Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon và một số nguyên tố khoáng đến quá trình tạo màng biocellulose từ môi trường bổ sung dịch tảo xoắn spirulina

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH – KTNN
======

NGUYỄN THỊ HUYỀN

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA NGUỒN CACBON
VÀ MỘT SỐ NGUYÊN TỐ KHOÁNG ĐẾN QUÁ TRÌNH
TẠO MÀNG BIOCELLULOSE TỪ MÔI TRƯỜNG
BỔ SUNG DỊCH TẢO XOẮN SPIRULINA

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Người hướng dẫn khoa học

PGS.TS. ĐINH THỊ KIM NHUNG

HÀ NỘI - 2017


LỜI CẢM ƠN
Bằng tất cả tấm lòng kính trọng, em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu
sắc đến PGS.TS. Đinh Thị Kim Nhung, người đã tận tình hướng dẫn giúp
đỡ em hoàn thành khóa luận này.
Em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Sư phạm Hà
Nội 2 và Ban chủ nhiệm khoa Sinh – KTNN đã tạo điều kiện thuận lợi cho em
hoàn thành đề tài nghiên cứu.
Cuối cùng em xin được cảm ơn gia đình, bạn bè và người thân đã quan
tâm giúp đỡ, động viên em trong suốt thời gian qua.
Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày … tháng 05 năm 2017
Sinh viên

Nguyễn Thị Huyền


LỜI CAM ĐOAN
Đề tài được thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS.TS. Đinh Thị Kim
Nhung, em xin cam đoan những gì viết trong khóa luận này đều là sự thật.
Đây là kết quả nghiên cứu của riêng em. Đề tài này không trùng với bất cứ đề
tài nào đã từng được công bố.
Nếu sai em xin hoàn toàn chịu trách nhiệm.
Hà Nội, ngày … tháng 05 năm 2017
Sinh viên

Nguyễn Thị Huyền


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
1. Lí do chọn đề tài ............................................................................................ 1
2. Mục đích nghiên cứu ..................................................................................... 2
3. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 2
4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu................................................................. 2
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn....................................................................... 3
6. Điểm mới của đề tài ...................................................................................... 3
NỘI DUNG ....................................................................................................... 4
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 4
1.1. Giới thiệu về tảo xoắn Spirulina ................................................................ 4
1.1.1. Lịch sử ..................................................................................................... 4

1.1.2. Phân loại tảo Spirulina ........................................................................... 4
1.1.3. Đặc điểm sinh học của tảo Spirulina ...................................................... 5
1.1.4. Nghiên cứu ứng dụng .............................................................................. 7
1.2. Vị trí và đặc điểm phân loại Gluconacetobacter trong sinh giới............... 7
1.2.1. Vị trí phân loại của Gluconacetobacter trong sinh giới ......................... 7
1.2.2. Đặc điểm phân loại của Gluconacetobacter ........................................... 7
1.3. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn Gluconacetobacter.............................. 9
1.3.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon................................................................. 9
1.3.2. Nguồn dinh dưỡng khoáng.................................................................... 10
1.4. Biocellulose .............................................................................................. 10
1.4.1. Cấu trúc ................................................................................................. 10
1.4.2. Một số tính chất. .................................................................................... 11
1.4.3. Cơ chế tổng hợp .................................................................................... 12
1.4.4. Chức năng của cellulose đối với vi khuẩn Gluconacetobacter ............ 13


1.5. Mặt nạ dưỡng da ( Biocellulose mask) .................................................... 14
1.6. Tình hình nghiên cứu và sản xuất Biocellulose hiện nay........................ 15
1.6.1. Trên thế giới .......................................................................................... 15
1.6.2. Tại Việt Nam ......................................................................................... 15
Chương 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................................. 17
2.1. Đối tượng nghiên cứu và hóa chất ........................................................... 17
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................ 17
2.1.2. Thiết bị và hóa chất ............................................................................... 17
2.2. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 18
2.2.1. Phương pháp vi sinh .............................................................................. 18
2.2.2. Phương pháp hóa sinh .......................................................................... 21
2.2.3. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng
tạo màng Biocellulose ..................................................................................... 22
2.2.4. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của một số nguyên tố khoáng đến

sự hình thành màng Biocelluose ..................................................................... 23
2.2.5. Thử nghiệm khả năng tạo màng Biocellulose trên môi trường lựa chọn
......................................................................................................................... 23
2.2.6. Phương pháp xác định trọng lượng tươi của màng Biocellulose .......... 23
2.2.7. Phương pháp thống kê và xử lí số liệu .................................................. 23
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 25
3.1. Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng tạo màng Biocellulose
trên môi trường tảo xoắn Spirulina ................................................................. 25
3.1.1. Phân lập vi khuẩn axetic trên môi trường tảo xoắn Spirulina .............. 25
3.1.2. Tuyển chọn chủng có khả năng tạo màng Biocellulose ........................ 28
3.2 Ảnh hưởng của nguồn cacbon tới khả năng tạo màng Biocellulose của
Gluconacetobacter xylinus T3 ........................................................................ 31


