Nghiên cứu khả năng hấp thụ thuốc berberin của màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường nước dừa già

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN

======

PHẠM THỊ MONG

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THỤ
THUỐC BERBERIN CỦA MÀNG
CELLULOSE VI KHUẨN LÊN MEN TỪ
MÔI TRƢỜNG NƢỚC DỪA GIÀ
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học ngƣời và động vật

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học
ThS. CAO BÁ CƢỜNG

HÀ NỘI, 2017


LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình thực hiện khóa luận này, tôi đã nhận đƣợc sự hƣớng dẫn
và giúp đỡ tận tình về mọi mặt từ các thầy cô, bạn bè. Nhân dịp này, tôi xin
đƣợc bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới ThS. Cao Bá Cƣờng
(Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2).
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với sự giúp đỡ nhiệt tình của
các thầy cô của Viện NCKH và ƢD Trƣờng ĐHSP Hà Nội 2, các thầy cô
trong khoa Sinh - KTNN, các thầy cô trong Ban Giám hiệu, Phòng đào tạo
cùng toàn thể các thầy cô, cán bộ Trƣờng ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo mọi điều
kiện giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận.
Tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên, hỗ trợ tôi trong suốt quá

trình học tập và thực hiện khóa luận này.
Một lần nữa, tôi xin trân trọng cảm ơn!
Hà Nội, 20 tháng 4 năm 2017
SINH VIÊN

Phạm Thị Mong


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan những kết quả và số liệu trong khóa luận “Nghiên cứu
khả năng hấp thụ thuốc berberin của màng cellulose vi khuẩn lên men từ
môi trƣờng nƣớc dừa già” là kết qủa nghiên cứu của cá nhân tôi trong suốt
thời gian qua dƣới sự hƣớng dẫn trực tiếp của ThS. Cao Bá Cƣờng, giảng
viên khoa Sinh - KTNN - Trƣờng ĐHSP Hà Nội 2 và đƣợc thực hiện tại
“Viện NCKH và ƢD Trƣờng ĐHSP Hà Nội 2”. Những số liệu và kết quả
trong khoá luận này là trung thực, không có sự trùng lặp hoặc sao chép của
một tài liệu nào khác.
Nếu sai tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm.
Hà Nội, 20 tháng 4 năm 2017
SINH VIÊN

Phạm Thị Mong


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài ....................................................................................... 1
2. Mục đích nghiên cứu................................................................................. 3
3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu............................................................. 3
4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn ..................................................... 3

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................... 4
1. Cellulose vi khuẩn và vi sinh vật tổng hợp cellulose ............................... 4
1.1. Cellulose vi khuẩn và tính chất của CVK .............................................. 4
1.1.1. Cellulose vi khuẩn............................................................................... 4
1.1.2. Cấu trúc kết tinh của cellulose vi khuẩn ............................................. 4
1.1.3. Tính chất của cellulose vi khuẩn......................................................... 5
1.1.4. Ứng dụng của CVK............................................................................. 6
1.2. Vi sinh vật tổng hợp cellulose................................................................ 8
1.2.1. Phân loại A. xylinum ........................................................................... 8
1.2.2. Đặc điểm hình thái của A. xylinum ..................................................... 8
1.2.3. Đặc điểm sinh lý của A. xylinum......................................................... 9
1.2.4. Vai trò của CVK đối với A. xylinum ................................................... 9
1.2.5. Môi trƣờng nuôi cấy A. xylinum ......................................................... 9
2. Giới thiệu về thuốc berberin ................................................................... 11
2.1. Công thức ............................................................................................. 11
2.2. Tính chất............................................................................................... 12
2.3. Tác dụng dƣợc lý.................................................................................. 12
2.4. Tƣơng tác thuốc ................................................................................... 12
2.5. Chỉ định ................................................................................................ 13
2.6. Chống chỉ định ..................................................................................... 13
3. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc ............................................. 13


3.1. Tình hình nghiên cứu thuốc ................................................................. 13
3.1.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới.................................................... 13
3.1.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam .................................................... 13
3.2. Tình hình nghiên cứu màng CVK ........................................................ 14
3.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới.................................................... 14
3.2.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam .................................................... 14
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......... 16

1. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu........................................................... 16
2. Nội dung nghiên cứu ............................................................................... 16
3. Các thiết bị và hóa chất sử dụng trong nghiên cứu ................................. 16
4. Phƣơng pháp nghiên cứu ........................................................................ 16
4.1. Phƣơng pháp tạo màng CVK ............................................................... 16
4.2. Phƣơng pháp xử lý màng CVK trƣớc khi hấp thụ thuốc berberin....... 18
4.3. Phƣơng pháp đánh giá độ tinh khiết của màng CVK .......................... 20
4.4. Phƣơng pháp dựng đƣờng chuẩn ......................................................... 20
4.5. Phƣơng pháp xác định lƣợng thuốc đƣợc hấp thụ vào màng CVK ..... 22
4.6. Phƣơng pháp thống kê và xử lý kết quả............................................... 23
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................. 24
1. Màng CVK thu đƣợc khi nuôi cấy trong môi trƣờng nƣớc dừa già ....... 24
2. Màng CVK thu đƣợc sau nuôi cấy.......................................................... 24
3. Màng CVK tinh chế ................................................................................ 25
4. Kiểm tra độ tinh khiết của màng CVK ................................................... 26
5. Màng CVK hấp thụ thuốc berberin......................................................... 27
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................... 31
1. Kết luận ................................................................................................... 31
2. Kiến nghị ................................................................................................. 31
TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................... 32


