Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc famotidin của màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường nước dừa già

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH-KTNN

NGUYỄN THỊ LIÊN

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG
THUỐC FAMOTIDIN CỦA MÀNG
CELLULOSE VI KHUẨN LÊN MEN TỪ
MÔI TRƯỜNG NƯỚC DỪA GIÀ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật

Người hướng dẫn khoa học
TS. Nguyễn Xuân Thành

HÀ NỘI, 2017


LỜI CẢM ƠN
Với lòng trân trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn ThS.
Hà Thị Minh Tâm, người thầy đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt
quá trình thực hiện khóa luận.
Tôi cũng xin bày tỏ lời cảm ơn tới các thầy cô tại Viện Nghiên cứu Khoa
học và Ứng dụng trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tạo mọi điều kiện
thuận lợi giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận này.
Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn Ban chủ nhiệm khoa Sinh - KTNN,
trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2. Đặc biệt, Tôi xin cảm ơn sự giúp đỡ, động
viên của gia đình, bạn bè tôi trong suốt thời gian làm khóa luận.
Mặc dù Tôi đã có nhiều cố gắng để hoàn thành khóa luận một cách tốt
nhất. Tuy nhiên do lần đầu làm quen với công việc nghiên cứu khoa học cũng

như hạn chế về kiến thức và kinh nghiệm nên không thể tránh khỏi những
thiếu sót, tôi rất mong nhận được sự góp ý của quý thầy, cô giáo để khóa luận
hoàn chỉnh hơn.
Một lần nữa, tôi xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, ngày

tháng 4 năm 2017

Sinh viên

Nguyễn Thị Liên


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin khẳng định những gì viết trong khóa luận “Nghiên cứu khả
năng giải phóng thuốc famotidin của màng cellulose vi khuẩn lên men từ
môi trường nước dừa già” là kết qủa nghiên cứu của cá nhân tôi dưới sự
hướng dẫn trực tiếp của ThS. Hà Thị Minh Tâm, giảng viên khoa Sinh KTNN trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2. Tất cả những số liệu đều được thu
thập từ thực nghiệm và qua xử lý thống kê, không trùng với bất cứ tài liệu
nào.
Hà Nội, ngày tháng 4 năm 2017
Sinh viên

Nguyễn Thị Liên


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
LỜI CAM ĐOAN

DANH MỤC BẢNG, HÌNH, SƠ ĐỒ
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài ....................................................................................... 1
2. Mục đích nghiên cứu ................................................................................. 3
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ............................................................. 3
4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiến...................................................... 3
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 4
1.1. Giới thiệu tổng quan về đối tượng, lĩnh vực nghiên cứu ....................... 4
1.1.1. Tổng quan về màng CVK ................................................................... 4
1.1.1.1. Vi khuẩn sản sinh CVK ................................................................... 4
1.1.1.2. Cấu trúc màng CVK ......................................................................... 7
1.1.1.3. Đặc tính của màng CVK .................................................................. 7
1.1.1.4. Chức năng sinh lý của CVK ............................................................ 8
1.1.2. Thuốc Famotidin ................................................................................. 8
1.1.2.1. Giới thiệu chung về thuốc ................................................................ 8
1.1.2.2. Tính chất........................................................................................... 9
1.1.2.3. Chỉ định và chống chỉ định .............................................................. 9
1.2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước .......................................... 10
1.2.1. Tình hình nghiên cứu về màng CVK ................................................ 10
1.2.1.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ................................................. 10
1.2.1.2. Tình hình nghiên cứu trong nước................................................... 11
1.2.2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về hướng nghiên cứu .... 12
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............. 13
2.1. Vật liệu nghiên cứu .............................................................................. 13
2.1.1. Giống vi khuẩn .................................................................................. 13


2.1.2. Nguyên liệu - hóa chất ...................................................................... 13
2.2. Thiết bị - dụng cụ ................................................................................. 13

2.2.1. Thiết bị .............................................................................................. 13
2.2.2. Dụng cụ ............................................................................................. 14
2.3. Phương pháp nghiên cứu...................................................................... 14
2.3.1. Phương pháp tạo màng CVK ............................................................ 14
2.3.2. Phương pháp dựng đường chuẩn ...................................................... 16
2.3.3. Phương pháp xác định lượng thuốc được hấp thụ vào màng CVK .. 17
2.3.4. Phương pháp xác định lượng thuốc giải phóng từ màng CVK ........ 19
2.3.4. Phương pháp phân tích dược động học giải phóng của thuốc
Famotidin .................................................................................................... 20
2.3.5. Phương pháp xử lí thống kê .............................................................. 20
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 21
3.1. Tạo màng CVK của A. xylinum trong môi trường nước dừa già ......... 21
3.2. Thu màng CVK thô từ môi trường ...................................................... 22
3.3. Tinh chế màng CVK ............................................................................ 23
3.4. Xác định lượng thuốc Famotidin giải phóng khỏi màng CVK ............ 23
3.6. Dược động học giải phóng thuốc của màng CVK ............................... 29
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 32
TÀI LỆU THAM KHẢO


