Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc berberin của màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường chuẩn

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
==============

NGUYỄN TRUNG THỊ QUÝ

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG
THUỐC BERBERIN CỦA MÀNG
CELLULOSE VI KHUẨN LÊN MEN TỪ
MÔI TRƢỜNG CHUẨN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học ngƣời và động vật
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học
ThS. Cao Bá Cƣờng

HÀ NỘI, 2017


LỜI CẢM ƠN
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ThS. Cao Bá Cƣờng đã hƣớng
dẫn, chỉ bảo tận tình, giúp đỡ tạo điều kiện cho em thực hiện và hoàn thành
tốt khóa luận này.
Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trƣờng ĐHSP Hà Nội 2,
khoa Sinh - KTNN, Viện NCKH&ƢD Trƣờng ĐHSP Hà Nội 2, phòng thí
nghiệm Sinh lý ngƣời và động vật, cùng các thầy cô trong tổ bộ môn Động
vật, ban bảo vệ đã tạo điều kiện giúp đỡ em.
Em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quan tâm động viên của bạn bè,
gia đình trong suốt quá trình hoàn thành khóa luận.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, Ngày 20 tháng 04 năm 2017
Sinh viên

Nguyễn Trung Thị Quý


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi và đƣợc sự
hƣớng dẫn khoa học của ThS. Cao Bá Cƣờng. Những số liệu kết quả trong
khóa luận này là trung thực, không có sự trùng lặp hoặc sao chép của một tài
liệu khác.
Nếu sai tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm.
Hà Nội, Ngày 20 tháng 04 năm 2017
Sinh viên

Nguyễn Trung Thị Quý


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Từ đầy đủ

Từ viết tắt
A. xylinum

Acetobacter xylinum

UV - vis

Ultraviolet visible

ĐHSP

Đại học Sƣ Phạm

CVK

Celulose vi khuẩn

NCKH và ƢD

Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng

Nxb

Nhà xuất bản

OD

Mật độ quang phổ

PC

Cellulose thực vật

Th.S

Thạc sĩ


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1

1. Lý do chọn đề tài ........................................................................................ 1
2. Mục đích nghiên cứu.................................................................................. 2
3. Nhiệm vụ nghiên cứu ................................................................................. 3
4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu ............................................................. 3
5. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn ...................................................... 3
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 4
1.1. Giới thiệu cellulose vi khẩn (CVK) ........................................................ 4
1.1.1. Cấu trúc của màng CVK ......................................................................... 4
1.1.2. Tính chất độc đáo của CVK .................................................................... 5
1.1.3. Màng CVK lên men từ môi trường chuẩn .............................................. 6
1.1.4. Ứng dụng của màng CVK ....................................................................... 6
1.2. Giới thiệu về thuốc berberin. .................................................................. 7
1.2.1. Công thức hóa học và tính chất .............................................................. 8
1.2.2. Tác dụng dược lý và ứng dụng................................................................ 9
1.2.3. Chỉ định và chống chỉ định của thuốc berberin................................... 10
1.3. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc ........................................ 10
1.3.1. Về màng cellulose vi khuẩn ................................................................... 10
1.3.2. Về thuốc berberin................................................................................... 11
Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 13
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu ........................................................................... 13
2.2. Nội dung nghiên cứu ............................................................................. 13
2.3. Thiết bị và hóa chất sử dụng trong nghiên cứu..................................... 13
2.3.1. Thiết bị .................................................................................................... 13
2.3.2. Nguyên liệu - hóa chất........................................................................... 13
2.4. Môi trƣờng tạo màng CVK ................................................................... 14
2.5. Phƣơng pháp nghiên cứu ...................................................................... 14


2.5.1. Phương pháp tạo màng CVK từ môi trường chuẩn ............................ 14
2.5.2. Phương pháp xử lý màng CVK trước khi hấp thụ thuốc ..................... 15

2.5.3. Phương pháp đánh giá độ tinh khiết của màng ................................... 17
2.5.4. Phương pháp xác định khối lượng CVK tạo thành ............................. 17
2.2.5. Xây dựng đường chuẩn của Berberin trong cồn 96º ........................... 17
2.2.6. Phương pháp xác định lượng thuốc được hấp thụ vào màng CVK.... 19
2.2.7. Phương pháp pha môi trường đệm PBS (Phosphate buffered saline) 19
2.5.8. Phương pháp xác định lượng thuốc giải phóng thông qua hệ thống
được thiết kế ..................................................................................................... 20
2.5.9. Phương pháp phân tích dược động học giải phóng của Berberin ..... 21
2.5.10. Phương pháp xử lý thống kê ............................................................... 22
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................ 23
3.1. Kết quả tạo màng và xử lý màng CVK lên men từ môi trƣờng chuẩn . 23
3.1.1. Màng CVK được lên men từ môi trường chuẩn .................................. 23
3.1.2. Tinh chế màng CVK............................................................................... 24
3.1.3. Kiểm tra độ tinh khiết của màng CVK.................................................. 24
3.2. Khảo sát màng CVK trong quá trình hấp thụ thuốc Berberin .............. 25
3.3. Lƣợng thuốc giải phóng từ màng CVK vào các môi trƣờng pH
khác nhau ..................................................................................................... 26
3.3.1. Mật độ quang của berberin khi tiến hành giải phóng thuốc tại các thời
điểm khác nhau trong các môi trường pH khác nhau ................................... 26
3.3.2. Tỉ lệ giải phóng dược chất của các màng ở các môi trường pH khác
nhau trong các khoảng thời gian khác nhau .................................................. 29
3.3.3. Đánh giá động dược học giải phóng của thuốc Berberin từ
màng CVK ......................................................................................................... 32
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 35
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 36


