Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện môi trường đến quá trình lên men lactic tạo nước giải khát từ tảo xoắn Spirulia

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
--------------------

NGUYỄN THỊ MINH PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA
ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG TỚI QUÁ TRÌNH LÊN MEN
TẠO NƯỚC GIẢI KHÁT TỪ TẢO XOẮN SPIRULINA
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Vi sinh học

Người hướng dẫn khoa học
PGS.TS. ĐINH THỊ KIM NHUNG

Hà Nội, 2017


TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
--------------------

NGUYỄN THỊ MINH PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA
ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG TỚI QUÁ TRÌNH LÊN MEN
TẠO NƯỚC GIẢI KHÁT TỪ TẢO XOẮN SPIRULINA
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Vi sinh học

Người hướng dẫn khoa học

PGS.TS. ĐINH THỊ KIM NHUNG

Hà Nội, 2017


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình học tập và tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên
cứu ảnh hưởng của điều kiện môi trường đến quá trình lên men lactic tạo
nước giải khát từ tảo xoắn Spirulia”, em đã nhận được sự hướng dẫn, giúp
đỡ tận tình, quý báu của các thầy cô giáo, các anh chị và các bạn.
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin được bày tỏ lời cảm
ơn chân thành tới:
PGS. TS. Đinh Thị Kim Nhung, giảng viên chính, tổ Thực vật - Vi
sinh, Trường Đại hoc Sư phạm Hà Nội 2, người đã trực tiếp hướng dẫn,
dạy bảo, động viên và cho em nhiều ý kiến quý báu, đồng thời tạo mọi điều
kiện thuận lợi để em thực hiện tốt đề tài tốt nghiệp này.
Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy giáo, cô giáo trong tổ
bộ môn Thực vật - Vi sinh, Khoa Sinh - KTNN, trường Đại học sư phạm Hà
Nội 2, Sở khoa học công nghệ Vĩnh Phúc, Công ty dược Hậu Giang đã
nhiệt tình giảng dạy và truyền đạt kinh nghiệm trong suốt thời gian em thực
hiện đề tài.
Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu nhà trường, Ban Chủ
nhiệm khoa Sinh - KTNN, Trung tâm thông tin thư viện, Phòng thí nghiệm
Vi sinh vật trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tạo điều kiện thuận lợi
cho em hoàn thành khóa luận này.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè và người thân,
những người luôn quan tâm, động viên, khích lệ, giúp đỡ em trong suốt quá
trình học tập, tiến hành và hoàn thiện đề tài.
Hà Nội, ngày …..tháng 04 năm 2017

Sinh viên thực hiện
Nguyễn Thị Minh Phương


LỜI CAM ĐOAN

Em xin cam đoan những gì viết trong khóa luận này đều là sự thật,
đây là kết quả nghiên cứu của riêng cá nhân em. Tất cả những số liệu đều
được thu thập từ thực nghiệm và qua xử lý thống kê, hoàn toàn không có số
liệu sao chép, bịa đặt. Đề tài nghiên cứu này không trùng với công trình
nghiên cứu của các tác giả khác.
Trong đề tài, em có sử dụng một số dữ liệu của một số tác giả khác,
em xin phép các tác giả được trích dẫn để bổ sung cho khóa luận của mình.
Nếu sai em xin chịu hoàn toàn trách nhiệm.
Hà Nội, ngày…..tháng 04 năm 2017
Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Minh Phương


BẢNG CHỮ CÁI VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

1. TCN

: Trước công nguyên

2. VK

: Vi khuẩn

3. NM

: Nấm men

4. TCVN

: Tiêu chuẩn Việt Nam

5. MT

: Môi trường

6. TP

: Thành phố

7. Nxb

: Nhà xuất bản


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 5
1. Lý do chọn đề tài ........................................................................................... 1
2. Mục đích nghiên cứu ..................................................................................... 2
3. Nhiệm vụ nghiên cứu .................................................................................... 2
4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tế ............................................................. 2
5. Đóng góp của đề tài....................................................................................... 2
NỘI DUNG ....................................................................................................... 3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 3

1.1. Giới thiệu về tảo xoắn Spirulina ................................................................ 3
1.1.1. Lịch sử về tảo xoắn Spirulina ................................................................. 3
1.1.2. Đặc điểm phân loại.................................................................................. 4
1.1.3. Đặc điểm cấu tạo của tảo xoắn................................................................ 4
1.1.4. Thành phần dinh dưỡng trong tảo xoắn Spirulina .................................. 6
1.2. Vi sinh vật và quá trình lên men tạo nước giải khát từ tảo xoắn
Spirulina ............................................................................................................ 6
1.2.1. Vi khuẩn Lactic ....................................................................................... 6
1.2.2. Vi khuẩn giấm ......................................................................................... 8
1.2.3. Nấm men ................................................................................................. 9
1.2.4. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của nhóm vi sinh vật lên
men tạo nước giải khát từ tảo xoắn Spirulina ................................................. 10
1.2.5. Cơ chế của quá trình lên men lactic ...................................................... 14
1.3. Ứng dụng của Spirulina ........................................................................... 14
1.3.1. Ứng dụng trong thực phẩm ................................................................... 14
1.3.2. Ứng dụng trong xử lý môi trường ......................................................... 15
1.3.3. Ứng dụng trong y học ........................................................................... 17
1.3.4. Ứng dụng trong mỹ phẩm ..................................................................... 17


