Nghiên cứu khả năng hấp thụ thuốc berberin của màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường chuẩn

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN

======

NGUYỄN THỊ LAN ANH

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THỤ THUỐC
BERBERIN CỦA MÀNG CELLULOSE VI KHUẨN
LÊN MEN TỪ MÔI TRƢỜNG CHUẨN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học ngƣời và động vật

HÀ NỘI, 2017


LỜI CẢM ƠN
Em xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Thị Bích Ngọc đã tận
tình hƣớng dẫn, động viên, giúp đỡ em trong quá trình nghiên cứu. Sự hiểu
biết sâu sắc về khoa học cũng nhƣ kinh nghiệm của cô là tiền đề giúp em đạt
đƣợc kết quả này.
Em xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, các thầy cô giáo trong khoa
Sinh – KTNN, các thầy cô trong Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng,
Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2, đã tận tình giảng dạy, tạo mọi điều kiện
thuận lợi trong thời gian em học tập và làm nghiên cứu tại Trƣờng.
Đây là những bƣớc đi đầu tiên trong nghiên cứu sáng tạo khoa học,
kinh nghiệm của em còn nhiều hạn chế và bỡ ngỡ. Do đó, không tránh khỏi
những thiếu sót nên em rất mong nhận đƣợc sự đóng góp quý báu của quý
thầy cô và các bạn sinh viên để đề tài khóa luận tốt nghiệp của em đƣợc hoàn
thiện hơn nữa.

Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 28 tháng 04 năm 2017
SINH VIÊN

Nguyễn Thị Lan Anh


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là đề tài do chính tôi thực hiện. Các số liệu và
kết quả nghiên cứu trong khóa luận là trung thực, không trùng lặp với bất kỳ
công trình nghiên cứu nào khác.
Hà Nội, ngày 28 tháng 04 năm 2017
SINH VIÊN

Nguyễn Thị Lan Anh


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
1. Lí do chọn đề tài ............................................................................................ 1
2. Mục đích nghiên cứu ..................................................................................... 2
3. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 3
4. Vật liệu và phạm vi nghiên cứu .................................................................... 3
5. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn.......................................................... 3
5.1. Ý nghĩa khoa học ....................................................................................... 3
5.2. Ý nghĩa thực tiễn ........................................................................................ 3
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 4
1.1. Tổng quan về cellulose vi khuẩn (CVK) ................................................... 4
1.1.1. Phân loại và đặc điểm hình thái của A. xylinum ..................................... 4
1.1.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của A. xylinum ............................................. 4

1.1.3. Một vài đặc điểm của màng CVK........................................................... 4
1.1.3.1. Cấu trúc của CVK ................................................................................ 4
1.1.3.2. Đặc tính của màng CVK ...................................................................... 5
1.1.3.3. Ứng dụng của CVK.............................................................................. 6
1.2. Thuốc berberin ........................................................................................... 6
1.2.1. Cấu trúc ................................................................................................... 7
1.2.2. Nguồn gốc ............................................................................................... 7
1.2.3. Tính chất vật lý và hóa học ..................................................................... 8
1.2.4. Tác dụng dƣợc lý và ứng dụng................................................................ 8
1.2.5. Chỉ định và chống chỉ định của thuốc BH .............................................. 9
1.2.6. Tƣơng tác thuốc....................................................................................... 9
1.3. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam .................................... 9
1.3.1. Trên thế giới ............................................................................................ 9
1.3.2. Ở Việt Nam ........................................................................................... 10


CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 12
2.1. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 12
2.1.1. Giống vi khuẩn ...................................................................................... 12
2.1.2. Nguyên liệu và hóa chất ........................................................................ 12
2.1.3. Thiết bị và dụng cụ................................................................................ 12
2.1.4. Môi trƣờng tạo màng CVK ................................................................... 12
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu.......................................................................... 13
2.2.1. Phƣơng pháp lên men thu màng CVK từ môi trƣờng chuẩn ................ 13
2.2.2. Phƣơng pháp xử lý màng CVK trƣớc khi hấp thụ thuốc ...................... 13
2.2.3. Phƣơng pháp đánh giá độ tinh khiết của màng CVK ........................... 14
2.2.4. Phƣơng pháp xác định đƣờng chuẩn ..................................................... 15
2.2.5. Phƣơng pháp xác định lƣợng thuốc đƣợc hấp thụ vào màng CVK ...... 16
2.2.6. Phƣơng pháp xử lý thống kê ................................................................. 17
2.3. Địa điểm nghiên cứu ................................................................................ 17

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ........................ 18
3.1. Màng CVK thu đƣợc khi nuôi cấy trong môi trƣờng chuẩn .................... 18
3.2. Màng CVK thu đƣợc sau nuôi cấy........................................................... 19
3.3. Quá trình xử lý màng CVK trƣớc khi hấp thụ ......................................... 20
3.4. Kiểm tra độ tinh khiết của màng CVK .................................................... 22
3.5. Màng CVK hấp thụ thuốc BH.................................................................. 23
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 28
1. Kết luận ....................................................................................................... 28
2. Kiến nghị ..................................................................................................... 28
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 29
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
Tên dầy đủ

