Xây dựng quy trình nhân giống lan hoàng thảo y ngọc (dendrobium transparens wall ex lindl ) bằng kĩ thuật nuôi cấy mô thực vật

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN
TRƢỜNG ĐẠI
HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
------------------------KHOA SINH – KTNN
-------------------------

NGUYỄN NGUYỆT QUỲNH

NGUYỄN THỊ HỒNG HUẾ

XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG LAN
HOÀNG THẢO Ý NGỌC (Dendrobium transparens
Wall. ex Lindl.) BẰNG KĨ THUẬT NUÔI CẤY MÔ

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO
THỰC VẬT

LAN PHI ĐIỆP TỪ HẠT
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Ngƣời
hƣớng
Chuyên ngành: Sinh
lý học
thựcdẫn
vậtkhoa học
TS. LA VIỆT HỒNG

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học
TS. LA VIỆT HỒNG

Hà Nội, 2017


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. La Việt Hồng – Khoa Sinh
KTNN Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2 đã tận tình hƣớng dẫn, động viên
và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Tôi xin cảm ơn tới Ban Giám hiệu trƣờng ĐHSP Hà Nội 2, Ban Chủ
nhiệm khoa Sinh – KTNN trƣờng ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo mọi điều kiện thuận
lợi để tôi hoàn thành khóa luận này.
Trong thời gian thực hiện đề tài tôi cũng nhận đƣợc sự giúp đỡ tận tình
của cô Mai Thị Hồng- Phòng thí nghiệm Sinh lý học thực vật, anh Đào Văn
Kiên- Học viên Cao học K18 đã giúp đỡ, đóng góp ý kiến để tôi hoàn thành
đề tài khóa luận, nhân đây tôi cũng xin gửi lời cảm ơn.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Phòng thí nghiệm Sinh
lí thực vật, Phòng thí nghiệm Thực vật- trƣờng ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo điều
kiện thuận lợi về thiết bị, phƣơng tiện để tôi có thể hoàn thành khóa luận này.
Cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, góp ý cho tôi trong quá
trình học tập và hoàn thành đề tài.
Hà Nội, 14 tháng 04 năm 2017
Sinh viên

Nguyễn Nguyệt Quỳnh


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi và một số kết

quả cùng cộng tác với các cộng sự khác. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong
khóa luận là trung thực và chƣa đƣợc ai công bố.
Hà Nội, 14 tháng 04 năm 2017
Sinh viên

Nguyễn Nguyệt Quỳnh


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

NAA:

α- Napthlacetic acid

KIN:

Kinetin

IBA:

Indol 3- butyric acid

IAA:

- Indole- acetic acid

BAP:

6- Benzyl amino purin

MS:

Murashige và Skoog

Nxb:

Nhà xuất bản

Tp.HCM:

Thành phố Hồ Chí Minh


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
LỜI CAM ĐOAN
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
MỤC LỤC
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
1. Lí do chọn đề tài ........................................................................................ 1
2. Mục đích nghiên cứu ................................................................................. 2
3. Phạm vi nghiên cứu ................................................................................... 2
4.Ý nghĩa khoa học và thực tiễn ................................................................... 2
NỘI DUNG ....................................................................................................... 4
Chƣơng1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................ 4
1.1. Giới thiệu chung về chi Dendrobium..................................................... 4
1.1.1.Vài nét về chi Dendrobium ................................................................ 4
1.1.2. Vài nét về lan Hoàng thảo ý ngọc ..................................................... 5

1.2. Đặc điểm sinh học của cây lan ............................................................... 6
1.2.1. Hạt lan............................................................................................... 7
1.2.2. Sự nảy mầm cộng sinh với nấm trong tự nhiên của hạt lan ............. 7
1.2.3. Sự nảy mầm không cộng sinh in vitro của hạt lan ............................ 9
1.3. Tình hình nghiên cứuchi Dendrobium trên thế giới và ở Việt Nam ...... 9
1.3.1. Tình hình nghiên cứu chi Dendrobium trên thế giới ........................ 9
1.3.2. Tình hình nghiên cứu chi Dendrobium ở Việt Nam ........................ 12
Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 14
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu .......................................................................... 14
2.2. Thời gian, địa điểm nghiên cứu ........................................................... 14
2.3. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm ............................................................. 14
2.3.1. Thiết bị ............................................................................................ 14


2.3.2. Dụng cụ ........................................................................................... 14
2.4. Môi trƣờng nuôi cấy............................................................................. 14
2.5. Điều kiện nuôi cấy ............................................................................... 15
2.6. Phƣơng pháp nghiên cứu...................................................................... 15
2.6.1. Nhân nhanh protocorm và phát triển chồi từ protocorm ............... 15
2.6.2. Nhân nhanh chồi in vitro: ............................................................... 16
2.6.3. Ra rễ-tạo cây in vitro hoàn chỉnh: .................................................. 16
2.6.4. Rèn luyện cây in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên: ............... 16
2.7. Phân tích thống kê số liệu thực nghiệm ............................................... 16
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ........................................................... 18
3.1. Nhân nhanh protocorm và tạo chồi từ protocorm ................................ 18
3.1.1. Ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng nhân nhanh protocorm ...... 18
3.1.2. Ảnh hưởng của nước dừa đến khả năng tạo chồi từ protocorm ..... 19
3.2. Nhân nhanh chồi in vitro ...................................................................... 21
3.2.1. Ảnh hưởng của KIN lên khả năng nhân chồi.................................. 21
3.2.2. Ảnh hưởng của BAP lên khả năng nhân chồi ................................. 22