1.3.5. Ứng dụng tảo làm thức ăn cho vật nuôi ................................................ 18
1.4. Tình hình nghiên cứu của tảo xoắn Spirulina hiện nay ........................... 18
1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ........................................................ 18
1.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước.......................................................... 20
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............. 22
2.1. Đối tượng và thiết bị nghiên cứu ............................................................. 22
2.1.1. Nguyên liệu ........................................................................................... 22
2.1.2. Hóa chất, dụng cụ thí nghiệm ............................................................... 22
2.2. Các loại môi trường.................................................................................. 23
2.2.1. Môi trường phân lập giống vi khuẩn lactic: MRS thạch (g/l) ............... 23

2.2.2. Môi trường nhân giống vi khuẩn lactic: MRS dịch thể (g/l) ................ 23
2.2.3. Môi trường lên men (g/l):...................................................................... 23
2.3. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 23
2.3.1. Phương pháp vi sinh .............................................................................. 23
2.3.2. Phương pháp hóa sinh ........................................................................... 26
2.3.3. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng đến
quá trình lên men ............................................................................................ 26
2.3.5. Phương pháp toán học ........................................................................... 27
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ....................... 29
3.1. Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có khả năng lên men
nước giải khát từ tảo xoắn Spirulina ............................................................... 29
3.1.1. Phân lập và tuyển chọn sơ bộ chủng vi khuẩn lactic lên
men nước giải khát từ tảo xoắn Spirulina ....................................................... 29
3.1.2. Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có khả năng lên men tạo nước
giải khát từ tảo xoắn Spirulina ........................................................................ 34
3.2. Ảnh hưởng của điều kiện môi trường tới lên men tạo nước giải khát
từ tảo xoắn Spirulina ....................................................................................... 37


3.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men .......................................................... 38
3.2.1. Ảnh hưởng của hàm lượng giống bổ sung ............................................ 39
3.3.3. Ảnh hưởng của thời gian lên men ......................................................... 41
KẾT LUẬN ..................................................................................................... 45
PHỤ LỤC ........................................................................................................ 46
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 47


DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Tảo xoắn (Spirulina) dưới kính hiển vi ............................................ 4

Hình 3.1. Dịch lên men từ bột tảo xoắn .......................................................... 29
Hình 3.2. Mẫu thử hoạt tính catalaza .............................................................. 33
Hình 3.3. Mẫu thử khả năng sinh acid lactic bằng thuốc thử Ufelmann ........ 34
Hình 3.4. Vòng phân giải CaCO3 của chủng Lactobacillus L5 ..................... 35
Hình 3.5. Khả năng lên màng của chủng vi khuẩn Lactobacillus L5 ............. 36
Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn số lượng tế bào ở các mức nhiệt độ khác nhau
trong môi trường lên men của các nhóm vi sinh vật đã tuyển chọn. ............. 38
Hình 3.7. Đồ thị biểu diễn sự biến thiên pH, acid tổng số, ethanol ................ 39
Hình 3.8. Sự biến thiên của hàm lượng đường sót ở các ................................ 40
hàm lượng giống bổ sung khác nhau .............................................................. 40
Hình 3.9. Đồ thị biểu diễn sự biến thiên pH theo thời gian lên men .............. 42
Hình 3.10. Đồ thị biểu diễn sự biến thiên pH theo thời gian lên men ............ 42
Hình 3.11. Đồ thị biểu diễn sự biến thiên pH theo thời gian lên men ............ 42


DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái và kích thước của vi khuẩn lactic trong các
mẫu phân lập ................................................................................................... 31
Bảng 3.2. Kích thước vòng phân giải của 9 chủng vi khuẩn Lactobacillus ... 35
Bảng 3.3. Đánh giá khả năng tạo màng của các chủng vi khuẩn
Lactobacillus ................................................................................................... 36
Bảng 3.4: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lên men ............................. 46
của các chủng vi sinh vật tuyển chọn .............................................................. 46
Bảng 3.5. Sự biến đổi thành phần hóa học trong quá trình lên men ............... 46
tạo nước giải khát từ tảo xoắn Spirulina ......................................................... 46


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài

Cùng với sự phát triển ngày càng cao của xã hội thì ngành công nghiệp
sản xuất nước giải khát cũng phát triển mạnh mẽ. Với xu hướng của thời đại
các sản phẩm nước nước giải khát không chỉ dừng lại từ nguyên liệu có sẵn
trong tự nhiên, từ nguồn nguyên liệu xanh mà còn từ những nguyên liệu có
giá trị dinh dưỡng, dược liệu cao như tảo Spirulina.
Tảo xoắn (tên khoa học là Spirulina platensis) là một loại vi tảo dạng sợi
xoắn màu xanh lục, chỉ có thể quan sát thấy hình xoắn sợi do nhiều tế bào đơn
cấu tạo thành dưới kính hiển vi. Những nghiên cứu mới nhất lại cho biết
chúng cũng không phải thuộc chi Spirulina mà lại là thuộc chi Arthrospira.
Tên khoa học hiện nay của loài này là Arthrospira platensis, thuộc bộ
Oscilatoriales, họ Cyanobacteria. Tảo Spirulina đã được nghiên cứu từ nhiều
năm nay. Chúng có những đặc tính ưu việt và giá trị dinh dưỡng cao. Các nhà
khoa học trên thế giới đã coi tảo Spirulina là sinh vật có ích cho loài người.
Tổ chức Y tế thế giới (WHO/OMS) công nhận tảo Spirulina là thực phẩm bảo
vệ sức khỏe tốt nhất của loài người trong thế kỉ XXI. Cơ quan quản lí thực
phẩm và dược phẩm Hoa Kì (FDA) công nhận nó là một trong những
nguồn protein tốt nhất [15].
Trên thế giới, sản phẩm từ tảo xoắn đã được biết đến khá lâu ở dạng là:
thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm. Ở Việt Nam, sản phẩm từ tảo xoắn chủ
yếu được biết đến dưới dạng dược phẩm, tận dụng những lợi ích của tảo xoắn
để cải thiện sức khỏe của con người. Tuy nhiên, sản phẩm này chỉ mới phát
triển ở những năm gần đây. Vì vậy, việc nghiên cứu chế biến nước giải khát
từ tảo xoắn, sẽ góp phần làm phong phú các sản phẩm nước uống trên thị
trường và tận dụng các ích lợi từ nguồn dược liệu này đến người tiêu dùng.
Hơn nữa, các công trình nghiên cứu về tảo xoắn ở nước ta vẫn chưa đầy đủ,
hoàn chỉnh. Đặc biệt là những nghiên cứu về ảnh hưởng của điều kiện môi
trường tới quá trình lên men tạo nước giải khát từ tảo xoắn. Vì vậy, tôi quyết
1

