Nghiên cứu tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng tạo màng Biocellulose trong môi trường bổ sung tảo xoắn Spirulina

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
--------------------

NGUYỄN THỊ PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN CHỦNG VI SINH VẬT
CÓ KHẢ NĂNG TẠO MÀNG BIOCELLULOSE TRONG
MÔI TRƯỜNG BỔ SUNG TẢO XOẮN SPIRULINA
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Vi sinh học

Người hướng dẫn khoa học

PGS.TS. ĐINH THỊ KIM NHUNG

Hà Nội, 2017


LỜI CẢM ƠN
Bằng tất cả tấm lòng kính trọng, em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu
sắc nhất đến PGS.TS. Đinh Thị Kim Nhung đã tận tình hướng dẫn giúp đỡ
em hoàn thành khóa luận này cùng toàn thể thầy cô trong tổ Vi sinh vật,
khoa Sinh - KTNN, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã giảng dạy và
khuyến khích em trong thời gian học tập.
Em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Sư phạm
Hà Nội 2 và Ban chủ nhiệm khoa Sinh - KTNN đã tạo điều kiện cho em
hoàn thành đề tài nghiên cứu.
Cuối cùng em xin được cảm ơn gia đình, bạn bè và người thân đã
quan tâm giúp đỡ, động viên em trong suốt thời gian qua.
Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 03 tháng 05 năm 2017

Sinh viên

Nguyễn Thị Phương


LỜI CAM ĐOAN
Em xin cam đoan những gì viết trong khóa luận này đều là sự thật.
Đây là kết quả nghiên cứu của riêng em. Tất cả các số liệu đều thu thập từ
thực nghiệm, qua sử lí thống kê, không có số liệu nào sao chép hay bịa đặt,
không trùng với kết quả đã công bố.
Nếu sai em xin chịu hoàn toàn trách nhiệm.
Hà Nội, ngày 03 tháng05 năm 2017

Sinh viên

Nguyễn Thị Phương


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
1. Lí do chọn đề tài ............................................................................................ 1
2. Mục đích nghiên cứu ..................................................................................... 2
3. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 2
4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu................................................................. 2
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn....................................................................... 2
6. Điểm mới của đề tài ...................................................................................... 3
NỘI DUNG ....................................................................................................... 4
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 4

1.1. Vị trí phân loại và đặc điểm hình thái của Gluconacetobacter ................. 4
1.2. Đặc điểm sinh lí - sinh hóa của Gluconacetobacter ................................. 4
1.3. Biocellulose (BC) ....................................................................................... 5
1.3.1. Cấu trúc màng Biocellulose .................................................................... 5
1.3.2. Một số tính chất của màng Biocellulose ................................................. 5
1.3.3. Quá trình tổng hợp Biocellulose từ vi khuẩn Gluconacetobacter .......... 6
1.3.4. Chức năng của cellulose với vi khuẩn Gluconacetobacter .................... 8
1.3.5. Ứng dụng của Biocellulose ..................................................................... 8
1.3.6. Mặt nạ dưỡng da (Biocellulose mask) .................................................... 9
1.4. Tình hình nghiên cứu và sản xuất BC hiện nay ....................................... 10
1.4.1.Tình hình nghiên cứu màng BC trên thế giới ........................................ 10
1.4.2. Tình hình nghiên cứu màng BC ở trong nước ...................................... 10
1.5. Sơ lược về tảo xoắn Spirulina .................................................................. 10


1.5.1. Phân loại tảo Spirulina .......................................................................... 11
1.5.2. Đặc điểm sinh học của tảo Spirulina .................................................... 11
1.5.3. Cấu tạo tảo Spirulina ............................................................................. 12
1.5.4. Sinh sản của tảo Spirulina ..................................................................... 13
1.5.5. Nghiên cứu ứng dụng ............................................................................ 14
2.1. Vật liệu và thiết bị nghiên cứu ................................................................. 15
2.1.1. Vi sinh vật ............................................................................................ 15
2.1.2. Hóa chất và thiết bị ............................................................................. 15
2.1.3. Môi trường ............................................................................................ 16
2.2. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 17
2.2.1. Phương pháp vi sinh .............................................................................. 17
2.2.2. Phương pháp hóa sinh ........................................................................... 20
2.2.3. Phương pháp xác định trọng lượng tươi của màng ............................... 22
2.2.4. Phương pháp thống kê và xử lí số liệu .................................................. 22
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ........................ 24

3.1.