DANH MỤC BẢNG, HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ
Bảng 2.1. Môi trường lên men tạo màng CVK ............................................... 14
Sơ đồ 2.1. Quy trình nuôi cấy thu nhận CVK ................................................. 15
Bảng 2.2. Giá trị mật độ quang phổ của Famotidin ở các nồng độ khác nhau
(n =3) ................................................................................................. 16
Hình 2.1. Đồ thị đường chuẩn Famotidine ở bước sóng 265nm. ................... 17
Bảng 2.3. Dung dịch đệm đa năng Britton và Robinson ................................ 19
Hình 3.1. Màng CVK khi nuôi cấy tĩnh ngày thứ 4 ........................................ 21
Hình 3.2. Màng CVK với thời gian nuôi cấy khác nhau ................................ 22
Hình 3.3. Màng CVK tinh chế ........................................................................ 23

Bảng 3.1. Giá trị OD hấp thụ thuốc của màng CVK (n = 3) .......................... 24
Bảng 3.2. Khối lượng Famotidin được hấp thụ, tỉ lệ hấp thụ và cường độ hấp
thụ Famotidin của màng CVK (n = 3) .............................................. 24
Bảng 3.3. Mật độ quang phổ màng CVK đang giải phóng thuốc tại các thời
điểm lấy mẫu (n = 3) ......................................................................... 25
Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn OD giải phóng thuốc Famotidin của màng CVK 26
Bảng 3.4. Tỉ lệ thuốc Famotidin được giải phóng tại các thời điểm lấy mẫu 27
Hình 3.4. Đường cong biểu diễn tỉ lệ giải phóng Famotidine của màng CVK
........................................................................................................... 28
Bảng 3.5. Hệ số tương quan (R2), tốc độ giải phóng thuốc (k) và trị số mũ giải
phóng (n) đối với các môi trường pH khác nhau (n = 3) .................. 30


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Tên viết tắt

Tên tiếng anh

Tên tiếng việt

A. xylinum

Acetobacter xylinum

Acetobacter xylinum

CVK

Bacterial Cellulose

Cellulose vi khuẩn
Cộng sự

Cs
E. coli

Escherichia coli

Vi khuẩn đại tràng

OD

Optical Density

Mật độ quang phổ

PC

Plant Cellulose

Cellulose thực vật


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Famotidin là loại thuốc kháng H2, thành phần chủ yếu là famotidin, có tác
dụng làm giảm tiết cả số lượng và nống độ HCl dịch vị do ức chế tác dụng
của Histamine lên tế bào dạ dày, làm lành các vết loét dạ dày, tá tràng, giảm
đau do loét. Thuốc có tác dụng phòng trừ loét tái phát khi dùng ở liều thấp và
kéo dài. Liều cao dùng để điều trị loét, thuốc có tác dụng chữa ợ hơi và làm

lành các vết loét, viêm thực quản do trào ngược axit.
Tuy nhiên trong quá trình dùng thuốc, người bệnh có thể gặp những tác
dụng phụ nhẹ của thuốc như: táo bón, đau đầu, ỉa chảy, mất ngủ, buồn nôn và
nôn do làm co thắt thực quản. Các tác dụng phụ khác gồm kích thích, thiếu
máu, lẫn lộn, loạn nhịp tim, dị ứng phát ban, trầm cảm, dễ chảy máu và bầm
tím, dụng tóc, thay đổi thị giác, vàng da hoặc mắt, da khô, ù tai, thay đổi vị
giác… Đây là những triệu chứng có thể gặp ngay cả ở liều điều trị. Đối với
phụ nữ có thai và trẻ em không nên dùng vì chưa có nghiên cứu về độ an toàn
của thuốc với 2 đối tượng này, đối với phụ nữ đang cho con bú không nên
dùng vì thuốc này có bài tiết qua sữa mẹ. Giảm liều lượng dùng với bệnh
nhân suy thận để tránh tích lũy Famotidin trong thận.
Trong những năm gần đây các nhà nghiên cứu đã có sự chú ý đặc biệt tới
việc sử dụng các vật liệu sinh học trong chăm sóc sức khỏe vì khả năng tái
tạo, tương thích sinh học và phân hủy sinh học của chúng. Một trong những
vật liệu sinh học được chú ý đến là cellulose. Vật liệu này vượt trội so với các
polymer tự nhiên và tổng hợp khác [16]. Tuy nhiên, hình thái, đặc tính và các
lĩnh vực ứng dụng cụ thể phụ thuộc nhiều vào nguồn gốc, tức là quá trình xây
dựng các loại cellulose.
Cellulose Vi khuẩn (CVK) là sản phẩm của một số loài vi khuẩn, đặc
biệt là chủng A. xylinum. CVK có cấu trúc và đặc tính rất giống với cellulose
1