định lựa chọn đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện môi trường đến
quá trình lên men lactic tạo nước giải khát từ tảo xoắn Spirulia”.
2. Mục đích nghiên cứu
Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện môi trường đến quá trình lên men
lactic tạo nước giải khát từ tảo xoắn Spirulia.
3. Nhiệm vụ nghiên cứu
3.1. Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có khả năng lên men từ tảo
xoắn Spirulina để tạo nước giải khát.
3.2.Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện môi trường đến quá trình lên men
lactic tạo nước giải khát từ tảo xoắn Spirulina.
4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tế
4.1 Ý nghĩa khoa học
Ứng dụng cơ sở khoa học của quá trình lên men lactic để nghiên cứu ảnh
hưởng của điều kiện môi trường tới quá trình lên men tạo Nước giải khát từ tảo
xoắn Spirulina.
4.2 Ý nghĩa thực tế
Là một trong những công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu ảnh
hưởng của điều kiện môi trường đến khả năng lên men dịch tảo xoắn
Spirulina để sản xuất nước giải khát. Từ đó cho ra sản phẩm nước giải khát
đáp ứng được nhu cầu của người tiêu dùng.
5. Đóng góp của đề tài
5.1. Phân lập được 15 chủng vi khuẩn lactic và dựa vào đặc điểm hình thái,
kích thước tuyển chọn sơ bộ được 9 chủng xác định là vi khuẩn
Lactobacillus. Tuyển chọn được 1 chủng vi khuẩn Lactobacillus L5 thích
hợp để lên men lactic tạo nước giải khát từ tảo xoắn Spirulina.
5.2. Tìm ra điều kiện môi trường thích hợp để lên men nước giải khát từ tảo
xoắn Spirulina đạt tiêu chuẩn về an toàn thực phẩm với: nhiệt độ thích
hợp cho lên men 300C, thời gian lên men 5 ngày, hàm lượng giống bổ
sung 10%, pH thích hợp 4,5.

2


NỘI DUNG
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về tảo xoắn Spirulina
1.1.1. Lịch sử về tảo xoắn Spirulina
Các nghiên cứu khoa học đã chỉ ra rằng, tảo Spirulina (có tên khoa học là
Arthrospira platensis) là một trong những loài sinh vật lâu đời nhất trên trái đất.
Nó sinh trưởng tự nhiên ở vùng nhiệt đới trong các hồ nước mặn của Châu Phi,
Trung và Nam Mỹ từ 3,5 tỷ năm trước. Từ xưa, Spirulina đã được những người
dân vùng đó dùng như một dạng thức ăn. Bằng kinh nghiệm, họ nhận thấy
Spirulina là một loại thực phẩm rất bổ dưỡng. Spirulina là tên gọi do nhả tảo học
người Đức - Deurben đặt vào năm 1827 dựa trên hình thái đặc trưng nhất là dạng
sợi xoắn ốc với khoảng 5 - 7 vòng đều nhau không phân nhánh [15].
Trong những năm 60 của thế kỉ XX, Brandily - một nhà nhân chủng
học người Pháp đã phát hiện ra loài tảo này trong lần khảo sát sự đa dạng sinh
học tại vùng hồ ở Tchad (Châu Phi), sau khi quan sát và nhận thấy những
người dân sống quanh vùng hồ này rất khỏe mạnh vì họ thường vớt loại tảo
này về ăn như là một loại thực phẩm chính [15].
Đến năm 1973, Tổ chức Lương nông quốc tế (FAO) và Tổ chức Y tế
thế giới (WHO) đã chính thức công nhận thảo Spirulina là nguồn dinh dưỡng
và dược liệu quý, đặc biệt trong chống lão hóa và chống suy dinh dưỡng. Hai
mươi năm sau, vào những năm cuối của thập kỉ 80 thế kỉ XX - nhiều giá trị
dinh dưỡng và chức năng sinh học của tảo Spirulina đã được khám phá và
công bố rộng rãi không chỉ ở Pháp và ở cả nhiều nước khác trên thế giới như
Mỹ, Nhật, Canada, Mehico, Đài Loan...