3.2.3. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP kết hợp NAA lên khả năng nhân chồi 25
3.3. Tạo rễ - hình thành cây in vitro hoàn chỉnh ......................................... 26
3.3.1. Ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ ...................................... 26
3.3.2. Ảnh hưởng của IAA đến khả năng tạo rễ ........................................ 27
3.4. Rèn luyện cây in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên..................... 29
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 31
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 33
PHỤ LỤC


DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1. Ảnh hƣởng của kinetin đến khả năng nhân nhanh protocorm của
loài D. transparens ......................................................................... 18
Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của nƣớc dừa đến khả năng tạo chồi từ protocorm của
D. transparens ........................................................................................19
Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của KIN lên khả năng nhân chồi của D. transparens
sau 8 tuần nuôi cấy.......................................................................... 21
Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của BAP lên khả năng nhân chồi của D. transparens
sau 8 tuần nuôi cấy.......................................................................... 22
Bảng 3.5. Ảnh hƣởng của tổ hợp BAP kết hợp NAA lên khả năng nhân chồi
của D. transparens sau 8 tuần nuôi cấy ................................................... 24
Bảng 3.6. Ảnh hƣởng NAA đến khả năng tạo rễ in vitro của D. transparens
sau 6 tuần nuôi cấy.......................................................................... 26
Bảng 3.7. Ảnh hƣởng của IAA đến khả năng tạo rễ in vitro D. transparens
sau 6 tuần nuôi cấy.......................................................................... 27


DANH MỤC HÌNH
Hình 3.1. Protocorm phát sinh từ protocorm của D. transparens ................... 18
Hình 3.2. Chồi phát sinh từ protocorm của D. transparens trên môi trƣờng

MS +10% ND ................................................................................... 20
Hình 3.3. Chồi in vitro của D. transparens sau 8 tuần nuôi cấy trên môi
trƣờng MS + 0,5 mg/l KIN ............................................................... 22
Hình 3.4. Chồi in vitro của D. transparens sau 8 tuần nuôi cấy trên môi
trƣờng MS ........................................................................................ 23
Hình 3.5. Chồi in vitro của D. transparens sau 8 tuần nuôi cấy trên môi
trƣờng MS + 1,5 mg/l BAP + 0,2 mg/l NAA ................................... 25
Hình 3.6. Ảnh hƣởng của NAA đến khả năng tạo rễ in vitro D. transparens
sau 6 tuần nuôi cấy............................................................................ 26
Hình 3.7. Ảnh hƣởng của IAA đến khả năng tạo rễ in vitro D. transparens
sau 6 tuần nuôi cấy............................................................................ 28
Hình 3.8. D. transparens in vitro rèn luyện ngoài tự nhiên ............................. 29


MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Họ Phong lan là một họ lớn nhất của thực vật có hoa với hơn 800 chi
và 25.000 loài. Hoa lan đƣợc đánh giá cao bởi vẻ đẹp lôi cuốn, quyến rũ và sự
đa dạng về kích thƣớc, hình dạng, màu sắc. Hiện nay, hoa lan chiếm 8% trong
ngành thƣơng mại hoa thế giới và có tiềm năng thay đổi tình hình kinh tế của
một quốc gia [26].
Chi Dendrobium thuộc họ Phong lan là một trong những chi thực vật
phổ biến nhất trên thế giới, chi này có khoảng 1200-1500 loài phân bố rộng
khắp ở Châu Á, Bắc Australia và New Zealand. Các loài thuộc chi này sinh
trƣởng nhanh, dễ dàng tái sinh thế hệ mới, hoa đẹp, ra hoa quanh năm [16].
Ngoài giá trị thƣơng mại, một số loài lan thuộc chi Dendrobium còn là thành
phần của các bài thuốc truyền thống ở Trung Quốc và Ấn Độ [44]… Trong tự
nhiên, các loài lan sinh trƣởng chậm, tái sinh chủ yếu bằng hạt. Tuy nhiên,
khả năng nảy mầm tự nhiên của hạt lan là cực kì thấp. Do đó, khả năng phục
hồi của các quần thể lan ở rừng tự nhiên là rất khó [1], [2].

Bằng các phƣơng pháp nhân giống vô tính truyền thống nhƣ giâm cành,
chiết cành, ghép cành,...ngƣời ta đã thu đƣợc nhiều giống cây trồng mới cho
năng suất và phẩm chất tốt. Tuy nhiên, các phƣơng pháp này còn nhiều hạn
chế nhƣ hệ số nhân thấp, tốn nhiều thời gian. Công nghệ nuôi cấy mô tế bào
thực vật ra đời đã mang lại lợi ích lớn cho nhiều nƣớc trên thế giới. Bên cạnh
việc khắc phục nhƣợc điểm của biện pháp nhân giống vô tính truyền thống,
nó còn thể hiện ƣu điểm vƣợt trội nhƣ tạo ra lƣợng lớn cây giống sạch bệnh,
đồng nhất về mặt di truyền trong thời gian ngắn; tạo sinh khối tế bào lớn làm
nguyên liệu cho công nghiệp và y dƣợc. Do đó khắc phục những hạn chế của
các phƣơng pháp nhân giống truyền thống [3].
Hoàng thảo ý ngọc (D. transparens Wall. ex Lindl.) là loài lan có hoa