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Ứng dụng của CVK .......................................................................... 7
Bảng 2.1. Môi trƣờng tạo màng CVK............................................................... 14

Bảng 2.2. Giá trị mật độ quang (OD) của dung dịch Berberin ở các nồng độ
(mg/ml) khác nhau (n = 3) ................................................................................ 18
Bảng 2.3. Môi trƣờng đệm PBS với pH tƣơng ứng là 2 và 12 ......................... 20
Bảng 3.1. Khối lƣợng thuốc hấp thụ vào màng CVK (n = 3) ........................... 26
Bảng 3.2. Mật độ quang khi tiến hành giải phóng thuốc tại các thời điểm
khác nhau trong các môi trƣờng pH khác nhau ................................................ 28
Bảng 3.3. Tỉ lệ thuốc berberin đƣợc giải phóng tại các thời điểm lấy mẫu ..... 30
Bảng 3.4. Hệ số tƣơng quan (R2), tốc độ giải phóng thuốc (k) và trị số mũ
giải phóng (n) đối với các môi trƣờng pH khác nhau (n = 3) ........................... 33


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học cơ bản của CVK .................................................... 5
Hình 1.2. Công thức cấu tạo của berberin......................................................... 8
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình tạo màng CVK thô .................................................. 15
Hình 2.2. Sơ đồ tinh chế CVK .......................................................................... 16
Hình 2.3. Phƣơng trình đƣờng chuẩn của Berberin (n = 3) .............................. 18
Hình 3.1. Màng CVK đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng cao nấm men ............. 23
Hình 3.2. Màng CVK sau tinh chế kích thƣớc 0.3 (a) và 0.7 (b)...................... 24
Hình 3.3. Kết quả thử sự hiện diện của đƣờng glucose .................................... 25
Hình 3.4. Màng CVK hấp thu thuốc Berberin ................................................. 25
Hình 3.5. Màng CVK- BH trong dung dịch đệm .............................................. 26
Hình 3.6. Mẫu đƣợc rút ra để đo quang phổ sau 6h .......................................... 27
Hình 3.7. Đồ thị biểu diễn OD giải phóng thuốc Berberin của màng CVK ..... 29
Hình 3.8. Biểu đồ tỉ lệ giải phóng ở pH = 2 ...................................................... 31
Hình 3.9. Biểu đồ tỉ lệ giải phóng ở pH = 12 .................................................... 31


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài

Cellulose vi khuẩn (CVK) là sản phẩm của một loài vi khuẩn, đặc biệt
là chủng Acetobacter xylinum (A. xylinum) [3, 8]. Màng sinh học (CVK) có
cấu trúc và đặc tính rất giống với cellulose của thực vật (gồm các phân tử
glucose liên kết với nhau bằng liên kết β-1,4 glucorit) cellulose vi khuẩn khác
với cellulose thực vật ở chỗ: không chứa các hợp chất cao phân tử nhƣ ligin,
hemicellulose, peptin và sáp nến do vậy chúng có những đặc tính vƣợt trội với
độ dẻo dai, bề chắc, độ đàn hồi cao, có khả năng hút nƣớc cao ở trạng thái ẩm
và độ tinh khiết cao, có thể phân hủy sinh học, tái chế hay phục hồi hoàn toàn,
bề mặt tiếp xúc lớn hơn gỗ bình thƣờng, không độc và không gây dị ứng, có
khả năng chịu nhiệt tốt và đặc biệt là khả năng cản khuẩn [3, 11, 12, 14].
Màng CVK đƣợc coi là một nguồn polymer mới, là một giải pháp trên con
đƣờng tìm nguồn nguyên liệu mới hiện nay.
Trên thế giới màng cellulose vi khuẩn đã đƣợc ứng dụng rất nhiều trong
các lĩnh vực công nghệ khác nhau nhƣ: dùng làm màng phân tách cho quá
trình xử lí nƣớc, chất mang đặc biệt cho các pin và năng lƣợng cho tế bào,
dùng làm chất biến đổi độ nhớt trong sản xuất các sợi truyền quang, làm môi
trƣờng cơ chất trong sinh học, thực phẩm hay thay thế thực phẩm [18]. Đặc
biệt trong lĩnh vực y học, màng CVK đã đƣợc ứng dụng làm da tạm thời thay
thế da trong quá trình điều trị bỏng, loét da, làm mạch máu nhân tạo điều trị
các bệnh tim mạch; làm mặt nạ dƣỡng da cho con ngƣời [11, 18]. Ở Việt
Nam, việc nghiên cứu và ứng dụng màng CVK còn ở mức độ khiêm tốn, các
nghiên cứu ứng dụng mới chỉ dừng lại bƣớc đầu nghiên cứu.
Màng cellulose vi khuẩn đƣợc lên men từ nhiều loại môi trƣờng khác
nhau. Trong đó đặc biệt là màng CVK lên men từ môi trƣờng chuẩn đƣợc sử
dụng phổ biến trên thế giới và có đặc tính bền hơn các màng màng cellulose
vi khuẩn lên men từ các môi trƣờng khác.