Phân lập, tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng tạo màng

Biocellulose trong môi trường bổ sung tảo xoắn Spirulina ............................ 24
3.1.1. Phân lập chủng vi sinh vật có khả năng tạo màng Biocellulose trong
môi trường bổ sung tảo xoắn Spirulina........................................................... 24
3.1.2. Tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng tạo màng Biocellulose
trong môi trường bổ sung tảo xoắn Spirulina ................................................. 26
3.2. Khảo sát khả năng tạo màng Biocellulose của chủng vi khuẩn
Gluconacetobacter xylinus T3 và ứng dụng chế tạo mặt nạ dưỡng da ........... 35


3.2.1. Khảo sát khả năng tạo màng Biocellulose của chủng vi khuẩn
Gluconacetobacter xylinus T3 ........................................................................ 35
3.2.2. Ứng dụng làm mặt nạ dưỡng da ............................................................ 37
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................. 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 41


DANH MỤC VIẾT TẮT

BBP

: Blue Bromphenol

Cs

: Cộng sự

Gx

: Gluconacetobacter

MT

: Môi trường

STT

: Số thứ tự

UV

: Ultraviolet (Tia tử ngoại)

PTN

: Phòng thí nghiệm

BC

: Biocellulose


DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1. Quá trình hình thành cellulose trong tế bào vi khuẩn
Gluconacetobacter.................................................................................................7
Hình 1.2. Con đường chuyển hóa cacbon trong vi khuẩn Gluconacetobacter ...8

Hình 1.3. Hình dạng của tảo xoắn Spirulina ......................................................12
Hình 1.4. Hình dạng tảo Spirulina quan sát dưới kính hiển vi ..........................12
Hình1.5. Khuẩn lạc vi khuẩn giấm của 2 mẫu phân lập trên môi trường ..........25
thạch đĩa ...............................................................................................................25
Hình 1.6.Vi khuẩn giấm của 2 mẫu phân lập trên môi trường thạch nghiêng ..25
Hình 1.7. Khả năng oxy hóa acid acetic của vi khuẩn giấm ..............................27
Hình 1.8. Đặc điểm màng của 6 chủng Gluconacetobacter ..............................29
Hình 1.9. Vi khuẩn của 3 chủng Gluconacetobacter T3, T7, M3 trên môi
trường thạch nghiêng ...........................................................................................32
Hình 1.10. Hình thái tế bào 3 chủng Gluconacetobacter T3,T7 và M3 ............32
(Độ phóng đại x 1000).........................................................................................32
Hình 1.11. Hoạt tính catalase ..............................................................................34


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1 . Thành phần môi trường lên men ............................................... 17
Bảng 3.1. Nguồn gốc đặc điểm các chủng vi khuẩn giấm trong mẫu phân
lập được ....................................................................................................... 24
Bảng 3.2. Đặc điểm hình thành màng cellulose của 6 chủng
Gluconacetobacter ...................................................................................... 28
Bảng 3.3. Hàm lượng acid acetic hình thành của 6 chủng
Gluconacetobacter ...................................................................................... 30
Bảng 3.4. Một số đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào của 3 chủng ...... 31
Gluconacetobacter ...................................................................................... 31
Bảng 3.5. Đặc điểm sinh hóa của các chủng vi khuẩn Gluconacetobacter 33
Bảng 3.6. Khảo sát khả năng tạo màng của Gluconacetobacter xylinus T3
..................................................................................................................... 36
Bảng 3.7. Màng sau khi xử lí theo phương pháp 2 ..................................... 39

MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Như chúng ta đã biết thế kỉ XX là thế kỉ của ngành công nghệ thông tin
thì thế kỉ XXI là thế kỉ của của ngành công nghệ sinh học. Ngày nay, công
nghệ sinh học đang dần trở thành một ngành kĩ thuật chủ đạo và chiếm giữ
một vị trí cao của nhiều quốc gia trên thế giới. Là một bộ phận của ngành
công nghệ sinh học, công nghệ vi sinh đã và đang phát triển mạnh mẽ với
những thành tựu lớn có ý nghĩa trong đời sống, trong các ngành như: Công
nghiệp, nông nghiệp, y học,... Cho đến ngày nay một trong những nguồn
nguyên liệu đã và đang được quan tâm gần đây đó là cellulose vi khuẩn hay
Biocellulose (BC). Hiện nay màng BC được xem là nguồn nguyên liệu mới
có tiềm năng được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực khác nhau như công
nghiệp thực phẩm, công nghệ giấy, công nghệ sản xuất pin... đặc biệt trong
lĩnh vực y học, màng BC đã được một số nước trên thế giới nghiên cứu ứng
dụng làm màng trị bỏng, mặt nạ dưỡng da, mạch máu nhân tạo... Trên thế
giới việc nghiên cứu Gluconacetobacter và quá trình sinh tổng hợp BC cũng
như ứng dụng của BC bắt đầu từ rất sớm. Những nghiên cứu đầu tiên là của
Brown A.J và cộng sự năm (1886). Trải qua hơn 1 thế kỷ nhưng cho đến nay
Gluconacetobacter và màng BC vẫn đang thu hút được sự chú ý của rất nhiều
nhà khoa học trên thế giới. Ở Việt Nam, nghiên cứu về Gluconacetobacter,
màng BC và ứng dụng của nó còn là vấn đề khá mới mẻ, chỉ mới được quan
tâm gần đây. Các nghiên cứu và công bố về vấn đề này còn rất khiêm tốn.
Các nghiên cứu hiện mới dừng ở nghiên cứu quá trình tạo màng BC ứng
dụng trong sản xuất thạch dừa, làm giá thể gắn kết tế bào vi khuẩn và làm
màng trị bỏng. Nhằm bổ sung những hiểu biết về Gluconacetobacter và quá
trình tạo màng BC định hướng nhu cầu nghiên cứu và ứng dụng màng BC