3.3. Ảnh hưởng của một số nguyên tố khoáng đến sự hình thành màng
Biocellulose của Gluconacetobacter xylinus T3 ............................................. 32
3.3.1. Ảnh hưởng của KH2PO4........................................................................ 32
3.3.2. Ảnh hưởng của MgSO4.7H2O ............................................................... 34
3.4. Thử nghiệm khả năng tạo màng Biocellulose trên môi trường lựa chọn. 36
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 37
1. Kết luận ....................................................................................................... 37
2. Kiến nghị ..................................................................................................... 37
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 38


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Hình dạng tảo Spirulina quan sát dưới kính hiển vi ........................ 5
Hình 1.2. Sợi cellulose của thực vật ............................................................... 11
Hình 1.4. Con đường chuyển hóa cacbon trong vi khuẩn Gluconacetobacter
......................................................................................................................... 13

Hình 3.1. Mẫu lên men tự nhiên dịch tảo Spirulina........................................ 25
Hình 3.2. Khuẩn lạc vi khuẩn axetic của mẫu phân lập.................................. 25
Hình 3.3. Hình thái tế bào học của 2 chủng Gluconacetobacter T3 và T5 (×
1000)................................................................................................................ 29
Hình 3.4. Hoạt tính catalase ........................................................................... 30
Hình 3.5. Ảnh hưởng của hàm lượng glucose đến sự hình thành màng
Biocellulose của chủng vi khuẩn G. xylinus T3 .............................................. 32
Hình 3.6. Ảnh hưởng của hàm lượng KH2PO4 đến sự hình thành màng
Biocellulose của chủng vi khuẩn G. xyinus T3 ............................................... 34
Hình 3.7. Ảnh hưởng của hàm lượng MgSO4.7H2O đến sự hình thành màng
Biocellulose của chủng vi khuẩn G. xylinus T3 .............................................. 35
Hình 3.8. Màng Biocellulose thu được ở môi trường lựa chọn (MT3)........... 36


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Đặc điểm sinh hoá của chủng vi khuẩn Gluconacetobacter ............ 9
Bảng 3.1. Đặc điểm hình thành màng cellulose của 3 chủng
Gluconacetobacter .......................................................................................... 28
Bảng 3.2. Một số đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào của 2 chủng
Gluconacetobacter T3 và T5 ........................................................................... 29
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của hàm lượng glucose đến khả năng tạo màng
Biocellulose đến chủng G. xylinus T3............................................................. 31
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của hàm lượng KH2PO4 đến khả năng tạo màng
Biocellulose của chủng G. xylinus T3 ............................................................. 33
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của hàm lượng MgSO4.7H2O đến khả năng tạo màng
Biocellulose của chủng G. xylinus T3 ............................................................. 34


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

cs

: Cộng sự

g/l

: gam trên lít

G. xylinus

: Gluconacetobacter xylinus

G. xylinus T3 : Gluconacetobacter xylinus T3
mm

n : milimet

stt

: số thứ tự

BC

: Biocellulose


MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Màng Biocellulose được tổng hợp từ một số loài vi khuẩn, có bản chất là
cellulose được liên kết với các tế bào vi khuẩn, màng này vừa có cấu trúc và

đặc tính cơ học rất giống với cellolose của thực vật, nhưng lại có một số tính
chất hóa lí đặc biệt như: độ bền cơ học và khả năng thấm hút nước cao, đường
kính sợi nhỏ, độ tinh khiết cao, khả năng polymer hóa lớn.
Trên thế giới, màng Biocellulose đã được ứng dụng rất nhiều trong các
lĩnh vực công nghệ khác nhau: như dùng làm màng phân tách cho quá trình
xử lí nước, chất mang đặc biệt cho pin và năng lượng cho tế bào, làm môi
trường cơ chất sinh học, màng bọc thực phẩm. Đặc biệt trong lĩnh vực y học,
màng Biocellulose đã được ứng dụng làm da tạm thời thay thế da trong quá
trình diều trị bỏng, loét da, làm mạch máu nhân tạo điều trị các bệnh tim
mạch, làm mặt nạ dưỡng da cho con người [5].
Ở Việt Nam, việc nghiên cứu và ứng dụng màng Biocellulose còn là vấn
đề khá mới mẻ, chỉ được quan tâm gần đây. Các nghiên cứu và công bố về
vấn đề này còn rất khiêm tốn. Các nghiên cứu hiện nay mới dừng ở nghiên
cứu quá trình tạo màng Biocellulose ứng dụng trong sản xuất thạch dừa, làm
giá thể gắn kết tế bào vi khuẩn và làm màng trị bỏng [12].
Trên thế giới việc nghiên cứu Gluconacetobacter và quá trình sinh tổng
hợp BC cũng như ứng dụng của BC bắt đầu từ rất sớm. Những nghiên cứu
đầu tiên là của Brown A.J và cộng sự năm (1886). Trải qua hơn 1 thế kỷ
nhưng cho đến nay Gluconacetobacter và màng BC vẫn đang thu hút được
sự chú ý của rất nhiều nhà khoa học trên thế giới.
Nguyên liệu dùng để nuôi Gluconacetobacter rất đa dạng: nước dừa già,
rỉ đường, nước mía, nước vo gạo. Các loại môi trường này đã được nghiên
cứu khá nhiều. Tuy nhiên môi trường dinh dưỡng tảo xoắn dùng để nuôi