thực vật (PC) [7, 9]. CV khác với PC ở chỗ không chứa các hợp chất cao phân
tử như lignin, hemicellulose, pectin và sáp nến do vậy chúng có những đặc
tính vượt trội với độ dẻo dai, bề chắc, độ đàn hồi cao, có khả năng hút nước
cao ở trạng thái ẩm và độ tinh khiết cao, có thể phân hủy sinh học, tái chế hay
phục hồi hoàn toàn, bề mặt tiếp xúc lớn hơn gỗ bình thường, không độc và
không gây dị ứng, có khả năng chịu nhiệt tốt và đặc biệt là khả năng cản
khuẩn [3, 6, 7, 9]. Với các đặc tính vượt trội như vậy, màng CVK được ứng

dụng trong nhiều lĩnh vực như: công nghệ thực phẩm, công nghệ giấy, công
nghệ pin, dùng làm màng lọc vi khuẩn [9]. Đặc biệt trong lĩnh vực y học,
màng CVK đã được ứng dụng làm da tạm thời thay thế da trong quá trình
điều trị bỏng, loét da, làm mạch máu nhân tạo điều trị các bệnh tim mạch, làm
ống thông niệu quản (Wan và Millon 2005) [9], làm mặt nạ dưỡng da cho con
người [6, 7, 9]. Ngoài ra, màng CVK còn có tác dụng giữ thuốc và kéo dài
thời gian giải phóng thuốc [10]. Bên cạnh đó, các sợi cellulose có cấu trúc
mạng sẽ là hệ thống vận chuyển và phân phối thuốc làm tăng sinh khả dụng
của thuốc, nó có thể giúp thuốc không bị phá hủy trong môi trường acid.
Các nghiên cứu cho thấy màng CVK được tạo ra từ các nguyên liệu rẻ
tiền, dễ kiếm, có thể sản xuất trên quy mô công nghiệp. Môi trường nuôi cấy
vi khuẩn A. xylinum rất đa dạng như nước dừa già, rỉ đường, nước mía,…
Trong đó nước dừa già được coi là môi trường kinh điển trong nuôi cấy A.
xylinum [9].
Với mục đích nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc famotidin của màng
cellulose vi khuẩn để khắc phục được những tác dụng phụ của thuốc
Famotidin trong chữa trị bệnh viêm loét dạ dày, chúng tôi đã chọn nghiên cứu
đề tài: “Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc famotidin của màng
cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường nước dừa già”

2


2. Mục đích nghiên cứu
Chế tạo được màng CVK từ vi khuẩn Acetobacter xylinum trong môi
trường nước dừa già.
Tìm hiểu khả năng giải phóng thuốc dựa trên màng CVK đã được tạo ra
để khắc phục những tác dụng không mong muốn của thuốc Famotidin trong
điều trị bệnh viêm loét dạ dày.
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu: Khả năng giải phóng thuốc famotidin của màng
cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường nước dừa già.
Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu được thực hiện ở quy mô phòng thí
nghiệm.
Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm sinh lý người và động vật trường
ĐHSP Hà Nội 2; Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng trường ĐHSP Hà
Nội 2.
4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiến
Ý nghĩa khoa học: Nghiên cứu này giúp tăng thêm hiểu biết về ứng
dụng của màng CVK. Mở ra những hướng nghiên cứu mới về khả năng hấp
thụ và giải phóng thuốc của màng CVK trên nhiều các loại thuốc khác nhau
nhằm kéo dài thời gian giải phóng và tăng sinh khả dụng của các loại thuốc
đó.
Ý nghĩa thực tiễn: Xây dựng được quy trình tạo màng CVK từ chủng A.
xylinum; Từ màng CVK đã được tạo ra được dùng để nghiên cứu khả năng
giải phóng thuốc nhằm khắc phục được những tác dụng phụ không mong
muốn trong việc điều trị viêm loét dạ dày bằng thuốc Famotidin. Từ kết quả
nghiên cứu được có thể áp dụng vào thực tiễn.

3


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu tổng quan về đối tượng, lĩnh vực nghiên cứu
1.1.1. Tổng quan về màng CVK
1.1.1.1. Vi khuẩn sản sinh CVK
CVK là sản phẩm của một số loại vi khuẩn, đặc biệt là chủng A. xylinum.
A.

xylinum

thuộc

nhóm

vi

khuẩn

Acetic,

chi

Acetobacter,

họ

Pseudomonadaceae. Là loại hiếu khí bắt buộc, có tiêm mao và sản xuất
cellulose ngoại bào [9].
Theo khóa phân loại của Bergey, A. xylinum thuộc [9]:
Lớp: Schizomycetes
Bộ: Pseudomonadales
Bộ phụ: Pseudomonadieae
Họ: Pseudomonadaceae
A. xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, kích thước ngang
khoảng 0,6 - 0,8µm, dài khoảng 2 - 3µm, vi khuẩn không sinh bào tử, gram
âm, không di động, sắp xếp riêng rẽ đôi khi xếp thành chuỗi, nhưng khi tế bào
già hay do điều kiện môi trường nuôi cấy, hình dạng có thể bị biến đổi: tế bào
dài hơn, phình to ra, phân nhánh hoặc không phân nhánh [9].
Trong môi trường nuôi cấy rắn, sau khoảng từ 3 - 7 ngày nuôi cấy, sẽ thu