1


đẹp, lâu tàn, có thể trồng trong vƣờn nhà nên đƣợc rất nhiều ngƣời ƣa chuộng.
Tuy nhiên, việc trồng loài lan này còn gặp nhiều khó khăn về nguồn cây
giống. Để chủ động nguồn cây giống phục vụ cho phát triển sản xuất phục vụ
nhu cầu nội tiêu cũng nhƣ xuất khẩu thì nhiệm vụ nhân giống lan bằng
phƣơng pháp nuôi cấy mô là hƣớng đi đúng đắn. Nhân giống Hoàng thảo ý
ngọc bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô sẽ cung cấp một lƣợng lớn cây giống
chất lƣợng cao, đồng đều, sạch bệnh, khắc phục đƣợc hiện tƣợng thoái hoá và
đặc biệt lƣu giữ nguồn gen quý cho nhu cầu nuôi trồng.
Xuất phát từ thực tế trên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Xây
dựng quy trình nhân giống lan Hoàng thảo ý ngọc (D. transparens Wall.
ex Lindl.) bằng kĩ thuật nuôi cấy mô thực vật” để chọn môi trƣờng nhân
nhanh phù hợp tạo ra số lƣợng cây con lớn, đồng đều và sạch bệnh trong thời
gian ngắn, làm tiền đề cho việc cung cấp cây giống có chất lƣợng tốt phục vụ
cho sản xuất, góp phần bảo tồn và phát triển nguồn gen quý này.
2. Mục đích nghiên cứu

Xây dựng quy trình nhân giống lan Hoàng thảo ý ngọc (D.
transparens Wall. ex Lindl.) nhằm tạo cơ sở cung cấp giống cho quá trình
sản xuất.
3. Phạm vi nghiên cứu
Tiến hành các nghiên cứu trong phạm vi phòng thí nghiệm.
4.Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
Ý nghĩa khoa học: góp phần bổ sung vào nguồn tài liệu nghiên cứu
invitro về lan Hoàng thảo ý ngọc (D. transparens Wall. ex Lindl.).
Ý nghĩa thực tiễn: kết quả của đề tài có thể đƣợc sử dụng nghiên cứu
trong nuôi cấy mô tế bào lan Hoàng thảo ý ngọc (D. transparens Wall. ex
Lindl.). Góp phần sản xuất cây giống có hiệu quả cao, chất lƣợng tốt, ứng
dụng vào sản xuất sẽ góp phần nâng cao hiệu quả nghiên cứu khai thác, bảo

2


tồn các nguồn gen quý về loài hoa lan.

3


NỘI DUNG
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu chung về chi Dendrobium
1.1.1. Vài nét về chi Dendrobium
Chi Dendrobium thuộc nhóm lan đa thân, là một chi lớn trong họ lan
với trên 1600 loài đƣợc chia thành 40 nhóm, phân bố trải dài từ Triều Tiên,
Nhật Bản qua Đông Dƣơng, Malaysia, Indonesia đến Australia, các đảo
Polynesi. Giống lan này đƣợc đặt tên và trở thành danh pháp khoa học chính
thức từ năm 1979 [4].

Dendrobium là nhóm cây phụ sinh bám trên cây gỗ, điều kiện sinh thái
rất đa dạng, thích nghi với nhiều loại khí hậu khác nhau [21].
Theo thống kê ở Việt Nam, chi Dendrobium có trên 100 loài phân biệt
nhau bằng thân, lá, hoa…[1].
Dendrobium là loại lan đa thân với nhiều giả hành, các giả hành thƣờng
mang một thân với nhiều lá mọc xen kẽ. Trên thân có rất nhiều mắt ngủ, căn
hành giữa hai mắt ngắn hơn ở Cattleya.
Hoa lƣỡng tính, đối xứng hai bên có thể mọc từ thân thành cụm hoặc
từng hoa riêng biệt. Màu sắc hoa rất đa dạng từ màu trắng, vàng tới tím. Cấu
tạo hoa cơ bản giống với đặc điểm của họ lan, với lá đài sau nằm một mình,
hai lá đài bên dính lại với nhau ở mép dƣới và dính vào đáy của trụ tạo thành
một phần dƣới chân của trụ gọi là cằm. Cánh môi gắn vào cằm, đôi khi kéo
dài với nhau tạo thành cựa, móc hay túi. Môi nguyên hay có thuỳ, gai sọc có
lông hay không, hai cánh bên giống hai lá đài. Trụ thấp, phần đực của đỉnh trụ
có nắp đậy, nắp gắn vào trụ nhờ một chỉ ngắn về phía sau, bốn khối phấn nhỏ
dính lại với nhau từng cặp không vĩ, không gót. Quả nang dạng túi.
Chi Dendrobium có nhiều loài hoa rất lâu tàn, cá biệt có loài trên 3
tháng hoặc hoa có thể nở suốt năm. Một nhóm gồm các loài thuộc chi

4


Dendrobium ra hoa vào đầu mùa mƣa do quá trình khô hạn trong mùa nắng,
nhóm khác ra hoa vào dịp Tết và hiện nay chƣa đƣợc biết một cách chắc chắn
do ảnh hƣởng của quang chu kỳ hay do tác động của cả 2 yếu tố.
Dựa vào dạng thân Dendrobium chia làm hai nhóm chính [7]:
- Dạng thòng hay Nobie, là dạng thân mềm, ra hoa từ chồi sơ khai của
giả hành đã trƣởng thành, phân bố chủ yếu ở vùng lạnh nhƣ Đà Lạt. Dạng
thòng đặc trƣng ở Hoàng thảo long tu (D. primulinum), giả hạc (D.
anosmum).