1


Gluconacetobacter chưa được nghiên cứu. Tảo xoắn Spirulina là loại tảo có
nhiều giá trị về dinh dưỡng, được ứng dụng trong các sản phẩm về chăm sóc
sắc đẹp và sức khỏe cho con người. Nhằm bổ sung những hiểu biết về

Gluconacetobacter và quá trình tạo màng BC định hướng nhu cầu nghiên
cứu và ứng dụng màng BC làm mặt nạ dưỡng da, tôi lựa chọn đề tài: “Ảnh
hưởng của nguồn cacbon và một số nguyên tố khoáng đến quá trình tạo
màng Biocellulose từ môi trường bổ sung dịch tảo xoắn Spirulina”.
2. Mục đích nghiên cứu
Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon và một số nguyên tố khoáng
đến quá trình hình thành màng Biocellulose trong môi truờng bổ sung dịch
tảo xoắn Spirulina. Từ đó tìm được nguồn cacbon và nguồn khoáng thích
hợp cho quá trình tạo màng Biocellulose trong môi trường bổ sung tảo xoắn
Spiruina.
3. Nội dung nghiên cứu
3.1. Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng tạo màng Biocellulose
trên nguồn nguyên liệu tảo xoắn Spirulina.
3.2. Ảnh hưởng của nguồn cacbon tới khả năng tạo màng của
Gluconacetobacter.
3.3. Ảnh hưởng của một số nguyên tố khoáng tới khả năng tạo màng của
Gluconacetobacter.
3.3.1. Ảnh hưởng của hàm lượng KH2PO4.
3.3.2. Ảnh hưởng của hàm lượng MgSO4.7H2O.
4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
4.1. Đối tượng nghiên cứu
Chủng vi khuẩn G. xylinus T3 có khả năng tạo màng Biocellulose phân
lập từ môi trường tảo xoắn.

2


4.2. Phạm vi nghiên cứu
Ảnh hưởng của nguồn cacbon và một số nguyên tố khoáng đến khả
năng tạo màng Biocellulose của chủng G. xylinus T3 đã tuyển chọn.

5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
5.1. Ý nghĩa khoa học
Tìm hiểu sự đa dạng của các chủng Gluconacetobacter có khả năng tạo
màng BC trên nguồn nguyên liệu mới, qua đó nghiên cứu đặc tính sinh lý,
sinh hóa của chủng vi khuẩn G. xylinus T3 có khả năng lên men tạo màng
Biocellulose trên môi trường tảo xoắn Spirulina. Kết quả nghiên cứu là dữ
liệu bổ sung cho các nghiên cứu và ứng dụng của chủng vi khuẩn G. xylinus
trong đời sống.
5.2. Ý nghĩa thực tiễn
Tìm ra hướng đi mới trong công nghệ sản xuất màng BC từ nguồn
nguyên liệu tảo xoắn Spirulina ứng dụng trong sản xuất mặt nạ dưỡng da.
6. Điểm mới của đề tài
Tìm được nguồn cacbon và nguồn khoáng thích hợp cho quá trình lên
men tạo màng Biocellulose dai, mỏng và nhẵn trong môi trường có bổ sung
tảo xoắn Spirulina là Glucose 10 (g/l); KH2PO4 1,0 (g/l); MgSO4.7H2O 1,0
(g/l).

3


NỘI DUNG
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về tảo xoắn Spirulina
1.1.1. Lịch sử
Spirulina do nhà tảo học Deurben (người Đức) đặt năm 1827, dựa trên
hình thái của tảo là dạng sợi xoắn ốc (spiralis) [29].
Cũng vào năm 1827, Turpin lần đầu tiên phân lập được tảo Spirulina từ
nguồn nước tự nhiên. Năm 1963, giáo sư Clement (người Pháp) đã nghiên
cứu thành công việc nuôi Spirulina ở qui mô công nghiệp. Do hình dạng “lò
xo xoắn” với khoảng 5-7 vòng đều nhau không phân nhánh dưới kính hiển vi

nên được gọi là Spirulina với tên khoa học là tảo Spirulina platensis (bắt
nguồn từ chữ spire, spiral có nghĩa là “xoắn ốc”) và trước đây được coi là
thuộc chi Spirulina. Thực ra đây không phải là sinh vật thuộc tảo (algae) vì
tảo thuộc sinh vật có nhân thật (Eukaryota). Spirulina thuộc vi khuẩn lam
(Cyanobacteria) nên chúng thuộc sinh vật nhân sơ hay nhân nguyên thủy
(Prokaryote) [29].
Năm 1973, Tổ chức Nông lương Quốc tế (FAO) và Tổ chức Y tế Thế
giới (WHO) đã chính thức công nhận tảo xoắn Spirulina là nguồn dinh dưỡng
và dược liệu quý, đặc biệt trong chống suy dinh dưỡng và chống lão hóa. Năm
1977, Viện sinh vật học là nơi tiên phong trong việc nuôi trồng Spirulina ở
Việt Nam theo mô hình ngoài trời, không mái che, có sục khí CO2 [29].
1.1.2. Phân loại tảo Spirulina
Ngành: Cyanophyta
Lớp: Cyanophyceae
Bộ: Oscillatoriales
Họ: Oscillatoriaceae
Giống: Spirulina