được khuẩn lạc nhỏ rồi lớn dần, đường kính hạt từ 2 - 5mm, tròn, nhày, rìa
mép trơn, có màu kem, hơi trong. Nhưng sau một tuần khuẩn lạc to, đục, có
màu cafe sữa rồi khô dần [15].
A. xylinum là loài vi khuẩn hiếu khí. Nhiệt độ tối ưu cho vi khuẩn phát
triển từ 25 - 30oC. Ở nhiệt độ 37oC tế bào sẽ bị suy thoái hoàn toàn. Nhiệt độ
thích hợp nhất là 25oC. Vi khuẩn tăng trưởng trong khoảng pH từ 3 - 8, pH
tối ưu để sản xuất cellulose là 5,5 [15].
4


A. xylinum sử dụng cacbon từ nhiều loại đường khác nhau, tùy thuộc vào
chủng mà lượng đường có thể thay đổi, nhưng đường hay được sử dụng và
cho hiệu suất cao là: glucose, fructose, manitol, sorbitol, nguồn đường cho
hiệu suất thấp hơn là glycerol, galactose, sucrose, maltose [8, 9].
A. xylinum có thể tích tụ acid acetic trong môi trường nuôi cấy. Các tế
bào vi khuẩn kháng lại được sự thay đổi pH của môi trường. Trong lúc nuôi
cấy pH môi trường có thể giảm đi từ 1 - 2 đơn vị do sự tạo ra acid acetic, acid
gluconic. Do đó, người ta thường bổ sung acid acetic vào môi trường nuôi cấy
để tránh nhiễm các loài vi khuẩn lạ [15].
Vi khuẩn có khả năng oxy hóa ethanol thành acid acetic, phản ứng
catalase dương tính, không tạo sắc tố nâu, có khả năng tổng hợp cellulose,
chuyển hóa glucoso thành acid acetic, chuyển glycerol thành dihydroxyaceton
[9].
Trong môi trường nuôi cấy lỏng, vi khuẩn sử dụng đường để chuyển hóa
thành cellulose tạo lớp màng dày trên bề mặt của môi trường. Sau 36 - 48 giờ
lớp màng dày, trong và đạt đến độ dày nhất định sau 7 - 10 ngày [15].
Môi trường nuôi cấy A. xylinum là môi trường tổng hợp từ các nguồn
dinh dưỡng cần thiết như nguồn cacbon, nito, nguồn sulfur và phospho, các
yếu tố tăng trưởng và các yếu tố vi lượng [9].
A. xylinum là loài có khả năng tổng hợp cellulose từ nguồn

cacbonhydrat. Nguồn cacbonhydrat mà A. xylinum sử dụng là glucose,
fructose, manitol, sorbitol, nếu sử dụng glcerol, galactose, lactose, sucrose
cho hiệu suất thấp hơn, không nên sử dụng mantose, cellobiose, erythriol,
acetate [15].
Nhu cầu sử dụng đường của A. xylinum là rất lớn và giữ vai trò quan
trọng trong quá trình tổng hợp CVK nên có rất nhiều nghiên cứu và đề nghị
sử dụng các sản phẩm thứ cấp trong các ngành công nghiệp khác như: rỉ
5


đường, nước dừa già, nước mía,... để làm nguyên liệu trong nuôi cấy A.
xylinum. Trong đó nước dừa già được xem là môi trường kinh điển trong nuôi
cấy A. xylinum [8, 9, 15]. Thành phần nước dừa già [15] được trình bày trong
bảng 1.1.
Bảng 1.1. Thành phần của nước dừa già
Nước (%)

94.99

Đồng (mg/100g)

0.04

Protein (%)

0.72

Mangan (mg/100g)

0.142

Chất béo toàn phần (%)

0.2

Selenium (µg/100g)

1

Carbonhydrat (%)

3.17

Vitamin C (mg/100g)

2.4

Đường (%)

2.16

Thiamin (mg/100g)

0.03

Calcium (mg/100g)

24

Riboflavin (mg/100g)

0.057

Sắt (mg/100g)

0.29

Niacin (mg/100g)

0.08

Magie (mg/100g)

25

Acid Panthenic (mg/100g) 0.043

Phosphorus (mg/100g)

20

Vitamin B6 (mg/100g)

0.032

Kali (mg/100g)

250

Folate (µg/100g)

3

Natri (mg/100g)

105

Kẽm (mg/100g)

0.1

Nước dừa già là môi trường thích hợp để nuôi cấy vi khuẩn vì trong
nước dừa chứa rất nhiều chất dinh dưỡng và chất kích tố tăng trưởng như
1,3 - diphenyllurea, hexitol, cytolunin, myoinositol, sorbitol,... Vì vậy A.
xylinum rất phát triển trong môi trường này [9, 15].
Nước dừa sau khi thu hoạch được sử dụng không quá 3 ngày, tránh để
lâu làm cho đường và các chất dinh dưỡng khác giảm đi dẫn đến cho hiệu suất
kém [9].