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

Từ viết tắt
A. xylinum

Từ đầy đủ
Acetobacter xylinum

CVK

Celulose vi khuẩn

OD

Mật độ quang phổ

ĐHSP

Đại học Sƣ phạm

NCKH và ƢD

Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng

Nxb

Nhà xuất bản


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Ứng dụng của CVK .......................................................................... 7
Bảng 1.2. Thành phần của nƣớc dừa già. ........................................................ 10
Bảng 2.1. Môi trƣờng lên men tạo màng CVK ............................................... 17
Bảng 2.2. Kết quả đo dƣờng chuẩn thuốc berberin ở bƣớc sóng 345nm
(n = 3)............................................................................................ 21
Bảng 3.1. Giá trị OD của dung dịch berberin 10% khi ngâm màng CVK
(n= 3) ............................................................................................. 28
Bảng 3.2. Lƣợng thuốc berberin hấp thụ vào màng CVK (n = 3) .................. 29

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của berberin....................................................... 11
Sơ đồ 2.1. Quy trình sản xuất CVK ................................................................ 18
Sơ đồ 2.2. Quy trình xử lý thu CVK tinh khiết ............................................... 19
Hình 2.1. Đồ thị đƣờng chuẩn berberin ở bƣớc sóng 345nm ......................... 21
Hình 3.1. Màng CVK nuôi ngày đầu (a) và màng CVK nuôi ngày thứ 6 (b). 24
Hình 3.2. Màng CVK thu đƣợc sau khi nuôi cấy. .......................................... 25
Hình 3.3. Các quy trình xử lý màng CVK ...................................................... 25
Hình 3. 4. Kết quả thử sự hiện diện của đƣờng glucose ................................. 26
Hình 3. 5. Màng CVK đang hấp thụ thuốc berberin ....................................... 27


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Cellulose là một hợp chất hóa học thƣờng đƣợc biết đến với vai trò là
bộ khung xƣơng quan trọng trong cơ thể thực vật. Không những cellulose
đƣợc tổng hợp bởi thực vật, mà cellulose còn đƣợc tổng hợp nên bởi vi sinh
vật, với tên gọi là cellulose vi khuẩn (viết tắt là CVK). Một trong những loài
vi sinh vật có khả năng tổng hợp cellulose rất tốt đó là Acetobacter xylinum
(A. xylinum).
Cellulose vi khuẩn có cấu trúc và đặc tính rất giống với cellulose của
thực vật (gồm các phân tử glucose liên kết với nhau bằng liên kết β-1,4
glucan), cellulose vi khuẩn khác với cellulose thực vật ở chỗ: không chứa các
hợp chất cao phân tử nhƣ lignin, hemicellulose, pectin và sáp nến do vậy chúng
có những đặc tính vƣợt trội với độ dẻo dai, bền chắc [2], [28]. Màng CVK ngày
càng đƣợc quan tâm nhiều hơn bởi nó đã đƣợc ứng dụng nhiều trong các lĩnh
vực công nghệ khác nhau: dùng màng CVK làm môi trƣờng phân tách cho quá

trình xử lí nƣớc, dùng làm chất mang đặc biệt cho các pin và năng lƣợng cho tế
bào, làm môi trƣờng cơ chất trong sinh học, thực phẩm hay thay thế thực phẩm,
thiết kế hệ thống hấp thu và giải phóng thuốc cùng nhiều ứng dụng khác [28].
Gần đây, khả năng ứng dụng màng CVK không ngừng đƣợc nghiên cứu, cải
tiến bởi các nhà khoa học trên thế giới (Otomo et al.,2000). Ở Việt Nam, việc
nghiên cứu và ứng dụng màng CVK còn ở mức độ khiêm tốn, các nghiên cứu
ứng dụng mới chỉ dừng lại bƣớc đầu nghiên cứu.
Theo các kết quả nghiên cứu cho thấy màng CVK đƣợc tạo nên từ các
nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm, có thể sản xuất trên quy mô công nghiệp. Môi
trƣờng nuôi cấy vi khuẩn A. xylinum rất đa dạng nhƣ nƣớc dừa già, rỉ đƣờng,
nƣớc mía,… Trong đó nƣớc dừa già đƣợc coi là môi trƣờng kinh điển trong
nuôi cấy A. xylinum [7].