1

sau này, tôi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả
năng tạo màng Biocellulose trong môi trường bổ sung tảo xoắn Spirulina”.
2. Mục đích nghiên cứu
Tuyển chọn được chủng vi sinh vật có khả năng tạo màng Biocellulose
trong môi trường bổ sung tảo xoắn Spirulina.
3. Nội dung nghiên cứu
3.1. Tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng tạo màng Biocellulose
trong môi trường bổ sung tảo xoắn Spirulina
3.2. Nghiên cứu khả năng tạo màng Biocellulose của chủng vi khuẩn
Gluconacetobacter xylinus T3 được tuyển chọn và ứng dụng làm mặt nạ
dưỡng da.
4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
4.1. Đối tượng nghiên cứu
Một số chủng Gluconacetobacter có khả năng tạo màng Biocellulose
trên nguồn nguyên liệu tảo xoắn Spirulina.
4.2. Phạm vi nghiên cứu
Nguồn tảo xoắn Spirulina tại phòng thí nghiệm Vi sinh vật khoa Sinh KTNN, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, Xuân Hòa, Phúc Yên,Vĩnh Phúc.
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
5.1.

Ý nghĩa khoa học
Nghiên cứu sự đa dạng của các chủng Gluconacetobacter có khả năng

tạo màng Biocellulose trên nguồn nguyên liệu tảo xoắn Spirulina. Qua đó
phân lập, tuyển chọn và định loại sơ bộ một số chủng Gluconacetobacter có
khả năng tạo màng có chất lượng tốt, thích hợp để tạo màng Biocellulose
đồng thời định hướng ứng dụng cho chủng nghiên cứu.
5.2.

Ý nghĩa thực tiễn

Tạo màng Biocellulose trên môi trường tảo xoắn Spirulina có triển

2


vọng ứng dụng vào trong cuộc sống đặc biệt là lĩnh vực thẩm mỹ dưỡng da,
trong quá công nghiệp thực phẩm, công nghệ giấy, công nghệ sản xuất pin...
Đặc biệt trong lĩnh vực y học, màng BC đã được một số nước trên thế giới
nghiên cứu ứng dụng làm màng trị bỏng, mặt nạ dưỡng da, mạch máu nhân tạo...
6. Điểm mới của đề tài
Tuyển chọn chủng vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus T3 có khả năng
tạo màng mỏng, dai, bề mặt nhẵn sử dụng làm mặt nạ dưỡng da. Khảo sát khả
năng tạo màng Biocellulose, tìm môi trường và điều kiện thích hợp cho chủng
vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus T3 sinh trưởng và phát triển tốt rút ngắn
được thời gian tạo màng.

3


NỘI DUNG
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Vị trí phân loại và đặc điểm hình thái của Gluconacetobacter
Theo hệ thống phân loại của nhà khoa học Bergey thì Gluconacetobacter
thuộc họ Acetobacteraceae. Họ này gồm 6 chi: Acetobacter, Gluconacetobacter,
Gluconobacter, Acidomonas, Asaia, Kozakia [20]. Gluconacetobacter thuộc
nhóm vi khuẩn acetic, là loài vi khuẩn tạo được nhiều BC nhất trong tự nhiên.
Mỗi tế bào Gluconacetobacter có thể chuyển hóa 108 phân tử glucose thành
cellulose trong 1 giờ [20].
Ngày nay, việc phân loại vi khuẩn acetic nói chung và vi khuẩn
Gluconacetobacter nói riêng còn tồn tại nhiều quan điểm khác nhau. Vì vậy,

