Nghiên cứu đặc điểm sinh học của nấm đông trùng hạ thảo tuyết (isaria tenuipes) phân bố ở việt nam

i
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành chương trình đào tạo cao học tại trường Đại học Lâm
nghiệp, nhằm vận dụng kiến thức đã học vào thực tiễn, làm quen với công tác
nghiên cứu khoa học và khả năng tổng hợp phân tích vấn đề, tác giả tiến hành
thực hiện Luận văn tốt nghiệp cao học.
Trong quá trình thực hiện và hoàn thiện luận văn, tác giả đã nhận được
nhiều sự quan tâm, giúp đỡ và đóng góp của cán bộ Phòng nghiên cứu Bảo vệ
Thực vật rừng – Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam, Khoa đào tạo sau Đại
học - Trường Đại học Lâm nghiệp, từ gia đình và bạn bè đồng nghiệp. Tác giả
xin chân thành cảm ơn sự ủng hộ, giúp đỡ đó. Đặc biệt tác giả muốn gửi lời
cảm ơn sâu sắc tới PGS. TS. Phạm Quang Thu, người thầy trực tiếp hướng
dẫn khoa học đã tận tình quan tâm, tạo điều kiện thuận lợi và truyền đạt
những kiến thức quý báu trong suốt quá trình thực hiện.
Luận văn được hoàn thiện trên cơ sở tham khảo nhiều tài liệu có liên
quan và ý kiến đóng góp của nhiều nhà chuyên môn và sự nỗ lực của tác giả.
Tuy nhiên do khả năng, điều kiện và thời gian còn hạn chế, chủ đề nghiên cứu
hoàn toàn mới nên luận văn không tránh khỏi những thiếu sót. Tác giả rất
mong nhận được ý kiến đóng góp, xây dựng của các nhà khoa học cũng như
của bạn bè đồng nghiệp để Luận văn được hoàn thiện.
Xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng 3 năm 2013
Tác giả


ii
MỤC LỤC
Trang
Trang phụ bìa
Lời cảm ơn ...................................................................................................... ..i
Mục lục ............................................................................................................ .ii

Danh mục các bảng .......................................................................................... iv
Danh mục các hình .......................................................................................... ..v
ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................. ..1
Chương 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ..................................... ..2
1.1. Nghiên cứu ở ngoài nước ........................................................................... 2
1.1.1. Nghiên cứu về phân loại nhóm nấm Đông trùng hạ thảo và nấm Đông
trùng hạ thảo tuyết (Isaria tenuipes)................................................................. 2
1.1.2. Nghiên cứu về thành phần hóa học của I. tenuipes ................................ 2
1.1.3. Nghiên cứu về giá trị dược liệu của nấm Đông trùng hạ thảo ............... 4
1.1.4. Nghiên cứu về nuôi trồng thể quả trên giá thể và nuôi cấy sinh khối hệ
sợi ...................................................................................................................... 6
1.2. Nghiên cứu ở trong nước ........................................................................... 7
1.2.1. Nghiên cứu về thành phần loài các loài nấm ký sinh côn trùng và nấm
đông trùng hạ thảo ............................................................................................ 7
1.2.2. Nghiên cứu về giá trị dược liệu............................................................... 8
1.2.3. Nghiên cứu về nuôi trồng thể quả trên giá thể và nuôi cấy sinh khối hệ
sợi ...................................................................................................................... 9
Chương 2 MỤC TIÊU - ĐỐI TƯỢNG - NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU ................................................................................................ 11
2.1. Mục tiêu nghiên cứu................................................................................. 11
2.2. Đối tượng nghiên cứu............................................................................... 11
2.3. Nội dung nghiên cứu. ............................................................................... 11
2.3.1. Phân lập các chủng nấm Isaria tenuipes ở Việt Nam ........................... 11
2.3.2. Đặc điểm sinh học của hệ sợi trong nuôi cấy thuần khiết .................... 11
2.3.3. Nghiên cứu hoạt tính của các chủng nấm ............................................. 11


iii
2.3.4. Nghiên cứu khả năng hình thành thể quả trên giá thể nhân tạo .......... 11
2.4. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 12

2.4.1. Phương pháp phân lập .......................................................................... 12
2.4.2. Đặc điểm sinh học của hệ sợi trong nuôi cấy thuần khiết .................... 12
2.4.3. Phương pháp nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm bê ̣nh của
chủng nấm Isaria tenuipes. ............................................................................. 14
2.4.4. Phương pháp nghiên cứu khả năng hình thành thể quả trên giá thể
nhân tạo ........................................................................................................... 15
Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ........................................................... 16
3.1. Nghiên cứu đặc điểm hình thái, giải phẫu và đặc điểm sinh trưởng của
chủng nấ m Isaria tenuipes .............................................................................. 16
3.1.1. Kế t quả điề u tra, phân lập và nghiên cứu đặc điể m sinh trưởng các
chủng nấ m Isaria tenuipes tại vườn Quố c gia Ba Vì ...................................... 16
3.1.2. Nghiên cứu đặc điểm hình thái, giải phẫu nấ m Isaria tenuipes ........... 19
3.2. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của hệ sợi nấm trong điều kiện nuôi cấy
thuần khiết ....................................................................................................... 20
3.2.1. Nghiên cứu xác định môi trường dinh dưỡng tối ưu cho nhân sinh khối
hệ sợi ............................................................................................................... 20
3.2.2. Nghiên cứu xác định nhiêt độ không khí tối ưu cho quá trình nhân sinh
khối hệ sợi. ...................................................................................................... 25
3.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường đến sinh trưởng của hệ sợi .. 29
3.3. Phương pháp nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm bê ̣nh của
chủng nấm Isaria tenuipes. ............................................................................. 33
3.3.1. Bước đầu đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của nấm Isaria tenuipes ... 33
3.3.2. Bước đầu đánh giá hoạt tính kháng nấm của nấm Isaria tenuipes ...... 36
3.4. Nghiên cứu đánh giá khả năng hình thành thể quả trên giá thể nhân ta ̣o .... 40
3.4.1. Nghiên cứu đánh giá khả năng hình thành thể quả trên giá thể lỏng . 40
3.4.2. Nghiên cứu nuôi trồng thể quả nấm Isaria tenuipes trên nhộng tằm .. 50
KẾT LUẬN - TỒN TẠI - KIẾN NGHỊ .......................................................... 54
TÀI LIỆU THAM KHẢO