1


Về mặt tính chất, CVK có độ tinh sạch lớn hơn nhiều so với các loại
cellulose khác, có thể phân hủy sinh học, tái chế hay phục hồi hoàn toàn.
Ngoài ra CVK còn có độ bền tinh thể cao, sức căng lớn, trọng lƣợng thấp, khả
năng thấm hút lớn, đƣờng kính sợi nhỏ,... Đồng thời CVK là một hàng rào cản
oxi và các sinh vật khác, ngăn cản sự phân hủy các cơ chất ở trong tế bào và
ngăn cản tác động của UV, ổn định về kích thƣớc và hƣớng, màng CVK còn
có ý nghĩa giữ thuốc và giải phóng thuốc kéo dài [27], [20],… Bên cạnh đó,
các sợi cellulose có cấu trúc mạng sẽ là hệ thống hấp thu thuốc làm tăng sinh
khả dụng của thuốc [20].
Nƣớc ta thuộc khí hậu nhiệt đới gió mùa: nóng ẩm, mƣa nhiều nên vi
khuẩn, nấm mốc và kí sinh trùng rất dễ phát triển, cùng với điều kiện vệ sinh
an toàn thực phẩm cũng nhƣ vệ sinh môi trƣờng ở nhiều nơi còn khá thấp nên
dễ tạo thành tạo các bệnh nhƣ rối loạn tiêu hóa, tiêu chảy, đau mắt hột.
Berberin là thuốc thông thƣờng mọi ngƣời hay sử dụng khi có dấu hiệu tiêu

chảy, thậm chí nhiều ngƣời luôn để sẵn trong túi xách.
Berberin là một alcaloid thực vật thuộc nhóm isoquinolin có trong nhiều
loại cây thuốc ở Việt Nam, khoảng 150 loài thuộc nhiều họ thực vật khác nhau.
Berberin chủ yếu ở trong thân và rễ cây vàng đắng với tỷ lệ 1.5-3%. Berberin
đƣợc biết đến với tác dụng nổi bật là kìm khuẩn tả và E. coli, điều trị bệnh lỵ.
Thuốc đƣợc sử dụng phổ biến do giá thành thấp và khá an toàn, không ảnh
hƣởng tới sự phát triển bình thƣờng của vi khuẩn có ích ở ruột. Hiện nay trên
thị trƣờng có các dạng bào chế của berberin nhƣ: thuốc nhỏ mắt, viên nén, viên
bao. Vì vậy vấn đề kiểm tra chất lƣợng nguyên liệu làm thuốc cũng nhƣ thành
phẩm là rất quan trọng. Tuy nhiên berberin chủ yếu đƣợc sử dụng qua đƣờng
uống với sinh khả dụng khá thấp. Việc đƣa thuốc vào cơ thể là mong muốn của
các nhà điều chế thuốc trong nhiều thập kỷ qua nhằm tăng sinh khả năng hấp
thu của thuốc nhƣng vấn đề này không hề đơn giản.

2


Với mục đích khắc phục những tác dụng phụ không mong muốn từ
thuốc berberin và giảm chi phí cho quá trình thí nghiệm và sản xuất. Đó là lí
do chúng tôi đã chọn đề tài: "Nghiên cứu khả năng hấp thụ thuốc berberin
của màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường nước dừa già".
2. Mục đích nghiên cứu
- Nghiên cứu, chế tạo màng CVK từ vi khuẩn A. xylinum trong môi
trƣờng nƣớc dừa già.
- Thiết kế khả năng hấp thụ thuốc berberin dựa trên màng CVK nhằm
tăng lƣợng thuốc hấp thụ vào cơ thể.
- Làm thế nào để lƣợng thuốc hấp thu vào màng CVK là nhiều nhất.
3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
- Đối tƣợng nghiên cứu: khả năng hấp thụ thuốc berberin của màng
cellulose vi khuẩn lên men từ môi trƣờng nƣớc dừa già.

- Vật liệu nghiên cứu: màng CVK làm từ môi trƣờng nƣớc dừa già,
thuốc berberin.
- Phạm vi nghiên cứu: nghiên cứu đƣợc thực hiện ở quy mô phòng thí
nghiệm.
- Địa điểm nghiên cứu: phòng thí nghiệm sinh lý ngƣời và động vật
khoa Sinh - KTNN - Trƣờng ĐHSP Hà Nội 2; Viện NCKH và ƢD Trƣờng
ĐHSP Hà Nội 2.
4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
- Ý nghĩa khoa học của đề tài: nghiên cứu về màng CVK để tăng thêm
hiểu biết về ứng dụng của màng CVK, tìm ra đƣợc khả năng hấp thụ thuốc
berberin của màng CVK.
- Ý nghĩa thực tiễn của đề tài: nếu thành công, đề tài định hƣớng khắc
phục đƣợc nhƣợc điểm berberin thông thƣờng nhƣ nâng cao tác dụng của
thuốc, rút ngắn thời gian điều trị và giảm chi phí điều trị cho con ngƣời,…

3


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1. Cellulose vi khuẩn và vi sinh vật tổng hợp cellulose
1.1. Cellulose vi khuẩn và tính chất của CVK
1.1.1. Cellulose vi khuẩn
Cellulose vi khuẩn là một chuỗi polymer do các glucopyranose nối với
nhau bằng liên kết β-1,4-glucan. Những chuỗi glucan đƣợc vi khuẩn tổng hợp
nối lại với nhau thành thớ sợi thứ cấp, có bề rộng 1.5nm [6, 23]. Đây là những
thớ sợi tự nhiên mảnh nhất khi so sánh với sợi cellulose sơ cấp trong tƣợng
tầng ở một vài loài thực vật. Các thớ sợi thứ cấp kết lại thành những vi sợi,
những vi sợi tạo thành bó sợi, những bó sợi tạo thành dải. Dải có chiều dày 34nm, và chiều dài 130-177nm (Yamanaka et al., 2000). Các dải siêu mịn của
cellulose vi khuẩn có chiều dài từ 1-9µm tạo thành cấu trúc mắt lƣới dày dặc,
đƣợc ổn định nhờ các liên kết hydro, đó là lớp màng film (Bielecki et al.,