6


1.1.1.2. Cấu trúc màng CVK
CVK được cấu tạo bởi những chuỗi polimer β - 1, 4 glucopyranose mạch
thẳng được tổng hợp từ một số loài vi khuẩn, chủ yếu là A. xylinum. Màng
CVK do A. xylinum tạo ra có cấu trúc hóa học đồng nhất với PC, tuy nhiên
chúng khác nhau về cấu trúc đại thể [7, 9].
Theo AJ. Brown (1886) [12], CVK bao gồm nhiều sợi siêu nhỏ có bản
chất là hemicellulose, đường kính 1.5nm , kết hợp với nhau thành bó, nhiều
bó hợp thành dãy, mỗi dãy dài khoảng 100nm, rộng khoảng 3 - 8nm.

1.1.1.3. Đặc tính của màng CVK
Trong nuôi cấy tĩnh, CVK tích lũy trên bề mặt môi trường dinh dưỡng
lỏng thành lớp màng mỏng như da, sau khi tinh chế và làm khô tạo thành sản
phẩm tương tự như giấy da với độ dày 0.01 – 0.5nm. Sản phẩm này có những
tính chất rất đặc biệt như: độ tinh sạch cao, khả năng đàn hồi tốt, độ kết tinh
và độ bền cơ học cao, khả năng thấm hút nước cao, độ polymer hóa lớn,
đường kính sợi nhỏ, có khả năng phục hồi độ ẩm ban đầu, có thể bị phân hủy
bởi enzym, không chứa các hợp chất cao phân tử như lignin, hemicellulose,
pectin và sáp nến, có thể bị phân hủy sinh học, bề mặt tiếp xúc lớn hơn gỗ
thường, không độc và không gây dị ứng, có khả năng chịu nhiệt tốt, đặc biệt
là khả năng cản khuẩn [7, 8, 9].
Với các tính chất này CVK được ứng dụng rất nhiều trong các ngành
công nghiệp khác nhau trong đó có y học. CV đã dược sử dụng thành công để
băng vết thương và cho cấy ghép tim mạch [13]. Ở Brazil, màng CVK ướt
tinh sạch được sản xuất và bán ra thị trường như một loại da nhân tạo dùng
đắp vết thương [9].

7


1.1.1.4. Chức năng sinh lý của CVK
A. xylinum là vi khuẩn tổng hợp polysaccharid ngoại bào, những tế bào
vi khuẩn này nằm trong mạng lưới polymer giúp tế bào bám chặt vào bề mặt
môi trường và thu nhận chất dinh dưỡng dễ dàng hơn so với tế bào vi khuẩn
không nằm trong mạng lưới polymer [9].
CVK có các đặc tính như độ bền cơ học cao, tính thấm và tính hút cao,
trạng thái kết tinh giúp A. xylinum kháng lại sự thay đổi của môi trường như
việc thay đổi xuống 1 hay 2 đơn vị pH trong thời gian nuôi cấy hay do lượng
nước bị giảm đi, các chất chuyển hóa được sinh ra [9].
1.1.2. Thuốc Famotidin

1.1.2.1. Giới thiệu chung về thuốc
Tên chung quốc tế: Famotidine
Tên tiếng Việt: Famotidin
Tên IUPAC: 3-[2-[(aminoiminomethy) amino]-4-thiazolyl] methyl]
thio]-N-(aminosulfonyl) propanimidamide.
Công thức phân tử:
CH5N7O2S3
Công thức cấu tạo:

Phân tử khối: 337,43 g/mol
Loại thuốc: đối kháng thụ thể histamine H2.

8


1.1.2.2. Tính chất
Famotidin là một chất kết tinh màu trắng, vàng nhạt. Nó ít tan trong
nước, không tan trong ethanol, aceton, ethyl acetat và ethyl ether. Nó dễ tan
trong acid vô cơ loãng.
Famotidin ức chế cạnh tranh tác dụng của histamine ở thụ thể H2 tế bào
vách, làm giảm tiết và giảm nồng độ acid dạ dày cả ngày và đêm, và cả khi
kích thích do thức ăn, histamine hoặc pentagastrin. Hoạt tính đối kháng
histamine ở thụ thể H2 của Famotidine phục hồi chậm, do thuốc khuếch tán
chậm khỏi thụ thể. So sánh theo phân tử lượng Famotidine có hoạt lực mạnh
hơn gấp 20 – 150 lần so với cimetidine và 3 – 20 lần so với Ranitidine trong
ức chế tiết acid dạ dày.
1.1.2.3. Chỉ định và chống chỉ định
Chỉ định: Famotidin được chỉ định trong điều trị loét dạ dày và loét tá
tràng, trào ngược dạ dày- thực quản và các tình trạng tăng tiết (hội chứng
Zollinger- Ellison), chữa ợ hơi và viêm thực quản do trào ngược axit, giảm

đau do loét, làm lành các vết loét.
Chống chỉ định: Dị ứng với các thành phần của thuốc. Famotidin nên
dùng thận trọng với người bị suy thận do thuốc thải trừ chủ yếu qua thận.
Tác dụng không mong muốn của thuốc:
+ Tiêu hóa: tiêu chảy hoặc táo bón, buồn nôn và nôn, khô miệng, biến ăn.
+ Thần kinh: Ðau đầu, chóng mặt,trầm cảm, rối loạn tâm thần nhất thời,
mất ngủ.
+ Da: dị ứng, phát ban da khô, vàng da, trứng cá.
+ Thận: Tăng creatinin huyết.
+ Tim mạch: gây loạn nhịp tim, nhịp tim bất thường, rối loạn tâm thất nhất
thời.