vấn đề này vẫn đang gây nhiều tranh cãi, đòi hỏi cần có nhiều hơn những
nghiên cứu tiếp theo.
Gluconacetobacter là trực khuẩn có dạng hình que, thẳng hay hơi cong,
có thể di động hay không di động, không sinh bào tử. Chúng là vi khuẩn
Gram âm, nhưng đặc điểm nhuộm Gram có thể thay đổi do tế bào già đi hay
do điều kiện môi trường. Chúng có thể đứng riêng lẻ hay xếp thành chuỗi.
Trên môi trường thiếu thức ăn hay môi trường nuôi cấy đã lâu,
Gluconacetobacter dễ dàng sinh ra những tế bào có hình thái đặc biệt (tế bào
có thể phình to hoặc kéo dài, đôi khi lại có dạng phân nhánh). Tế bào thường
được tìm thấy nhiều trong dịch hoa quả, giấm, dịch rượu, trong đất... [17].
1.2. Đặc điểm sinh lí - sinh hóa của Gluconacetobacter
Vi khuẩn Gluconacetobacter sinh trưởng, phát triển ở điều kiện
nhiệt độ 25oC - 35oC; pH: 4 - 6. Các chủng vi khuẩn Gluconacetobacter sinh
trưởng được trong điều kiện pH thấp, vì vậy có thể bổ sung thêm acid acetic
vào môi trường nuôi cấy để hạn chế sự nhiễm khuẩn lạ.

4


Đặc điểm sinh hóa của các chủng vi khuẩn Gluconacetobacter bao
gồm: Oxy hóa ethanol thành acetic, CO2, H2O; Phản ứng catalase dương.
1.3. Biocellulose (BC)
1.3.1. Cấu trúc màng Biocellulose
Biocellulose có đường kính bằng 1/100 đường kính của cellulose thực
vật (PC - plant cellulose). Trên môi trường dịch thể, trong điều kiện nuôi
cấy tĩnh, vi khuẩn Gluconacetobacter hình thành nên lớp màng có bản chất là
cellulose, được tập hợp bởi nhiều bó sợi cellulose liên kết với nhau được gọi
là màng Biocellulose hay màng BC. Cấu trúc của màng Biocellulose: Được
cấu tạo bởi chuỗi polyme β - 1,4 glucopynanose mạch thẳng. Có thành phần
hóa học đồng nhất với cellulose thực vật, nhưng khác nhau về cấu trúc, đặc

tính [17].
Chuỗi polyme β - 1,4 glucopynanose mới hình thành liên kết với nhau
tạo thành sợi nhỏ (subfibril) có kích thước 1,5 nm. Những sợi nhỏ kết kinh
tạo thành sợi lớn hơn - sợi vĩ mô (microfibril) (Jonas and Farah, 1998) [29],
những sợi kết hợp với nhau tạo thành bó và cuối cùng tạo dải ribbon
(Yamanakaet.al 2000) [38]. Dải ribbon có chiều dài trong khoảng từ 1 – 9 nm.
Những dải ribbon được kéo ra từ tế bào này sẽ liên kết với những dải ribbon
của tế bào khác bằng liên kết hidro hoặc lực Van Der Waals tạo thành cấu
trúc mạng lưới hay một lớp màng mỏng trên bề mặt môi trường nuôi cấy.
1.3.2. Một số tính chất của màng Biocellulose
Brown A.J (1886), đã nghiên cứu lớp màng đặc do vi khuẩn
Gluconacetobacter tạo ra trên môi trường nuôi cấy và thấy có bản chất là
hemicellulose. Hemicellulose là những polysaccarid không tan trong nước
nhưng tan trong dung dịch kiềm tính [19].
Một số tính chất của màng Biocellulose:

5


 Độ tinh sạch: Màng BC có độ tinh sạch tốt hơn nhiều so với các
cellulose khác, có thể phân hủy sinh học, tái chế hay phục hồi hoàn
toàn.
 Độ bền cơ học: Màng BC có độ bền tinh thể cao, sức căng lớn, trọng
lượng thấp, ổn định về kích thước.
 Tính hút nước: Màng BC có khả năng giữ nước đáng kể (lên đến 99%),
có tính xốp, độ ẩm cao.
1.3.3. Quá trình tổng hợp Biocellulose từ vi khuẩn Gluconacetobacter
Khi nuôi cấy vi khuẩn Gluconacetobacter trong môi trường có nguồn
dinh dưỡng đầy đủ (chủ yếu là carbonhydrat, vitamin B1, B2, B12… và các chất
kích thích sinh trưởng), chúng sẽ thực hiện quá trình trao đổi chất của mình

bằng cách hấp thụ chất dinh dưỡng từ môi trường bên ngoài vào cơ thể, một
phần để cơ thể sinh trưởng và phát triển, một phần để tổng hợp cellulose và
thải ra môi trường. Ta thấy các sợi nhỏ phát triển ngày càng dài hướng từ đáy
lên bề mặt trong môi trường nuôi cấy [22]. Thiaman (1962) đã giải thích cách
tạo thành cellulose như sau: Các tế bào Gx khi sống trong môi trường lỏng sẽ
thực hiện quá trình trao đổi chất của mình bằng bằng cách hấp thụ đường
glucose, kết hợp đường với acid béo để tạo thành tiền chất nằm ở màng tế bào.
Tiền chất này được tiết ra ngoài nhờ hệ thống lỗ nằm ở trên màng tế bào cùng
với một enzyme có thể polymer hóa glucose thành cellulose.