- Dạng đứng hay Phalaenopsis là dạng thân cứng, hoa mọc ở giả
hành non lẫn giả hành đã trƣởng thành. Ở giả hành mới, chồi non nhất ở
gần ngọn là chồi đầu tiên phát triển thành vòi, dạng này thƣờng sống ở
vùng có khí hậu nóng.
Về hình dạng của giả hành cũng rất đa dạng [7]:
- Nhóm có giả hành to ngắn, tận cùng thƣờng có 2-3 lá đài, bền, không
rụng. Phát hoa tập trung tại phần này tạo thành chùm có thể đứng hay thòng
nhƣ Thuỷ tiên trắng (D. fermeri), Vảy vá (D. lindleyi)…
- Nhóm giả hành rất dài và mang lá dọc theo chiều dài của giả hành,
thƣờng rụng lá khi ra hoa nhƣ Hoàng thảo long tu (D. primulinum), Ý nhi (D.
gratiosissimum)…
- Nhóm giả hành rất mảnh mai có thể dài hay ngắn, có lá mọc dọc theo
chiều dài của chúng và các lá này thƣờng bền, không rụng. Hoa thƣờng chỉ
mọc ở nách lá nhƣ Hƣơng duyên (D. revolutum)…
1.1.2. Vài nét về lan Hoàng thảo ý ngọc
Lan Hoàng thảo ý ngọc có tên khoa học là D. transparens Wall. ex
Lindl. thuộc chi Dendrobium nên mang hầu nhƣ tất cả các đặc điểm của chi.
Hoàng thảo ý ngọc có thân thòng, lá mỏng. Hoa to 3-4 cm, 2-3 chiếc
mọc ở các đốt của thân cây đã rụng lá. Độ bền của hoa từ 12-20 ngày. Đài hoa
màu trắng tính khiết, lƣỡi tím hoa bèo. Màu sắc hoa biến thiên từ tím đến

5


trắng; cánh và lƣỡi pha màu rất hài hoà.
Loài này thƣờng dễ trồng, ra hoa vào mùa xuân (phổ biến tháng 4), có
hƣơng thơm lạ, nhẹ. Đây là loài đặc hữu của Sơn La, Điện Biên, Lai Châu.
1.2. Đặc điểm sinh học của cây lan
Với 750 chi và 20.000-25.000 loài (Takhtajan, 1987), họ lan đã chiếm
vị trí thứ 2 sau họ Cúc (Asteracea) trong ngành thực vật hạt kín và là họ lớn

nhất trong lớp một lá mầm. Chính vì thế, hình thái, cấu tạo cũng nhƣ hệ thống
phân loại họ này hết sức đa dạng và phức tạp [7].
Nhìn chung, họ lan bao gồm các cây thân thảo, sống lâu năm (đôi khi
hoá gỗ một phần ở gốc), mọc ở đất, hốc hoặc vách đa, sống phụ hoặc hoại sinh.
Nét độc đáo của họ lan là lối sống phụ sinh (bì sinh), treo lơ lửng trên
vỏ của các cây thân gỗ khác. Chúng phát triển thành các dạng thân rễ nạc, dài
hay ngắn, mập hay mảnh mai, đƣa cơ thể lan đi xa hay chụm lại thành các bụi
dày. Hệ rễ khí sinh ở đây vừa làm nhiệm vụ hút nƣớc, muối khoáng trên vỏ
cây gỗ, vừa bám chặt vào giá thể để giữ cây khỏi bị gió cuốn đi, ngoài ra nó
còn chống đỡ cho cây mọc cao vƣơn ra chỗ có nắng giữa đám tán lá cây [14].
Căn cứ vào cấu trúc, Pfitzer xếp đa số lan tập trung vào hai nhóm:
nhóm đa thân (sympodial) và nhóm đơn thân (monopodial) ngoại trừ một
nhóm trung gian giữa hai nhóm trên gồm rất ít giống [7].
- Nhóm đơn thân gồm những cây chỉ tăng trƣởng theo chiều cao làm
cho cây dài ra mãi. Gồm các giống: Vanda, Phalaenopsis, Aerides,
Rhynchostylis,... Ở nhóm này, lá đƣợc xếp thành hai hàng đối nhau, lá trên
một hàng xen kẽ với lá của hàng kia. Ở một số giống nhƣ Phalaenopsis các
đốt thân rất ngắn và các lá trở nên dày đặc. Ở một số giống khác các đốt
tƣơng đối cách xa nhau nhƣ Vanda.
- Nhóm đa thân gồm những cây tăng trƣởng liên tục, có những chu kỳ
nghỉ sau những mùa tăng trƣởng. Nhóm đa thân có giả hành rất biến động,

6


nhóm này gồm các giống nhƣ: Cattleya, Oncidium, Dendrobium, Cymbidium,
Epidendrum…. Căn cứ vào cách ra hoa, có thể chia nhóm này thành hai nhóm
phụ: nhóm ra hoa phía trên gồm các giống Dendrobium, Cymbidium,
Oncidium… Nhóm ra hoa ở đỉnh nhƣ Cattleya, Laelia, Epidendrum…
- Nhóm trung gian gồm các loài nhƣ Centropetatum, Phachyphilum,