4


1.1.3. Đặc điểm sinh học của tảo Spirulina
Tảo Spirulina có dạng xoắn lò xo khoảng 5-7 vòng đều nhau không phân
nhánh. Đường kính xoắn khoảng 35-50 micromet, bước xoắn 60 micromet,
chiều dài thay đổi có thể đạt 0,25mm. Nhiều trường hợp tảo xoắn Spirulina có
kích thước lớn hơn. Tảo là trung gian giữa vi khuẩn và tảo nhân thực. Người
ta cho rằng tảo Spirulina giống với vi khuẩn hơn, do đó tảo Spirulina còn có
tên là vi khuẩn lam.
Tảo có khả năng vận chuyển theo hình thức trượt xung quanh trục của
chúng. Vận tốc vận chuyển của chúng có thể đạt 5 micron/giây [29].

Hình 1.1. Hình dạng tảo Spirulina quan sát dưới kính hiển vi
1.1.3.1. Đặc điểm cấu tạo tế bào của tảo Spilurina
Là tảo lam đa bào dạng sợi, gồm nhiều hình trụ xếp không phân nhánh.
Mỗi tế bào của sợi có chiều rộng 5 micromet, dài 2 mm. Không có lục lạp mà
chỉ chứa thylacoid phân bố đều trong tế bào. Không có không bào. Không có
nhân điển hình, vùng nhân không rõ, trong đó có chứa DNA (Hedeskog và
Hifsten A.1980). Thành tế bào tảo gồm các lớp lipopolysaccharide, các sợi
nhỏ protein và các phân tử peptidoglucan. Màng tế bào nằm sát ngay dưới
thành tế bào và nối với màng quang hợp thylacoid tại một vài điểm.
Bộ máy quang hợp của tảo xoắn Spirulina: Phycobilisome chứa
phycobiliprotein và protein liên kết được gắn vào bề mặt ngoài của thylacoid.

5


Phycobilisome có khối lượng khoảng 7 triệu dalton và có thể tách nguyên vẹn
để nghiên cứu. Đối với phycobilisome có cả phycoerythin và phycocyanin thì
lớp ngoài cùng là phycoerythin, tiếp theo là phycocyanin và phần trong cùng
là allophycocyanin. Phycobilisome hoạt động như một anten thu nhận năng
lượng mặt trời để chuyển vào PS II. Con đường truyền năng lượng bắt đầu từ
phycoerythin sang phycocyanin và cuối cùng đến allophycocyanin trước khi
đạt tới PS II. Có khoảng 50 % năng lượng ánh sáng mặt trời Spirulina nhận
được nhờ phycobilisome.
Các sắc tố quang hợp gồm chlorophylla, carotenoid, phycocyanin,
allophycocyanin và thường có carotenoid-glycoside như myxoxanthophyll,
oscillaxanthin. Spirulina có chứa 3 nhóm sắc tố chính: Chlorophyll hấp thụ
ánh sáng lam và đỏ. Carotenoid hấp thụ ánh sáng lam và lục. Phycobillin hấp
thụ ánh sáng lục, vàng và da cam [29].
1.1.3.2. Sinh sản của tảo Spirulina

Tảo Spirulina có phương thức sinh sản vô tính, từ một cơ thể mẹ trưởng
thành (gọi là trichome), tự phân chia thành nhiều mảnh, mỗi mảnh gồm một
số vòng xoắn (2 - 4 tế bào, gọi là hormogonia). Để tạo thành các hormogonia,
sợi Spirulina sẽ hình thành các tế bào chuyên biệt cho sự sinh sản (gọi là đoạn
necridia). Các necridia hình thành các đĩa lõm ở hai mặt và tạo ra hormogonia
bởi sự chia cắt tại vị trí các đĩa. Khi đã phát triển, dần dần phần đầu
hormogonia bị tiêu giảm và trở nên tròn nhưng vách tế bào vẫn có chiều dày
không đổi. Các hormogonia phát triển, trưởng thành và chu kì sinh sản lặp lại
để đảm bảo vòng đời của Spirulina.
Thông thường, Spirulina sinh sản bằng cách gãy ra từng khúc. Trong
trường hợp gặp điều kiện không thuận lợi, Spirulina cũng có khả năng tạo bào
tử giống như ở vi khuẩn. Chu kì phát triển của Spirulina rất ngắn. Chu kì này
thường diễn ra trong 24 giờ như của tảo Chlorella [29].