6


Hình 1.1. Quá trình hình thành cellulose trong tế bào vi khuẩn
Gluconacetobacter
Quá trình sinh tổng hợp BC là một tiến trình bao gồm nhiều bước được
điều hòa một cách chuyên biệt và chính xác bằng một hệ thống chứa nhiều
loại enzyme, phức hợp xúc tác và protein điều hòa (hình 1.1).
Theo Alaban C.A và cộng sự (1967) [17] các enzyme tham gia vào quá
trình sinh tổng hợp cellulose và vi khuẩn gồm:
1PFK: Fructose-1-phosphate kinase

PG1: Phosphoglucoisomerase

PGM: Phosphoglucomutase

PTS: Hệ thống phosphotranferrase

UGP: UDP-glucose pyrophosphorylase Fru-6-phosphate
Fru-bi-P: Fructose-1,6-diphosphate

Glc-6-P: Glucose-6-phosphate

Glc-1-P: Glucose-1-phosphate

PGA: Phosphogluconic acid

UDPGlc: Uridine diphosphoglucose

CS: Cellulose synthase

GK: Glucokinase

FK: fructokinase

FBP: fructose-1,6-diphosphate phosphatase
G6PDH: glucose-6-phosphate dehydrogenase

7


Hình 1.2. Con đường chuyển hóa cacbon trong vi khuẩn
Gluconacetobacter
1.3.4. Chức năng của cellulose với vi khuẩn Gluconacetobacter
Màng Biocellulose nằm ở mặt thoáng của môi trường nuôi cấy có tác
dụng như một lớp bảo vệ cho các tế bào vi khuẩn Gluconacetobacter trước
các nhân tố có hại của môi trường. Có những ghi nhận rằng cellulose bao
quanh tế bào vi khuẩn bảo vệ chúng khỏi tia cực tím. Khoảng 23% số tế bào
Gluconacetobacter được bao bọc bởi Biocellulose sống sót sau 1 giờ xử lí
bằng tia cực tím. Khi tách Biocellulose ra khỏi tế bào, khả năng sống của

chúng giảm đáng kể, chỉ còn 3% [31].
Ngoài ra, màng Biocellulose còn là giá thể chống đỡ cho các tế bào vi
khuẩn đồng thời cũng giúp chúng lấy chất dinh dưỡng từ môi trường một
cách dễ dàng hơn so với khi ở trong môi trường lỏng không có mạng lưới
cellulose.
1.3.5. Ứng dụng của Biocellulose
Màng Biocellulose đã thu hút được sự chú ý của nhiều nhà khoa học
trên thế giới và được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực. Trong công nghệ môi
trường, các nhà khoa học đã dùng màng Biocellulose làm màng phân tách để

8


xử lý nước, làm chất mang đặc biệt cho pin và tế bào năng lượng Brown,
(1999), Jonas và Farad (1998) đã dùng màng như một chất đặc biệt để biến
đổi độ nhớt, làm các sợi truyền quang, làm môi trường cơ chất trong sinh học.
Trong công nghiệp giấy, màng Biocellulose được sử dụng để sản xuất giấy
điện tử có chất lượng cao. Trong công nghiệp thực phẩm, nó được ứng dụng
để sản xuất thạch dừa, một món ăn được ưa chuộng ở Đông Nam Á, làm vỏ
bao xúc xích,…Trong y học và dược phẩm, màng Biocellulose được dùng để
trị bỏng, làm da nhân tạo, mặt nạ dưỡng da,…
1.3.6. Mặt nạ dưỡng da (Biocellulose mask)
Hiện nay trên thế giới xu hướng làm đẹp từ các sản phẩm tự nhiên
không chứa chất hóa học đang thịnh hành. Hàng loạt các hãng mỹ phẩm lớn
đều tập trung nghiên cứu cho ra những sản phẩm làm đẹp có nguồn gốc tự
nhiên không có hoặc rất ít tác dụng phụ trong đó có mặt nạ dưỡng da
(Biocellulose mask). Biocellulose mask được sản xuất bằng công nghệ vi sinh
và nguồn nguyên liệu chính là nước dừa. Màng thu được xử lí thành phẩm và
bổ sung thêm các hoạt chất với các hướng ứng dụng khác nhau như: Làm
trắng da, trị mụn hay làm mờ vết nám...