Dichaea…
1.2.1. Hạt lan
Hạt lan rất nhỏ (nhƣ hạt bụi) và hầu nhƣ không chứa bất kỳ dinh dƣỡng
dự trữ nào cho phôi trong giai đoạn đầu tiên của quá trình nảy mầm nhƣ các
loài thực vật khác. Cấu tạo hạt rất đơn giản, chỉ bao gồm một phôi chƣa phân
hoá đƣợc bao bọc bởi một lớp áo hạt. Trên thực tế, quả phong lan chứa một số
lƣợng rất lớn hạt lan, mỗi quả chứa trên một triệu hạt [30].
Phôi của các loài thực vật thuộc họ lan có kích thƣớc rất nhỏ và chƣa
phân hoá. Quá trình phát triển của phôi hạt lan rất khác biệt với các loài thực
vật có hoa khác [38].
Phôi ở thực vật hai lá mầm: dạng cầu→ dạng thuỷ lôi→ dạng có lá mầm.
Phôi ở thực vật một lá mầm: dạng cầu→ dạng khiên→ dạng diệp tiêu.
Phôi ở thực vật họ lan: dạng cầu→ dạng chuyển tiếp→ dạng protocorm.
1.2.2. Sự nảy mầm cộng sinh với nấm trong tự nhiên của hạt lan
Vì hạt lan quá nhỏ, hầu nhƣ không chứa chất dự trữ và chỉ có một phôi
chƣa phân hoá nên k thể phát triển theo cách bình thƣờng đƣợc. Vì vậy việc
làm cho hạt lan nảy mầm và phát triển thành cây lan trƣởng thành là vấn đề
khó khăn vào giai đoạn đầu của thời kỳ phát triển ngành lan [1].
Ngƣời trồng lan đã tìm mọi cách để gieo hạt nhƣng không thành công.
Năm 1844, Neumann đã làm nảy mầm một số hạt lan bằng cách rải các hạt
lan trên các diện tích đất quanh gốc của các cây lan lớn. Dominy là ngƣời đầu
tiên đã tạo ra đƣợc các hạt lan lai và làm nảy mầm các hạt lan trƣớc năm

7


1853, nhƣng chỉ thành công ở một số giống [14].
Năm 1899, Noel Bernard nhà thực vật ngƣời Pháp đã khám phá ra bí
mật của việc nảy mầm ở hạt lan khi ông khảo sát các hạt lan Neottia nidus nảy
mầm tự nhiên trong rừng vùng Fontainebleu ở Pháp. Ông thấy các cây lan con

ấy đều nhiễm nấm. Sự thật thì việc liên hệ giữa nấm và cây lan con đã đƣợc
khảo sát từ năm 1850 và sự liên hệ giữa nấm và rễ lan đã đƣợc các nhà khoa
học nghiên cứu suốt hơn nửa thế kỉ tiếp theo đó nhƣng không ai nghĩ rằng sự
hiện diện của nấm là cần thiết cho sự nảy mầm của các hạt lan. Điều này cắt
nghĩa lý do thành công của Neumann [46].
Năm 1904, Noel Bernard thành công trong việc phân lập các nấm từ rễ
lan rồi cho nhiễm nấm vào các hạt lan. Bằng cách đó Noel Bernard là ngƣời
đầu tiên đã làm cho 100% hạt lan nảy mầm. Sau đó, Bernard và Burgeff đã
cộng tác với nhau để đƣa ra phƣơng pháp gieo hạt có nhiễm nấm trong môi
trƣờng chứa agar. Phƣơng pháp này đƣợc xem là phƣơng pháp gieo hạt cộng
sinh (semissymbiotiques), tạo ra cuộc cách mạng cho sự gia tăng số lƣợng lớn
cây lan trồng từ hạt [7], [11].
Mỗi loài nấm chỉ giúp nảy mầm một số loài lan:
- Rhizoctonia repens giúp hạt Cattleya, Laelia, Angraecum,
Cypripedium nảy mầm.
- Rhizoctonia mucoroides giúp hạt Vanda, Phalaenopsis nảy mầm.
- Rhizoctonia lanugiosa giúp cho hạt Oncidium, Odontoglossum và
Miltonia nảy mầm [38].
Khi nảy mầm, phôi tăng trƣởng thành một hình cầu nhỏ, cấu trúc giống
thân hành (corn) đƣợc gọi là protocorm, gồm một mô phân sinh chồi và rễ
không hoạt động tại hai cực đối diện nhau. Trong tự nhiên, protocorm có màu
xanh lá cây và tích luỹ carbohydrate dự trữ thông qua quang hợp. Khi
protocorm đã phát triển và tích luỹ vật chất đầy đủ thì nó sẽ hình thành lá
mầm và rễ đầu tiên. Khi cây con đủ lớn để tự sản xuất “ thức ăn” chúng

8


không cần phải cộng sinh với nấm [30].
Quan sát dƣới kính hiển vi điện tử quét, sự nảy mầm cộng sinh với hạt

của Anoectochilus formosanus cho thấy có sự xâm nhiễm của hệ sợi nấm vào
lớp áo hạt. Sau khi hấp thu nƣớc, phôi trƣơng phồng và làm rách lớp áo hạt.
Phôi làm vỡ tung lớp áo hạt, nhú phôi sẽ hình thành trên một đầu protocorm
và mô phân sinh đỉnh trên đầu còn lại. Trên mặt cắt dọc của protocorm cho
thấy có sự xâm nhiễm của hệ sợi nấm [25].
1.2.3. Sự nảy mầm không cộng sinh in vitro của hạt lan
Năm 1922, Knudson đã thành công trong việc thay thế nấm bằng
đƣờng ở môi trƣờng agar để gieo hạt. Với các bình cấy có môi trƣờng agar và
muối khoáng thích hợp thì khả năng nảy mầm của hạt lan là rất ít hay không
có, nhƣng nếu có nấm thì sự nảy mầm của hạt lan lại rất lớn [7]. Sự khác biệt
giữa cây lan và hạt lan là sử dụng CO2 trong không khí. Từ CO2 và nƣớc, cây
lan tạo thành carbohydrate trong quá trình quang hợp theo phản ứng:
nCO2+nH2O→(CH2O)n +nO2
Từ carbohydrate và muối khoáng hấp thu từ rễ, cây lan đã tạo ra đƣợc
các chất phức tạp cần thiết cho sự phát triển. Hạt lan không nảy mầm đƣợc là
do chƣa có khả năng tổng hợp carbohydrate từ CO2 và không có nguồn
carbohydrate dự trữ. Thí nghiệm kiểm tra cho thấy chỉ cần thêm 2% đƣờng
vào môi trƣờng gieo hạt chỉ gồm có agar và muối khoáng, không cần có nấm
hạt lan vẫn nảy mầm tốt. Nhƣ thế vai trò chủ yếu của nấm đối với sự nảy
mầm của hạt lan là cung cấp nguồn carbohydrate. Từ đó phƣơng pháp của
Knudson đã đƣợc sử dụng khắp nơi trên thế giới và đƣợc gọi là phƣơng pháp
gieo hạt không cộng sinh (semis asymbiotique) [7], [38].
1.3. Tình hình nghiên cứuchi Dendrobium trên thế giới và ở Việt Nam
1.3.1. Tình hình nghiên cứu chi Dendrobium trên thế giới
Trong những năm qua, kỹ thuật nuôi cấy in vitro phát triển rất mạnh