3

1.1.2. Đặc điểm phân loại
Tảo Spirulina là các vi sinh vật có hình xoắn sống trong nước mà ta
quen gọi là Tảo xoắn với tên khoa học là Spirulina platensis. Thực ra đây
không phải là một sinh vật thuộc ngành Tảo (Algae) vì Tảo thuộc giới sinh
vật có nhân thật (Eukaryotes). Spirulina thuộc ngành Vi khuẩn lam
(Cyanobactera), chúng thuộc giới sinh vật có nhân sơ hay nhân nguyên thủy
(Prokaryotes). Những nghiên cứu mới nhất lại cho biết chúng cũng không
phải thuộc chi Spirulina mà lại thuộc chi Arthrospira [14].
Về phân loại khoa học [14, 22], tảo Spirulina thuộc:
- Giới (domain): Bacteria
- Ngành (phylum): Cyanobactera
- Lớp (class): Chroobacteria
- Bộ (order): Oscillatoriales
- Họ (family): Phormidiaceae
- Chi (genus): Arthrospira
-

Loài (species): Anthrospira platensis

Vì có cấu tạo và chức năng khác các loài thông thường nên Spirulina
còn có tên là vi khuẩn lam hay phiêu sinh thực vật.
1.1.3. Đặc điểm cấu tạo của tảo xoắn

Hình 1.1: Tảo xoắn (Spirulina) dưới kính hiển vi
Tảo Spirulina là một loài vi tảo có dạng xoắn hình lò xo, màu xanh lam
với kích thước chỉ khoảng 0,25mm. Chúng sống trong môi trường nước giàu
4

bicarbonat (HCO3) độ kiềm cao (pH từ 8,5 - 11). Quan sát dưới kính hiển vi điện
tử cho thấy Spirulina có dạng lông, cấu tạo đơn bào, có lớp vỏ capsule, thành tế
bào có nhiều lớp, có cơ quan quang hợp hoặc hệ phiến thylakoid, riboxom và
những sợi ADN nhỏ. Capsule có cấu trúc sợi nhỏ và bao quanh là một lớp sợi
khác bảo vệ cho chúng. Bề ngang của lông thay đổi từ 6 - 12µm và được cấu tạo
từ các tế bào hình trụ tròn. Đường kính xoắn ốc của nó từ 30 - 70µm, chiều dài
của lông là khoảng 500µm, trong một vài điều kiện nuôi cấy khi có kích thích thì
chiều dài của các sợi có thể lên đến 1mm. Điều này giải thích tại sao hình dáng
xoắn ốc của Spirulina trong môi trường lỏng bị thay đổi thành hình xoắn lò xo
trong môi trường rắn. Những thay đổi này là do sự hút nước hoặc khử nước của
oligopeptide trong màng peptidoglican tạo nên [14, 15].
Thành tế bào của Spirulina có cấu tạo gồm 4 lớp, xếp theo thứ tự từ bên
trong ra ngoài là: LI, LII, LIII và LIV. Các lớp này đều rất mỏng, ngoại trừ
lớp 2 được cấu tạo từ peptidoglycan, chất này giữ cho thành tế bào cứng chắc.
Lớp 1 chứa β- 1,2-glucan, một chất khó tiêu hoá đối với con người. Tuy
nhiên, lớp này chiếm tỉ lệ thấp (<1%), độ dày nhất của nó là 12nm, còn các
protein và các lipo-polysaccarit tự nhiên của lớp thứ hai là lý do cho sự tiêu
hóa Spirulina rất dễ dàng của con người [5].
Chlorophyll a, caroten và phycobilisome nằm trong hệ thylakoid - cơ
quan quang hợp của tảo này. Phycobilisome là nơi chứa phycocyanin (có sắc
tố xanh). Riboxom và các sợi ADN nằm ở vùng trung tâm.
Spirulina chứa nhiều tổ chức ngoại vi kết hợp với thylakoid, chúng là
các hạt cyanophycin, thể polyhedral, các hạt poliglucan, hạt lipid, các hạt
poliphotphat. Các hạt cyanophycin, hay còn gọi là các hạt dự trữ, có vai trò
quan trọng do các hợp chất hoá học tự nhiên của chúng và các nhóm sắc tố
của chúng. Thể polyhedral hay carboxysome cho phép cố định CO2 trong hệ
thống quang hợp và có thể mang ra một cơ quan dự trữ. Các hạt polyglucan
5

hoặc glycogen hoặc hạt α là những polyme glucose, nhỏ, tròn và khuếch tán
rộng trong thylacoidal. Các hạt lipid, hạt β hoặc hạt osmophile từ cơ quan dự
trữ, được cấu tạo bởi poly-β hydroxybutyrate, chỉ tìm thấy ở trong các tế bào
prokaryote, chúng được coi như là những chất dự trữ năng lượng [14,5].
1.1.4. Thành phần dinh dưỡng trong tảo xoắn Spirulina
Spirulina chứa hàm lượng protein rất cao và chứa đầy đủ các vitamin.
Spirulina có giá trị dinh dưỡng cao vì chứa hàm lượng protein cao và các chất có
hoạt tính sinh học khác. Giá trị protein trung bình của Spirulina là 65%, cao hơn
so với nhiều loại thực phẩm. Spirulina là nguồn giàu vitamin B12 nhất. Ngoài ra,
.