1

Nƣớc ta thuộc khí hậu nhiệt đới gió mùa: nóng ẩm, mƣa nhiều nên vi
khuẩn, nấm mốc và kí sinh trùng rất dễ phát triển, cùng với điều kiện vệ sinh
an toàn thực phẩm cũng nhƣ vệ sinh môi trƣờng ở nhiều nơi còn khá thấp nên
dễ tạo thành các bệnh nhƣ rối loạn tiêu hóa, tiêu chảy, đau mắt hột. Berberin
là hoạt chất có nguồn gốc thực vật, rẻ tiền, an toàn, thuốc có hoạt tính chống
viêm [2]. Berberin đƣợc sử dụng khá phổ biến trong điều trị bệnh đƣơng tiêu
hóa. Ngoài ra, berberin còn đƣợc điều chế thành thuốc nhỏ mắt điều trị viêm
kết mạc, đau mắt hột. Berberin sở hữu tính chất dƣợc khác nhau bao gồm các
tác dụng chống ung thƣ [24].
Tuy nhiên berberin chủ yếu đƣợc sử dụng qua đƣờng uống với sinh khả
dụng khá thấp và có khả năng gây tác dụng phụ cho việc vận chuyển thuốc
ngoài đƣờng tiêu hóa [24]. Trong quá trình sử dụng có thể bị tác nhân khác
gây ảnh hƣởng làm giảm hiệu quả của thuốc. Mặt khác, berberin cũng có tác
dụng phụ tiềm năng liên kết với bắp của mình và tiêm tĩnh mạch, nhƣ sốc
phản vệ và phát ban thuốc. Do đó, cần thiết phải nghiên cứu khả năng giải
phóng của thuốc berberin.
Với mục đích tạo ra màng CVK dựa trên loài vi khuẩn thuộc chủng A.
xylinum, từ đó chế tạo màng sinh học để khảo sát sự giải phóng thuốc qua
màng nhằm kéo dài thời gian giải phóng, hạn chế tác dụng phụ, khắc phục
tính ít tan trong nƣớc và khả dụng sinh học của CVK trong việc điều trị bệnh.
Đó là lý do chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc
berberin của màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trƣờng chuẩn”.
2. Mục đích nghiên cứu
Nghiên cứu tạo màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trƣờng chuẩn đã
đƣợc nạp thuốc và nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc berberin từ hệ thống
này nhằm tìm ra hệ thống có khả năng giải phóng kéo dài để định hƣớng
nhằm nâng cao hiệu quả sử dụng thuốc.

2

3. Nhiệm vụ nghiên cứu
- Tạo màng CVK từ môi trƣờng chuẩn.
- Cho màng CVK nạp thuốc berberin.
- Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc berberin từ hệ thống màng CVK
đã đƣợc nạp thuốc berberin.
4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
- Đối tƣợng nghiên cứu: Khả năng giải phóng thuốc berberin của màng
cellulose vi khuẩn lên men từ môi trƣờng chuẩn.
- Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu đƣợc thực hiện ở quy mô phòng
thí nghiệm.
- Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm Sinh lý ngƣời và động vật
khoa Sinh - KTNN - Trƣờng ĐHSP Hà Nội 2; Viện NCKH&ƢD Trƣờng
ĐHSP Hà Nội 2.
5. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
- Ý nghĩa khoa học:
Nghiên cứu về màng CVK để tăng thêm hiểu biết về ứng dụng của màng
CVK.
- Ý nghĩa thực tiễn của đề tài:
Đề tài định hƣớng khắc phục đƣợc nhƣợc điểm berberin thông thƣờng:
nâng cao tác dụng của thuốc, rút ngắn thời gian điều trị và giảm chi phí điều
trị cho con ngƣời, …