9


+ Máu: dễ chảy máu, tăng transaminase huyết tương,hiếm khi mất bạch
cầu hạt, giảm toàn thể tiểu cầu, giảm bạch cầu, giảm tiểu cầu, thiếu máu
không tái tạo. Các thuốc kháng histamin H2 gây giảm tiết acid nên cũng giảm
hấp thụ vitamin B12 rất dễ gây thiếu máu.
+ Gan: Viêm gan mãn tính dẫn đến vàng da, rối loạn chức năng gan, viêm
tụy, nhưng sẽ khỏi khi ngừng thuốc.
+ Cơ: đau cơ, đau khớp.
1.2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
1.2.1. Tình hình nghiên cứu về màng CVK
1.2.1.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Trên thế giới màng Cellulose vi khuẩn đã được ứng dụng rất nhiều
trong các lĩnh vực công nghệ khác nhau như: dùng làm màng phân tách cho
quá trình xử lí nước, chất mang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế
bào, dùng làm chất biến đổi độ nhớt trong sản xuất các sợi truyền quang, làm
môi trường cơ chất trong sinh học, thực phẩm hay thay thế thực phẩm. Đặc

biệt trong lĩnh vực y học, màng CVK đã được ứng dụng làm da tạm thời thay
thế da trong quá trình điều trị bỏng, loét da, làm mạch máu nhân tạo điếu trị
các bệnh tim mạch; làm mặt nạ dưỡng da cho con người.
Nghiên cứu về màng CVK từ vi khuẩn A. xylinum và những ứng dụng
của nó đã được tiến hành ở nhiều nước trên thế giới. Tác giả Brown (1989),
dùng màng CVK làm môi trường phân tách cho quá trình xử lý nước, dùng
làm chất mang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế bào. Brown (1989),
Jonas và Farad, 1998, dùng màng như là một chất để biến đổi độ nhớt, để
làm ra các sợi truyền quang, làm môi trường cơ chất trong sinh học, thực
phẩm [9].
Czaja và cs (2006) sử dụng màng CVK đắp lên các vết thương hở, vết
bỏng đã thu được kết quả tốt. Đặc biệt tác giả Wan (Canada) đã được đăng kí
10


bản quyền về làm màng CVK từ A. xylinum dùng trị bỏng. Các tác giả Jonas
và Farad (1998), Czaja và cs (2006) đã dùng màng CVK làm da nhân tạo,
mặt nạ dưỡng da cho phụ nữ [9].
1.2.1.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
Từ năm 2000, Bộ môn Vi Sinh - Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành
phố Hồ Chí Minh đã bước đầu nghiên cứu dùng màng CVK từ A. xylinum
phối hợp với hoạt chất tái sinh mô của dầu mù u điều trị vết bỏng thực
nghiệm cho kết quả tốt [9].
Nguyễn Văn Thanh và cs (2006) [9] đã tiến hành nuôi cấy, tinh chế và
thu màng CVK từ A. xylium đạt hiệu cao. Đồng thời nhóm nghiên cứu trên
cũng đã tiến hành thử nghiệm in vivo trong ứng dụng màng CVK điều trị
bỏng với 2 loại màng CVK gồm cho thêm hoạt chất tái sinh mô và hoạt chất
kháng khuẩn. Kết quả cho thấy màng CVK có cho thêm hoạt chất tái sinh mô
từ dầu mù u làm gia tăng hiệu quả trị bỏng là ưu điểm mà các loại màng khác
trên thế giới không có.

Năm 2012, Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Thị Thùy Vân, Trần Như
Quỳnh [7] đã công bố công trình nghiên cứu “Nghiên cứu vi khuẩn
Acetobacter xylinum tạo màng bacterial cellulose ứng dụng trong điều trị
bỏng”, kết quả cho thấy màng CVK tạo bởi A. xylinum BNH2 tổng hợp có sợi
cellulose nhỏ, dai, độ bền kéo, độ thấu khí cao; độ hút nước tốt có triển vọng
ứng dụng làm màng trị bỏng.
Trong những năm gần đây phòng thí nghiệm Thực vật - Vi sinh Trường
Đại học Sư phạm Hà Nội 2 phân lập tuyển chọn được chủng A. xylinum BHN
có khả năng tạo màng CVK và những nghiên cứu bước đầu cho thấy màng
CVK từ chủng A. xylinum BHN có khả năng ứng dụng cho trị bỏng cho thỏ là
cơ sở để tạo ra màng trị bỏng cho người. Mong muốn khắc phục được những