Spirulina còn chứa các vitamin khác như A, B1, B2, B6, E và H (Fox, 1986).
Spirulina cung cấp 21% thiamin và riboflavin so với nhu cầu hàng ngày.
Các chất màu trong Spirulina: Spirulina có màu xanh lam - lục là do
Spirulina chứa nhiều sắc tố với hàm lượng cao như chlorophyll,
phycocyanin, β - caroten. Caroten trong tảo Spirulina cao gấp 10 lần trong
củ cà rốt. Sắc tố tạo cho tảo có mầu xanh lam là phycocyanin [14].
1.2. Vi sinh vật và quá trình lên men tạo nước giải khát từ tảo xoắn Spirulina
Hệ vi sinh vật lên men dịch tảo xoắn Spirulina là một tập đoàn vi sinh
vật cộng sinh bao gồm các vi khuẩn và nấm men.
1.2.1. Vi khuẩn Lactic
Phân loại khoa học
Giới
Ngành
Lớp
Loài
Họ
Giống

Vi khuẩn

Firmicutes
Bacilli
Lactobacillales
Lactobacillaceae
Lactobacillus

6


Những vi khuẩn gây lên men sinh axit Lactic được gọi là vi khuẩn
lactic. Vi khuẩn lactic được đặc trưng bởi khả năng sinh axit Lactic rất
mạnh từ các loại đường khác nhau, đặc biệt là đường lactose. Hầu hết các
vi sinh vật sinh axít Lactic đều thuộc về họ Lactobacillaceae và được xếp
bốn chi: Streptococcus, Pediococcus, Lactobacillus và Leuconostoc. Chúng
có dạng hình cầu hoặc hình que, Gram dương, không bào tử, không di
động. Tuy nhiên, hiện nay người ta tìm thấy một số giống trong họ vi
khuẩn lactic có khả năng tạo bào tử. Vi khuẩn lactic không khử nitrate,
phản ứng catalase âm tính, kỵ khí tuỳ ý, một vài loài kỵ khí sống trong hệ
tiêu hoá của con người [5].
Vi khuẩn lactic là những vi sinh vật có nhu cầu dinh dưỡng cao. Để
sinh trưởng bình thường, ngoài nguồn cacbon, chúng cần nitơ, một phần
dưới dạng cacaxit amin, một số vitamin, các chất sinh trưởng, và các chất
khoáng… Chúng không thể phát triển được trong môi trường có thành phần
đơn giản như glucose và NH4+ như một số loài khác. Vì thế người ta phải
cho vào môi trường một số chất giàu dinh dưỡng: cao nấm men, cao thịt,
các loại đường để chúng có thể lên men.
Vi khuẩn lactic có thể tồn tại trong môi trường khô, có thể chịu được
hàm lượng cồn từ 10 - 15% và có thể chịu được nồng độ CO2 cao. Chúng
được tìm thấy khắp nơi trong tự nhiên, dưới da, trong hệ tiêu hoá…
Lactobacillus có vai trò quan trọng nhất trong lên men lactic.

Vi khuẩn lactic là vi khuẩn kỵ khí Gram dương, có dạng hình que dài,
không sinh bào tử, tế bào thường xếp đôi hoặc thành chuỗi, không di động.
Chúng là nhóm chính của vi khuẩn axit lactic, hầu hết các chủng của chúng
biến đổi đường lactose và những đường khác thành axit lactic. Chúng là vi
khuẩn rất phổ biến và thường là lành tính. Ở người, chúng có mặt ở âm đạo
và ở ruột. Nhiều loài có ở thực vật đang phân rã. Sự sản xuất axit lactic làm
7


ngăn cản sự phát triển của một vài loài vi khuẩn có hại khác [2], [5].
1.2.2. Vi khuẩn giấm
Vi khuẩn giấm là tác nhân chính của quá trình lên men acetic. Giống
vi khuẩn acetic, phân bố rộng rãi trong tự nhiên và có thể dễ dàng tìm thấy
các vi khuẩn này từ không khí, đất, nước, lương thực thực phẩm, giấm,
rượu, bia, hoa quả… Ngày nay người ta đã biết tới hơn 20 loài vi khuẩn có
khả năng lên men acetic thuộc nhóm khác nhau [1].
Về hình dạng tế bào vi khuẩn giấm là những trực khuẩn hình que hay
hình elip, hình chỉ, hình cầu hoặc có hình bán nguyệt, kích thước tế bào
thay đổi tùy loài (0.3 - 0.6 x 1.0 - 8.0μm). Các tế bào đứng riêng rẽ hoặc
xếp thành chuỗi, có hoặc không có tiêm mao, sống và phát triển trong điều
kiện hiếu khí bắt buộc hóa dị dưỡng hữu cơ, không sinh bào tử. Ở môi
trường dịch thể vi khuẩn giấm có sự hình thành màng trên mặt thoáng,
màng tạo thành có độ dày mỏng khác nhau và đặc điểm của các loại màng
cũng khác nhau tùy loại [1].
Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, nhu cầu dinh dưỡng của vi
khuẩn giấm rất phong phú. Nguồn carbon có thể được cung cấp từ các hợp
chất đường, rượu etylic và các acid hữu cơ. Vi khuẩn giấm có thể sử dụng
các muối amon làm nguồn cung cấp nitơ và phân giải pepton. Một số acid
amin như acid pantothenic và các chất khoáng K, Mg, Ca, Fe, P, S… cũng
có vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng và phát triển. Do đó bia,

dịch tự phân nấm men, nước mạch nha, nước trái cây… là nguồn dinh
dưỡng rất tốt cho sự phát triển của vi khuẩn. Một số loài vi khuẩn còn tổng
hợp được vitamin B1, vitamin B2, oxy hoá sorbit thành đường sorbose
(dùng trong công nghiệp sản xuất vitamin C), hay như Acetobacter xylinum
có thể tổng hợp được sợi cellulose giống như những sợi bông [1].