3


Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu cellulose vi khẩn (CVK)
Cellulose là đại phân tử tồn tại phổ biến nhất trên trái đất, là thành phần
chính của sinh khối thực vật cũng nhƣ đại diện cho các polymer ngoại bào của

vi sinh vật. Cellulose vi khuẩn (CVK) là sản phẩm trao đổi chất sơ cấp và chủ
yếu tạo màng bảo vệ [8].
Cho đến nay, A. xylinum đƣợc đánh giá là loài vi khuẩn có khả năng
sinh màng CVK hiệu quả nhất trong tự nhiên. Loài vi khuẩn gram âm sống
hiếu khí bắt buộc, không sinh bào tử và là một trong những loài tiến hóa nhất
của nhóm vi khuẩn tía. Mỗi tế bào A. xylinum có thể chuyển hóa tới 108 phân
tử glucose và phân tử cellulose trong 1 giờ nên khả năng tổng hợp cellulose là
rất lớn.
A. xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, có thể di động hoặc
không và không sinh bào tử. Chúng là vi khuẩn gram âm nhƣng gram của chúng
có thể bị biến đổi do tế bào già đi hay do môi trƣờng. Tế bào đứng riêng lẻ hay
xếp thành chuỗi. A. xylinum thuộc loại vi khuẩn hiếu khí bắt buộc vì thế chúng
tăng trƣởng ở bề mặt tiếp xúc giữa môi trƣờng lỏng và môi trƣờng khí và có khả
năng tạo màng cellulose trên môi trƣờng nuôi cấy [12].
Trên môi trƣờng rắn sau khoảng 3 - 7 ngày nuôi cấy, khuẩn lạc A.
xylinum có dạng nhỏ, nhày, có màu kem, hơi trong nhƣng sau 1 tuần thì
khuẩn lạc to, đục, màu cà phê sữa, khô dần.
Trên môi trƣờng lỏng sau 24 giờ nuôi cấy thì xuất hiện một lớp màng
đục dày, sau 36 - 48 giờ hình thành một lớp màng trong và ngày càng dày.
1.1.1. Cấu trúc của màng CVK
Cấu trúc hóa học cơ bản của CVK giống với cellulose có nguồn gốc
thực vật (plant cellulose - PC), tuy nhiên chúng khác nhau về cấu trúc đại thể.
Các sợi mới sinh ra của CVK kết lại với nhau để hình thành nên các sợi sơ

4


cấp (subfibril), có chiều rộng khoảng 1.5nm. Các sợi sơ cấp này kết lại thành
các vi sợi, các vi sợi nằm trong các bó, cuối cùng hình thành các dải. Các dải
có chiều dày 3 - 4nm, chiều rộng 70 - 80nm; 3.2 x 133nm. Cấu trúc của CVK

phụ thuộc chặt chẽ vào điều kiện nuôi cấy [22]. Cấu trúc hóa học của CVK
đƣợc thể hiện trong hình 1.1.

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học cơ bản của CVK
1.1.2. Tính chất độc đáo của CVK
Độ tinh khiết cao: CVK là cellulose sinh học duy nhất đƣợc tổng hợp
không có chứa lignin hay hemicellulose. Do đó CVK có thể bị vi khuẩn phân
hủy hoàn toàn và là nguồn nguyên liệu tái sinh.
Độ bền dai cơ học lớn: Cellulose có độ bền dai cao, chịu lực kéo cao,
trọng lƣợng nhẹ, độ bền đáng kể.
Khả năng hút nƣớc cực cao ở trạng thái ẩm: Khả năng giữ nƣớc đáng
kể, lực ẩm cao.
Màng CVK có khả năng giữ nƣớc rất lớn, nó có thể hút 60 - 700 lần
trọng nƣớc của nó [18].
Màng CVK đƣợc hình thành trực tiếp trong quá trình sinh tổng hợp vì
vậy việc sản xuất giấy, sợi không cần qua các bƣớc trung gian.
Màng CVK đƣợc định hƣớng trong quá trình tổng hợp: Có khả năng
hình thành các sợi biến động, tạo các bền theo một trục. Theo Brown và White
(1989) [31] có thể hình thành một gang tay cellulose không cần khâu bằng cách