9


mẽ, nuôi cấy mô tế bào thực vật đã và đang trở thành một công cụ hiệu quả

của công nghệ sinh học. Kỹ thuật nuôi cấy in vitro đƣợc ứng dụng rộng rãi
trong việc nhân giống vô tính cây trồng, trong cải thiện giống, bảo vệ nguồn
gen, thu sinh khối, hoạt chất quý... [20], [19], [36], [52]. Với những thành
công trong nhân giống các cây trồng khác nhau nên những khó khăn trong
việc nhân giống các loài lan ngoài tự nhiên đã khắc phục đƣợc bằng phƣơng
pháp nhân giống in vitro và đã đƣợc áp dụng từ sớm [46].
Chi Dendrobium gồm rất nhiều loài có giá trị cao. Vì vậy, đây cũng là
đối tƣợng đƣợc nhiều nhà khoa học quan tâm nuôi cấy in vitro từ rất sớm. Vật
liệu nuôi cấy khởi đầu thƣờng đƣợc sử dụng là hạt, đỉnh chồi, đoạn thân hay
lá. Phƣơng pháp tái sinh cây có thể thông qua PLBs (protocorm like bodies),
callus, phôi soma... Tuy nhiên, phƣơng pháp tái sinh cây thông qua PLBs
đƣợc sử dụng rộng rãi và có khả năng ứng dụng lớn nhất [12], [45], [50].
Kết quả thành công đầu tiên của Kundson (1922) là công trình nhân
giống in vitro lan với việc thay thế nấm bằng đƣờng ở môi trƣờng agar có rất
nhiều ƣu điểm [30].
Morel (1960) sử dụng chồi đỉnh của Cymbidium cấy vào môi trƣờng
Knudson III (C) để tạo ra protocorm [42]. Vào năm 1964, ông tiếp tục thí
nghiệm cắt nhỏ thể protocorm và cấy lại vào môi trƣờng, từ một thể
protocorm có thể sản xuất hơn 4.000 cây con/năm [43]. Từ kết quả thí nghiệm
của Morel, rất nhiều giống lan đa thân đã đƣợc nhân vô tính thành công nhƣ
Cattleya (Scully, 1967) [49], Dendrobium (Sagawa, 1984 [51]).
Để hoàn thiện quy trình nuôi cấy mô hoa lan, các nhà nghiên cứu đã đi
sâu tìm hiểu ảnh hƣởng của một số chất phụ gia lên sự hình thành callus và
protocorm nhƣ ảnh hƣởng của nƣớc dừa (Goh và cộng sự, 1970, 1973, 1975)
[31], [32], [33] với nồng độ 10-25%, dung dịch cà chua (Loh và cộng sự, 1978)

10


[37], ảnh hƣởng của nguồn cacbon và các hợp chất vô cơ (He S.L và cộng sự,

2003) [34].
Từ 2000 đến 2002, Chen và cộng sự đã kết luận môi trƣờng ½ MS bổ
sung 10-20 g/l saccharose, 170 mg/l NaH2PO4 và 0,5 g/l peptone là thích hợp
nhất cho sự hình thành phôi trực tiếp từ mẫu lan Onncidium Gower Ramsey
[22], [23], [24].
Năm 2009, José Geraldo và Rezende nghiên cứu ảnh hƣởng các nồng độ
khác nhau của saccharose và GA3 đến sự phát triển protocorms từ hạt nảy mầm
của phong lan Cattleyaloddigesii sp. đã đi đến kết luận nồng độ 0 mg M-1GA3
và 60 mg M-1 saccharose cho số rễ và sự phát triển rễ non Cattleya loddigesiis
tốt nhất [35], [48].
Maridass M. và cộng sự (2010) đã tiến hành nhân giống in vitro chồi rễ
của loài Dendrobium nanum. Các chồi rễ đƣợc cấy lên môi trƣờng cơ bản có
bổ sung các chất KTST nhƣ KIN, BAP, NAA. Kết quả nghiên cứu cho thấy,
sau 3-4 tuần các chồi rễ cảm ứng tạo thành callus và môi trƣờng tối ƣu cho tỷ
lệ tạo callus cao nhất là tổ hợp môi trƣờng bổ sung 2,0μM NAA và 1,2μM
KIN. Sau 12 tuần, các chồi đƣợc tạo thành và môi trƣờng tối ƣu cho sự phát
triển của chồi là môi trƣờng bổ sung 0.5μM BAP, chồi đạt chiều cao tốt nhất
là 15.78 mm [39].
Dai Chuan Yun et al. (2011) đã nghiên cứu và xác định đƣợc môi
trƣờng tối ƣu cho nhân nhanh protocorm lan Dendrobium candidum Wall. ex
Lindl. là 1/2MS + 6-BA 2mg/l + αNAA 0,5mg/l + KIN 1mg/l. Nghiên cứu
này đã cung cấp cơ sở khoa học cho sản xuất ở quy mô công nghiệp
protocorm và nhân giống chất lƣợng cao D. candidum [27].
Sana Asghar et al. (2011) đã nghiên cứu và xác định đƣợc môi trƣờng
có bổ sung 2ml/l BAP cho nhân nhanh chồi in vitro Dendrobium nobile [17].
S. Tuhuteru et al. (2012) nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ nƣớc dừa