8


1.2.3. Nấm men
Tế bào nấm men thường có dạng hình cầu, ovan, elip, hình trụ, hình
quả chanh… kích thước tương đối lớn: đường kính khoảng 7μm, chiều dài:
8 - 12μm. Hình dạng và kích thước tế bào thay đổi, không đồng đều ở các
loài khác nhau, ở các lứa tuổi khác nhau và điều kiện nuôi cấy khác nhau.
Nấm men thuộc nhóm sinh vật nhân chuẩn đơn bào, tế bào nấm men
có thành phần và cấu tạo khá phức tạp gồm thành tế bào, màng nguyên sinh
chất, tế bào chất, ty thể, riboxom, nhân, không bào và các hạt dự trữ...
Có rất nhiều cách phân loại, nấm men chủ yếu gồm hai lớp là nấm
men thật (Ascomyces) và nấm men giả (Fungiimporfecti).
+ Lớp nấm men thật (Ascomyces): phần lớn nấm men dùng trong công
nghiệp thuộc lớp Ascomyces, đa số thuộc giống Saccharomyces; giống
Schizosaccharomyces giống Endomyces.
+ Lớp nấm men giả (Fungi imporfecti) gồm: Crrytococus (toscula,
tornlopsis); Mycoderma; Candida; Rhodotorula.
Khi cấy nấm men vào môi trường dinh dưỡng đầy đủ, tế bào nấm men
tăng nhanh về kích thước và đồng thời sinh khối được tích lũy nhiều cho
đến khi cơ chất của môi trường giảm đến mức thấp nhất thì quá trình sinh
trưởng phát triển của chúng chậm và ngừng hẳn. Các nấm men sinh sản
bằng phương pháp nhân đôi thường cho lượng sinh khối rất lớn sau một
thời gian ngắn. Tế bào sẽ già đi khi môi trường thiếu chất dinh dưỡng và tế

bào không còn khả năng sinh sản nữa. Tuy nhiên đa số nấm men sinh sản
bằng phương pháp nảy chồi nên hiện tượng phát hiện tế bào già rất rõ [13].

9


1.2.4. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của nhóm vi sinh vật lên men tạo nước
giải khát từ tảo xoắn Spirulina
1.2.4.1. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic
Các loại vi khuẩn lactic khác nhau thì có nhu cầu dinh dưỡng khác
nhau. Chúng không chỉ có nhu cầu về các nguồn cơ chất chứa các nguyên
tố cở bản như cacbon, nitơ, photphat và lưu huỳnh mà còn có nhu cầu về
một số chất cần thiết khác như vitamin, muối vô cơ…
Nhu cầu dinh dưỡng cacbon
Vi khuẩn lactic có thể sử dụng nhiều loại hydrat cacbon từ các
monosaccarit (glucoza, fructoza, manoza), các disaccarit (saccaroza,
lactoza, maltoza) cho đến các polysaccarit (tinh bột, dextrin).
Chúng sử dụng nguồn cacbon này để cung cấp năng lượng, xây dựng
cấu trúc tế bào và làm cơ chất cho quá trình lên men tổng hợp các acid hữu cơ.
Nhu cầu dinh dưỡng nitơ
Phần lớn vi khuẩn lactic không tự tổng hợp được các hợp chất chứa
nitơ. Vì vậy để đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển chúng phải sử
dụng các nguồn nitơ có sẵn trong môi trường.
Các nguồn nitơ vi khuẩn lactic có thể sử dụng như: cao thịt, cao nấm
men, trypton, dịch thủy phân casein từ sữa, pepton,… Hiện nay cao nấm
men là nguồn nitơ được sử dụng nhiều nhất và có hiệu quả nhất. Tuy nhiên
ở quy mô công nghiệp không thể sử dụng nguồn nitơ này vì rất tốn kém.
Nhu cầu về vitamin
Vitamin đóng vai trò là các coenzyme trong quá trình trao đổi chất
của tế bào, nên rất cần thiết cho hoạt động sống. Tuy nhiên, đa số các loài

vi khuẩn lactic không có khả năng sinh tổng hợp vitamin. Vì vậy cần bổ
sung vào môi trường các loại vitamin. Các chất chứa vitamin thường sử
dụng như nước chiết từ khoai tây, ngô, cà rốt hay dịch tự phân nấm men…
Nhu cầu các hợp chất hữu cơ khác
Ngoài các acid amin và vitamin, vi khuẩn lactic còn cần các hợp chất
10