Ở Việt Nam, mặt nạ Biocellulose từ nước dừa lần đầu tiên được sản
xuất tại tỉnh Bến Tre được kiểm nghiệm nhiều lần tại trung tâm kiểm nghiệm
dược và mỹ phẩm Bến Tre và được sở y tế chấp nhận (Số công bố 013/11
CBMP-BT do sở y tế Bến Tre cấp). Đây là lần đầu tiên mặt nạ 100% thiên
nhiên xuất hiện ở nước ta mà chưa có sản phẩm nào trên thị trường có. Có
nguồn gốc từ nước dừa, hoàn toàn không cần dùng khăn giấy hay sợi để làm
khuôn định hình như các loại mặt nạ thường thấy trên thị trường. Khác với
các mặt nạ hóa chất trên thị trường có tác dụng ngay lập tức và không tốt về
lâu dài cho da mặt. Mặt nạ từ nước dừa có công dụng mang đến làn da trắng
sáng, mịn màng một cách tự nhiên và đẹp nhất. Mỗi tấm mặt nạ được đóng
riêng trong từng túi nhôm kín, độ dày 1 mm, 2 mm, 3 mm, trọng lượng 60 g
[43].

9


1.4. Tình hình nghiên cứu và sản xuất BC hiện nay
1.4.1.Tình hình nghiên cứu màng BC trên thế giới
Chủng vi khuẩn Gluconacetobacter và màng BC đã thu hút được sự
chú ý của nhiều nhà khoa học trên thế giới. Màng BC được ứng dụng trong
nhiều lĩnh vực, điển hình như: Trong công nghệ thực phẩm sử dụng màng BC
để bảo quản thực phẩm, sản xuất thạch dừa; Trong công nghiệp giấy, màng
BC sử dụng để sản xuất giấy chất lượng cao; Trong lĩnh vực y học, màng BC
bước đầu nghiên cứu sử dụng làm màng trị bỏng, làm da nhân tạo. Hiện nay
màng BC ngày càng chiếm ưu thế là sản phẩm thân thiện với môi trường thay
thế cho túi ni lông.
1.4.2. Tình hình nghiên cứu màng BC ở trong nước
Tại Việt Nam, việc nghiên cứu và sử dụng màng BC đã thu hút được
sự chú ý của nhiều tác giả quan tâm. Điển hình như nghiên cứu đặc tính cấu
trúc màng BC làm cơ sở sản xuất thạch dừa của tác giả Nguyễn Thúy Hương,

trường đại học Bách Khoa. Tp.HCM [6]; Nghiên cứu màng trị bỏng sinh học
có tẩm dầu mủ u bằng phương pháp lên men của tác giả Nguyễn Văn Thanh
và cộng sự, đại học Y Dược TP.HCM [7]; Bước đầu sử dụng màng BC hấp
phụ bacteriocin để bảo quản thịt tươi sơ chế tối thiểu của tác giả Trần Thị
Tưởng An, Nguyễn Thúy Hương trường đại học Quốc Gia TP.HCM [6];
Nghiên cứu một số đặc tính của chủng vi khuẩn Gluconacetobacter bước
đầu ứng dụng màng BC làm bao bì bảo quản thực phẩm, túi thay thế túi ni
lông của Đinh Thị Kim Nhung và cộng sự [10].
1.5. Sơ lược về tảo xoắn Spirulina
Tảo Spirulina hay tảo xoắn Spirulina là tên gọi do nhà tảo học Deurben
(Đức) đặt vào năm 1827 dựa trên hình thái tảo Spirulina có dạng sợi xoắn ốc.
Cũng vào năm 1827, Turpin lần đầu tiên phân lập được tảo Spirulina từ
nguồn nước tự nhiên. Năm 1963, giáo sư Clement (người Pháp) đã nghiên

10


cứu thành công việc nuôi Spirulina ở qui mô công nghiệp. Do hình dạng “lò
xo xoắn” với khoảng 5 - 7 vòng đều nhau không phân nhánh dưới kính hiển
vi nên được gọi là Spirulina với tên khoa học là tảo Spirulina platensis (bắt
nguồn từ chữ spire, spiral có nghĩa là “xoắn ốc”) và trước đây được coi là
thuộc chi Spirulina. Thực ra đây không phải là sinh vật thuộc tảo (algae) vì
tảo thuộc sinh vật có nhân thật (Eukaryota). Spirulina thuộc vi khuẩn lam
(Cyanobacteria) nên chúng thuộc sinh vật nhân sơ hay nhân nguyên thủy
(Prokaryote).
Năm 1973, Tổ chức Nông lương Quốc tế (FAO) và Tổ chức Y tế Thế
giới (WHO) đã chính thức công nhận tảo xoắn Spirulina là nguồn dinh dưỡng
và dược liệu quý, đặc biệt trong chống suy dinh dưỡng và chống lão hóa.
Năm 1977, Viện sinh vật học là nơi tiên phong trong việc nuôi trồng
Spirulina ở Việt Nam theo mô hình ngoài trời, không mái che, có sục khí