6


1.1.4. Nghiên cứu ứng dụng
Tảo xoắn Spirulina đã được nghiên cứu sản xuất và được ứng dụng
trong nhiều lĩnh vực khác nhau ở các nước trên thế giới, đặc biệt là trong
ngành thực phẩm và mỹ phẩm. Spirulina được nghiên cứu bổ sung vào rất
nhiều thực phẩm như: mì sợi, yaourt, kẹo, trà xanh, bánh quy, bánh mì,
bia…Các sản phẩm này được bán ở siêu thị của nhiều nước như: Chi Lê, Đan
Mạch, Hà Lan, Mỹ, Úc, NewZealand…
Nhiều giá trị dinh dưỡng và sinh học của tảo Spirulina đã được khám
phá: Tảo rất giàu protein (60-70 % trọng lượng khô của tảo), các vitamin
nhóm B, hàm lượng vitamin B12 cao gấp 2 lần trong gan bò. Caroten cao gấp
10 lần trong củ cà rốt. Ngoài ra tảo Spirulina còn chứa các khoáng vi lượng
(coban, kẽm, sắt…), 11 vitamin cần thiết cho cơ thể và các chất chống oxi
hóa. Tảo Spirulina làm cân bằng dinh dưỡng, tổng hợp các chất nội sinh, tăng

hormon và điều hòa sinh lí [29].
1.2. Vị trí và đặc điểm phân loại Gluconacetobacter trong sinh giới
1.2.1. Vị trí phân loại của Gluconacetobacter trong sinh giới
Theo hệ thống phân loại của nhà khoa học Bergey thì
Gluconacetobacter thuộc chi Acetobacter, họ Pseudomonadaceae, bộ
Pseudomonadales, lớp Schizommycetes. Gluconacetobacter thuộc nhóm vi
khuẩn axetic, là loài vi khuẩn tạo được nhiều Biocellulose nhất trong tự nhiên.
Mỗi tế bào Gluconacetobacter có thể chuyển hóa 108 phân tử glucose thành
cellulose trong 1 giờ [22].
Ngày nay, việc phân loại vi khuẩn acetic nói chung và vi khuẩn
Gluconacetobacter nói riêng còn tồn tại nhiều quan điểm khác nhau. Vì vậy,
vấn đề này vẫn đang gây nhiều tranh cãi, đòi hỏi cần có nhiều hơn những
nghiên cứu tiếp theo.
1.2.2. Đặc điểm phân loại của Gluconacetobacter

7


1.2.2.1. Đặc điểm hình thái tế bào học
Gluconacetobacter là trực khuẩn hình que, thẳng hay hơi cong, kích thước
khoảng 2 µm, tế bào đứng riêng lẻ hoặc xếp thành từng chuỗi, không có khả năng
di động, không sinh bào tử [14]. Các tế bào được bao bọc bởi màng nhày có bản
chất là hemicellulose, màng này bắt màu xanh khi nhuộm axit H2SO4, bắt màu hồng
khi nhuộm fucshin. Gluconacetobacter có khả năng tích lũy 4,5 % acid acetic
trong môi trường, khi nồng độ acid trong môi trường khá cao sẽ ức chế hoạt
động của vi khuẩn [4], [24].
1.2.2.2. Đặc điểm nuôi cấy
Trên môi trường thạch đĩa, vi khuẩn Gluconacetobacter hình thành
khuẩn lạc nhẵn hoặc xù xì, rìa mép khuẩn lạc bằng phẳng hay gợn sóng, màu
trắng hoặc trong suốt, khuẩn lạc lồi lên dễ tách khỏi môi trường [25].

Gluconacetobacter khi nuôi cấy trong môi trường lỏng ở điều kiện tĩnh,
chúng sẽ hình thành trên bề mặt môi trường một lớp màng Biocellulose.
Ngược lại trong điều kiện nuôi lắc, cellulose hình thành dạng hạt nhỏ với kích
thước không đều nhau và phân tán trong môi trường dinh dưỡng tạo ra những
đặc tính hình thái khác hẳn cellulose trong điều kiện nuôi cấy tĩnh [14].
1.2.2.3. Đặc điểm sinh lí, sinh hóa
+ Đặc điểm sinh lí:
Vi khuẩn Gluconacetobacter phát triển ở nhiệt độ 25 - 35oC, pH: 4 - 6.
Nhiệt độ và pH tối ưu tùy thuộc vào giống. Ở 37oC, tế bào sẽ suy thoái hoàn
toàn ngay cả trong môi trường tối ưu. Gluconacetobacter có khả năng chịu
được pH thấp nên người ta thường bổ sung thêm acid acetic vào môi trường
nuôi cấy để hạn chế sự nhiễm khuẩn lạ [26].
+ Đặc điểm sinh hóa:
Năm 1950, Frateur đã chính thức đưa ra một khóa phân loại mới căn cứ
vào các tiêu chuẩn: khả năng oxy hoa acid acetic thành CO2 và H2O; hoạt tính

8


catalase; khả năng sinh trưởng trên môi trường Hoyer...[27]. Theo quan điểm
này Gluconacetobacter là chủng thuộc chi Acetobacter, họ Pseudomonadaceae,
bộ Pseudomonadales, lớp Schizommycetes. Đặc điểm phân biệt với các chủng
khác trong cùng một chi được trình bày ở bảng 1.1 dưới đây.
Bảng 1.1. Đặc điểm sinh hoá của chủng vi khuẩn Gluconacetobacter
Đặc điểm

