hình 8). Đối vớichuyển đổibergaptol, 48 giờđã được sử dụngđể thay
thế.Sau một thời gianphảnứngngắnkhoảng 2 giờ, việc sản xuất bergaptenđạt180µg, tương
ứng với mứctối đa60%quansátđượcsau 24 giờnếumức tối đa củabergaptensản xuấttại24 h
tính là 100% (hình 8).Một điều đáng lưuýrằng trongcùngmộtthời gian phản ứng(tức là 2
h)sự sản xuấtbergaptenlà cao hơn 5 lầnso vớisản xuất bởiphầnAdBMTammoniumsulfatetinh khiết (36µg) cónguồngốctừcùng một số lượngtếbào.Khi thời gianủbệnhkéo dàiđến
24giờ, việc sản xuất bergaptenđạtnăng suấttối đa460,1µg, đó là caohơn khoảng 13lần so
vớisản xuất bởiphầnAdBMT ammoniumsulfatekết tủacũng xuất phát từcùng một số
lượngtếbào(Hình 8).Sau đó, nồng độcủabergaptendầndầngiảm xuống còn71%
chuyểnđổisau 48giờ ủ.
Hình 8.Sự sảnxuất hiệu quả củabergaptentrongnuôi cấy biểu hiện quá mứcAdBMT.
50mlcủanuôi cấy tế bàobiểu hiện quá mứcAdBMTđượctạo ratrong sự hiện
diệncủa1mMIPTGở 16°Ctrong 16 giờ.Các tế bào đượcthuhoạchbằng cách ly tâm, cố
địnhtrong 25 mlmôi trườngLBvà ủở 25°Ctrong 48giờvới việc bổ sungcủabergaptolđể đạt
được mộtnồng độ cuối cùnglà 100μΜ. Các khoảng thời gian khác nhau


đãđượcthựchiệnđể

ước

tínhnồngđộcủabergaptenvàbergaptoltrong môi trườngbởiUPLC. Bergaptenđược chuẩn
hóatrên cơ sởcủamột số lượng bằngsố lượng của các tế bào vi khuẩn E. coli. Sự
sảnxuấttối đabergaptensau 24 giờđược chỉ địnhlà 100%.Ba thí nghiệmđộclập 2 lầnđã
được thực hiệnchomỗi phân tích.
THẢO LUẬN
Bạch chỉ,một loại thảo mộcTrungQuốc, từ lâu đã đượcsửdụngnhưlàmột loại kemmặt
chomục đíchlàm trắng da. Cơ chếtác phẩmlàm trắngdakhông đượckhoa học chứng
minhcho đến khiPiaoetal. (2004)báocáorằngchiết xuấtacetateethylcủa A. dahuricacótiềm
nănghoạt động ức chếchốnglạityrosinasenấm. Tyrosinaselàmột enzymegiới hạn có thể
chuyển đổityrosine3,4-dihydroxyphenylalanine và sau đóoxy hóanó để tạo
thànhdopaquinone, dẫnđến sự hình thànhcuối cùng củamelanin. Xét rằngchất tyrosinase
ức chếngănchặnsự hình thành củahắctốmelanin, chúng có thể dẫnđếngiảmđộ tốicủa da.
Chấthoạt độnglàm trắng dađượcphânlậptừrễBạch chỉđược xác định là8-hydroxybergapten
(Piao etal, 2004), là một hợp chấtchuyển đổi từbergaptenbởisự hydroxyl hóamộtbước.
Tuy nhiên,Bergaptenlà một sảnphẩmtừbergaptolđược xúc tác bởi BMT, một enzyme quan
trọng của con đường sinh tổng hợp furanocoumarin. (cần quá trình chuyển đổi tyrosine
3,4-dihydroxyphenylalanine thành melanin)
Một báo cáo trước đó chỉ ra rằng BMT không ổn định và do đó, phương pháp phân đoạn
ammonium sulfate được áp dụng cho tinh chế enzyme (Hehmann et al, 2004). Theo đó,
AdBMT thường xuyên bị cô lập từ nuôi cấy tế bào E. colivà được tinh chế bằng phân
đoạn ammonium sulfate. Một phương pháp đơn giản và hiệu quả đã được phát triển để
sản xuất bergapten trong E. coli (Hình 8). Việc sản xuất bergapten in vivo có một số lợi
thế lớn. Đầu tiên, với cùng một số lượng tế bào vi khuẩn E. coli, một số lượng lớn


bergapten có thể được sản xuất trong chất lỏng. Sau một thời gian phản ứng ngắn 2-h
(Hình 8), sự sản xuất bergapten in vivo cao hơn 5 lần so với sản xuất bởi phần AdBMT
tinh khiết ammonium sulfate bắt nguồn từ cùng một số lượng tế bào. Quan trọng hơn,