11

trong môi trƣờng nuôi cấy in vitro và xác định bổ sung 100ml/l nƣớc dừa cho
môi trƣờng tối ƣu cho sự phát triển và nhân nhanh Dendrobium anosmum [53].
Từ các kết quả nghiên cứu trên cho thấy trên thế giới đã có rất nhiều
công trình nghiên cứu đối với cây hoa lan nói chung và các loài lan thuộc chi
Dendrobium nói riêng. Ngoài ra đã có nhiều nghiên cứu tập trung đi sâu vào
một số lĩnh vực nhƣ chọn tạo giống, nhân giống, các biện pháp kỹ thuật và
các biện pháp phòng trừ sâu, bệnh hại,…
Các kết quả này có ý nghĩa quan trọng trong việc giúp các nhà nghiên
cứu và sản xuất hoa lan nƣớc ta kế thừa kinh nghiệm, tiết kiệm đƣợc thời gian
và kinh phí để đem lại hiệu quả cao trong việc nhân giống và nuôi trồng cây
hoa lan trong điều kiện Việt Nam.
1.3.2. Tình hình nghiên cứu chi Dendrobium ở Việt Nam
Nghiên cứu nhân giống lan Dendrobium bằng phƣơng pháp gieo hạt
in vitro, Vũ Quốc Luận, Dƣơng Tuấn Nhựt (2007) đã bƣớc đầu nghiên cứu
thành công khả năng tạo chồi hoa Dendrobium Mild Yumi trong nuôi cấy
in vitro [5].
Năm 2011, Vũ Ngọc Lan đã nghiên cứu nhân nhanh in vitro 2 giống
lan Hoàng Thảo rừng dùng làm dƣợc liệu là Dendrobium nobile Lindl.và
Dendrobium chrysanthum Lindl., tác giả đã kết luận kỹ thuật nuôi cấy lỏng
lắc và lỏng lắc thoáng khí đã làm tăng hệ số nhân nhanh thể sinh chồi lan D.
nobile Lindl. Nhân nhanh cụm chồi D. chrysanthum Lindl. bằng bioreactor đã
giảm đƣợc ½ thời gian nhân giống và cải thiện chất lƣợng chồi [3].
Cùng năm 2011, Hà Thị Thuý và cộng sự đã tìm ra môi trƣờng tạo cây
hoàn chỉnh các giống lan Hoàng Thảo D. farmeri, D. anosmum, D. chrysanthum
là VW + 0,3 mg/l NAA + 0,2 mg/l GA3 + 3g/l agar + 30g/l saccarose [13].
Năm 2013, Ngô Thị Nguyệt và cộng sự đã tìm ra môi trƣờng tối ƣu nhân
nhanh Cypripedium formosanum, Cymbidium lowianum, D. anosmum là : MS

12

+ 0,5 mg/l BAP + 1,2 mg/l KI; MS + 2 mg/l BAP + 1,2 KI; MS +1,5 mg/l
BAP + 0,9 mg/l KI [8].
Tóm lại, ở Việt Nam đã có nhiều nghiên cứu về thu thập, lƣu giữ nguồn
gen hoa lan bản địa và nhập nội cũng nhƣ đánh giá, tuyển chọn những giống
phong lan triển vọng cho sản xuất và đi sâu nghiên cứu các biện pháp kỹ thuật
về giá thể, phân bón, kỹ thuật điều khiển ra hoa, phòng trừ sâu, bệnh hại...
Các kết quả nghiên cứu đƣợc ứng dụng vào sản xuất đã bƣớc đầu đem lại hiệu
quả tích cực trong việc phát triển ngành trồng lan ở Việt Nam. Tuy nhiên các
nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở một số đối tƣợng và chƣa hoàn thiện đƣợc quy
trình kỹ thuật trồng, chăm sóc đầy đủ, đặc biệt là trên chi lan Dendrobium.

13


Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Đối tƣợng nghiên cứu của chúng tôi là lan Hoàng thảo ý ngọc (D.
transparens Wall. ex Lindl) thuộc:
Ngành: Magnoliophyta
Lớp: Monocotyledoneae
Bộ: Orchidales
Họ: Orchidaceae
Chi: Dendrobium
Vật liệu nghiên cứu là Quả lan Hoàng thảo ý ngọc (D. transparens
Wall. ex Lindl) do Phòng thí nghiệm Sinh lý thực vật (Khoa Sinh-KTNN,
ĐHSP Hà Nội 2) cung cấp.
2.2. Thời gian, địa điểm nghiên cứu
Thí nghiệm đƣợc tiến hành từ tháng 1/2016 đến tháng 4/2017 tại Phòng
thí nghiệm Sinh lý học thực vật - trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2.