Từ viết tắt
A. xylinum

Acetobacter xylinum

BH

Berberin hydrochlorid

C

Nồng độ

Cs

Cộng sự

CVK

Cenllulose vi khuẩn

E. coli

Escherichia coli

Et al

An other

h

Giờ

OD

Optical Density

UV - vis

Ultraviolet visible


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Môi trƣờng tạo màng CVK............................................................. 13

Bảng 2.2. Giá trị mật độ quang (OD) của dung dịch BH ở các nồng độ
(mg/ml) khác nhau (n = 3) .............................................................................. 15
Bảng 3.1. Giá trị OD của dung dịch BH 10% khi ngâm màng CVK (n = 3) . 24
Bảng 3.2. Lƣợng thuốc hấp thụ BH qua màng CVK (n=3) ............................ 26


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học cơ bản của CVK .................................................... 5
Hình 1.2. Công thức cấu tạo của BH ................................................................ 7
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình nuôi cấy thu nhận CVK......................................... 14
Hình 2.2. Phƣơng trình đƣờng chuẩn BH ....................................................... 16
Hình 3.1. Màng CVK nuôi cấy trong môi trƣờng chuẩn. ............................... 19
Hình 3.2. Màng CVK ở các độ dày khác nhau ............................................... 20
Hình 3.3. Màng CVK thô ................................................................................ 20
Hình 3.4. Màng CVK thô đƣợc ngâm trong NaOH 3% ................................. 21
Hình 3.5. Màng CVK ngâm trong HCl 3%..................................................... 21
Hình 3.6. Màng CVK ngâm trong nƣớc ......................................................... 22
Hình 3.7. Kết quả thử sự hiện diện của đƣờng glucose .................................. 23
Hình 3.8. Màng CVK đang hấp thụ thuốc berberin ........................................ 24


MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Cellulose vi khuẩn (viết tắt là CVK) là sản phẩm của một loài vi khuẩn,
đặc biệt là chủng Acetobacter xylinum. Màng sinh học (CVK) có cấu trúc và
đặc tính rất giống với cellulose của thực vật (gồm các phân tử glucose liên kết
với nhau bằng liên kết β-1,4 glucozit) [4]. Trên thế giới, màng CVK đã đƣợc
ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực công nghệ khác nhau: dùng màng CVK
làm môi trƣờng phân tách cho quá trình xử lí nƣớc, dùng làm chất mang đặc
biệt cho các pin và năng lƣợng cho tế bào, làm môi trƣờng cơ chất trong sinh

học, thực phẩm hay thay thế thực phẩm, thiết kế hệ thống vận tải phân phối
thuốc và nhiều ứng dụng khác [18]. Trong lĩnh vực y học, màng CVK đã
đƣợc ứng dụng làm da tạm thời thay thế da trong quá trình điều trị bỏng, loét
da, làm mạch máu nhân tạo, điều trị các bệnh tim mạch, làm mặt nạ dƣỡng da
cho con ngƣời [10, 18]. Amin et al. [15] đã báo cáo việc sử dụng màng CVK
làm màng bọc cho paracetamol bằng cách sử dụng kĩ thuật phun phủ. Kết quả
cho thấy màng CVK có khả năng giữ thuốc và giải phóng thuốc chậm lại, làm
tăng hiệu quả sử dụng của thuốc.
Ở Việt Nam việc nghiên cứu và ứng dụng màng CVK mới đƣợc quan
tâm gần đây và đã đạt đƣợc kết quả bƣớc đầu. Đề tài của Nguyễn Văn Thanh
– Đại học Y Dƣợc TP Hồ Chí Minh 2006 [5] đã “Nghiên cứu chế tạo màng
cellulose trị bỏng từ Acetobacter xylinum”. Theo kết quả nghiên cứu cho thấy
màng CVK đƣợc tạo nên từ các nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm, có thể sản xuất
trên quy mô công nghiệp. Về mặt tính chất, CVK có độ tinh sạch lớn hơn
nhiều so với các loại cellulose khác, có thể phân hủy sinh học, tái chế hay
phục hồi hoàn toàn. Ngoài ra CVK còn có độ bền tinh thể cao, sức căng lớn,
trọng lƣợng thấp, khả năng thấm hút lớn, đƣờng kính sợi nhỏ, chứa nhiều
dƣỡng chất [13]. Đồng thời là một hàng rào cản oxi và các sinh vật khác, ngăn