việc ủ trong môi trường có thể được tiếp tục mở rộng đến 24 h để đạt được sự sản xuất
bergapten tối đa, nhưng không cho phản ứng được tiến hành trong ống nghiệm vì SAM
ngoại sinh và AdBMT thêm vào có thể không bền. Việc sản xuất bergapten in vivo, do
đó, cao hơn 13 lần so với sản xuất bởi phần AdBMT tinh khiết ammonium sulfate (Hình
8). Những kết quả này cho thấy rằng phần AdMBT tinh khiết ammonium sulfate làm
giảm đáng kể hoạt động của enzyme của nó có thể là do quá trình chiết và tinh chế
protein. Thứ hai, SAM không còn cần thiết để được thêm vào phản ứng in vitro bởi vì vi
khuẩn E. coli có thể tự cung cấp cofactorcho quá trình methyl hóa và do đó, làm giảm
đáng kể chi phí sản xuất. Thứ ba, sự tinh chế BMT từ các tế bào là không cần thiết. E.
coli có thể sử dụng các bergaptol bổ sung và chuyển đổi nó thành bergapten, cuối cùng
thoát ra môi trường mặc dù cơ chế tiết bergapten vào môi trường là không rõ ràng. Với
thực tế là bergaptencó thể được phát hiện trong môi trường, sự cô lập và tinh sạch
bergapten do đó đơn giản rất nhiều. Nó phù hợp với một báo cáo được công bố trước đó
bởi Ishikawa et al. (2009), chỉ ra rằng bergapten có thể được sản xuất trong một chất lỏng
của dịch treo tế bào G. littoralis. Tuy nhiên, việc sản xuất bergapten trong nuôi cấy tế bào
E. coli là thuận tiện hơn hơn so với sản xuất trong dịch treo tế bào G. littoralis vì nguồn
của E. coli là dễ dàng và được sử dụng rộng rãi.
Chuỗi axit amin của AdBMT chia sẻsự tương tự trình tự cao với trình tự BMT từ G.
littoralis và A. Majus. Nói chung, tất cả các OMTs thực vật chứa năm vùng bảo tồn cao
(vùng I-V) đặc trưng cho SAM phụ thuộc vào OMTs (Vidgren et al, 1994;. Ibrahim et al,
1998). Hai mô-típ A và B được xem xét để kiểm soát độ đặc của chất nền (Joshi và
Chiang năm 1998; Schröder et al, 2002). Sự tồn tại của các motif bảo tồn cao A và B
trong những 3 BMT này có thể phản ánh rằng chúng sử dụng cùng một chất nền (tức là,
bergaptol). Điều này được hỗ trợ bởi thực tế rằng AmBMT từ A. Majus cũng sử dụng
bergaptol như một chất nền. Tuy nhiên, những cấu trúc tính năng phổ biến thì khó có thể
tìm thấy trong OMTs động vật (ví dụ như con người).
AdBMT được phân loại như là một thành viên của OMTs loại II (Kopycki et al, 2008) và
hoạt động của enzyme của nó là Mg2+độc lập (Hình 7C). Tuy nhiên, việc bổ sung Cu2+,
Ni2+, và CO2+ ở nồng độ thậm chí thấp như 0,1 mM ức chế nghiêm trọng hoạt động của
enzyme. Các kết quả tương tự đã được mô tả cho OMTs dị loài (Morishige et al, 2000;.

Hehmann et al, 2004). Ngoài ra, sự thiếu của hoạt động enzyme cũng có thể do quá trình
tinh chế như tách rửa và từng bước cô đặc. Cho rằng ion Ni2+ ức chế hoạt động BMT, cột
Ni-NTA thường được sử dụng để làm sạch protein không thích hợp cho tinh chế BMT. Vì


vậy, sự tủa ammonium sulfate được sử dụngcho tinh chế AdBMT từ các chất chiết xuất từ
protein của các tế bào biểu hiện quá mức AdBMT.
Kết luận, cDNA BMTđã được xác định từ Bạch chỉ và biểu hiện quá mức trong E. coli.
Các điều kiện tối ưu của AdBMT được xác định trong hệ đệm kali photphat, và người
tanhận thấy rằng các enzyme không yêu cầu Mg2+ cho hoạt động xúc tác. Một sự sản xuất
bergapten đơn giản và hiệu quả trong dịch nuôi cấy đã được phát triển. Với việc cung cấp
bergaptol trong môi trường, các tế bào vi khuẩn E. coli có thể được sử dụng như là một lò
phản ứng sinh học tiềm năng để sản xuất bergapten.
Lời cảm ơn. Công trình này được hỗ trợ bởi National
Hội đồng Khoa học Grant NSC98-2311-B-005-002-MY3 tạiĐài Loan C.-S. Wang.