2001) [7, 23].
1.1.2. Cấu trúc kết tinh của cellulose vi khuẩn
Ngày nay nhờ vào các kỹ thuật công nghệ hiện đại ngƣời ta đã xác định
đƣợc cấu trúc của cellulose vi khuẩn. Chẳng hạn nhƣ kỹ thuật nhiễu xạ tia X
giúp xác định đƣợc kích thƣớc và phân biệt cấu trúc cellulose vi khuẩn.
Những kỹ thuật khác nhƣ phổ hồng ngoại, phổ Raman, và phổ cộng hƣởng từ
hạt nhân giúp xác định các dạng kết tinh của cellulose (Bielecki et al., 2001).
Nhƣ các cellulose tự nhiên khác, cellulose vi khuẩn đƣợc tạo thành bởi
hai loại cấu trúc tinh thể riêng biệt, cellulose Iα và Iβ. Trong vi sợi cellulose
đều có sự tham gia của hai loại cấu trúc tinh thể này (Yamamoto & Horii,
1993). Trong khi hầu hết tinh thể Iβ tinh khiết thu đƣợc từ cellulose thực vật
thì vẫn chƣa có cách nào thu nhận đƣợc các tinh thể Iα tinh khiết từ nguồn
này. Cấu trúc của cellulose đƣợc tổng hợp từ vi khuẩn A. xylinum chứa nhiều
tinh thể Iα hơn cellulose thực vật, hàm lƣợng loại tinh thể này có thể lên đến

4


hơn 60%. Tỉ lệ này có thể dao động trong khoảng 64% đến 71% tuỳ vào
chủng vi sinh vật và nhiệt độ môi trƣờng (Yamamoto & Horii, 1994). Ngƣợc
lại Iβ chủ yếu có trong thành phần cellulose hình thành nên thành tế bào của
một số loài thực vật bậc cao nhƣ cotton và gai. Ở đó, cellulose Iα chỉ chiếm
khoảng 20%.
Nhìn chung, cấu trúc tinh thể đƣợc coi nhƣ là một yếu tố quan trọng
trong việc xác định các tính chất của cellulose mặc dù cho đến bây giờ vẫn có
rất ít các nghiên cứu về sự tƣơng quan giữa cấu trúc tinh thể và những đặc
tính riêng biệt của cellulose đƣợc thực hiện.
1.1.3. Tính chất của cellulose vi khuẩn
Tính chất của CVK đã đƣợc nghiên cứu bởi nhiều tác giả [21, 22]:
- Cellulose vi khuẩn là cellulose rất trong suốt, cấu trúc mạng tinh thể

mịn, kích thƣớc ổn định, sức căng và độ bền sinh học cao.
- Khả năng giữ nƣớc và hấp thụ nƣớc cực tốt, tính xốp chọn lọc.
- Có độ tinh sạch cao so với các loại cellulose khác, không chứa ligin và
hemicellulose.
- Có thể bị phân hủy hoàn toàn bởi một số vi sinh vật, là nguồn tài
nguyên có thể phục hồi.
- Khả năng kết sợi, tạo tinh thể tốt.
- Tính bền cơ tốt, khả năng chịu nhiệt tốt: tinh thể cellulose vi khuẩn có
độ bền cao, ứng suất dài lớn, trọng lƣợng nhẹ, tính bền rất cao.
- Lớp màng cellulose đƣợc tổng hợp một cách trực tiếp, vì vậy việc sản
xuất một số sản phẩm từ cellulose vi khuẩn không cần qua bƣớc trung gian.
Đặc biệt vi khuẩn có thể tổng hợp đƣợc cellulose dƣới dạng màng mỏng hoặc
dƣới dạng các sợi chỉ cực nhỏ.
- Có thể kiểm soát đƣợc đặc điểm lý học của cellulose theo mong muốn
bằng cách tác động vào quá trình sinh tổng hợp cellulose của A. xylinum. Từ
đó có thể kiểm soát các dạng kết tinh và trọng lƣợng phân tử cellulose.

5


1.1.4. Ứng dụng của CVK
Mặc dù bản chất hoá học của CVK tƣơng tự cellulose thực vật nhƣng
nhờ sản xuất dễ dàng, đặc tính cơ học cao, tính ổn định dƣới hoá chất và nhiệt
độ cao. Ngoài ra còn nhiều điểm ƣu việt nhƣ: độ tinh sạch, độ kết tinh, độ bền
đàn hồi, độ co giãn, khả năng giữ hình dạng ban đầu, khả năng giữ nƣớc và
hút nƣớc cao và một số điểm khác. Với những điểm ƣu việt này, CVK còn
đƣợc ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau nhƣ: Trong công nghiệp giấy
màu CVK đƣợc dùng để sản xuất giấy điện tử chất lƣợng cao, trong công
nghiệp môi trƣờng đã sử dụng màng CVK làm màng phân tách để xử lý nƣớc
và biến đổi độ nhớt của nƣớc (Brown, 1989, Jonas và Fonah, 1998), dùng làm

chất màng đặc biệt cho các sợi pin và tế bào năng lƣợng (Brown, 1989), làm
các sợi truyền quang, là môi trƣờng cơ chất trong sinh học sử dụng để cố định
protein.
CVK hiện đƣợc mong đợi là vật liệu hoá sinh mới với những ứng dụng
thú vị và đang tiếp tục nghiên cứu, phát triển hàng loạt [6, 7, 11, 12, 15, 19,
22, 24, 27, 32, 20] đƣợc thể hiện cụ thể trong bảng 1.1.