11


tác dụng phụ của thuốc Famotidin trong chữa bệnh viêm loét dạ dày, nâng cao
tối đa hiệu quả của thuốc mà tiết kiệm được chi phí. Màng CVK có thể tự sản
xuất trong nước từ những nguồn nguyên liệu dễ kiếm và giá thành thấp, có
những đặc tính phù hợp trong việc nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc
Famotidin.
1.2.2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về hướng nghiên cứu
Tính đến cuối năm 2014 trên thế giới chỉ có 18 nghiên cứu ứng dụng
CVK trong vận tải và phân phối thuốc đã được báo cáo [10], trong đó có 9
nghiên cứu với màng CVK tinh khiết, 2 nghiên cứu với thể chất biến đổi
màng CVK và 7 với các vật liệu nanocomposite. Như vậy, trong lĩnh vực này
cần tiếp tục được tiến hành nghiên cứu.
Amineda.I.F và cs [10] (2014) đã nghiên cứu việc sử dụng màng CVK
làm hệ thống phân phối thuốc thử nghiệm in vitro trên da, kết quả nghiên cứu
cho thấy CVK có thể sử dụng làm hệ thống phân phối thuốc qua da, tuy nhiên
vẫn cần kiểm tra sự tương thích với da trong điều kiện bình thường. Viêc bổ

sung glycerol vào màng CVK giúp màng linh động hơn, giúp giữ ẩm cho da.
Ở Việt Nam việc ứng dụng màng CVK làm hệ thống phân phối thuốc
vẫn còn là hướng đi mới, cần được nghiên cứu thêm.
Hiện chưa có công trình nào công bố về việc sử dụng CVK từ dừa già
làm hệ thống hấp thụ và giải phóng thuốc Famotidin.

12


CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Giống vi khuẩn
Giống vi khuẩn A. xylinum thuần chủng được cung cấp bởi Phòng thí
nghiệm Vi sinh, khoa Sinh – KTNN, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2.
2.1.2. Nguyên liệu - hóa chất
Nguyên liệu: Nước dừa già.
Hóa chất: Famotidin dạng tinh khiết (98%).
Pepton, đường glucose.
(NH4)2SO4, KH2PO4.
Acid boric, NaOH, HCl.
Nước cất, cồn 960.
CH3COOH, H3PO4.
2.2. Thiết bị - dụng cụ
2.2.1. Thiết bị
Cân phân tích CP 224S.
Cân kĩ thuật TE 412.
Máy đo quang phổ tử ngoại UV - 2450 (Shimadzu - Nhật Bản).
Nồi hấp khử trùng HV - 110/HIRAIAM.
Buồng cấy vô trùng (Haraeus).

Tủ ấm (Biner - Đức).
Khuấy từ gia nhiệt (IKA - Đức).
Máy lắc tròn tốc độ chậm (Orbital Shakergallenkump - Anh).
Bể rung siêu âm S60/H
Bể ổn nhiệt 1013.
Tủ sấy, máy ép màng.

13


2.2.2. Dụng cụ
Hộp nhựa để lên men tạo màng CVK, cốc đong 500ml, 1000ml, pipet,
bình định mức, bình tam giác, bình xịt cồn, kéo, giấy bạc, giấy thấm, giấy quỳ
tím và một số dụng cụ khác.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp tạo màng CVK
Tạo màng CVK từ môi trường chuẩn Hestrin - Schramm [19] có cải tiến
bằng cách thay cao nấm men bằng nước dừa già được trình bày trong bảng
2.1.
Bảng 2.1. Môi trường lên men tạo màng CVK
Thành phần

Khối lượng

Nước dừa già

1000ml

Đường glucose

30g

(NH4)2SO4

0.5g

KH2PO4

0.3g

Pepton

10g

Acid acetic

2%

Dịch giống A. xylinum

10%

Pha môi trường với tỉ lệ như trong bảng 2.1, hấp khử trùng ở 113 oC
trong 15 phút sau đó khử trùng bằng tia UV trong 30 phút để nguội môi
trường rồi bổ sung 10% dịch giống và 2% acid acetic, nuôi cấy tĩnh trong 6
ngày ở 26oC thu được sản phẩm màng CVK thô [7].
Sau khi nuôi cấy tĩnh từ 6 - 14 ngày, ở 26oC màng CVK được tách ra
rửa sạch bằng nước cất sau đó tinh chế theo quy trình ở sơ đồ 2.1 [9].