2.3. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm
2.3.1. Thiết bị
Các thiết bị sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật : Cân kĩ thuật (Sartorius,
Đức), tủ lạnh sâu (FRIGO), máy đo pH (HM30G/TOA, Đức), Nồi hấp khử
trùng (HV - 110/HIRAYAMA, Nhật), Tủ lạnh Hitachi (31AG5D, Thái lan),
Máy cất nƣớc hai lần (Hamilton, Mỹ), Buồng cấy vô trùng (AV 110/TELSTAR), Máy khuấy từ gia nhiệt (ARE/VELP, Italia), Cân phân tích
(Sartorius, Đức).
2.3.2. Dụng cụ
Dao cấy, khay cấy, kéo, túi nilon, bình tam giác, đèn cồn, bình xịt cồn vỉ
xốp nuôi cấy,…
2.4. Môi trƣờng nuôi cấy

14


- pH môi trƣờng: 5,8.
- Môi trƣờng đƣợc khử trùng trong nồi khử trùng ở nhiệt độ 117 oC trong
15 phút.
- Các thí nghiệm nuôi cấy in vitro đều sử dụng môi trƣờng dinh dƣỡng
cơ bản MS (Murashige và Skoog, 1962) [49] bổ sung 30g/l saccharose , 7g/l
agar, 10% nƣớc dừa và các chất điều hòa sinh trƣởng : Kinetin (KI), 6 Benzyl amino purine (BAP) và α – Napththalen acetic acid (α-NAA).
2.5. Điều kiện nuôi cấy
Các thí nghiệm đều đƣợc thực hiện trong điều kiện nhân tạo.
- Ánh sáng: các mẫu đều đƣợc nuôi cấy với cƣờng độ chiếu sáng
2000lux.
- Quang kì: 16 giờ/ngày.
- Nhiệt độ phòng: 25 oC - 27 oC.
- Độ ẩm trung bình: 70% - 74%.
2.6. Phƣơng pháp nghiên cứu
Quả lan đƣợc khử trùng sơ bộ bằng cồn 70% trong 2 phút, lắc trong

nƣớc javel 5% trong 10 phút. Sau đó bổ dọc quả, lấy hạt đặt vào đĩa petri
sạch, khử trùng bề mặt bằng khí clo (100 ml NaClO+3,3 ml HCl đặc) trong 2
giờ, hạt đƣợc gieo lên môi trƣờng MS. Sau 8-10 tuần hạt nảy mầm đƣợc sử
dụng làm nguyên liệu cho các thí nghiệm nhân nhanh bằng kỹ thuật nuôi cấy
mô thực vật.
Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần nhắc
lại. Mẫu sau khi cấy đƣợc nuôi trong điều kiện nhiệt độ 25±2oC, cƣờng độ
chiếu sáng 2000 Lux, thời gian chiếu sáng 10 h/ngày. Gồm các thí nghiệm:
2.6.1. Nhân nhanh protocorm và phát triển chồi từ protocorm
Sử dụng hạt lan nảy mầm sau 10 tuần nuôi cấy trên môi trƣờng MS
(Murasige và Skoog, 1962) có bổ sung thêm chất điều hoà sinh trƣởng KIN

15


(0,0; 0,3; 0,5; 0,7 mg/l) để nghiên cứu khả năng nhân nhanh protocorm.
Theo dõi chỉ tiêu: đƣờng kính cụm protocorm (cm), số protocorm/cụm
sau 10 tuần nuôi cấy.
Sử dụng protocorm từ thí nghiệm trên để nuôi cấy trên môi trƣờng MS
có bổ sung thêm nƣớc dừa (ND): 0%; 5%; 10%; 15%; 20% (v/v) để nghiên
cứu khả năng tạo chồi in vitro từ protocorm.
Theo dõi tỷ lệ phần trăm tạo chồi từ protocorm sau 10 tuần nuôi cấy.
2.6.2. Nhân nhanh chồi in vitro:
Sử dụng chồi in vitro 10 tuần tuổi nuôi cấy trên môi trƣờng MS có bổ
sung riêng rẽ các chất điều hoà sinh trƣởng thuộc nhóm KIN và BAP: 0,0;
0,5; 1,0; 1,5; 2,0 (mg/l) và môi trƣờng cơ bản MS bổ sung tổ hợp BAP (0,52,0 mg/l) kết hợp NAA 0,2 mg/l.
Theo dõi số chồi/mẫu, số lá/chồi và chiều cao chồi (cm) sau 8 tuần
nuôi cấy.
2.6.3. Ra rễ-tạo cây in vitro hoàn chỉnh:
Chồi in vitro 2 tháng tuổi có chiều cao 4-5cm đƣợc nuôi cấy trên môi

trƣờng MS có bổ sung NAA (0,3;0,5;0,7 mg/l) hoặc IAA (0,3;0,5;0,7 mg/l) để
khảo sát khả năng tạo rễ in vitro.
Theo dõi tỷ lệ tạo rễ (%), số rễ/chồi và chiều dài rễ (cm) sau 6 tuần
nuôi cấy.
2.6.4. Rèn luyện cây in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên:
Cây D. transparens hoàn chỉnh đƣợc đƣa vào rèn luyện thích nghi với
điều kiện tự nhiên trên giá thể xơ dừa đã đƣợc xử lý.
2.7. Phân tích thống kê số liệu thực nghiệm
Số liệu thực nghiệm đƣợc phân tích theo các tham số thống kê gồm trung
bình mẫu, độ lệch chuẩn, phân tích thống kê số liệu ANOVA 1 yếu tố và kiểm
tra sự sai khác giữa giá trị trung bình bằng phƣơng pháp LSD của Fisher trên

16


phần mềm Excel 2010 [6].

17