1


cản sự phân hủy các cơ chất ở trong tế bào và ngăn cản tác động của UV, ổn
định về kích thƣớc và hƣớng, màng CVK còn có ý nghĩa giữ thuốc và giải
phóng thuốc kéo dài [14, 20], có tiềm năng cao cho các ứng dụng trong các hệ
thống vận chuyển thuốc, cho cả thẩm thấu qua da, qua đƣờng miệng và mô kỹ thuật, và một số ứng dụng y sinh học khác,…
Berberin hydrocholoride (BH) đã đƣợc biết đến nhƣ một chất kháng
khuẩn tự nhiên trong việc điều trị các bệnh lí nhƣ tiêu chảy, viêm đƣờng tiêu
hóa do vi khuẩn tả, E. coli, amip đƣờng ruột [21]. Theo một vài nghiên cứu
gần đây, BH còn có tác dụng tốt trong việc điều trị một số bệnh mãn tính nhƣ

tiểu đƣờng, viêm khớp, hạ lipid, choresterol máu, đặc biệt là bệnh viêm đại
tràng. BH sở hữu tính chất dƣợc khác nhau bao gồm cả tác dụng chống ung
thƣ [21].
Tuy nhiên thuốc có tác dụng phụ là khó tan trong nƣớc làm giảm khả
năng hấp thụ thuốc. Trong quá trình sử dụng có thể bị các tác nhân khác gây
ảnh hƣởng làm giảm hiệu quả hấp thụ [21].
Nhờ những đặc tính độc đáo trên mà CVK có thể giúp giúp thuốc duy
trì hiệu quả thời gian chữa bệnh, tăng khả năng phân phối thuốc có kiểm soát,
tăng thời gian tồn tại của thuốc trong đƣờng ruột. Cách tiếp cận này có thể
đƣợc sử dụng để tăng cƣờng khả dụng sinh học qua đƣờng uống hoặc qua da.
Với mục đích nghiên cứu khả năng hấp thụ thuốc của màng CVK để khắc
phục những tác dụng phụ của thuốc, chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu khả
năng hấp thụ thuốc berberin của màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi
trường chuẩn”.
2. Mục đích nghiên cứu
Tìm hiểu khả năng hấp thụ thuốc của màng để tìm ra trƣờng hợp hấp
thụ thuốc nhiều nhất nhằm tăng sinh khả dụng, hiệu quả của thuốc.

2


3. Nội dung nghiên cứu
Tạo màng và xử lý màng CVK.
Khảo sát, đánh giá khả năng hấp thụ thuốc qua hệ thống màng đƣợc
thiết kế.
4. Vật liệu và phạm vi nghiên cứu
Vật liệu nghiên cứu: Màng CVK thu đƣợc từ môi trƣờng chuẩn, thuốc
berberin dạng tinh khiết.
Phạm vi nghiên cứu: nghiên cứu đƣợc thực hiện trong quy mô của
phòng thí nghiệm.

5. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
5.1. Ý nghĩa khoa học
Tăng thêm hiểu biết về tiềm năng hấp thụ thuốc của màng CVK.
5.2. Ý nghĩa thực tiễn
Từ hệ thống màng CVK đã hấp thụ thuốc tìm ra màng hấp thụ tốt nhất
nhằm cải thiện nhƣợc điểm của thuốc.
Từ kết quả nghiên cứu đƣợc có thể áp dụng vào thực tiễn.

3


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về cellulose vi khuẩn (CVK)
1.1.1. Phân loại và đặc điểm hình thái của A. xylinum
A. xylinum thuộc nhóm vi khuẩn Acetic, chi Acetobacter, họ
Pseudomonadaceae. Là loại hiếu khí bắt buộc, sản xuất cellulose ngoại bào.
Theo khóa phân loại của Bergey, A. xylinum thuộc họ Pseudomonadaceae, bộ
Pseudomonadales, lớp Schizomycetes [11].
A. xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, kích thƣớc ngang
khoảng 0,6 – 0,8µm, dài khoảng 2 – 3µm, có thể di động hay không di động
và không sinh bào tử. Chúng là vi khuẩn gram âm nhƣng đặc điểm nhuộm
gram có thể bị thay đổi do tế bào già đi hay do điều kiện môi trƣờng. Chúng
có thể đứng riêng rẽ hay xếp thành chuỗi [11].
1.1.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của A. xylinum
Nhiệt độ tối ƣu để A. xylinum phát triển là 25- 30oC và pH từ 5,4 - 6,3.
A. xylinum có thể phát triển trong phạm vi pH từ 3 - 8, nhiệt độ từ 12 – 35oC
và nồng độ ethanol có thể tới 10% [8].
Các đặc điểm sinh hóa dùng định danh của A. xylinum bao gồm: oxy
hóa ethanol thành acid acetic, CO2, H2O, phản ứng catalase dƣơng tính,
không tăng trƣởng trên môi trƣờng Hoyer. Chuyển hóa glucose thành acid,

chuyển hóa glycerol thành dihydroxyaceton, không sinh sắc tố nâu, tổng hợp
cellulose [8].
1.1.3. Một vài đặc điểm của màng CVK
1.1.3.1. Cấu trúc của CVK
CVK là sản phẩm của một số loài vi khuẩn, đặc biệt là chủng
Acetobacter xylinum. CVK cấu tạo bởi những chuỗi polyme β-1,4glucopyranose không phân nhánh. Những nghiên cứu đã cho thấy cấu trúc
hóa học cơ bản của CVK giống cellulose của thực vật (plant cellulose - PC),