hữu cơ khác cho sự phát triển như các bazơ nitơ hay các acid hữu cơ.
Một số acid hữu cơ có ảnh hưởng thuận lợi đến tốc độ sinh trưởng của
vi khuẩn lactic như acid xitric, acid oleic. Nên hiện nay người ta sử dụng
các muối citrat, dẫn xuất của acid oleic làm thành phần môi trường nuôi
cấy, phân lập và bảo quản các chủng vi khuẩn lactic.
Tương tự như hai acid hữu cơ trên, acid axetic cũng có những tác
động quan trọng đến sự sinh trưởng của tế bào. Nên người ta thường sử
dụng acid axetic dưới dạng các muối axetat để làm chất đệm cho môi
trường khi nuôi cấy vi khuẩn lactic.
Nhu cầu các muối vô cơ khác: Để đảm bảo cho sinh trưởng và phát
triển đầy đủ, vi khuẩn lactic rất cần các muối vô cơ.
Nhu cầu dinh dưỡng oxi
Vi khuẩn lactic vừa có khả năng sống được trong môi trường có oxy
và vừa sống được trong môi trường không có oxy. Trong điều kiện hiếu khí
sinh khối vi khuẩn sẽ phát triển nhanh hơn so với điều kiện kỵ khí, trong
điều kiện này từ một phân tử glucose sẽ bị oxy hóa hoàn toàn thành CO2 và
H2O và tổng hợp các enzyme, từ một phân tử glucose tạo ra 36 hoặc 38 ATP.
Các quá trình sinh lí của tế bào nấm men
Tế bào nấm men có thể sống độc lập. Quá trình sống của chúng gồm
các quá trình dinh dưỡng, quá trình sinh trưởng và đặc điểm di truyền.
Dinh dưỡng
Dinh dưỡng carbon: các hợp chất hữu cơ khác nhau như các loại đường

và dẫn xuất, rượu, acid hữu cơ, acid amin… có thể là nguồn dinh dưỡng
carbon của nấm men, trong đó nguồn đường là chủ yếu. Nấm men có thể sử
dụng nhiều nguồn đường khác nhau như sucrose, maltose, lactose, glucose…
Dinh dưỡng nitơ: đa số nấm men không đồng hóa được nitrat mà chỉ
có khả năng sử dụng các muối amon ở dạng hòa tan, có thể là đạm hữu cơ
hoặc vô cơ. Nguồn nitơ hữu cơ thường dùng là acid amin, pepton, amid,
urê, nucleotit… Đạm vô cơ là các muối amon khử nitrat, sulfat, acetat…

11


Dinh dưỡng các chất sinh trưởng: các vitamin, các purin và prymidin
là nhân tố sinh trưởng cơ bản của nấm men.
1.2.4.2. Quá trình trao đổi chất
Quá trình trao đổi chất và năng lượng của vi khuẩn lactic thực hiện thông
qua việc lên men lactic. Dựa vào khả năng lên men lactic người ta chia vi khuẩn
lactic làm hai nhóm: Lên men lactic đồng hình và lên men lactic dị hình.
Lên men lactic đồng hình [1], [2]
Lên men lactic đồng hình là quá trình lên men trong đó các sản phẩm
acid lactic tạo ra chiếm 90% tổng số các sản phẩm lên men và một lượng
nhỏ acid acetic, aceton, di-acetyl….
Phương trình chung biểu diễn quá trình lên men:
2CH3CHOHCOOH + 21,8.104 J

C6H12O6

Trong quá trình lên men lactic đồng hình, glucoza được chuyển hoá
theo chu trình Embden - Mayerhoff, vi khuẩn sử dụng cho qui trình này tất cả
các loai enzym aldolase, còn hydro tách ra khi dehydro hoá triozophophat
dược chuyển đến pyruvat. Vì trong vi khuẩn lên men lactic đồng hình không

có enzyme cacboxylase cho nên acid pynivic không phân huỷ nữa mà tiếp tục
khử thành acid lactic theo sơ đồ chuyển hoá dưới đây[17], [2].
Sơ đồ: Sơ đồ chuyển hóa glucose thành acid lactic
Glucose
Glucose - 6 - photphat

Fructose - 6 -

Fructose -1, 6 Photpho dioxyaceton

Photphoglyceraldehyd
Acid - 1,3 - diphotphoglyceric

Acid pyruvic

12
Acid lactic


Cũng có một số tác giả cho rằng lên men lactic đồng hình tiến hành
theo hai giai đoạn:
Giai đoạn 1: thời kỳ sinh trưởng cấp số mũ của vi khuẩn, từ hexoza nhờ
sự oxi hoá photphoglyceraldehyde kèm theo việc khử pividinnucleotide
(PN) để tạo acid photphoglyceriaic.
PCH2 - CHOH + H2O + PN

P. CH2CHOG - COOH + PNH2

Giai đoạn 2: do chất nhận hydro là PN - H2 tăng mà thế oxy hoá khử
của môi trường giảm xuống dẫn đến sự nhường hydro từ PN-H2 cho acid

photphoglycerinic để khử nó thành acid lactic.
CH2OP - CHO - COOH + H2O (PN-H2)

CH3CHOHCOOH + H3PO4+PN+ H2O

Tuỳ thuộc vào tính đặc hiệu quang học của enzym lactate - dehydrogenase
và sự có mặt của lactataxemase mà loại acid lactic dạng nào được tạo ra D
(-), L (+) hoặc DL.
Lên men lactic dị hình[1], [2]
Lên men lactic dị hình là quá trình lên men trong đó ngoài sản phẩm
acid lactic còn tạo ra một lượng đáng kể các sản phẩm phụ như acid acetic,
etanol, acid succinic, CO2,…
Phương trình chung biển diễn quá trình lên men:
C6H12O6CH3CHOHCOOH+HOOC(CH2)COOH+CH3COOH+C2H5OH+CO2…
Trong đó, acid lactic chiếm khoảng 40%, acid succinic khoảng 20%,
rượu etylic và acid acetic 10% các lọai khí 20%.... đôi khi không có các khí
mà thay vào đó là sự tích luỹ một lượng ít acid foocmic. Như vậy, các sản
phẩm phụ khác nhau đáng kể tạo thành trong quá trình lên men lactic dị
hình chứng tỏ rằng quá trình này phức tạp hơn so với lên men lactic đồng hình.
Theo quan điểm tiến hoá sinh lý trong vi sinh vật học người ta cho
rằng lên men lactic đồng hình là hướng tiến hoá độc lập của lên men dị hình.