5


sử dụng một khối đất xốp mà không khí thấm qua đƣợc và dìm xuống không
khí bên trong môi trƣờng lỏng nuôi cấy A. xylinum, tế bào vi khuẩn sẽ tập hợp
xung quanh đất xốp và hình thành cellulose theo hình dạng mong muốn.
Màng CVK đƣợc biến đổi trực tiếp trong quá trình tổng hợp: Khi thêm
chất phụ gia hay cơ chất nhất định vào trong quá trình tổng hợp CVK thì có
thể làm thay đổi những thuộc tính của CVK. Nếu cho thuốc nhuộm vào môi
trƣờng nuôi cấy có thể kiểm soát các tính chất vật lý của cellulose trong quá

trình tổng hợp.
Tổng hợp trực tiếp các dẫn xuất của cellulose nhờ vào sự tác động gen
liên quan đến quá trình tổng hợp cellulose từ đó giúp kiểm soát hình dạng
cellulose, kiểm soát trọng lƣợng phân tử cellulose.
1.1.3. Màng CVK lên men từ môi trường chuẩn
Màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trƣờng chuẩn đƣợc sử dụng
phổ biến trên thế giới và có đặc tính bền hơn các màng cellulose vi khuẩn lên
men từ các môi trƣờng khác. Bên cạnh đó, màng CVK lên men từ môi trƣờng
chuẩn có khả năng chịu lực và khả năng thấm hút tốt.
1.1.4. Ứng dụng của màng CVK
Màng CVK có nhiều ƣu điểm vƣợt trội nhƣ: độ tinh sạch, độ kết tinh,
độ bền sức căng, độ bền đàn hồi, độ co giãn, khả năng giữ hình dạng ban đầu,
khả năng giữ nƣớc và hút nƣớc cao, bề mặt tiếp xúc lớn hơn bột gỗ thƣờng,
bề mặt dƣới của vi sợi dƣới 100mm, bị phân hủy sinh học, có tính thƣơng tích
sinh học, tính trơ chuyển hóa, không độc và không gây dị ứng [18].
Với những ƣu điểm nổi bật, CVK ngày càng đƣợc nghiên cứu nhiều và
có nhiều ứng dụng rộng rãi [4, 10, 11, 12, 18, 22, 23, 25, 30] đƣợc thể hiện cụ
thể trong bảng 1.1.

6


Bảng 1.1. Ứng dụng của CVK
Lĩnh vực ứng dụng

Sản phẩm
Tráng miệng ( thạch dừa)
Ăn kiêng ( kem, salad)

Thực phẩm

Thịt nhân tạo
Vỏ bao xúc xích
Nƣớc uống siro không có cholesterol
Lớp màng trị bỏng

Y dƣợc

Tác nhân vận chuyển thuốc
Da nhân tạo
Chất làm co mạch

Mỹ phẩm

Móng nhân tạo
Đánh mỏng dày và mỏng hơn
Miếng xốp làm sạch vết dầu tràn

Môi trƣờng

Hấp thu chất độc
Quần áo, giày dép tự phân hủy

Dầu mỏ
Trang phục
Thể thao

Thu hồi dầu
Sản xuất sợi nhân tạo
Y phục quân đội

Lều lắp ráp
Gỗ nhân tạo

Sản phẩm rừng

Giấy, giấy đặc biệt để lƣu trữ hồ sơ
Thùng hàng có độ bền cao

Lĩnh vực khác

Làm màng lọc

1.2. Giới thiệu về thuốc berberin.
Berberin là hoạt chất chiết từ cây hoàng đằng (còn có tên vàng đắng,
hoàng liên, tên khoa học là Coptis teeta) là loại cây dây leo thân gỗ có phân

7


nhánh, mọc hoang ở nhiều nơi. Berberin có nhiều trong thân và rễ cây hoàng
đắng với tỷ lệ 1.5 - 3%, berberin chiếm ít nhất là 82% so với alcaloid toàn phần.
Tên chung quốc tế: berberin.
Loại thuốc: kháng khuẩn, chống tiêu chảy do vi khuẩn, ký sinh trùng
đƣờng ruột.
1.2.1. Công thức hóa học và tính chất
Berberin là một alkaloid thực vật thuộc nhóm isoquinol có khung
protoberberin [1]. Isoquinolin còn đƣợc gọi là benzo pyridin hay 2 - benzamin
là một hợp chất hữu cơ thơm heterocyclic.
Công thức cấu tạo

Hình 1.2. Công thức cấu tạo của berberin
Công thức phân tử : C20H18NO4Cl.2H2O
Khối lƣợng phân tử: 371.82
Tên hoa học: 5,6-đihydro-8,9-đimethoxy-1,3-đioxa-6a-azoniaindeno
(5,6-a) anthracen clorid dihydrat [1].
Tính chất vật lý:
Tinh thể hay bột kết tinh màu vàng, không mùi có vị rất đắng. Độ chảy
khi ở dạng base là 145ºC (bị phân hủy) [17]. Độ tan dạng base tan chậm trong
nƣớc 1/500 [27], hơi tan trong ethanol, khó tan trong ether [17]. Dạng muối
sulfat dễ tan trong nƣớc ở tỷ lệ 1/30. Tan trong ethanol. Berberin không có C
bất đổi nên không có đồng phân quang học [11, 17].