4


tuy nhiên chúng khác nhau về cấu trúc đại thể [6]. Theo AJ. Brown (1886),
CVK gồm nhiều sợi siêu nhỏ có bản chất là hemicellulose, đƣờng kính 1,5nm,
kết hợp với nhau. Các sợi này kết hợp với nhau thành bó, nhiều bó hợp thành
dãy, mỗi dãy dài khoảng 100nm, rộng khoảng 3 – 8nm [6]. Cấu trúc hóa học
của CVK đƣợc trình bày trên hình 1.1.

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học cơ bản của CVK
1.1.3.2. Đặc tính của màng CVK
Trong nuôi cấy tĩnh, CVK tích lũy trên bề mặt môi trƣờng lỏng thành
lớp màng mỏng nhƣ da, sau khi tinh chế và làm khô tạo thành sản phẩm
tƣơng tự nhƣ giấy da với độ dày 0,01 – 0,05mm. Sản phẩm này có những tính
chất rất đặc biệt nhƣ:
Độ tinh khiết cao: CVK là cenllulose sinh học duy nhất đƣợc tổng hợp
không có chứa lignin hay hemicellulose. Do đó CVK có thể bị vi khuẩn phân
hủy hoàn toàn và là nguồn nguyên liệu tái sinh.
Độ bền dai cơ học lớn: Cellulose có độ bền dai cao, chịu lực kéo cao,
trọng lƣợng nhẹ, độ bền đáng kể.
Khả năng hút nƣớc cực cao ở trạng thái ẩm: khả năng giữ nƣớc đáng
kể, lực ẩm cao. Màng CVK có khả năng giữ nƣớc rất lớn, nó có thể hút 60 700 lần trọng nƣớc của nó.

Màng CVK có thể bị phân hủy sinh học, bề mặt tiếp xúc lớn hơn gỗ
thƣờng, không độc và không gây dị ứng, có khả năng chịu nhiệt tốt (khoảng
100oC không gây ảnh hƣởng lớn đến tính chất của CVK nhƣng nhiệt độ thấp

5


có thể làm tăng tính mềm dẻo của nó), đặc biệt có khả năng cản khuẩn. Với
đặc tính này, CVK đã đƣợc ứng dụng làm màng lọc vô khuẩn [11].
1.1.3.3. Ứng dụng của CVK
CVK đƣợc ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực công nghệ khác nhau
nhƣ: thực phẩm, công nghiệp dệt, mỹ phẩm, công nghệ giấy, công nghệ pin,...
đặc biệt trong lĩnh vực y học. Trong y học, màng CVK thu đƣợc từ quá trình
nuôi cấy tĩnh đƣợc nghiên cứu và sử dụng làm da nhân tạo để trị bỏng, đắp
lên các vết thƣơng hở. Ở Brazil, màng CVK ƣớt tinh sạch đƣợc sản xuất và
bán ra thị trƣờng nhƣ một loại da nhân tạo dùng đắp vết thƣơng [4]. Trƣờng
Đại học Y dƣợc Thành phố Hồ Chí Minh cũng nghiên cứu sử dụng màng
CVK có tẩm dầu mù u làm màng trị bỏng đƣợc thực nghiệm ở thỏ. Kết quả
cho thấy rằng màng CVK giúp vết thƣơng mau lành và ngăn không cho vết
thƣơng nhiễm trùng [5]. Sản phẩm CVK còn đƣợc ứng dụng làm màng băng
vết thƣơng, trong phẫu thuật, ghép mô, cơ quan nội tạng,... Dựa vào đặc tính
trƣơng nở của CVK ngƣời ta ứng dụng làm tác nhân vận chuyển thuốc, dùng
làm huyền phù CVK để ổn định các tá dƣợc dạng nƣớc, làm cho chúng không
bị tách khi bảo quản lâu ngày [4].
Ngoài ra CVK còn đƣợc ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau
nhƣ: Trong công nghiệp giấy màu CVK đƣợc dùng để sản xuất giấy điện tử
chất lƣợng cao, trong công nghiệp môi trƣờng đã sử dụng màng CVK làm
màng phân tách để xử lý nƣớc và biến đổi độ nhớt của nƣớc (Brown, 1989,
Jonas và Fonah, 1998), dùng làm chất màng đặc biệt cho các sợi pin và tế bào
năng lƣợng (Brown, 1989), làm các sợi truyền quang, là môi trƣờng cơ chất

trong sinh học sử dụng để cố định protein [4].
1.2. Thuốc berberin
Tên quốc tế: Berberine.