13


1.2.5. Cơ chế của quá trình lên men lactic
Lên men lactic là một quá trình trao chuyển hóa sinh học kỵ khí làm
biến đổi các hợp chất đường thành acid lactic (chủ yếu) và một số sản
phẩm khác. Các sản phẩm như acid lactic, ethanol, CO2 được vi khuẩn thải
vào môi trường lên men còn các phân tử ATP được giữ lại trong tế bào để

phục vụ cho quá trình trao đổi chất và sinh trưởng của vi sinh vật. Kết quả
là hàm lượng acid lactic tích lũy trong môi trường lên men ngày càng tăng,
làm giảm pH môi trường và kéo theo những biến đổi hóa lý khác [2]. Có
hai kiểu lên men lactic:
Lên men lactic đồng hình hầu như chỉ cho ra sản phẩm là acid lactic.
Lên men lactic dị hình là quá trình lên men lactic ngoài sản phẩm acid
lactic còn có các sản phẩm khác như acid acetic, ethanol, CO 2…
Ngoài ra, trong dịch lên men còn xuất hiện nhiều hợp chất hóa học
mới là sản phẩm trung gian hoặc sản phẩm phụ của quá trình lên men. Một
số hợp chất dễ bay hơi có vai trò quan trọng góp phần hình thành nên mùi vị
đặc trưng cho các sản phẩm lên men lactic. Lượng sản phẩm phụ thu được
hoàn toàn phụ thuộc vào giống vi sinh vật, môi trường dinh dưỡng và điều kiện
ngoại cảnh [2].
1.3. Ứng dụng của Spirulina
1.3.1. Ứng dụng trong thực phẩm
Từ những năm 1970, ở Nhật Bản và ở Mỹ, tảo Spirulina đã đựơc
xem là một loại siêu thực phẩm. Hiện tại, có 2 loại thực phẩm Spirulina: loại
thứ nhất là các viên và dạng con nhộng được làm từ bột Spirulina, loại thứ 2
là thực phẩm chứa Spirulina và các thành phần khác. Ví dụ như mì ăn liền,
các bánh dinh dưỡng, thức uống và bánh bao.
Đến những năm 1990 vấn đề tiêu thụ Spirulina đã phát triển vượt bậc
tại Trung Quốc, Ấn Độ, Châu Á, Bắc Mỹ làm cho Spirulina ngày càng trở

14


nên phổ biến. Gần đây, trên thị trường Việt Nam xuất hiện nhiều chế phẩm
bán ở cửa hàng thực phẩm, siêu thị hoặc cả trong nhà thuốc với thành phần
và công dụng rất gần với thực phẩm dinh dưỡng và thuốc chữa bệnh.
Những chế phẩm đó là sản phẩm giao thoa giữa thực phẩm và thuốc - còn

gọi là thực dược hay thực phẩm chức năng [15]. Đặc biệt trong những
tháng giữa năm 2005 tới nay, các chế phẩm chứa tảo Spirulina đang bán
trong nhóm sản phẩm nêu trên được khá nhiều người chú ý. Thực phẩm
dinh dưỡng được dùng ở dạng nước uống, siro, yaourt, bột dinh dưỡng. Có
thể dùng tảo nguyên chất để uống hoặc trộn vào thức ăn như nấu canh, làm
bánh. Một số nước còn có trà Spirulina. Ở Đức, người ta đã bắt đầu đưa tảo
vào bia, gọi là bia xanh. Cơ thể có thể hấp thụ mỗi ngày 30 - 45g. Dùng
thừa cũng vô hại. Người bị bệnh nặng không ăn được có thể bơm tảo thẳng
vào dạ dày là đủ các chất dinh dưỡng. Ngoài ra, trên thị trường Việt Nam
xuất hiện ở một số cửa hàng thực phẩm, siêu thị một số loại nước giải khát
nhập ngoại được tạo từ tảo xoắn Spirulina [15].
1.3.2. Ứng dụng trong xử lý môi trường
Từ năm 1975, Oswald và cộng sự tại trường Đại Học Tổng Hợp
Califonia đã thử nghiệm dùng Spirulina trong xử lý nước thải công nghiệp và
đi đến kết luận rằng: trong hệ xử lý nước thải Spirulina có vai trò tạo O2, tăng
độ kết lắng, loại trừ kim loại và các chất hữu cơ độc hại. Tảo Spirulina đang
được rất nhiều nước trên thế giới sử dụng để cải tạo nước, xử lý nước thải từ
các nhà máy, nước thải công nghiệp, nước ô nhiễm [15].
Ở Việt Nam hiện nay, quy mô và mức độ ô nhiễm kim loại nặng trong
nước thải công nghiệp đang gia tăng với tốc độ đáng lo ngại. Việc áp dụng
các biện pháp hóa lý như đã nêu thường có giá thành cao, khiến nhiều hoạt
động công nghiệp vẫn tiếp tục thải nước thải chứa kim loại nặng vào môi
trường. Vì vậy nghiên cứu sử dụng vi tảo để loại trừ kim loại nặng trong

15