6


Bảng 1.1. Ứng dụng của CVK
Lĩnh vực ứng dụng

Sản phẩm
Tráng miệng (thạch dừa)
Ăn kiêng (kem, salad)

Thực phẩm

Thịt nhân tạo
Vỏ bao xúc xích
Nƣớc uống siro không có cholesterol
Thuốc rƣợu Kombucha hay trà Manchurian
Màng trị thƣơng, màng trị bỏng

Y dƣợc

Tác nhân vận chuyển thuốc
Da nhân tạo
Chất làm co mạch

Màng nhân tạo

Mỹ phẩm

Chất làm dày và tăng cứng cho thuốc đánh
bóng móng tay
Miếng xốp làm sạch vết dầu tràn

Môi trƣờng

Hấp thu chất độc
Quần áo, giày dép tự phân hủy

Dầu mỏ
Trang phục
Thể thao

Thu hồi dầu
Sản xuất sợi nhân tạo
Y phục quân đội
Lều lắp ráp
Gỗ nhân tạo

Sản phẩm rừng

Giấy, giấy đặc biệt để lƣu trữ hồ sơ
Thùng hàng có độ bền cao

Lĩnh vực khác

Làm màng lọc

7


1.2. Vi sinh vật tổng hợp cellulose
Cellulose vi khuẩn đƣợc nhiều loài vi sinh vật tổng hợp trong đó chủng
A. xylinum đƣợc biết đến nhiều nhất, đây cũng là loài vi khuẩn sinh tổng hợp
cellulose hiệu quả nhất và đƣợc tập trung nghiên cứu nhiều nhất. Cấu trúc của
cellulose đƣợc tổng hợp bởi các vi sinh vật khác nhau là khác nhau.
1.2.1. Phân loại A. xylinum
A. xylinum là một vi khuẩn acetic thuộc họ Acetobacteraceae, họ này
bao gồm các giống sau: Acetobacter, Acidomonas, Asaia, Gluconacetobacter,
Gluconobacter và Kozakia. Các loài vi khuẩn này trƣớc đây đƣợc gọi với các
tên gọi Acetobacter xylinus hay Acetobacter xylinum, sau đó đƣợc xếp lại vào
giống Gluconacetobacter với tên gọi Gluconacetobacter xylynus.
A. xylinum có thể đƣợc phân lập từ các nguồn khác nhau nhƣ từ nƣớc
quả (Kahlon & Vyas, 1971), hay từ một số loài thực vật nhƣ lá của cây cọ
(Faparusi et al., 1974), từ giấm (Passmore & Carr, 1975), từ thạch dừa
(Bernado et al., 1998), từ nấm Kombucha và trà (Hermann et al., 1928).
1.2.2. Đặc điểm hình thái của A. xylinum
- A. xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, có thể di động hay
không di động, không sinh bào tử. Là vi khuẩn Gram âm, chúng có thể đứng
riêng rẽ hay xếp thành chuỗi.
- Nếu A. xylinum phát triển trên môi trƣờng thiếu chất dinh dƣỡng, chúng
biến đổi thành dạng có hình thái đặc biệt nhƣ: dạng tế bào phình to, kéo dài,
phân nhánh hoặc không phân nhánh và dần dần sẽ gây thoái hóa giống làm
giảm hoạt tính một cách đáng kể.
- Khuẩn lạc của A. xylinum có kích thƣớc nhỏ, bề mặt nhầy và trơn, phần
giữa khuẩn lạc lồi lên, dày hơn và sẫm màu hơn các phần xung quanh, rìa

mép khuẩn lạc nhẵn.

8


1.2.3. Đặc điểm sinh lý của A. xylinum
- Oxy hóa ethanol thành acid acetic, CO2, H2O.
- Phản ứng catalase dƣơng tính: tạo bọt khí trong dung dịch lên men.
- Không tăng trƣởng trên môi trƣờng Hoyer.
- Chuyển hóa glucose thành acid gluconic.
- Chuyển hóa glycerol thành dihydroxyaceton.
- Không sinh sắc tố nâu.
- Tổng hợp cellulose.
1.2.4. Vai trò của CVK đối với A. xylinum
Màng cellulose đƣợc sản xuất bởi A. xylinum đóng nhiều vai trò cho sự
phát triển và tồn tại của vi sinh vật trong tự nhiên.
- Cung cấp chất dinh dƣỡng cho vi khuẩn trong điều kiện thiếu thức ăn [21].
- Sự tổng hợp và tiết cellulose bởi A. xylinum giúp tế bào lơ lửng và tới
đƣợc bề mặt giàu khí oxy vì đây là vi khuẩn hiếu khí. Do đó chỉ những tế bào
gần ranh giới lỏng khí của môi trƣờng mới sản xuất cellulose [33].
- Màng cellulose xúc tiến sự hình thành tập đoàn của A. xylinum trên cơ
chất và bảo vệ vi khuẩn trƣớc những đối thủ cạnh tranh sử dụng cùng cơ chất.
- Vì độ nhớt và đặc tính ƣa nƣớc của lớp cellulose nên khả năng chống
chịu với những thay đổi bất lợi (thay đổi pH, sự có mặt của chất độc và vi
sinh vật gây bệnh,…) trong môi trƣờng sống tăng lên.
- Sợi cellulose giúp chống ảnh hƣởng gây chết của tia UV. 23% vi khuẩn
acetic đƣợc bao bọc bởi màng cellulose có thể sống sót hơn 1 giờ khi bị chiểu
tia UV [21].
1.2.5. Môi trường nuôi cấy A. xylinum
Môi trƣờng nuôi cấy A. xylinum là môi trƣờng tổng hợp từ các nguồn