STT

Hiện tượng

Kết
quả

1

Oxy hoá ethanol thành acid Chuyển
acetic

hoá

môi

trường

chứa

+

Bromphenol Blue 0,04% từ màu xanh
sang màu vàng
Hiện tượng sủi bọt khí

2

Hoạt tính catalase

3

Sinh trưởng trên môi trường Sinh khối không phát triển

+
_

Hoyer
4

Chuyển hoá glycerol thành Tạo kết tủa đỏ gạch trong dịch sau lên
dihydroxyaceton

5

6

men

Chuyển hoá glucose thành Vòng sáng xuất hiện xung quanh khuẩn
acid

+

+

lạc trên môi trường chứa CaCO3

Kiểm tra khả năng sinh sắc tố Không hình thành sắc tố nâu

_

nâu
7

Kiểm tra khả năng tổng hợp Váng vi khuẩn xuất hiện màu lam

+

cellulose

1.3. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn Gluconacetobacter
1.3.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon
Để vi khuẩn sinh trưởng và phát triển tốt hơn cần cung cấp nguồn
cacbon phù hợp. Tùy nhóm vi sinh vật mà nguồn cacbon được cung cấp là vô
cơ hay hữu cơ. Giá trị dinh dưỡng và khả năng hấp thụ cacbon phụ thuộc vào
hai yếu tố: thành phần hóa học và tính chất sinh lí của nguồn thức ăn, đặc
điểm sinh lí của từng loại vi sinh vật.

9


Người ta sử dụng đường làm thức ăn nuôi cấy phần lớn các vi sinh vật dị
dưỡng. Đường đơn ở nhiệt độ cao có thể chuyển hóa thành loại hợp chất có
màu tối khó hấp thụ. Trong môi trường kiềm sau khử trùng, đường còn dễ bị
chuyển hóa làm biến đổi pH môi trường. Để tránh hiện tượng này khi khử
trùng môi trường có chứa đường người ta thường chỉ hấp ở áp lực 0,5 atm ở
110oC trong 30 phút. Từ các loại đường đơn tốt nhất nên sử dụng phương pháp
hấp gián đoạn (phương pháp Tyndal). Để nuôi cấy các loại vi sinh vật khác
nhau người ta sử dụng các nồng độ đường không giống nhau, với vi khuẩn
thường dùng 0,2 - 0,5 % đường, hầu hết các vi sinh vật chỉ đồng hoá được các
loại đường ở dạng đồng phân D [5], [26]. Gluconacetobacter sinh trưởng chính
trong môi trường có ethanol, glucose, glycerol. Có thể sinh trưởng trong môi
trường chỉ có D - mantolse. Hầu hết các chủng không sử dụng saccarose.

Các hợp chất hữu cơ chứa cả cacbon và nitơ (pepton, nước thịt, nước
chiết ngô, nước chiết nấm men, nước chiết đại mạch...) có thể vừa sử dụng
làm nguồn cacbon, vừa sử dụng làm nguồn nitơ đối với sinh vật.
1.3.2. Nguồn dinh dưỡng khoáng
Phospho chiếm tỉ lệ cao nhất trong số các nguyên tố khoáng của tế bào vi
sinh vật. Để đảm bảo nguồn dinh dưỡng phospho, người ta thường sử dụng
các loại phospho vô cơ: KH2PO4, K2HPO, KNO3…Bổ sung phosphat vào các
môi trường dinh dưỡng còn có tác dụng tạo ra tính đệm của môi trường.
Ngoài ra, còn nhiều nguyên tố khoáng cũng có vai trò ảnh hưởng đến
sinh trưởng của chủng G. xylinus và quá trình hình thành màng Biocellulose
như Fe, S, Ca, Mn, Na, Cl…Nếu thiếu một trong số các nguyên tố này thì
chủng Gluconacetobacter không sinh trưởng và phát triển bình thường.
1.4. Biocellulose
1.4.1. Cấu trúc
Biocellulose có đường kính bằng 1/100 đường kính của cellulose thực vật

10


(PC-Plant Cellulose). Màng Biocellulose được cấu tạo bởi chuỗi polyme β - 1,4
glucopyranose mạch thẳng, có thành phần hóa học đồng nhất với cellulose thực
vật nhưng cấu trúc và đặc tính lại khác xa nhau [22].
Chuỗi polyme β-1,4 glucopyranose mới hình thành liên kết với nhau
tạo thành sợi nhỏ (subfibril) có kích thước 1,5 nm. Những sợi nhỏ kết tinh tạo
sợi lớn hơn - sợi vĩ mô (microfibril) (Jonas and Farah, 1998), những sợi này
kết hợp với nhau tạo thành bó và cuối cùng tạo dải ribbon (Yamanaka et.al
2000). Dải ribbol có chiều dài trong khoảng từ 1 - 9 nm. Những dải ribbol
được kéo ra từ tế bào này sẽ liên kết với những dải ribbol của tế bào khác
bằng liên kết hiđro hoặc lực Van Der Waals tạo thành cấu trúc mạng lưới hay
một lớp màng mỏng trên bề mặt môi trường nuôi cấy. Kích thước bên của

màng tăng lên khi quần thể vi khuẩn sinh trưởng [6], [10].