iv
DANH MỤC CÁC BẢNG
Tên bảng

TT
1.1
1.2
1.3
3.1
3.2

Trang

Thành phần sinh hoá và nguyên tố khoáng trong nấm I.
tenuipes

3

Thành phần acid amin trong nấm đông trùng hạ thảo I.
tenuipes

4

Thành phần vitamin trong nấm Đông trùng hạ thảo I.
tenuipes

4

Đặc điểm và kết quả phân lập các chủng nấm ở Ba Vì

16

Kết quả xác định môi trường dinh dưỡng nhân sinh khối hệ
sợi nấm Isaria tenuipes

21

3.3

Xác định nhiệt độ không khí tố i ưu cho sinh trưởng của
nấm

26

3.4

Sinh trưởng của nấ m I. tenuipes ở các pH môi trường khác
nhau

29

3.5
3.6
3.7

Đường kính vòng ức chế khuẩn B. subtilis của nấm I.
tenuipes

33

Đường kính vòng ức chế nấm F. oxysporum của nấm I.
tenuipes

37

Xác định môi trường dinh dưỡng tối ưu nuôi trồng thể quả
nấm Isaria tenuipes

40

3.8

Kết quả xác định nhiệt độ không khí tố i ưu cho nuôi trồng
thể quả

43

3.9

Kết quả xác định nhiệt độ không khí tố i ưu cho nuôi trồng
thể quả

46

3.10

Kết quả nghiên cứu khả năng hình thành thể quả của nấm
Isaria tenuipes trên giá thể nhộng tằm

51

v

DANH MỤC CÁC HÌNH
Tên hình

TT

Trang

3.1

Hệ sợi nấm BV2

18

3.2

Hệ sợi nấm BV4

18

3.3

Hệ sợi nấm BV5

18

3.4

Hệ sợi nấm BV6

18

3.5

Hệ sợi nấm BV11

19

3.6

Hệ sợi nấm BV16

19

3.7

Hệ sợi nấm BV17

19

3.8

Thể quả nấm

20

3.9

Bào tử vô tính

20

3.10

Sinh trưởng hê ̣ sơ ̣i nấ m ở các môi trường dinh dưỡng khác
nhau

22

3.11 Sự khác nhau về đô ̣ dầ y hê ̣ sơ ̣i nấ m
3.12
3.13

22

Trọng lươ ̣ng tươi hê ̣ sơ ̣i ở các môi trường dinh dưỡng khác
nhau

23

Tro ̣ng lươ ̣ng khô hê ̣ sơ ̣i ở các môi trường dinh dưỡng khác
nhau

24

3.14 Sinh trưởng của nấ m ở thang nhiê ̣t đô ̣ không khí khác nhau

27

3.15 Tro ̣ng lươ ̣ng tươi hệ sơi ở các nhiệt độ không khí khác nhau

28

3.16 Tro ̣ng lươ ̣ng khô hệ sợi ở các nhiệt độ không khí khác nhau

28

3.17
3.18

Hê ̣ sơ ̣i nấm nuôi cấy trên môi trường CT5 ở các pH khác
nhau

30

Hê ̣ sơ ̣i nấm nuôi cấy trên môi trường CT7 ở các pH khác
nhau

30

3.19 Trọng lượng tươi hệ sợi ở pH môi trường khác nhau

32

3.20 Trọng lượng khô hệ sợi ở pH môi trường khác nhau

32

3.21

Đường kính vòng ức chế khuẩn B. subtilis của nấm I.
tenuipes

34


vi

3.22
3.23
3.24

Khả năng kháng khuẩn Bacillus subtilis của nấm Isaria
tenuipes

35

Khả năng kháng khuẩn của nấm Isaria tenuipes và đối
chứng

36

Đường kính vòng ức chế nấm F. oxysporum của nấm I.
tenuipes

38

3.25 Khả năng kháng nấm của nấm Isaria tenuipes và đối chứng

39

3.26 Thể quả nấ m ở CT2,CT4
3.27 Thể quả nấ m ở CT5

41

3.28
3.29

Tro ̣ng lươ ̣ng tươi thể quả ở các môi trường dinh dưỡng
khác nhau

41
42

Tro ̣ng lươ ̣ng khô thể quả ở các môi trường dinh dưỡng khác
nhau

3.30 Thể quả nấm ở các thang nhiệt độ khác nhau

42
44

3.31

Tro ̣ng lươ ̣ng tươi thể quả ở các nhiệt độ không khí khác
nhau

45

3.32

Tro ̣ng lươ ̣ng khô thể quả ở các nhiệt độ không khí khác
nhau

45

3.33 Thể quả nấ m I. tenuipes trên các pH môi trường khác nhau

47

3.34 Trọng lượng khô thể quả ở pH môi trường khác nhau

48

3.35 Trọng lượng khô thể quả ở pH môi trường khác nhau

49

3.36 Hê ̣ sơ ̣i nấ m I. tenuipes

49

3.37 Thể quả nấ m I. tenuipes
3.38 Thể quả nấm sau 20 ngày

53

3.39 Thể quả nấm sau 30 ngày

53

3.40 Thể quả nấm sau 35 ngày

53

3.41 Thu hoạch thể quả nấm

53

53


1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Nấm đông trùng hạ thảo tuyết (Isaria tenuipes (Peck.) Samson), tên
trước đây là (Paecilomyces tenuipes Peck.) là một loài nấm dược liệu được
nuôi trồng và sử dụng lâu đời ở Hàn Quốc. Trong tự nhiên, loại nấm này tồn
tại ở hai giai đoạn: giai đoạn hữu tính có tên là Cordyceps takaomontana
Yakushiji, còn giai đoạn vô tính có tên là Isaria tenuipes Peck. Đây là một
loài nấm có giá trị dược liệu quý, tác dụng chủ yếu trong điều trị và hỗ trợ
điều trị bệnh ung thư nhờ tác dụng về dược lý và sinh học của chúng. Một
hợp chất hóa học có hoạt tính sinh học có giá trị dược liệu chứa trong thể quả
ở giai đoạn hữu tính và ở giai đoạn vô tính của loài nấm này là 4-acetyl12,13-epoxyl-9-trichothecene-3,15-diol (Oh, G.S. et.al. 2001). Đây là hợp
chất đang được dùng để điều trị bệnh ung thư, đặc biệt là bệnh máu trắng ở
các nước trên thế giới, đặc biệt được sử dụng rộng rãi ở Hàn Quốc (Eiji
Yokoyama et al., 2003). Đây là một loài nấm dược liệu quý và lần đầu tiên