dinh dƣỡng cần thiết nhƣ nguồn cacbon, nito, nguồn sulfur và phospho, các
yếu tố tăng trƣởng và các yếu tố vi lƣợng [26].

9


A. xylinum là loài có khả năng tổng hợp cellulose từ nguồn
cacbonhydrat. Nguồn cacbonhydrat mà A. xylinum sử dụng là glucose,
fructose, manitol, sorbitol nếu sử dụng glycerol, glactose, lactose, sucrose cho
hiệu suất thấp hơn, không nên sử dụng mannose, cellobiose, erythriol, acetate.
Việc sử dụng các loại đƣờng cũng nhƣ nồng độ các loại đƣờng trong môi
trƣờng còn phụ thuộc vào những chủng A. xylinum khác nhau [26].
Nhu cầu sử dụng đƣờng của A. xylinum là rất lớn và giữ vai trò quan
trọng trong quá trình tổng hợp CVK nên có rất nhiều nghiên cứu và đề nghị
sử dụng các sản phẩm thứ cấp trong các ngành công nghiệp khác nhƣ: rỉ
đƣờng, nƣớc dừa già, nƣớc mía,... để làm nguyên liệu trong nuôi cấy A.
xylinum. Trong đó, nƣớc dừa già đƣợc xem là môi trƣờng kinh điển trong
nuôi cấy A. xylinum. Thành phần môi trƣờng của nƣớc dừa già [7] đƣợc trình
bày ở bảng 1.2 dƣới đây:
Bảng 1.2. Thành phần của nƣớc dừa già.
Nƣớc (%)

94.99

Đồng (mg/100g)

0.04

Protein (%)

0.72

Mangan (mg/100g)

0.142

Chất béo toàn phần (%)

0.2

Selen (µg/100g)

1

Cacbohydrat (%)

3.17

Vitamin C (mg/100g)

2.4

Đƣờng (%)

2.16

Vitamin B1 (mg/100g)

0.03

Canxi (mg/100g)

24

Vitamin B2 (mg/100g)

0.057

Sắt (mg/100g)

0.29

Vitamin B3 (mg/100g)

0.08

Magie (mg/100g)

25

Vitamin B5 (mg/100g)

0.043

Photpho (mg/100g)

20

Vitamin B6 (mg/100g)

0.032

Kali (mg/100g)

250

Vitamin B9 (µg/100g)

3

Natri (mg/100g)

105

Kẽm (mg/100g)

0.1

10


Nƣớc dừa già là môi trƣờng thích hợp để nuôi cấy vi khuẩn vì trong
nƣớc dừa chứa nhiều chất dinh dƣỡng và chất kích thích tố tăng trƣởng nhƣ
1,3 - diphenyllurea, hexitol, cytolunin, myoinositol, sorbitol,… Vì vậy, A.
xylinum thích hợp phát triển trong môi trƣờng này [6].
Nƣớc dừa sau khi thu hoạch đƣợc sử dụng không quá 3 ngày, tránh để
lâu làm cho đƣờng và các chất dinh dƣỡng khác giảm đi dẫn đến cho hiệu suất
kém [7], [13].
2. Giới thiệu về thuốc berberin
Berberin là hoạt chất đƣợc chiết từ cây Hoàng đằng (còn có tên vàng

đắng, hoàng liên, tên khoa học là Coptis teet. Là loại cây dây leo thân gỗ có
phân nhánh, mọc hoang ở nhiều nơi. Trong Hoàng đằng có nhiều alcaloid dẫn
xuất của izoquinolein, chủ yếu là berberin tỷ lệ từ 1.5 đến 2-3%. Berberin
chiếm ít nhất là 82% so với alcaloid toàn phần [8].
Tên chung quốc tế: Berberin.
Loại thuốc: Kháng khuẩn, chống tiêu chảy do vi khuẩn, ký sinh trùng
đƣờng ruột.
2.1. Công thức
Công thức hóa học: C20H18NO4Cl.2H2O
Khối lƣợng phân tử: 371.82 [29]
Công thức cấu tạo đƣợc thể hiện ở hình 1.1