14

Tách màng CVK thô
Ép loại nước
Ngâm trong NaOH 3%
48 giờ, rửa và ép
Ngâm trong HCl 3%
48 giờ, rửa và ép
Ngâm trong nước
48 giờ, kiểm tra tạp chất
CVK tinh chế
Sơ đồ 2.1. Quy trình nuôi cấy thu nhận CVK
Tách CVK: Trong môi trường nuôi cấy tĩnh CVK tạo thành màng dày ở
mặt môi trường nuôi cấy, ép màng loại bỏ môi trường.
Trong màng chứa một lượng lớn vi khuẩn vì vậy ngâm màng trong
NaOH 3% trong 48 giờ để pha vỡ thành tế bào vi khuẩn và giải phóng nội độc
tố của vi khuẩn [9].
Ngâm HCl: Màng sau khi được ngâm NaOH rửa nước rồi ép màng. Sau
đó ngâm với HCl 3% trong khoảng 48 giờ để trung hòa hết NaOH [9].
Ngâm nước: Màng sau khi ngâm HCl rửa nước rồi ép màng. Ngâm nước
đến trung hòa hết acid HCl thời gian khoảng 48 giờ thu được CVK tinh chế
[9].
CVK tinh chế được sấy trong tủ sấy ở 90oC, áp suất thường đến khối
lượng không đổi, ta được khối lượng CVK tạo thành [9].

15


2.3.2. Phương pháp dựng đường chuẩn
Nguyên tắc: Dựa vào mẫu dung dịch chuẩn (5 mẫu):

Pha thuốc Famotidin ở các nồng độ là 5%, 10%, 15%, 20%, 25%.
Dùng máy đo quang phổ tử ngoại UV - 2450 để đo mật độ quang phổ
(OD) của các dung dịch chuẩn đã pha ở bước sóng 265nm [1, 19].
Dựng đồ thị đường chuẩn và lập phương trình chuẩn thuốc Famotidine
bằng phần mềm Excel 2010.
Để kết quả đo có độ chính xác cao tiến hành pha dung dịch chuẩn 3 lần
và đo quang phổ 3 lần lấy giá trị trung bình để dựng đường chuẩn.
Kết quả trung bình quang phổ của thuốc Famotidin ở bước sóng 265nm
được trình bày trong bảng 2.2.
Bảng 2.2. Giá trị mật độ quang phổ của Famotidin ở các nồng độ khác
nhau (n =3)
Nồng độ

5

10

15

20

25

0.326

0.488

0.651

0.823

(mg/ml)
OD

0.171

± 0.001 ±0.0487 ±0.0015 ±0.002

16

±0.0015


Mật độ quang

OD 265nm

y = 0.0327x + 0.001
R² = 0.9996

0.450
0.400
0.350
0.300
0.250
0.200
0.150
0.100
0.050
0.000

OD 265nm
Linear (OD 265nm)

0

10

20

30

Nồng độ thuốc famotidin

Hình 2.1. Đồ thị đường chuẩn Famotidine ở bước sóng 265nm.
Từ đồ thị đường chuẩn ta thu được phương trình đường chuẩn của
Famotidin ở bước sóng 265nm sau:
y = 0.0327x + 0.001
R2 = 0.9996
Trong đó: x là nồng độ Famotidin (mg/ml) ;
y là giá trị OD tương ứng với nồng độ x ;
R2 là hệ số tương quan.
2.3.3. Phương pháp xác định lượng thuốc được hấp thụ vào màng CVK
Lượng thuốc Famotidin hấp thụ vào màng CVK được tiến hành thử
nghiệm trên 2 mẫu.
Mẫu 1: Dùng màng CVK có độ dày 0.3cm.
Mẫu 2: Dùng màng CVK có độ dày 0.5cm.
Cho 2 mẫu màng CVK đã sấy khô vào 2 bình tam giác có chứa sẵn
100ml dung dịch Famotidine 5%. Sau đó cho vào bể rung siêu âm để ở nhiệt
độ 37oC, sau 30 phút, 1 giờ, 2 giờ lấy mẫu ra đo quang phổ để xác định lượng

17


thuốc được hấp thụ vào màng đến khi giá trị OD không đổi hoặc thay đổi
không đáng kể, lặp lại thí nghiệm 3 lần lấy giá trị trung bình để tính toán.
Lấy giá trị OD thu được thay vào phương trình đường chuẩn ta được
nồng độ Famotidin (C%) trong dung dịch, từ đó tính được khối lượng
Famotidin có trong dung dịch theo công thức số 1 [4]:
C% (w/v) = [mct(mg)/Vdd(ml)] × 100% (1)
Trong đó:

C% là nồng độ phần trăm khối lượng - thể tích chỉ số mg chất

tan có trong 100 ml dung dịch;
mct là khối lượng chất tan (mg) ;
Vdd là thể tích của dung dịch (ml).
Sau khi tính được lượng thuốc Famotidin có trong dung dịch ta tính được
khối lượng thuốc Famotidin được hấp thụ vào màng CVK theo công thức 2:
mHT = m1 - m2 (2)
Trong đó:

mHT là khối lượng thuốc Famotidin được hấp thụ vào màng

CV (mg) ;
m1 là khối lượng thuốc Famotidin ban đầu (mg) ;
m2 là khối lượng thuốc Famotidin có trong dung dịch sau khi
hấp thụ (mg).
Tỉ lệ thuốc được hấp thụ vào màng CV được tính theo công thức số 3
[19]:

EE (%) =

Q Q
Q
T

D

× 100%(3)

T

Trong đó:

EE là phần trăm thuốc được hấp thụ vào màng ;

Q

T

Q

D

là lượng thuốc lý thuyết ;
là lượng thuốc còn lại.

18