CO2 [44].
1.5.1. Phân loại tảo Spirulina
Ngành: Cyanophyta
Lớp: Cyanophyceae
Bộ: Oscillatoriales
Họ: Oscillatoriaceae
Giống: Spirulina
1.5.2. Đặc điểm sinh học của tảo Spirulina
Tảo Spirulina có dạng xoắn lò xo khoảng 5 - 7 vòng đều nhau không
phân nhánh. Đường kính xoắn khoảng 35 - 50 micromet, bước xoắn 60
micromet, chiều dài thay đổi có thể đạt 0,25 mm. Nhiều trường hợp tảo xoắn
Spirulina có kích thước lớn hơn. Tảo là trung gian giữa vi khuẩn và tảo nhân
thực. Người ta cho rằng tảo Spirulina giống với vi khuẩn hơn, do đó tảo
Spirulina còn có tên là vi khuẩn lam.

11


Tảo có khả năng vận chuyển theo hình thức trượt xung quanh trục của
chúng. Vận tốc vận chuyển của chúng có thể đạt 5 micron/giây [44].

Hình 1.3. Hình dạng của tảo xoắn

Hình 1.4. Hình dạng tảo Spirulina

Spirulina

quan sát dưới kính hiển vi

1.5.3. Cấu tạo tảo Spirulina

Là tảo lam đa bào dạng sợi, gồm nhiều hình trụ xếp không phân nhánh.
Mỗi tế bào của sợi có chiều rộng 5 micromet, dài 2 mm. Không có lục lạp mà
chỉ chứa thylacoid phân bố đều trong tế bào. Không có không bào. Không có
nhân điển hình, vùng nhân không rõ, trong đó có chứa DNA ( Hedeskog và
Hifsten A.1980). Thành tế bào tảo gồm các lớp lipopolysaccharide, các sợi
nhỏ protein và các phân tử peptidoglucan. Màng tế bào nằm sát ngay dưới
thành tế bào và nối với màng quang hợp thylacoid tại một vài điểm.
Bộ máy quang hợp của tảo xoắn Spirulina: Phycobilisome: chứa
phycobiliprotein và protein liên kết được gắn vào bề mặt ngoài của thylacoid.
Phycobilisome có khối lượng khoảng 7 triệu dalton và có thể tách nguyên vẹn
để nghiên cứu. Đối với phycobilisome có cả phycoerythin và phycocyanin thì
lớp ngoài cùng là phycoerythin, tiếp theo là phycocyanin và phần trong cùng
là allophycocyanin. Phycobilisome hoạt động như một anten thu nhận năng
lượng mặt trời để chuyển vào PS II. Con đường truyền năng lượng bắt đầu từ
phycoerythin sang phycocyanin và cuối cùng đến allophycocyanin trước khi

12


đạt tới PS II. Có khoảng 50% năng lượng ánh sáng mặt trời Spirulina nhận
được nhờ phycobilisome.
Các sắc tố quang hợp gồm chlorophylla, carotenoid, phycocyanin,
allophycocyanin và thường có carotenoid - glycoside như myxoxanthophyll,
oscillaxanthin. Spirulina có chứa 3 nhóm sắc tố chính: Chlorophyll hấp thụ
ánh sáng lam và đỏ. Carotenoid hấp thụ ánh sáng lam và lục. Phycobillin hấp
thụ ánh sáng lục, vàng và da cam [44].
1.5.4. Sinh sản của tảo Spirulina
Tảo lam là vi sinh vật xuất hiện cùng lúc với vi khuẩn trên trái đất
(Cifferi O, Tiboni O, 1985). Hiện nay, người ta biết khoảng 2500 loài. Tảo
lam phân bố rất rộng và có khả năng chịu nhiệt rất cao. Người ta phát hiện

chúng sống ở những suối nước nóng đến 690C. Tảo Spirulina có phương thức
sinh sản vô tính, từ một cơ thể mẹ trưởng thành (gọi là trichome), tự phân
chia thành nhiều mảnh, mỗi mảnh gồm một số vòng xoắn (2 - 4 tế bào, gọi là
hormogonia). Để tạo thành các hormogonia, sợi Spirulina sẽ hình thành các
tế bào chuyên biệt cho sự sinh sản (gọi là đoạn necridia). Các necridia hình
thành các đĩa lõm ở hai mặt và tạo ra hormogonia bởi sự chia cắt tại vị trí các
đĩa. Khi đã phát triển, dần dần phần đầu hormogonia bị tiêu giảm và trở nên
tròn nhưng vách tế bào vẫn có chiều dày không đổi. Các hormogonia phát
triển, trưởng thành và chu kì sinh sản lặp lại để đảm bảo vòng đời của
Spirulina.
Thông thường, Spirulina sinh sản bằng cách gãy ra từng khúc. Trong
trường hợp gặp điều kiện không thuận lợi, Spirulina cũng có khả năng tạo
bào tử giống như ở vi khuẩn. Chu kì phát triển của Spirulina rất ngắn. Chu kì
này thường diễn ra trong 24 h như của tảo Chlorella [44].