8


Tính chất hóa học:
Tính chất hóa học của N: Berberin có tính chất nhƣ một base yếu, tạo
muối bằng cách thay thế nhóm OH, việc tạo muối berberin không giống nhƣ
các alkaloid khác mà muối tạo thành giống muối của hydroxyd kim loại,
nghĩa là có loại phân tử nƣớc [7].
Tính chất hóa học của oxy: Berberin kém ổn định trong môi trƣờng
kiềm mạnh, N không bền vững, trong môi trƣờng kiềm mạnh dễ biến mở
vòng, cho chức aldehyd gọi là Berberinal [7].
Tính chất hóa học mạch kép: Berberin có thể mất mạch kép tại nhân
giữa để cho các hydro alkaloid không màu [7].
1.2.2. Tác dụng dược lý và ứng dụng
Berberin có tác dụng kháng khuẩn đƣợc dùng chủ yếu trong các bệnh
rối loạn đƣờng tiêu hóa [27]. Berberin chống nhiễm nấm, kí sinh trùng và
nhiễm trùng vi khuẩn hay virut. Berberin còn là thành phần của một số thuốc
nhỏ mắt chữa đau mắt hột.

Ngoài ra berberin với liều nhỏ có tác dụng kích thích tim, làm giãn
mạch vành, với liều lớn ức chế hô hấp, làm tê liệt trung khu hô hấp trong khi
tim vẫn đập. Berberin còn có tác dụng hạ nhiệt, gây tê, lợi mật, kháng lợi
niệu. Berberin đem khử hóa cho tetrahydroberberine có tác dụng an thần,
mềm cơ và hạ huyết áp nhẹ.
Những nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng: berberin có khả năng hạ đƣờng
huyết hiệu quả nhƣ metformin [30]. Berberin làm giảm mạnh lƣợng
cholesterol, LDL cholesterol, triglycerid và sơ vữa [22]. Ngoài ra berberin
còn điều trị chứng co giật và bệnh động kinh [23], bảo vệ các tế bào thần kinh
trong các trƣờng hợp tổn thƣơng não do tắc mạch máu não gây ra [33] và có
tác dụng chống trầm cảm [23].

9


1.2.3. Chỉ định và chống chỉ định của thuốc berberin
Chỉ định: nhiễm trùng đƣờng ruột, tiêu chảy, lỵ trực tràng, hội chứng
lỵ, viêm ống mật, đau mắt đỏ, đau mắt hột, nhức mỏi mắt, viêm kết mạc, các
trƣờng hợp ngứa mắt do dị ứng.
Chống chỉ định: quá mẫn cảm, phụ nữ có thai. Phụ nữ mang thai và cho
con bú: không uống berberin nếu bạn đang mang thai. Các nhà nghiên cứu
cho rằng berberin có thể đi qua nhau thai và có thể gây hại cho thai nhi. Vàng
da nhân (kernicterus), một loại tổn thƣơng não, đã phát triển ở trẻ sơ sinh tiếp
xúc với berberin. Không uống berberin nếu bạn đang cho con bú. Berberin có
thể đi vào cơ thể trẻ sơ sinh qua sữa mẹ, và có thể gây ra hại cho trẻ sơ sinh.
1.3. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc
1.3.1. Về màng cellulose vi khuẩn
Trên thế giới
Nghiên cứu về màng CVK từ vi khuẩn A. xylinum và những ứng dụng
của nó đã đƣợc tiến hành ở nhiều nƣớc trên thế giới. Tác giả Brown (1989),

dùng màng CVK làm môi trƣờng phân tách cho quá trình xử lý nƣớc, dùng
làm chất mang đặc biệt cho các pin và năng lƣợng cho tế bào. Brown (1989),
Jonas và Farad, 1998, dùng màng nhƣ là một chất để biến đổi độ nhớt, để làm
ra các sợi truyền quang, làm môi trƣờng cơ chất trong sinh học, thực phẩm
[15]. Các tác giả Hamlyn và cs (1997), Cienchanska (2004), Legeza và cs
(2004), Wan và Milon (2005), Czaja và cs (2006) sử dụng màng đắp lên các
vết thƣơng hở, vết bỏng đã thu đƣợc kết quả tốt [15].
Tại Việt Nam
Tại Việt Nam việc nghiên cứu và sử dụng màng CVK từ vi khuẩn A.
xylinum ngày càng đƣợc quan tâm. Năm 2006, Nguyễn Văn Thanh và cs [15]
đã tiến hành nuôi cấy, tinh chế và thu màng CVK từ A. xylium đạt hiệu quả
cao. Đồng thời nhóm nghiên cứu trên cũng đã tiến hành thử nghiệm in vivo