6


Nhóm dƣợc lý: Thuốc đƣờng tiêu hóa.
Thuốc nghiên cứu ở dạng: Berberine hydrochloride (BH).
1.2.1. Cấu trúc
Berberin là một nhóm alcaloid thực vật thuộc nhóm isoquinolin có
khung là protoberberin [2]. Isoquinolin còn đƣợc gọi là penzo pyridin hay 2benzamin là một hợp chất hữu cơ thơm heterocyclic [12].
Công thức cấu tạo của berberin đƣợc trình bày trên hình 1.2.

Hình 1.2. Công thức cấu tạo của BH
Công thức phân tử: C20H18NO4Cl.2H2O.
Khối lƣợng phân tử: 371.82.
Tên khoa học: 5,6 dihydro- 8,9- dimethoxy- 1,3dioxa- 6a – azo
niaindeno (5,6- a) anthracen clorid dihydrat [1].
1.2.2. Nguồn gốc
BH có nhiều trong thân và rễ cây vằng đắng với tỷ lệ 1,5 - 3%, BH
chiếm ít nhất là 82% so với alcaloid toàn phần [7].
BH thƣờng có lẫn các tạp chất alcaloid khác nhƣ: palmatin, jatrorrhizin.
Giới hạn tạp chất palmatin không quá 2%, jatrorrhizin không quá 5% [4, 7].

7


1.2.3. Tính chất vật lý và hóa học
Tính chất vật lý: Berberin là tinh thể hay bột kết tinh màu vàng, không

mùi có vị rất đắng. Độ chảy khi ở dạng base là 1450C (bị phân hủy). Độ tan
dạng base tan chậm trong nƣớc 1/500, hơi tan trong ethanol, khó tan trong
ether. Dạng muối sulfat dễ tan trong nƣớc ở tỷ lệ 1/30, tan trong ethanol. BH
không có nồng độ chất tan bất đổi nên không có đồng phân quang học [12].
Tính chất hóa học: BH có tính chất nhƣ một base yếu, tạo muối bằng
cách thay thế nhóm OH, việc tạo muối BH không giống nhƣ các alkaloid khác
mà muối tạo thành giống muối của hydroxyd kim loại, nghĩa là có loại phân
tử nƣớc [7].
1.2.4. Tác dụng dược lý và ứng dụng
Berberin có tác dụng kháng khuẩn đƣợc dùng chủ yếu trong các bệnh
rối loạn đƣờng tiêu hóa [17]. Ngoài ra, berberin với liều nhỏ có tác dụng kích
thích tim, làm giãn mạch vành, với liều lớn ức chế hô hấp làm tê liệt trung
khu hô hấp trong khi tim vẫn đập. Berberin còn có tác dụng hạ nhiệt, gây tê,
lợi mật, kháng lợi niệu, đối với đƣờng huyết lúc đầu có tác dụng tăng cao và
sau đó thì hạ [17].
Berberin đem khử hóa cho tetrahydroberberin có tác dụng an thần và
mềm cơ, hạ huyết áp [2].
Những nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng: berberin có khả năng hạ
đƣờng huyết hiệu quả nhƣ metformin, cơ chế hoạt động bao gồm việc ức chế
aldose reductase, làm giảm đƣờng và ngăn ngừa sự kháng insulin [13].
Berberin làm giảm mạnh lƣợng cholesterol, triglycerid và xơ vữa nhƣng cơ
chế hoạt động khác biệt với statin làm cho berberin không gây ra tác dụng phụ
điển hình nhƣ statin [29]. Ngoài ra, berberin còn điều trị đƣợc chứng co giật
và bệnh động kinh, bảo vệ các tế bào thần kinh trong các trƣờng hợp tổn
thƣơng não do tắc mạch máu não gây ra, có tác dụng chống trầm cảm [25].

8


Tuyệt vời hơn nữa là tác dụng chống ung thƣ của berberin, nó có thể

ngăn chặn sự phát triển của nhiều loại tế bào ung thƣ, bao gồm ung thƣ vú,
ung thƣ biểu mô, ung thƣ tụy, ung thƣ dạ dày mà không làm ảnh hƣỏng đến
sự phát triển của các tế bào bình thƣờng ở nồng độ nhất định [25].
Tuy nhiên sinh khả dụng đƣờng uống của nó thấp và có khả năng gây
tác dụng phụ cho đƣờng vận chuyển thuốc ngoài đƣờng tiêu hóa. Trong quá
trình sử dụng có thể bị các tác nhân khác gây ảnh hƣởng làm giảm hiệu quả
hấp thụ.
1.2.5. Chỉ định và chống chỉ định của thuốc BH
Chỉ định:
Bệnh lỵ trực khuẩn, hội chứng lỵ, viêm ruột, tiêu chảy, viêm ống mật
và đặc biệt là bệnh sỏi mật, vàng da, sốt rét, mụn nhọt.
Điều trị viêm kết mạc, đau mắt đỏ do kích thích bên ngoài và điều trị
bệnh đau mắt hột [12].
Chống chỉ định:
Phụ nữ có thai vì khả năng gây co bóp tử cung của berberin.
Ngƣời dị ứng với berberin (rất hiếm gặp) [7].
1.2.6. Tương tác thuốc
Vitamin B6 và Nicotinamid có thể làm mất tác dụng kháng khuẩn của
BH [12].
1.3. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam
1.3.1. Trên thế giới
- Thuốc berberin
Đã có nhiều công trình nghiên cứu về thuốc BH trên thế giới nhƣ:
Ryan Bradley, ND, MPH và Bill Water, ND đã nghiên cứu về berberin
trong bệnh tiểu đƣờng [16].
Jianping Ye, Weiping Jia đã tìm hiểu về tác dụng và cơ chế của