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của berberin

11


Tên khoa học: 5,6 - dihydro - 8,9 - dimethoxyl - 1,3 - dioxa - 6aazoniaindeno (5,6 - a) anthracen clorid dihydrat.
2.2. Tính chất
 Lý tính: tinh thể hay bột kết tinh màu vàng, không mùi có vị rất đắng.
Độ chảy khi ở dạng base là 140ºC (bị phân hủy). Độ tan dạng base tan chậm
trong nƣớc, hơi tan trong ethanol, khó tan trong ether. Dạng muối clorid tan ở
tỷ lệ 1/400 trong nƣớc, dễ tan trong nƣớc sôi, tan trong ethanol, thực tế không
tan trong clorofrom và ether. Dạng muối sulfat dễ tan trong nƣớc ở tỉ lệ 1/30,
tan trong ethanol [30].
 Hoá tính: berberin có tính chất nhƣ một base bậc 4, tạo muối bằng cách
thay thế nhóm-OH, việc tạo muối của berberin không giống nhƣ các alcaloid
khác mà muối tạo thành giống muối của hydroxyd kim loại.
2.3. Tác dụng dược lý
Berberin có tác dụng kháng vi trùng nhƣ: vi khuẩn (shigella, tụ cầu và

liên cầu khuẩn), thể protozoal, vi nấm, candida, virus, nấm men, kí sinh trùng
gây bệnh ( kí sinh trùng sốt rét, kí sinh trùng đƣờng ruột) [29].
Berberin có tác dụng kìm khuẩn tả và E. coli, đặc biệt khi dùng sẽ
không ảnh hƣởng tới sự phát triển bình thƣờng của hệ vi khuẩn có ích ở ruột,
khi dùng phối hợp với một số thuốc kháng sinh sẽ hạn chế tác dụng phụ gây
ra bởi các thuốc kháng sinh đối với hệ sinh vật đƣờng ruột.
Berberin có tác dụng bài tiết ion trong lòng ruột, ức chế co cơ, giảm
cholesterol và trygycerid, chống tiểu đƣờng, ức chế cơn nhịp nhanh thất, giảm
viêm cho ngƣời bị viêm khớp, tăng tiểu cầu của bệnh nhân xuất huyết, giảm tiểu
cầu tiên phát và thứ phát, kích thích sự bài tiết mật và thải trừ bilirubin [19].
2.4. Tương tác thuốc
Vitamin B6 và Nicotinamid có thể làm mất tác dụng kháng khuẩn của
berberin.

12


2.5. Chỉ định
- Bệnh lỵ trực khuẩn, hội chứng lỵ, viêm ruột, tiêu chảy, viêm ống mật
và đặc biệt là bệnh sỏi mật, vàng da, sốt, sốt rét, mụn nhọt [15].
- Điều trị viêm kết mạc, đau mắt đỏ do kích thích bên ngoài (do nắng,
gió, lạnh, bụi, khói,...) và điều trị bệnh đau mắt hột [29].
- Điều trị bệnh Leishmania, Trichomonas.
2.6. Chống chỉ định
- Phụ nữ có thai vì khả năng gây co bóp tử cung của berberin.
- Ngƣời dị ứng với berberin (rất hiếm gặp).
3. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc
3.1. Tình hình nghiên cứu thuốc
3.1.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Lin Huang, Xiuli Chen, Thanh Nguyen Xuan, Huiru Tang, Liming

Zhang và Guang [28] nghiên cứu tạo ra Chitosan tráng (bọc) nano-liposome
cho việc phân phối uống berberine. Kết quả cho thấy chitosan bọc nanoliposome là hiệu quả hơn so với những ngƣời không tráng cho việc cung cấp
bằng miệng của berberin. Ngoài ra, Chu L, Yang Y, Wang X, và cộng sự [34]
đã có công trình nghiên cứu về berberine kích thích vận chuyển glucose thông
qua một cơ chế khác biệt với insulin. Và nhiều nghiên cứu khác.
3.1.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam
Ở Việt Nam, đã có một số công trình nghiên cứu về berberin nhƣ:
Nguyễn Thị Thùy, Vũ Bình Dƣơng, Nguyễn Trang Điệp, Hoàng Văn Lƣơng
[16] đã có công trình nghiên cứu bào chế viên nén berberin giải phóng tại
đích đại tràng theo cơ chế phân hủy bởi hệ vi sinh vật đại tràng.
Phạm Viết Trang, Nguyễn Liêm [17] đã có nghiên cứu góp phần
nghiên cứu cải tiến quy trình chiết suất berberin từ cây vàng đắng.
Hồ Cảnh Hậu, Hoàng Văn Thêm, Nguyễn Thị Lan Hƣơng, Nguyễn
Văn Thuận, Nguyễn Cẩm Vân, Nguyến Tuấn Quang [5] (2015) đã nghiên cứu