được mô tả và được ghi nhận có phân bố ở Việt Nam. Qua các đợt điều tra,
Trung tâm nghiên cứu bảo vệ rừng - Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam đã
thu được một số mẫu Đông trùng hạ thảo tại rất nhiều nơi như: Vườn Quốc
gia Ba Vì, Vườn quốc gia Tam Đảo, Khu bảo tồn thiên nhiên Tây Yên Tử,...
và nguồn gen các loài này đang đươ ̣c lưu giữ bảo quản ta ̣i phòng.
Việc nhân nuôi và gây trồng nhân tạo thành công loài nấm này có ý
nghĩa vô cùng to lớn trong việc bảo tồn và phát triển loài này ở Việt Nam. Để
nhân nuôi nhân ta ̣o thành công loài nấ m này thì không thể không biết được
đặc điểm sinh học của chúng. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của các loài nấm
Isaria tenuipes là cơ sở khoa học quan trọng được xem như yếu tố quyết định
đến sự thành bại của việc nuôi trồng thể quả nấm nhân tạo.
Với những lý do trên, tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu đặc
điểm sinh học của nấm Đông trùng hạ thảo tuyết (Isaria tenuipes) có phân
bố ở Việt Nam” nhằm góp phần bảo tồn, nghiên cứu ứng dụng và phát triển
bền vững các loài Đông trùng hạ thảo quý hiếm. Thành công của đề tài sẽ có ý
nghĩa rất lớn trong nghiên cứu khoa học và y học nước nhà, đặc biệt là cơ sở để
tiếp tục nghiên cứu quy trình nuôi trồng nhân tạo loại nấm thần dược này.


2
Chương 1
TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.1. Nghiên cứu ở ngoài nước
1.1.1. Nghiên cứu về phân loại nhóm nấm Đông trùng hạ thảo và nấm
Đông trùng hạ thảo tuyết (Isaria tenuipes)
Dựa trên đặc điểm hình thái cũng như đặc điểm về cấu trúc phân tử, các
loài nấm đông trùng hạ thảo được xếp trong 162 đơn vị phân loại thuộc 2 họ
Cordycipitaceae và Ophiocordycipitaceae [14].
Isaria tenuipes là một loài nấm phổ biến được tìm thấy tại nhiều khu
vực miền núi Hàn Quốc [21]. Hình dạng nấm có thể mọc riêng lẻ hay thành

cụm nhóm. Có thể mọc thẳng hoặc đột xuất nhánh, và có thể dài lên 45 mm,
thân cây nấm chủ yếu là màu vàng chanh và bên trên có bột màu trắng [13].
Theo hệ thống phân loại truyền thống loài nấm Isaria tenuipes được
xếp vào họ Clavicipitaceae [11]. Đây là một loài nấm dược liệu được nuôi
trồng và sử dụng lâu đời ở Hàn Quốc. Trong tự nhiên, trên cùng một ký chủ,
rất dễ dàng thấy 2 dạng thể quả: dạng thể quả chứa bào tử hữu tính (stromata)
có tên go ̣i là Cordyceps takaomontana Yakushiji & Kumazawa và dạng thể
quả chứa bào tử vô tính (synnemata) chính là Isaria tenuipes.
1.1.2. Nghiên cứu về thành phần hóa học của I. tenuipes
Nấm I. tenuipes xâm nhiễm nhộng hay sâu non và sau đó hình thành
các dạng thể quả màu vàng mọc thẳng hay phân nhánh ra bên ngoài mình của
vật chủ. Theo y học truyền thống của Trung Hoa, dạng thể quả của nấm I.
tenuipes có giá trị cao về mặt dược liệu do các tác dụng về dược lý và sinh
học của chúng. Các hoạt chất Ergosterol peroxide và Acetoxyscirpenediol
tách chiết từ nấm I. tenuipes nuôi cấy nhân tạo có khả năng ức chế các dòng
tế bào ung thư ở người như tế bào khối u dạ dày, tế bào ung thư gan, tế bào
ung thư ruột kết - ruột thẳng. Hoạt tính của Acetoxyscirpenediol mạnh hơn
Cisplatin là hoạt chất đang được dùng điều trị cho các bệnh nhân ung thư hiện


3
nay là 4 đến 6,6 lần [16] . Một hợp chất hóa học có hoạt tính sinh học có giá
trị dược liệu chứa trong thể quả ở giai đoạn hữu tính và ở giai đoạn vô tính
của loài nấm Isaria tenuipes này là 4-acetyl-12,13-epoxyl-9-trichothecene3,15-diol [17]. Đây là hợp chất đang được dùng để điều trị bệnh ung thư, đặc
biệt là bệnh máu trắng ở các nước trên thế giới, đặc biệt được sử dụng rộng
rãi ở Hàn Quốc [10].
Trong dạng thể quả của nấm Isaria tenuipes còn chứa các hợp chất sinh
học và giá trị dược phẩm cao, chẳng hạn như adenosine và N6-(2hydroxyethyl) adenosine [13]. Có tác dụng tăng cường hệ thống miễn dịch và
lấy lại năng lượng, tương tự các chức năng bổ của nhân sâm.
Một số thành phần sinh hoá, nguyên tố khoáng, acid amin và các

vitamin trong nấm đông trùng hạ thảo I. tenuipes đã được xác định như sau
[30]:
Bảng 1.1: Thành phần sinh hoá và nguyên tố khoáng trong nấm I. tenuipes