10


trong ứng dụng màng CVK điều trị bỏng với 2 loại màng CVK gồm cho thêm
hoạt chất tái sinh mô và hoạt chất kháng khuẩn. Kết quả cho thấy màng CVK
có cho thêm hoạt chất tái sinh mô từ dầu mù u làm gia tăng hiệu quả trị bỏng
là ƣu điểm mà các loại màng khác trên thế giới không có.
Năm 2012, Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Thị Thùy Vân, Trần Nhƣ
Quỳnh [3] đã công bố công trình nghiên cứu “Nghiên cứu vi khuẩn
Acetobacter xylinum tạo màng Bacterial cellulose ứng dụng trong điều trị
bỏng”, kết quả cho thấy màng CVK tạo bởi A. xylinum BNH2 tổng hợp có sợi
cellulose nhỏ, dai, độ bền kéo, độ thấu khí cao, độ hút nƣớc tốt có triển vọng
ứng dụng làm màng trị bỏng.
1.3.2. Về thuốc berberin
Trên thế giới
Đã có những công trình nghiên cứu về thuốc berberin trên thế giới nhƣ:
Huilixing và Jianping Ye đã xác định hiệu quả và tính an toàn của

berberin trong điều trị bệnh nhân tiểu đƣờng loại 2 [19].
Pyan Bradley, ND, MPH và Bill Walter, ND đã nghiên cứu về berberin
trong bện tiểu đƣờng [28].
Jianping Ye, Weiping Jia đã tìm hiểu về tác dụng và cơ chế của berberin
trong điều trị bệnh tiểu đƣờng [20].
Tại Việt Nam
Việc nghiên cứu thuốc berberin ở Việt Nam có một số công trình
nghiên cứu sau:
Phan Quốc Kinh đã nghiên cứu những Alkaloid chiết xuất từ các cây
thuốc Việt Nam [6].
Nguyễn Liêm - chiết xuất berberin bằng áp lực nóng [9].
Phạm Viết Trang, Nguyễn Liêm - góp phần nghiên cứu cải tiến quy
trình sản xuất berberin từ cây vàng đắng [9].

11


Hồ Đắc Trinh - chiết berberin clorid trong vàng đắng bằng dung dịch
acid sulfuric loãng [15].
Trần Công Khánh - góp phần nghiên cứu phƣơng pháp sản suất
berberin từ cây vàng đắng Coscinium usitatum Pierre [5].

12


Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Đối tƣợng nghiên cứu: Khả năng giải phóng thuốc berberin của màng
cellulose vi khuẩn lên men từ môi trƣờng chuẩn.
Vật liệu nghiên cứu: Màng CVK, thuốc berberin dạng tinh khiết.

Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu đƣợc thực hiện ở quy mô phòng
thí nghiệm.
2.2. Nội dung nghiên cứu
Tạo màng CVK từ môi trƣờng chuẩn.
Cho màng CVK nạp thuốc berberin.
Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc berberin từ hệ thống màng CVK
đã đƣợc nạp thuốc berberin.
2.3. Thiết bị và hóa chất sử dụng trong nghiên cứu
2.3.1. Thiết bị
- Máy đo quang phổ UV - 2450 (Shimadzu - Nhật Bản);
- Cân phân tích;
- Nồi hấp khử trùng HV - 110/HIRAIAMA;
- Buồng cấy vô trùng (Haraeus);
- Tủ sấy, tủ ấm (Binder - Đức);
- Khuấy từ gia nhiệt (IKA - Đức);
- Kính hiển vi quang học (Carl Zeiss - Đức);
- Máy lắc tròn tốc độ chậm (Orbital Shakergallenkump - Anh);
- Tủ lạnh Daewoo, tủ lạnh sâu;
- Và nhiều dụng cụ hóa sinh thông dụng khác.
2.3.2. Nguyên liệu - hóa chất
Nguyên liệu: nƣớc cất 2 lần, gạc vô trùng.

13


Hóa chất:
Hóa chất đặc biệt: Pepton của hãng DIFCO.
Các hóa chất thông thƣờng có nguồn gốc của Trung Quốc và Việt Nam:
berberin (độ tinh khiết 98%), cao nấm men, cồn 96º, đƣờng glucose, pepton,
acid axetic, KH2PO4, NaCl, KCl, Na2HPO4, NaOH, acid HCl đậm đặc, nƣớc

cất và một số hóa chất khác.
2.4. Môi trƣờng tạo màng CVK
Môi trƣờng tạo CVK đƣợc trình bày trên bảng 2.1.
Bảng 2.1. Môi trƣờng tạo màng CVK
STT

Hóa chất

Khối lƣợng

1

Nƣớc cất 2 lần

1000ml

2

Glucose

20g

3

Cao nấm men

5g

4

Pepton

5g

5

Na2HPO4

2.7g

6

Axit citric

1.5g

2.5. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.5.1. Phương pháp tạo màng CVK từ môi trường chuẩn
Quá trình lên men tạo màng CVK sử dụng quy trình lên men tĩnh: Môi
trƣờng dinh dƣỡng để lên men A. xylinum đƣợc cho vào các bình lên men có
bề mặt thoáng rộng. Trong quá trình lên men các bình đƣợc đậy bằng vải xô
có độ xốp giúp tạo độ thông khí giữa môi trƣờng lên men và môi trƣờng bên
ngoài nhƣng vẫn tránh đƣợc khả năng nhiễm khuẩn. Nhiệt độ thích hợp cho
quá trình lên men 28 - 30ºC. Sợi cellulose nằm ở mặt phân cách giữa môi
trƣờng lỏng và không khí. Cellulose tiếp tục đƣợc tổng hợp bám lên màng
cellulose bên trên. Sau 7 - 10 ngày có thể thu CVK [14].