13


định lƣợng berberin chlorid trong viên nén đại tràng 105 bằng phƣơng pháp
sắc ký lỏng hiệu năng cao.
3.2. Tình hình nghiên cứu màng CVK
3.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Nghiên cứu về màng CVK từ vi khuẩn A. xylinum và những ứng dụng
của nó đã đƣợc tiến hành ở nhiều nƣớc trên thế giới. Tác giả Brown (1989)
dùng màng CVK làm môi trƣờng phân tách cho quá trình xử lý nƣớc, dùng
làm chất mang đặc biệt cho các pin và năng lƣợng cho tế bào. Brown (1989)
và cộng sự [23], dùng màng nhƣ là một chất để biến đổi độ nhớt, để làm ra
các sợi truyền quang, làm môi trƣờng cơ chất trong sinh học, thực phẩm hoặc
thay thế thực phẩm. Đặc biệt Brown (1989) [22], đã dùng CVK làm vải đặc
biệt, để sản xuất giấy chất lƣợng cao, làm cơ chất để cố định protein hay cho

sắc kí.
Đặc biệt tác giả Wan (Canada) [22 ] đã đƣợc đăng kí bản quyền về làm
màng CVK từ A. xylinum dùng trị bỏng. Các tác giả Jonas và Farad (1998),
Czafa và cộng sự (2006) đã dùng màng CVK làm da nhân tạo, làm mặt nạ
dƣỡng da cho phụ nữ.
3.2.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam
Tại Việt Nam tình hình điều trị bỏng trong nƣớc ngày càng đƣợc cải
tiến. Công tác điều trị bỏng bao gồm việc cấy ghép, phẫu thuật, tạo ra một số
màng trị bỏng nhƣ màng ối, trung bì da lợn, da ếch, màng chitosan, sử dụng
các chất có nguồn gốc từ tự nhiên có tác dụng điều trị bỏng,… Từ năm 2000
nhóm nghiên cứu các tác giả Nguyễn Văn Thanh [7] và cộng sự đã có một số
công trình nghiên cứu về màng CVK thu đƣợc là cơ sở để chế tạo màng sinh
học dùng trong trị bỏng ở Việt Nam [7].
Năm 2012, Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Thị Thùy Vân, Trần Nhƣ
Quỳnh [14] đã công bố công trình nghiên cứu “Nghiên cứu vi khuẩn

14


Acetobacter xylinum tạo màng bacterial cellulose ứng dụng trong điều trị
bỏng”, kết quả cho thấy màng CVK tạo bởi A. xylinum BNH2 tổng hợp có sợi
cellulose nhỏ, dai, độ bền kéo, độ thấu khí cao; độ hút nƣớc tốt có triển vọng
ứng dụng làm màng trị bỏng.

15


CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
Đối tƣợng nghiên cứu: nghiên cứu khả năng hấp thụ thuốc berberin của

màng CVK lên men từ nƣớc dừa già.
Nguyên liệu: nƣớc dừa già (không dùng nƣớc dừa để lâu quá 3 giờ sau
khi đập trái để tránh nhiễm khuẩn).
Hóa chất đặc biệt: pepton của hãng DIFCO.
Các hóa chất thông thƣờng có nguồn gốc của Trung Quốc và Việt Nam:
berberin (độ tinh khiết 98%), cồn 96º, đƣờng glucose, (NH4)2SO4, acid axetic,
(NH4)2HPO4, NaOH, HCl, nƣớc cất.
Phạm vi nghiên cứu: nghiên cứu đƣợc thực hiện ở quy mô phòng thí nghiệm.
2. Nội dung nghiên cứu
- Tạo màng CVK từ vi khuẩn A. xylinum trong môi trƣờng nƣớc dừa già.
- Cho màng CVK hấp thụ thuốc berberin.
3. Các thiết bị và hóa chất sử dụng trong nghiên cứu
Nồi hấp Tommy (Nhật), buồng cấy vô trùng (Haraeus), máy ép màng,
tủ ấm, tủ sấy Blinder (Đức), máy lắc TEIO TRCH (Hàn Quốc), máy rung siêu
âm, máy quang phổ tử ngoại khả kiến UV - vis 2450 (Nhật), khuấy từ gia
nhiệt (IKA-Đức), tủ lạnh Electrolux, ...
Thiết bị phân tích: cân phân tích, cân kĩ thuật (Precisa XT 320M).
Hộp nhựa có kích thƣớc 15 x 10 x 4cm, hộp lồng, cốc đong 500ml1000ml, ống nghiệm, bình định mức, bình tam giác, pipet các loại từ 1-50ml,
bình xịt cồn, kéo, giấy bạc và một số dụng cụ khác.
4. Phƣơng pháp nghiên cứu
4.1. Phương pháp tạo màng CVK
Tạo màng CVK từ môi trƣờng nƣớc dừa già đƣợc trình bày trong
bảng 2.1.

16


Bảng 2.1. Môi trƣờng lên men tạo màng CVK
Thành phần

Khối lƣợng

Glucose

30g

Pepton

10g

(NH4)2HPO4

0.3g

(NH4)2SO4

0.5g

Acid acetic

2%

Nƣớc dừa già

1000ml

Dịch giống A.xylium

10%

Pha môi trƣờng với tỉ lệ nhƣ trong bảng 2.1, hấp khử trùng ở 113ºC
trong 15 phút sau đó khử trùng bằng tia UV trong 30 phút để nguội môi
trƣờng rồi bổ sung 10% dịch giống và 2% acid acetic, nuôi cấy tĩnh trong 6
ngày ở 26ºC thu đƣợc sản phẩm màng CVK thô [14]. Cụ thể quá trình tạo
màng CVK với nguyên liệu nƣớc dừa già đƣợc thực hiện theo sơ đồ 2.1.

17