STT

Chỉ tiêu

Đơn vị tính

Hàm lượng

1

Protein

% chất khô

7,75

2

Mannitol

% chất khô

1,21

3

Lipid

% chất khô

7,77

4

Cu

mg/kg

21,1

5

Fe

mg/kg

43,9

6

Mn

mg/kg

22,2

7

Se

mg/kg

0,32

8

Zn

mg/kg

2,55

9

Ca

mg/10g

12,0

10

Cr

mcg/10g

0,80

11

K

mg/10g

186,0

12

Na

mg/10g

3,0


4
Bảng 1.2: Thành phần acid amin trong nấm đông trùng hạ thảo I. tenuipes

TT

Acid amin

ĐV

1

Alanin

%

2

Glycin

3

Hàm

Hàm

TT

Acid amin

ĐV

1,40

10

Methionine

%

0,25

%

1,32

11

Glutamic acid

%

2,46

Valin

%

1,00

12

Phenylalanine

%

1,30

4

Leucin

%

1,44

13

Lysine

%

2,66

5

Isoleucin

%

0,69

14

Histidine

%

0,80

6

Threonine

%

0,83

15

Tyrosine

%

2,89

7

Serin

%

0,73

16

Cystine

%

0,12

8

Proline

%

2,83

17

Arginine

%

5,30

9

Asparatic acid

%

1,44

18

Tryptophan

%

0,29

lượng

lượng

Bảng 1.3: Thành phần vitamin trong nấm Đông trùng hạ thảo I. tenuipes

STT

Acid amin

Đơn vị tính

Hàm lượng

1

Vitamin B1

mcg/10g

89,4

2

Vitamin B3

mg/10g

0,37

3

Vitamin B6

mcg/10g

19,1

4

Vitamin C

mg/10g

1,25

5

Vitamin E

mg/10g

0,23

6

Vitamin A

mg/10g

0,12

7

Vitamin D

mg/10g

242,0

1.1.3. Nghiên cứu về giá trị dược liệu của nấm Đông trùng hạ thảo
Nấm Đông trùng hạ thảo là một loại nấm là loại dược liệu quý, rất tốt
cho sức khoẻ, phù hợp với mọi lứa tuổi. Đông trùng hạ thảo là một vị thuốc
bồi bổ hết sức quý giá, có tác dụng tích cực với rấ t nhiề u bệnh như rối loạn


5
tình dục, thận hư, liệt dương, di tinh, hay có tác dụng làm tăng cường công
năng của tuyến thượng thận, cải thiện được chức năng thận, nâng cao năng
lực miễn dịch, kháng khuẩn, kháng virus, chống ung thư và chất phóng xạ.
Isaria tenuipes là một loài nấm có giá trị dược liệu quý, tác dụng chủ
yếu trong điều trị và hỗ trợ điều trị bệnh ung thư nhờ tác dụng về dược lý và
sinh học của chúng. Những hợp chất có hoạt tính chống khối u hoặc tác động
đến hệ thống miễn dịch như: Leucinostatins A, D, Polygalactosamine,
Saintopin, Sphingofungins E và F, UCE1022, Paeciloquinones A, B, C, D, E
và F, Ergosterol peroxide, Acetoxyscirpenediol, … Đă ̣c biê ̣t, hoạt chất
Ergosterol peroxide và Acetoxyscirpenediol trong nuôi cấy nhân tạo có khả
năng ức chế các dòng tế bào ung thư ở người như khối u dạ dày, ung thư gan,

ung thư ruột kết - ruột thẳng được tách chiết và thử nghiệm trên lâm sàng.
Không chỉ vậy loài nấm Isaria tenuipes còn được phát hiện có hàm lượng
dinh dưỡng cao: giàu các vitamin D, vitamin B1, vitamin B6, và nhiều
nguyên tố khoáng như K, Fe, Mg, Cu... (Borchers et al., 1999; Liu et al.,
1996; Lee et al., 1996).
Trong thể quả của nấm Isaria tenuipes còn chứa các hợp chất sinh học
và giá trị dược phẩm cao, chẳng hạn như adenosine và N6-(2-hydroxyethyl)
adenosine [13]. Nấm này đã được sử dụng như một loại thuốc dân gian truyền
thống hoặc như là một thực phẩm thành phần tăng cường hệ thống miễn dịch
và lấy lại năng lượng, tương tự như các chức năng bổ của nhân sâm.
Một kết quả thí nghiệm về sức sống của chuột cho thấy chuột uống dịch
nấm đông trùng hạ thảo chiết trong nước, chiết trong cồn và đối chứng (được
uống nước vô trùng) đều sống khỏe mạnh trong 4 tuần thí nghiệm và biểu
hiện bình thường về hình thái, tập tính trong ăn, uống và các hoạt động khác
trong cả 2 lần thí nghiệm dù liều dùng cho chuột/ngày là rất cao so với thể
trọng của chuột. Điều này cho thấy với liều uống hàng ngày tương đương


6
890mg nấm đông trùng hạ thảo Isaria tenuipes/kg thể trọng là an toàn đối với
chuột bạch. Thời gian bơi của chuột được uống dịch chiết nấm trong nước và
trong cồn đều dài hơn so với đối chứng. Chuột đối chứng có thời gian bơi dao
động từ 3 đến 4 giờ, còn ở các công thức được uống dịch chiết của nấm
thường là trên 5 giờ. Điều đó cho thấy nấm đã tăng cường khả năng vận động
của chuột.
1.1.4. Nghiên cứu về nuôi trồng thể quả trên giá thể và nuôi cấy sinh khối
hệ sợi
Trong những năm gần đây cùng với phương pháp nuôi cấy hệ sợi nấm
trong môi trường lỏng (Xu và cs, 2003; 2004; 2006) thì phương pháp nuôi cấy
nấm nhân tạo trên giá thể tằm - nhộng để sản xuất nấm ở qui mô lớn làm dược

liệu hoặc thức ăn bổ dưỡng rất phát triển tại các nước như Nhật Bản, Trung
Quốc và Hàn Quốc [22]; Kikuchi và cs, 2004.
Nuôi cấy thu sinh khối hệ sợi cũng được các tác giả tiến hành trên môi
trường dinh dưỡng lỏng với thành phần như sau: 40 g/lít đường glucose, 10
g/lít cao nấm men, 0.5 g/lít KH2PO4, 0.5 g/lít K2HPO4:3H2O, và 0.5 g/lít
MgSO4.7H2O.
Ở Hàn Quốc dạng bào tử vô tính Isaria tenuipes đã được nuôi cấy trên
môi trường có chứa nhộng tằm, kết quả cho thấy tỷ lệ số ng cao nhất đạt
97,6% trên các giống tằm được thử nghiệm. Trọng lượng tươi của bào tử vô
tính Isaria tenuipes khác nhau tùy theo từng mùa, dao động từ 1,44 ~ 0,94 g.
Đạt cao nhất khi nuôi cấy vào mùa xuân. Bào tử vô tính của I. tenuipes sản
xuất trên nhộng là màu trắng hoặc màu trắng sữa, và tương tự về hình dạng và
màu sắc thể quả thu thập trong tự nhiên [20].
Trong những năm gần đây cùng với phương pháp nuôi cấy hệ sợi nấm
trong môi trường lỏng thì phương pháp nuôi cấy nấm nhân tạo trên giá thể
nhộng tằ m [15]. Ngoài ra nấm cũng được nuôi cấy trên môi trường gạo và
nhộng tằm [20].