9

berberin trong điều trị bênh tiểu đƣờng [30].
Chu L, Yang Y, Wang X và cộng sự đã có công trình nghiên cứu về
berberin kích thích vận chuyển glucose thông qua một cơ chế khác biệt với
insulin [22].
- Màng CVK
Tính đến cuối năm 2014 trên thế giới chỉ có 18 nghiên cứu ứng dụng
CVK trong vận tải và phân phối thuốc đã đƣợc báo cáo [15], trong đó có 9
nghiên cứu với màng CVK tinh khiết, 2 nghiên cứu với thể chất biến đổi
màng CVK và 7 nghiên cứu với các vật liệu nanocomposite.
Nghiên cứu về màng CVK từ vi khuẩn A. xylinum và những ứng dụng
của nó đã đƣợc tiến hành ở nhiều nƣớc trên thế giới. Tác giả Brown. E. (2007)
[7] dùng màng CVK làm môi trƣờng phân tách cho quá trình xử lý nƣớc,
dùng làm chất mang đặc biệt cho các pin và năng lƣợng cho tế bào. Brown
(2007), Jonas và Farad, (1998) [26] dùng màng nhƣ là một chất để biến đổi độ
nhớt, để làm ra các sợi truyền quang, làm môi trƣờng cơ chất trong sinh học,
thực phẩm hoặc thay thế thực phẩm. Đặc biệt Brown (2007) [17] đã dùng
CVK làm vải đặc biệt. Jonas và Farad, (1998) [26] dùng màng CVK để sản
xuất giấy chất lƣợng cao.
Tuy nhiên, những ứng dụng thƣờng thấy trên thế giới của màng CVK là
dùng trong ngành dƣợc phẩm và mỹ phẩm. Các tác giả: Wan và Millon
(2009) [28], Czaja và cs, (2007) [27] sử dụng màng CVK đắp lên các vết
thƣơng hở, vết bỏng đã thu đƣợc kết quả tốt. Đặc biệt tác giả Wan (Canada)
[28] đã đƣợc đăng kí bản quyền về làm màng CVK từ A. xylinum dùng trị
bỏng. Các tác giả Jonas và Farad (1998) [26], Czaja và cs (2007) [27] đã dùng
màng CVK làm da nhân tạo, làm mặt nạ dƣỡng da cho phụ nữ.
1.3.2. Ở Việt Nam
- Thuốc berberin

10

Việc nghiên cứu thuốc BH ở Việt Nam có một số công trình nghiên cứu
sau:
Nguyễn Liêm- chiết xuất berberin bằng áp lực nóng [6].
Phạm Viết Trang, Nguyễn Liêm- góp phần nghiên cứu cả tiến quy trình
sản xuất berberin từ cây vàng đắng [6].
Hồ Đắc Trinh- chiết berberin clorid trong vàng đắng bằng dung dịch
acid sufucric loãng [12].
Vũ Bình Dƣơng, Nguyễn Trọng Điệp, Nguyễn Thị Thùy, Hoàng Văn
Lƣơng – nghiên cứu bào chế viên nén berberin giải phóng tại đích đại tràng
[3].
- Màng CVK
Năm 2006 nhóm nghiên của tác giả Nguyễn Văn Thanh và cộng sự đã
có một số công trình nghiên cứu về màng CVK, là cơ sở để chế tạo màng sinh
học dùng trong trị bỏng ở Việt Nam [5].
Mới đây nhóm tác giả Đinh Thị Kim Nhung cũng đang bƣớc đầu ứng
dụng màng CVK trong điều trị bỏng trên thỏ. Công tác điều trị bỏng hiện
đang sử dụng phƣơng pháp cấy ghép, phẫu thuật, hoặc dùng một số màng trị
bỏng nhƣ màng ối, trung bì da lợn, da ếch, màng chitossan, sử dụng các chất
có nguồn gốc từ tự nhiên có tác dụng điều trị bỏng. Theo tác giả Huỳnh Thị
Ngọc Lan [5], màng trị bỏng sinh học CVK với các hoạt chất tái sinh mô và
các chất sát khuẩn đều có nguồn gốc thiên nhiên vì thế nó không chứa các yếu
tố nguy cơ nhƣ không có độc tố trực tiếp, không gây dị ứng, không có yếu tố
lây lan mầm bệnh, không giải phóng chất lạ vào vết thƣơng [5].