Hình 1.2. Sợi cellulose của thực vật
1.4.2. Một số tính chất
Màng Biocellulose có cơ chế kết tinh khác hẳn cellulose của thực vật ở
chỗ chúng không có sự kết hợp hemixellulose, lignin hay những thành phần
phụ khác mà được cấu tạo từ các sợi microfibil tạo nên những bó sợi song
song cấu thành mạng lưới cellulose [1]. Do đó màng Biocellulose có độ bền
cơ học cao, độ tinh khiết cao, khả năng thấm hút nước lớn… hơn hẳn
cellulose của thực vật [24]. Cụ thể:

11


+ Độ tinh sạch: màng Biocellulose có độ tinh sạch tốt hơn rất nhiều so với
các cellulose khác, có thể phân hủy sinh học, tái chế hay phục hồi hoàn toàn.
+ Độ bền cơ học: màng Biocellulose có độ bền tinh thể cao, sức căng lớn,
trọng lượng lớn, ổn định về kích thước.
+ Tính hút nước: màng Biocellulose có khả năng giữ nước đáng kể (lên
đến 99 %), có tính tơi xốp, độ ẩm cao.
1.4.3. Cơ chế tổng hợp
Khi nuôi cấy vi khuẩn Gluconacetobacter trong môi trường có nguồn
dinh dưỡng đầy đủ (chủ yếu là carbohydrate, vitamin B1, B2, B12…và các chất
kích thích sinh trưởng), chúng sẽ thực hiện quá trình trao đổi chất của mình
bằng cách hấp thụ dinh dưỡng từ môi trường bên ngoài vào cơ thể, một phần
để cơ thể sinh trưởng và phát triển, một phần để tổng hợp cellulose và thải ra
môi trường. Ta thấy các sợi tơ nhỏ phát triển ngày càng dài hướng từ đáy lên
bề mặt trong môi trường nuôi cấy. Thiaman (1962) đã giải thích cách tạo
thành cellulose như sau: Các tế bào Gluconacetobacter khi sống trong môi
trường lỏng sẽ thực hiện quá trình trao đổi chất của mình bằng cách hấp thụ

đường glucose, kết hợp đường với axit béo để tạo thành tiền chất nằm ở màng
tế bào. Tiền chất này được tiết ra ngoài nhờ hệ thống lỗ nằm ở trên màng tế
bào cùng với một enzyme có thể polymer hóa glucose thành cellulose.

Hình 1.3. Con đường sinh tổng hợp cellulose ở Gluconacetobacter

12


Quá trình tổng hợp Biocellulose là một tiến trình bao gồm nhiều bước
được điều hòa một cách chuyên biệt và chính xác bằng một hệ thống chứa
nhiều loại enzyme, phức hợp xúc tác các loại protein điều hòa [17], [20].
Theo tác giả Alina Krystynowics và cộng sự có 4 enzyme tham gia xúc
tác tổng hợp cellulose ở vi khuẩn Gluconacetobacter: Glucokinase (GK),
Phosphoglucomutase (PGM), Glucose - 1 - phosphate uridylytransferase
(UDPG pyrophosphorylase hay UGP), Cellulose synthase (CS). Trong đó
UGP là enzyme có vai trò quan trọng nhất.

Hình 1.4. Con đường chuyển hóa cacbon trong vi khuẩn
Gluconacetobacter
1.4.4. Chức năng của cellulose đối với vi khuẩn Gluconacetobacter
Lớp màng cellulose do vi khuẩn Gluconacetobacter tạo ra bao xung
quanh môi trường hạn chế nguồn oxy từ bên ngoài vào môi trường, điều này
ngăn cản sự cung cấp oxy cho các vi khuẩn hiếu khác, tạo điều kiện thuận lợi
cho quá trình cạnh tranh sinh tồn của vi khuẩn Gluconacetobacter. Màng
cellulose có khả năng giữ nước nên giúp cho vi khuẩn phân hủy các chất dinh
dưỡng để sử dụng và giúp tế bào chống lại ảnh hưởng của tia UV (tia tử
ngoại). Nhờ tính dẻo dai và tính thấm nước của các lớp cellulose mà các tế
bào vi khuẩn kháng lại được những thay đổi không thuận lợi trong môi trường
sống như: giảm độ ẩm, thay đổi pH, xuất hiện các chất độc hại. Các vi khuẩn