7
Thành phần môi trường nuôi cấy nấm luôn là đề tài để các nhà khoa
học nghiên cứu tìm ra môi trường thích hợp nhất phù hợp với mục đích nuôi
cấy. Thành phần trong 1 lít môi trường [9]: 50g glucose, 1.84g NH4NO3,
0.39g KH2PO4, 1.42g Na2HPO4.12H2O, 0.60g MgSO4.7H2O, 0.1mg KCl,
2mg MnSO4.H2O, 10mg CoCl2.6H2O, 2mg Na2MoO4·2H2O, 20mg
ZnSO4.7H2O, 3mg of CuSO4·5H2O, 2mg of FeSO4.7H2O and 60mg of
EDTA. Trong thành phần này KH2PO4 phosphate làm ảnh hưởng đến sinh
khối của nấm tuy nhiên lại có khả năng kích thích làm tăng số lượng thể quả.
1.2. Nghiên cứu ở trong nước
1.2.1. Nghiên cứu về thành phần loài các loài nấm ký sinh côn trùng và

nấm đông trùng hạ thảo
Các loài nấm ký sinh côn trùng như Beauveria bassiana, Metarhizium
anisopliae,... đã được nghiên cứu về những vấn đề khác nhau như điều tra
thành phần loài, loài sâu bị ký sinh, phân lập và nuôi cấy trong phòng thí
nghiệm và đặc biệt là nhân sinh khối, tạo chế phẩm để phòng trừ một số loài
sâu hại đối với cây nông nghiệp và cây lâm nghiệp. Phân lập và sử dụng nấm
Beauveria để phòng trừ mọt hại nông sản [2]. Nghiên cứu sản xuất với quy
mô công nghiệp và thử nghiệm trên diện rộng chế phẩm nấm ký sinh côn
trùng Beauveria và Metarhizium được thể hiện nhiều trong các công trình
nghiên cứu của [7].
Trong báo cáo tổng kết đề tài "Nghiên cứu xây dựng công trình nuôi
trồng nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris (L.:Fr.) có giá trị dược liệu
và thương mại cao" của PGS.TS Phạm Quang Thu [6] cho thấy đã điều tra
được rất nhiều mẫu nấm của Isaria tenuipes. Loài nấm I. tenuipes này lần đầu
tiên được phát hiện và mô tả ở Việt Nam vào năm 2010 [4]. Loài nấm này
phân bố ở rừng tự nhiên nhiệt đới lá rộng thường xanh ở độ cao từ 800 - 1000
m so với mực nước biển. Hiêṇ đã phát hiêṇ đươ ̣c nhiề u mẫu nấ m Isaria


8
tenuipes ở các Vườn Quốc gia Ba Vì - Hà Nội và Vườn Quốc gia Tam Đảo Vĩnh Phúc, Vườn Quố c gia Tây Yên Tử - Quảng Ninh. Nấm mọc đơn lẻ hoặc
mọc thành cụm, chùm trên nhộng thuộc bộ Cánh vẩy [5].
1.2.2. Nghiên cứu về giá trị dược liệu
Tác dụng của đông trùng hạ thảo cũng được nhiều tác giả Việt Nam
khẳng định. Theo tài liệu tổng hợp của y học cổ truyền Việt Nam thì đông
trùng hạ thảo có tác dụng bổ phế và thận, ích khí, chỉ huyết và trừ đờm. Chủ
trị: trị ho lâu ngày, yếu mệt, thổ huyết, nhiều mồ hôi, di tinh, đau lưng mỏi
gối. Thận kém biểu hiện như bất lực, xuất tinh và đau lưng dưới và đầu gối:
Dùng đông trùng hạ thảo với Sơn thù du, Sơn dược và Thỏ ti tử, hoặc dùng độc
vị đông trùng hạ thảo. Ho và hen mạn tính hoặc ho có đờm máu, do phế hư:

Dùng đông trùng hạ thảo với Sa sâm, A giao và Xuyên bối mẫu. Ra mồ hôi
nhiều do cơ thể mệt, ốm: đông trùng hạ thảo nấu với thịt gà, vịt hoặc heo [29].
Đỗ Tất Lợi (1977) [1] cho rằng Đông trùng hạ thảo là một vị thuốc bổ,
dùng để chữa trị thần kinh suy nhược, chữa ho, ho lao, bổ tinh khí, chữa đau
lưng, bổ thận. Liều dùng 6 - 12 g với hình thức ngâm rượu.
Một số sản phẩm từ nấm Đông trùng hạ thảo I. tenuipes [30]:
- Nấm khô: Nấm tươi sau khi thu hoạch được sấy ở 600C trong 24 giờ
và bảo quản trong tùi nylon hàn kín.
- Rượu Đông trùng hạ thảo: phát triển sản phẩm rượu từ nấm Đông
trùng hạ thảo nhằm mục đích tăng cường thể lực. Thành phần của rượu bao
gồm: Nấm khô được ngâm trong rượu nếp với tỷ lệ 20 gr nấm khô trong 1lít
rượu. Rượu có màu vàng nâu, mùi vị thơm, ngon.
- Viên nang Đông trùng hạ thảo: Bột nấm Đông trùng hạ thảo bổ sung
thêm chất phụ gia được trộn ướt bằng máy trộn siêu tốc rồi sấy tầng sôi ở
700C trong 20 phút. Sau đó trộn khô, đóng viên nang, mỗi viên 400mg. Đóng
lọ 50 viên.


9
1.2.3. Nghiên cứu về nuôi trồng thể quả trên giá thể và nuôi cấy sinh khối
hệ sợi
Ở Việt Nam thì các nghiên cứu về nuôi trồng thể quả nấm đông trùng
hạ thảo Isaria tenuipes có rất ít.
Quy trình sản xuất đông trùng hạ thảo trên tằm dâu của tiến sỹ Nguyễn
Mậu Tuấn [30] tại Trung tâm Nghiên cứu Thực nghiệm Nông Lâm nghiệp
Lâm Đồng tại Bảo Lộc hoàn tất đã mở ra một hướng đi mới đầy triển vọng
cho Lâm Đồng trong việc sản xuất dược liệu quý trên diện rộng. Đây là người
đầu tiên trong nước đưa ra được qui trình hoàn chỉnh về sản xuất đông trùng
hạ thảo trên con tằm dâu, một loại côn trùng được người dân nuôi từ rất lâu
đời và với qui trình này có thể sản xuất đại trà loại dược liệu quý này ngay