14

Cụ thể quy trình tạo màng CVK lên men từ môi trƣờng chuẩn đƣợc
thực hiện theo quy trình ở sơ đồ 2.1 [14].
Nƣớc cất 2 lần

Bổ sung dinh dƣỡng
(bảng 2.1)

Hấp thanh trùng
(113ºC, 20 phút)
Để nguội

Đổ giống và acid acetic vào bình nuôi
cấy thực hiện trong buồng cấy vô trùng
( 10% giống + 2% acid)
Đậy bình bằng vải xô
sạch, để nơi thoáng mát
Lên men 7- 8 ngày

Thu CV
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình tạo màng CVK thô
2.5.2. Phương pháp xử lý màng CVK trước khi hấp thụ thuốc
Màng CVK sau khi thu đƣợc chứa một lƣợng lớn môi trƣờng lên men
và các sản phẩm của quá trình trao đổi chất acid acetic. Vì vậy, trƣớc khi hấp

15


thụ thuốc cần phải xử lý màng để quá trình tiến hành thí nghiệm hấp thụ và
giải phóng đƣợc chính xác.
Quy trình xử lý màng [13] đƣợc trình bày trên sơ đồ 2.2.

Tách màng CV thô
Ép loại nƣớc
Ngâm trong NaOH 3%
48 giờ, rửa và ép
Ngâm trong HCl 3%
48 giờ, rửa và ép
Ngâm trong nƣớc
48 giờ, kiểm tra tạp chất
Thu CV tinh chế
Hình 2.2. Sơ đồ tinh chế CVK
Tách CVK: Trong nuôi cấy tĩnh CVK tạo thành màng dày ở mặt môi
trƣờng nuôi cấy, ép màng loại bỏ môi trƣờng.
Trong màng chứa một lƣợng lớn vi khuẩn vì vậy ngâm màng trong
một NaOH 3% để phá vỡ thành tế bào vi khuẩn và giải phóng nội độc tố
của vi khuẩn.
Ngâm HCl: Màng sau khi đƣợc ngâm bằng NaOH rửa nƣớc rồi ép
màng. Sau đó, ngâm với HCl 3% khoảng 48 giờ để trung hòa hết NaOH.

16


Ngâm nƣớc: Màng sau khi ngâm với rửa nƣớc rồi ép màng. Ngâm nƣớc
đến trung hòa hết acid thời gian khoảng 48 giờ ta thu đƣợc CVK tinh khiết.
2.5.3. Phương pháp đánh giá độ tinh khiết của màng
 Mục đích: nhằm đảm bảo màng CVK sau khi xử lý đã loại đƣợc các
tạp chất có thể gây độc hại, kiểm tra sự hiện diện của đƣờng glucose trong
màng CVK.
 Nguyên tắc: dùng thuốc thử Fehling mới pha để phát hiện sự hiện
diện của đƣờng D - glucose, nếu có sẽ xuất hiện kết tủa nâu đỏ.
 Tiến hành:

- Dịch thử của màng CVK các loại sau khi đã xử lý hóa học.
- Mẫu đối chứng: là nƣớc cất và dung dịch D - glucose.
- Cho vào các ống nghiệm chứa mẫu thử mỗi ống nghiệm 1ml thuốc
thử Fehling. Ngâm trong nƣớc đun sôi 10 - 15 phút.
- Quan sát tủa xuất hiện trong ống nghiệm.
2.5.4. Phương pháp xác định khối lượng CVK tạo thành
CVK sau khi đƣợc tách ra khỏi môi trƣờng, xử lý qua công đoạn hóa
học [15] thu đƣợc CVK tinh chế. CVK tinh chế đƣợc ép áp lực, thu đƣợc khối
lƣợng CVK tạo thành.
2.2.5. Xây dựng đường chuẩn của berberin trong cồn 96º
- Chuẩn bị dung dịch mẫu trắng: cồn 96º.
- Chuẩn bị dung dịch chứa thuốc berberin ở các nồng độ (mg/ml) khác
nhau: 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% trong cồn 96º.
- Dùng máy đo quang phổ tử ngoại UV - Vis để đo mật độ quang phổ
(OD) của các dung dịch đã pha nhƣ trên ở bƣớc sóng 345nm [24].
- Tiến hành đo 3 lần, lấy giá trị trung bình quang phổ của thuốc
berberin để xây dựng đƣờng chuẩn của thuốc berberin.

17