11


CHƢƠNG 2
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Giống vi khuẩn
Giống vi khuẩn A. xylinum thuần cung cấp bởi Phòng thí nghiệm Vi
sinh khoa sinh - KTNN, Trƣờng ĐHSP Hà Nội 2.
2.1.2. Nguyên liệu và hóa chất
Nguyên liệu: Nƣớc cất 2 lần, gạc vô trùng.
Hóa chất:
Thuốc BH dạng tinh khiết (Sigma – Mỹ) và dạng chế phẩm bán trên thị
trƣờng.
Các hóa chất đặc biệt (cao nấm men, pepton) của hãng MERD, DIFCO.
Các hóa chất thông thƣờng có nguồn gốc từ Trung Quốc và Việt Nam
nhƣ amoni sunfat, diamoni phosphat, acid acetic, natri hydroxit, axit
clohydric, đƣờng glucose và một số hóa chất khác ở dạng tiêu chuẩn phân
tích.
2.1.3. Thiết bị và dụng cụ
Máy đo quang phổ UV – 2450 (Shimadzu – Nhật Bản); Cân phân tích
(Sartorius – Thụy sỹ), nồi hấp Tommy (Nhật), buồng cấy vô trùng (Haraeus);
Tủ sấy, tủ ấm (Binder - Đức); Khuấy từ gia nhiệt (IKA – Đức); Máy lắc tròn
tốc độ chậm (Orbital Shakergallenkump - Anh); Tủ lạnh Electrolux; Máy lắc
TEIO TRCH (Hàn Quốc); Máy rung siêu âm; Bể ổn nhiệt.
Bình tam giác để lên men tạo màng CVK, hộp lồng, ống nghiệm, bình
định mức, pipet,…
2.1.4. Môi trường tạo màng CVK
A. xilynum đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng chuẩn. Thành phần và khối
lƣợng các chất có trong môi trƣờng nuôi cấy màng CVK đƣợc thể hiện trong

12


bảng 2.1.

Bảng 2.1. Môi trƣờng tạo màng CVK
STT

Hóa chất

Khối lƣợng

1

Nƣớc cất 2 lần

1000 ml

2

Glucose

20g

3

Disodium phophat

2,7g

4

Cao nấm men

5g

5

Pepton

5g

6

Axit citric

1,5g

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp lên men thu màng CVK từ môi trường chuẩn
Bƣớc 1: Chuẩn bị môi trƣờng nhƣ bảng 2.1.
Bƣớc 2: Hấp khử trùng các môi trƣờng đó ở 113oC trong 15 phút.
Bƣớc 3: Lấy các môi trƣờng ra khử trùng bằng tia UV trong 15 phút
rồi để nguội môi trƣờng.
Bƣớc 4: Bổ sung 10% dịch giống và 2% acid acetic, lắc đều tay cho
giống phân bố đều trong dung dịch.
Bƣớc 5: Dùng gạc vô trùng bịt miệng lọ, ủ tĩnh trong khoảng 4 – 14
ngày ở 26oC.
Bƣớc 6: Thu màng CVK thô, rửa sạch chúng dƣới vòi nƣớc.
2.2.2. Phương pháp xử lý màng CVK trước khi hấp thụ thuốc
Mục đích: loại bỏ đƣợc các tạp chất trong môi trƣờng nuôi cấy, đồng
thời phá hủy và trung hòa độc tố của vi khuẩn.
Quy trình xử lý màng CVK đƣợc trình bày trên hình 2.1.

13

Tách màng CVK thô
Ép loại nƣớc
Ngâm trong NaOH 3%
48 giờ, rửa và ép
Ngâm trong HCl 3%
48 giờ, rửa và ép
Ngâm trong nƣớc
48 giờ, kiểm tra tạp chất
CVK tinh chế
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình nuôi cấy thu nhận CVK
2.2.3. Phương pháp đánh giá độ tinh khiết của màng CVK
Mục đích: nhằm đảm bảo màng CVK sau khi xử lý đã loại đƣợc các
tạp chất có thể gây độc hại, kiểm tra sự hiện diện của đƣờng glucose trong
màng CVK.
Nguyên tắc: dùng thuốc thử Fehling mới pha để phát hiện sự hiện diện
của đƣờng D – glucose, nếu có sẽ xuất hiện kết tủa nâu đỏ.
Tiến hành:
Dịch thử của màng CVK các loại sau khi đã xử lý hóa học.
Mẫu đối chứng: là nƣớc cất và dung dịch D – glucose.

14


Cho vào các ống nghiệm chứa mẫu thử mỗi ống nghiệm 1ml thuốc thử
Fehling. Đun dƣới ngọn lửa đèn cồn 10 – 15 phút.
Quan sát tủa xuất hiện trong ống nghiệm.
2.2.4. Phương pháp xác định đường chuẩn
Chuẩn bị dung dịch cồn 96o.