trên đất Lâm Đồng. Cho đến nay tiến sỹ Tuấn đã hoàn thiện 2 qui trình nuôi
cấy đông trùng hạ thảo ở 2 sản phẩm là nhộng trùng thảo (Cordyceps
militaris) trên nhộng tằm dâu và đông trùng hạ thảo tằm dâu (Cordyceps
takaomontana hay Isaria tenuipes (còn gọi là Paecilomyces tenuipes)) trên
con tằm dâu.
Theo Tiến sỹ Nguyễn Xuân Thám [30], Phó Giám đốc Sở Khoa học
Công nghệ Lâm Đồng, việc hoàn tất qui trình sản xuất đông trùng hạ thảo trên
tằm dâu có ý nghĩa đặc biệt cho những người làm nghiên cứu sinh học trên
đất Lâm Đồng, mở ra một hướng đi mới cho việc nghiên cứu sản xuất các loại
dược liệu ở địa phương phục vụ phát triển kinh tế xã hội.
Nhận xét:
Từ phần tổng quan tài liệu những nghiên cứu về Đông trùng hạ thảo
cho thấy: nấm Đông trùng hạ thảo là một loài nấm có giá trị dược liệu quý,
chữa trị được nhiều loài bệnh nan y như ung thư, kháng khuẩn, chống oxy hóa
và các bệnh về yếu sinh lý.


10
Nghiên cứu về thành phần loài, giá trị dược liệu và nuôi trồng thể quả
được tiến hành nghiên cứu với trình độ cao ở nhiều nước trên thế giới và đạt
được kết quả tốt.
Tại Việt Nam, những nghiên cứu về thành phần loài nấm Đông trùng
hạ thảo được công bố vào năm 1996 và 2001 có 3 loài nấm thuộc chi
Cordyceps. Về thành phần hóa học và giá trị dược liệu chưa được nghiên cứu
nhiều, từ các nguồn tài liệu khác nhau, các nhà khoa học đã khẳng định nấm
Đông trùng hạ thảo là một dược liệu quý và hiếm.
Từ những cơ sở lý luận trên, việc nghiên cứu hệ thống về nấm Đông
trùng hạ thảo ở Việt Nam là rất cần thiết. Việc phân lập thuần khiết các chủng
nấm ở Việt Nam để lưu trữ nguồn gen và tiến hành xác định hàm lượng để
tuyển chọn chủng có tiềm năng dược liệu cao. Đây là cơ sở ban đầu để tiếp

tục nghiên cứu quy trình nuôi trồng nấm trong điều kiện ở Việt Nam.


11

Chương 2
MỤC TIÊU, ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG
VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Mục tiêu nghiên cứu.
- Tìm hiểu một số đặc điểm của hệ sợi trong nuôi cấy thuần khiết của
các chủng nấm đã thu thập được.
- Đánh giá hoạt tính sinh học của chủng nấm thông qua hoạt tính kháng
khuẩn, kháng nấm bệnh của chúng.
- Đánh giá khả năng hình thành thể quả trên giá thể nhân tạo.
2.2. Đối tượng nghiên cứu
Chủng nấm Isaria tenuipes sưu tầm ở Vườn quốc gia Ba Vì.
2.3. Nội dung nghiên cứu.
2.3.1. Phân lập các chủng nấm Isaria tenuipes ở Việt Nam
- Phân lâ ̣p và nghiên cứu đặc điểm sinh trưởng của hệ sợi nấm trong nuôi cấy
thuần khiết.
- Nghiên cứu đặc điểm hình thái nấ m Isaria tenuipes.
2.3.2. Đặc điểm sinh học của hệ sợi trong nuôi cấy thuần khiết
- Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến sinh trưởng của hệ sợi.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ không khí đến sự sinh trưởng của hệ sợi.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường đến sinh trưởng của hệ sợi.
2.3.3. Nghiên cứu hoạt tính của các chủng nấm
- Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các chủng Isaria tenuipes.
- Đánh giá hoạt tính kháng nấm của các chủng Isaria tenuipes.
2.3.4. Nghiên cứu khả năng hình thành thể quả trên giá thể nhân tạo
- Thí nghiệm nuôi trồng các chủng Isaria tenuipes trên giá thể lỏng

- Thí nghiệm nuôi trồng các chủng Isaria tenuipes trên nhộng tằm.


12

2.4. Phương pháp nghiên cứu.
2.4.1. Phương pháp phân lập
2.4.1.1. Phương pháp phân lập và nghiên cứu đặc điểm sinh học của hệ sợi
trong nuôi cấy thuần khiết
Phân lâ ̣p nấ m: Môi trường phân lập nấm Đông trùng hạ thảo là môi
trường PDA (Potato Dextrose Agar). Môi trường sau khi pha xong được hấp
khử trùng ở 121oC trong thời gian 20 phút sau đó được đổ vào các hộp lồng
vô trùng. Chọn thể quả nấm tươi mới, non không bị sâu bệnh. Tách lấy bô ̣t
bào tử nấ m cấy vào môi trường dinh dưỡng. Sau đó cất giữ mẫu trong tủ định
ôn ở nhiệt độ 25oC. Khi sơ ̣i nấ m bắ t đầ u xuấ t hiêṇ chọn sợi nấm không bị tạp
nhiễm mọc ra từ mô nấm cấy truyền sang môi trường dinh dưỡng mới. Sau
khi tách sợi nấm khoảng 2 - 3 lần, sợi nấm không bị nhiễm khuẩn, nấm tạp và
sợi nấm mọc đồng nhất thì được sợi nấm thuần khiết.
Đặc điểm sinh trưởng của hệ sợi nấm trong nuôi cấy thuần khiết:
Các chủng nấm được cấy trên môi trường chuẩn PDA và được nuôi trong tủ
định ôn có nhiệt độ 250C. Định kỳ theo thời gian 05 ngày quan sát mô tả cách
thức mọc, màu sắc, và đo tốc độ sinh trưởng của hệ sợi và khả năng sinh bào
tử vô tính (bào tử chồi) của nấm. Sử dụng phương pháp quan sát, mô tả, đo
đếm và chụp ảnh dưới sự hỗ trợ của kính hiển vi quang học và kính soi nổi.
2.4.1.2. Nghiên cứu đặc điểm hình thái của nấm Isaria tenuipes
Nhận biết đặc điểm hình thái qua quan sát, mô tả, chụp ảnh (hình dạng,
kích thước, màu sắc…) bằng mắt thường, kính hiển vi soi nổi Olympus SZPT và kính hiển vi quang học Olympus BX50, xem đặc điểm của nấm như thể
quả, bào tử, (hình dạng, kích thước, màu sắc, cách thức sắp xếp…).
2.4.2. Đặc điểm sinh học của hệ sợi trong nuôi cấy thuần khiết
2.4.2.1. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến

sinh trưởng và phát triển của hệ sợi.