13


Gluconacetobacter có thể tăng trưởng và phát triển bên trong lớp vỏ bao.
Thực nghiệm chỉ ra rằng cellulose bao quanh tế bào vi khuẩn bảo vệ
chúng khỏi tia cực tím. Khoảng 23 % số tế bào Gluconacetobacter được bao
bọc bởi Biocellulose sống sót sau 1 giờ xử lý bởi tia cực tím. Khi tách
Biocellulose ra khỏi tế bào, khả năng sống sót của tế bào giảm chỉ còn khoảng
3%.
Ngoài ra, màng Biocellulose là giá thể chống đỡ cho vi khuẩn
Gluconacetobacter luôn ở bề mặt tiếp giáp giữa môi trường lỏng và không
khí. Chính mạng lưới này làm cho các tế bào có thể bám chặt trên bề mặt môi
trường và làm tế bào thu nhận chất dinh dưỡng một cách dễ dàng hơn so với
khi tế bào ở trong môi trường lỏng không có mạng lưới cellulose.
1.5. Mặt nạ dưỡng da ( Biocellulose mask)
Hiện nay trên thế giới xu hướng làm đẹp từ các sản phẩm tự nhiên
không chứa chất hóa học đang rất thịnh hành. Hàng loạt các hãng mĩ phẩm
lớn đều tập trung nghiên cứu cho ra những sản phẩm làm đẹp có nguồn gốc
tự nhiên không có hoặc rất ít tác dụng phụ trong đó có mặt nạ dưỡng
da (Biocellulose mask). Biocellulose mask được sản xuất bằng công nghệ vi
sinh và nguồn nguyên liệu chính là nước dừa. Màng thu được được xử lí
thành phẩm và bổ sung thêm các hoạt chất với các hướng ứng dụng khác
nhau như: làm trắng da, trị mụn hay làm mờ vết nám…
Ở Việt Nam, mặt nạ Biocellulose từ nước dừa lần đầu tiên được sản
xuất tại tỉnh Bến Tre được kiểm nghiệm nhiều lần tại trung tâm kiểm nghiệm
dược và mĩ phẩm Bến Tre và được sở y tế xét duyệt chấp nhận (Số công bố
013/11CBMP-BT do sở y tế Bến Tre cấp). Đây là lần đầu tiên mặt nạ 100 %
thiên nhiên xuất hiện ở nước ta, có nguồn gốc từ nước dừa, hoàn toàn không
cần dùng khăn giấy hay sợi để làm khuôn định hình như các loại mặt nạ

thường thấy trên thị trường. Khác với các mặt nạ hóa chất trên thị trường có

14


tác dụng hóa chất ngay lập tức và không tốt về lâu dài cho da mặt, mặt nạ
nước dừa có công dụng từ từ mang đến làn da trắng sáng, mịn màng một cách
tự nhiên và đẹp nhất. Mỗi tấm mặt nạ được đóng riêng trong từng túi nhôm
kín, độ dày 1 mm, 2 mm, 3 mm, trọng lượng 60 gram [31].
1.6. Tình hình nghiên cứu và sản xuất Biocellulose hiện nay
1.6.1. Trên thế giới
Vi khuẩn Gluconacetobacter và màng Biocellulose đã thu hút được sự
chú ý của nhiều nhà khoa học trên thế giới và được ứng dụng trong nhiều lĩnh
vực: công nghệ môi trường, công nghiệp giấy, công nghiệp thực phẩm, y
học... Các nghiên cứu hiện nay về màng Biocellulose trên thế giới đã tập trung
vào vấn đề đề sản xuất và ứng dụng các sản phẩm từ màng Biocellulose vào
các lĩnh vực khác nhau.
Hầu hết các tác giả nước ngoài nghiên cứu theo hướng sinh tổng hợp
cellulose từ vi khuẩn, ứng dụng của màng Biocellulose trong y học, công
nghiệp giấy, trong chế biến thực phẩm.
Tuy nhiên những ứng dụng thường thấy trên thế giới của màng
Biocellulose là trong ngành dược phẩm và mỹ phẩm. Czajt và cs (2006), sử
dụng màng Biocellulose đắp lên vết thương hở, vết bỏng đã thu được kết quả
tốt. Các tác giả Jonas và Farad (1998), Czaja và cs (2006) đã dùng màng
Biocellulose làm da nhân tạo, làm mặt nạ dưỡng da cho phụ nữ.
1.6.2. Tại Việt Nam
Ở Việt Nam, những nghiên cứu và ứng dụng về Gluconacetobacter và
màng Biocellulose còn khá mới mẻ. Các công trình nghiên cứu mới chỉ quan
tâm tới quá trình tạo màng, đặc tính và cấu trúc của màng. Về ứng dụng thực
tiễn, mới chỉ được ứng dụng trong chế tạo màng sinh học dùng trong trị bỏng

và được ứng dụng trong sản xuất thạch dừa [5], [14].
Việc nghiên cứu và sử dụng màng Biocellulose từ chủng

15


Gluconacetobacter ngày càng được nhiều tác giả quan tâm. Ngày càng có
nhiều các nghiên cứu, công bố liên quan đến chủng Gluconacetobacter sự
hình thành màng Biocellulose và các hướng ứng dụng màng Biocellulose.
Năm 2006, tác giả Nguyễn Văn Thanh, Trưởng bộ môn Vi Sinh – Ký Sinh,
Trường đại học Y Dược học Tp.HCM đã chế tạo thành công màng trị bỏng
sinh học dầu mù u bằng phương pháp lên men. Màng Biocellulose có khả
năng thấm nước cao, kết dính chặt và trơ về mặt hóa học nên nó có vai trò
như màng sinh học, có thể thay thế da tạm thời. Với các hoạt chất tái sinh mô
và các chất sát khuẩn đều có nguồn gốc thiên nhiên không gây đau rát và
không chứa các yếu tố gây kích ứng da, chính vì vậy dùng màng sinh học để
ngăn ngừa biến chứng nhiễm trùng vết thương bỏng, tạo điều kiện che phủ
sớm vết thương, qua đó, rút ngắn thời gian điều trị và giảm thiểu sẹo xấu trên
vùng bỏng sâu.
Gần đây, nhóm nghiên cứu của tác giả Đinh Thị Kim Nhung đã thu
nhận màng Biocellulose từ vi khuẩn Gluconacetobacter, ứng dụng màng
Biocellulose trong điều trị bỏng [17].

16