Chuẩn bị dung dịch chứa thuốc BH ở các nồng độ (mg/ml) khác nhau:
5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% mg/ml trong dung dịch cồn 96o.
Dùng máy đo quang phổ tử ngoại UV – 2450 để đo mật độ quang phổ
(OD) của các dung dịch đã pha nhƣ trên ở bƣớc sóng 345nm [9].
Tiến hành đo 3 lần, lấy giá trị trung bình quang phổ của thuốc BH để
xây dựng đƣờng chuẩn của thuốc BH.
Giá trị mật độ quang (OD) của dung dịch thuốc BH ở các nồng độ
khác nhau đƣợc thể hiện ở bảng 2.2.
Bảng 2.2. Giá trị mật độ quang (OD) của dung dịch BH ở các nồng độ
(mg/ml) khác nhau (n = 3)
STT

Nồng độ

Giá trị OD 345nm (n = 3)

Giá trị trung

(mg/ml)

Lần 1

Lần 2

Lần 3

bình

1

5

0,353

0,355

0,354

0,354 ± 0,003

2

10

0,712

0,714

0,710

0,712 ± 0,002

3

20

1,523

1,522

1,532

1,526 ± 0,006

4

30

2,031

2,299

2,286

2,205 ± 0,151

5

40

2,966

3,004

3,046

3,005 ± 0,040

6

50

3,703

3,641

3,504

3,616 ± 0,102

Dựng đồ thị biểu diễn và lập đƣờng chuẩn BH bằng phần mềm Excel
2010, kết quả đƣợc đồ thị nhƣ hình 2.2.

15


OD 345nm

y = 0,0734x + 0,0074
R² = 0,9986

Độ hấp thụ quang (nm)

4,0
3,5
3,0
2,5
2,0
1,5

OD 345nm

1,0
0,5
0,0
0

10

20

30

40

50

60

Nồng độ dung dịch berberin (mg/ml)

Hình 2.2. Phƣơng trình đƣờng chuẩn BH
Phƣơng trình đƣờng chuẩn:
y = 0,0734x + 0,0074 (R2 = 0,9986)
Trong đó:

(1)

x: Nồng độ BH (mg/ml)
y: Giá trị OD tƣơng ứng với nồng độ x

R: Hệ số tƣơng quan

2.2.5. Phương pháp xác định lượng thuốc được hấp thụ vào màng CVK
Lƣợng thuốc BH hấp thụ vào màng CVK đƣợc tiến hành thử nghiệm
trên 2 mẫu.
Mẫu 1: Dùng màng CVK có độ dày 0,3cm.
Mẫu 2: Dùng màng CVK có độ dày 0,5cm.
Mẫu 3: Dùng màng CVK có độ dày 0,7cm.
Cho 3 mẫu màng đã loại nƣớc 70% vào 3 bình tam giác có chứa sẵn
100ml dung dịch BH 10%. Sau đó cho vào máy lắc 180 vòng/phút ở nhiệt độ
phòng, sau 1 giờ; 1,5 giờ; 2 giờ lấy mẫu ra đo quang phổ để xác định lƣợng
thuốc đƣợc hấp thụ vào màng đến khi giá trị OD không đổi, lặp lại thí nghiệm
3 lần lấy giá trị trung bình để tính toán, từ đó xác định đƣợc lƣợng thuốc hấp
thu vào các màng CVK theo công thức:

16


mht = m1 – m2 (mg)

(2)

Trong đó: mht: khối lƣợng thuốc đã đƣợc hấp thu vào màng.
m1: khối lƣợng thuốc ban đầu trong dung dịch (100mg).
m2: khối lƣợng thuốc có trong dung dịch sau khoảng thời
gian nhất định màng hấp thu thuốc.
Hiệu suất thuốc nạp vào màng CVK đƣợc tính theo công thức [29]:

EE (%) 

(Qt  Qd )
100
Qt

Trong đó:

(3)

EE: phần trăm thuốc nạp vào màng.

𝑄𝑡: lƣợng thuốc lí thuyết.
𝑄𝑑 : lƣợng thuốc còn lại.
R

2.2.6. Phương pháp xử lý thống kê
Các số liệu đƣợc phân tích xử lý thông qua phần mềm Excel 2010 và
đƣợc biểu diễn dƣới dạng số trung bình ± độ lệch chuẩn.
Kiểm định giả thiết về giá trị trung bình của hai mẫu bằng cách sử
dụng hàm: t – Test: Two Sample Assuming Unequal Variences với ý nghĩa α
= 0,05, những khác biệt đƣợc coi là ý nghĩa thống kê khi giá trị p < 0,05.
2.3. Địa điểm nghiên cứu
Phòng thí nghiệm Sinh lý ngƣời và động vật khoa Sinh học Trƣờng Đại
học Sƣ phạm Hà Nội.
Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng Trƣờng Đại học sƣ phạm Hà
Nội 2.

17