13
Nấ m đươ ̣c nuôi cấy trên 07 môi trường dinh dưỡng lỏng với thành phần
như sau:
TT
1

Công thức
Công thức 1

2

Công thức 2

3

Công thức 3

4

Công thức 4

Mô tả công thức thí nghiệm
40 g/lít glucose + 10 g/lít peptone + 0.5 g/lít KH2PO4
+ 0.5 g/lít K2HPO4:3H2O + 0.5 g/lít MgSO4.7H2O.
40 g/lít succose + 10 g/lít peptone + 0.5 g/lít KH2PO4
+ 0.5 g/lít K2HPO4:3H2O, + 0.5 g/lít MgSO4.7H2O.
40 g/lít maltose + 10 g/lít peptone + 0.5 g/lít KH2PO4

+ 0.5 g/lít K2HPO4:3H2O, và 0.5 g/lít MgSO4.7H2O.
40 g/lít fructose + 10 g/lít peptone + 0.5 g/lít KH2PO4
+ 0.5 g/lít K2HPO4:3H2O, + 0.5 g/lít MgSO4.7H2O.
40 g/lít glucose + 10 g/lít peptone + 0.5 g/lít KH2PO4

5

Công thức 5

+ 0.5 g/lít K2HPO4:3H2O, + 0.5 g/lít MgSO4.7H2O +
10g/lit yeast extract.

6

Công thức 6

200 g/lít khoai tây + 20 g/lít glucoze.
30 g/lít glucose + 3 g/lít peptone + 0.5 g/lít KH2PO4

7

Công thức 7

+ 0.5 g/lít K2HPO4:3H2O, + 0.5 g/lít MgSO4.7H2O + 3
g/lit yeast extract + 5g/l nhộng.

Môi trường được pha chế theo đúng tỷ lệ, hấp khử trùng ở 121 oC và
được đổ vào các lọ thuỷ tinh sạch, để nguội và cấy nấm. Mỗi loài nấm được
cấy trên 10 bình thuỷ tinh, thí nghiệm lặp lại 03 lần. Sinh trưởng của hệ sợi
đánh giá thông qua tro ̣ng lươ ̣ng tươi, tro ̣ng lươ ̣ng khô hê ̣ sơ ̣i. Xử lý số liệu

bằng Excel và SPSS.
2.4.2.2. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ không khí đến sinh
trưởng và phát triển của hệ sợi
Sau khi cấy nấm vào hộp lồng chứa môi trường thích hợp đặt vào các
thang nhiệt độ không khí khác nhau: 100C, 150C, 200C, 250C, 300C và 350C.


14
Chỉ tiêu đánh giá là sinh trưởng của hệ sợi, và sự hình thành bào tử vô tính
(bào tử chồi). Mỗi thang nhiê ̣t đô ̣ được cấy trên 10 bình thuỷ tinh, thí nghiệm
lặp lại 03 lần. Xử lý số liệu bằng Excel và SPSS.
2.4.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của độ pH môi trường đến sinh trưởng và
phát triển của hệ sợi.
Nấm đươ ̣c cấ y trong các thang pH khác nhau: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9. pH của
môi trường đươ ̣c điề u chin
̉ h bằng dung dịch HCL 10% và KOH 10%. Sau khi
đã điều chỉnh pH môi trường đem hấp khử trùng ở 121 0C tương đương 1 atm
trong 20 phút. Cấy nấm vào các lọ chứa môi trường thích hợp có độ pH khác
nhau, theo dõi ở thang nhiệt độ 250C và độ ẩm không khí thích hợp. Chỉ tiêu
đánh giá là sinh trưởng của hệ sợi, và sự hình thành bào tử vô tính (bào tử
chồi). Mỗi thang pH được cấy trên 10 bình thủy tinh, thí nghiệm lặp lại 03
lần. Xử lý số liệu bằng Excel và SPSS.
2.4.3. Phương pháp nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm bê ̣nh
của chủng nấm Isaria tenuipes.
Chuẩn bị dịch nuôi cấy: Nuôi cấy hệ sợi nấm của các chủng nấm Đông
trùng hạ thảo cần thử hoạt tính trên môi trường lỏng sau 25 ngày lọc lấy dịch
nuôi cấy. Các chất có hoạt tính sinh học do hệ sợi nấm Đông trùng hạ thảo tạo
ra có trong dịch nuôi cấy.
2.4.3.1. Phương pháp nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của chủng nấm
Isaria tenuipes.

Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn: Khuẩn được chọn để đánh giá hoạt
tính kháng khuẩn của nấm Isaria tenuipes loài Bacillus subtilis. Môi trường
PDA được đổ ra các hộp lồng để nguội trang khuẩn Bacillus subtilis đều trên
mặt thạch, giữa hộp lồng khoan lấy 01 giếng thạch có đường kính 10mm, cho
01ml dịch nuôi cấy nấm vào giếng ở giữa hộp lồng. Nuôi cấy nấm trong điều
kiện 250C, xác định đường kính vòng ức chế. Mỗi loài nấm thí nghiệm với 05
hộp lồng với 03 lần nhắc lại.


15
2.4.3.2. Phương pháp nghiên cứu hoạt tính kháng nấm bê ̣nh của chủng nấm
Isaria tenuipes.
Đánh giá hoạt tính kháng nấ m: Môi trường PDA được đổ ra các hộp
lồng, giữa hộp lồng khoan lấy giếng có đường kính 10mm, cho 01ml dịch
nuôi cấy nấm vào giếng ở giữa hộp lồng. Để hộp lồng trong điều kiện nhiệt độ
40C cho các chất hóa học khuếch tán ra môi trường PDA. Cấy chủng nấm
bênh
̣ được chọn vào 04 góc của hộp lồng chứa dịch. Nuôi cấy nấm trong điều
kiện 25oC, sau 12 ngày xác định đường kính vòng ức chế. Mỗi loài nấm thí
nghiệm với 05 hộp lồng và 03 lần nhắc lại.
2.4.4. Phương pháp nghiên cứu khả năng hình thành thể quả trên giá thể
nhân ta ̣o
2.4.4.1. Phương pháp nghiên cứu khả năng hình thành thể quả trên giá thể
lỏng
Nấm Isaria tenuipes đươ ̣c cấy trên đĩa thạch PDA và nuôi ở điề u kiêṇ
25oC trong 07 - 10 ngày. Nấ m đươ ̣c cấ y trên giá thể nước là môi trường dinh
dưỡng dich
̣ thể được trình bày ở mu ̣c 3.4.2.1. Lo ̣ nuôi cấy có dung tích 250
ml, mỗi lọ đựng 100 ml môi trường dich
̣ thể , chiều sâu của dung dịch 4cm.