13


1.5.5. Nghiên cứu ứng dụng
Tảo xoắn Spirulina đã được nghiên cứu sản xuất và được ứng dụng
trong nhiều lĩnh vực khác nhau ở các nước trên thế giới và được nghiên cứu
ứng dụng trong ngành thực phẩm và mỹ phẩm. Spirulina được nghiên cứu bổ
sung vào rất nhiều sản phẩm thực phẩm như: mì sợi, yaourt, kẹo, trà xanh,
bánh quy, bánh mì, bia…Các sản phẩm này được bán ở siêu thị của nhiều
nước như: Chi Lê, Đan Mạch, Hà Lan, Mỹ, Úc, New Zealand…
Nhiều giá trị dinh dưỡng và sinh học của tảo Spirulina được khám phá:
Tảo Spirulina rất giàu protein (60 - 70% trọng lượng khô của tảo) trong khi
thịt bò chỉ có 21%, thịt gà ta 20,3%... Các loại acid amin chủ yếu có tỉ lệ vượt
trội so với chuẩn của tổ chức lương nông quốc tế (FAO). Hệ số tiêu hóa
protein cũng rất cao với 80 - 85% protein được hấp thu sau 18 giờ.

Tảo Spirulina có các vitamin nhóm B, hàm lượng vitamin B12 cao gấp
2 lần trong gan bò. Caroten cao gấp 10 lần trong củ cà rốt. Ngoài ra tảo
Spirulina còn chứa các khoáng vi lượng (coban, kẽm, sắt...), 11 vitamin cần
thiết cho cơ thể và chất chống oxi hóa: Betacaroten và carotenoid. Đặc biệt kẽm (Zn) và các acid amin có trong tảo giúp tăng cường khả năng hoạt động
tình dục ở nam giới. Tảo Spirulina làm cân bằng dinh dưỡng, tổng hợp các
chất nội sinh, tăng hoocmon và điều hòa sinh lí [44].

14


CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vi sinh vật và thiết bị nghiên cứu
2.1.1. Vi sinh vật
Nguồn vi sinh vật do phòng vi sinh vật học khoa Sinh - KTNN trường
Đại học Sư phạm Hà Nội 2 cung cấp.
2.1.2. Hóa chất và thiết bị
2.1.2.1. Hóa chất
Hóa chất PTN Vi sinh vật khoa Sinh - KTNN, trường ĐHSPHN2 cung
cấp gồm:
- Ethanol, glucose, fructose, saccarose, mantose, lactose, manitol,
sorbitol, dihyroxyaceton, acid acetic
- Cao thịt, cao nấm men, pepton, (NH4)2SO4, NaNO3, NaNO2
- KH2PO4, CaCO3, MgSO4.7H2O, NaCl, NaOH
- Blue Bromphenol, lugol, fucshin, tím gentian, phenolphthalein
2.1.2.2. Thiết bị
- Nồi hấp Tommy (Nhật)
- Box vô trùng (Haraeus)
- Máy lắc Orbital Shakergallenkump (Anh)
- Máy li tâm Sorvall (Mỹ)
- Micropipet Jinson (Pháp) các loại từ 0.5μl - 10ml

- Máy so màu UV - vis (Nhật)
- Máy đo pH (MP 200R - Thuỵ Sĩ)
- Cân (Precisa XT 320M - Thuỵ Sĩ)
- Máy cất nước 2 lần (Hamilton - Anh)
- Kính hiển vi quang học Carl Zeiss (Đức)
- Kính lúp soi nổi STEMI 2000 - C

15


2.1.3. Môi trường
2.1.3.1. Môi trường phân lập vi khuẩn (Môi trường GCP) (g/l)
Glucose: 20 g

(NH4)2S04 : 3 g

Pepton: 5 g

Thạch agar : 20 g

MgS04.7H20: 2 g

CaCO3 : 2 g

KH2P04: 2 g

pH: 5,5 - 6,0

Nước máy: 1000ml
2.1.3.2. Môi trường giữ giống (g/l)

Glucose: 20 g

(NH4)2S04 : 3 g

Pepton: 5 g

Thạch agar : 20 g

MgS04.7H20: 2 g

KH2P04: 2 g

Nước máy: 1000 ml
2.1.3.3. Môi trường nhân giống vi sinh vật nghiên cứu (g/l)
Glucose: 20 g

(NH4)2S04 : 3 g

KH2P04: 2 g

Acid acetic: 2 %

pH : 5,0 - 6,0

MgS04.7H20: 2 g

Nước máy: 1000 ml
Bột tảo xoắn Spirilina: 16 g
2.1.3.4. Môi trường lên men
Chúng tôi đã sử dụng một số môi trường có thành phần theo bảng sau:

16