Theo dõi sinh trưởng của nấ m và sự hiǹ h thành mầ m thể quả cũng như
thể quả, chỉ tiêu đánh giá là số lươ ̣ng thể quả, hình dáng và màu sắ c thể quả.
2.4.4.2. Phương pháp nghiên cứu khả năng hình thành thể quả trên giá thể
nhộng tằm
Nuôi trồng thể quả nấm đông trùng hạ thảo tuyết trên nhộng tằm được
thực hiện theo quy trình của Pil - Don Kang và cộng sự 2010 [19].


16
Chương 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Nghiên cứu đặc điểm hin
̀ h thái, giải phẫu và đặc điểm sinh trưởng
của chủng nấ m Isaria tenuipes
3.1.1. Kế t quả phân lập và nghiên cứu đă ̣c điểm sinh trưởng các chủng
nấ m Isaria tenuipes ta ̣i vườn Quố c gia Ba Vì
Ta ̣i Vườn Quố c gia Ba Vì đã thu đươ ̣c 07 chủng nấ m Isaria. Kế t quả
phân lâ ̣p nấ m đươ ̣c trình bày trong bảng 3.1 sau:
Bảng 3.1: Đặc điểm và kết quả phân lập các chủng nấm ở Ba Vì.

STT

Ký hiệu
chủng

Ký chủ

Kết quả
phân lập

Tôc đô ̣
sinh trưởng
(µm/giờ)

Độ dày
hệ sợi (mm)

1

BV2

Cánh vẩy Thành công

170,9

0,8

2

BV4

Cánh vẩy Thành công

183,9

0,3

3

BV5

Cánh vẩy Thành công

172,6

0,8

4

BV6

Cánh vẩy Thành công

195,8

0,6

5

BV11

Cánh vẩy Thành công

168,2

0,3

6

BV16

Cánh vẩy Thành công

163,6

0,5

7

BV17

Cánh vẩy Thành công

151,1

0,2

Kế t quả ở bảng trên cho thấ y 7 mẫu nấ m thu đươ ̣c đề u ký sinh trên ký
chủ của bô ̣ cánh vẩ y và cả 7 mẫu đề u phân lâ ̣p thành công tức là nấ m đề u có
thể sinh trưởng đươ ̣c trong môi trường dinh dưỡng nhân ta ̣o. Các mẫu nấm
được ký hiệu là chủng BV2, BV4, BV5, BV6, BV11, BV16, BV17. Đặc điểm
hệ sợi nấm của từng chủng được mô tả dưới đây:


17
Chủng BV2: Hệ sợi nấm khi cấy trên môi trường dinh dưỡng PDA khi
non có màu trắng, khi già chuyển dần sang màu vàng nhạt, sợi nấm dài, hệ sợi
rất bông, độ dầy hệ sợi 0,8 mm, hệ sợi thường mọc thành những vòng tròn
đồng tâm (Hình 3.1).
Chủng BV4: Hệ sợi nấm bông, ngắn, màu trắng, độ dầy hệ sợi 0,3 mm,

hệ sợi nấm mọc thành những đường tròn đồng tâm bên trên có một lớp bột
mỏng màu trắng. Nấm sinh trưởng nhanh (Hình 3.2).
Chủng BV5: Hệ sợi nấm bông, sợi nấm ngắn có màu vàng nhạt, độ dầy hệ
sợi 0,8 mm. Hệ sợi nấm cũng mọc thành những đường tròn đồng tâm (Hình 3.3).
Chủng BV6: Hệ sợi nấm dày 0,6 mm, nấm khi non có màu trắng, khi
già chuyể n sang màu vàng chanh nha ̣t, sơ ̣i nấ m ngắn mọc bám trên bề mặt
thạch. Nấ m sinh trưởng nhanh nhất trên môi trường PDA, với tố c đô ̣ sinh
trưởng 195,8 µm/giờ trong điề u kiê ̣n nuôi cấ y thuầ n khiế t trên môi trường PDA
hê ̣ sơ ̣i nấ m vẫn có khả năng hiǹ h thành thể quả gầ n giố ng với thể quả ngoài tự
nhiên (Hình 3.4). Vì vậy, đề tài chọn nấm BV6 để tiến hành nghiên cứu về các
đặc điểm hình thái, giải phẫu, kháng khuẩn kháng nấm và nuôi trồng nhân tạo.
Chủng BV11: Hệ sợi nấm bông, ngắn, có màu trắng đục. Độ dày hệ sợi
0,3 mm, tốc độ sinh trưởng khá nhanh. Trong điều kiện nuôi cấy thuần khiết
thấy xuất hiện chồi bào tử phân sinh (Hình 3.5).
Chủng BV16: Hệ sợi nấm bông, ngắn, màu trắng tinh, độ dầy hệ sợi
0,3. Nấm mọc tròn đều, tốc độ sinh trưởng khá chậm. Trong điều kiện nuôi
cấy thuần khiết chưa thấy xuất hiện chồi bào tử phân sinh (Hình 3.6).
Chủng BV17: Hệ sợi nấm ít bông, màu trắng hơi vàng, độ dầy hệ sợi
0,2 mm, tốc độ sinh trưởng của nấm là chậm nhất (Hình 3.7).


18

Một số hình ảnh về các chủng nấm phân lập được

Hình 3.1: Hệ sợi nấm BV2

Hình 3.2: Hệ sợi nấm BV4

Hình 3.3: Hệ sợi nấm BV5

Hình 3.4: Hệ sợi nấm BV6


19

Hình 3.5: Hệ sợi nấm BV11

Hình 3.6: Hệ sợi nấm BV16

Hình 3.7: Hệ sợi nấm BV17
(Nguồn: Tác giả)
3.1.2. Nghiên cứu đặc điểm hình thái, giải phẫu nấ m Isaria tenuipes
Ngoài tự nhiên, thể quả nấ m có màu trắng, bông, chiều dài thể quả nấ m
khoảng 5 - 45 mm, thể quả (synnemata) bao gồ m 2 phầ n chính là: cuống nấm
và tế bào sinh bào tử vô tính (conidiogenous structures). Cuống nấ m dài bằng
¾ chiều dài thể quả, nấm có màu vàng chanh. Phần trên là đỉnh sinh bào tử vô
tính phân thành nhiều nhánh giống như san hô và căng phồng chứa đầy bào tử