Nghiên cứu biểu hiện và tinh sạch protein tái tổ hợp glycoprotein (GP5) của vius gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (PRRSV) (LV thạc sĩ)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN VÀ TINH SẠCH
PROTEIN TÁI TỔ HỢP GLYCOPROTEIN (GP5)
CỦA VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN HÔ
HẤP VÀ SINH SẢN Ở LỢN (PRRSV)

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 60 42 02 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thái Nguyên, 2015

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


i

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan bản luận văn là công trình nghiên cứu của tôi dƣới sự
hƣớng dẫn của PGS.TS. Lê Văn Sơn các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là
trung thực và chƣa từng đƣợc công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Tác giả luận văn

Hà Đăng Chiến

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

ii

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Lê Văn Sơn đã tận
tình chỉ bảo và hƣớng dẫn tôi trong suốt quá trình triển khai, nghiên cứu và
hoàn thành luận văn.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các Thầy, Cô giáo – Các nhà
khoa học đã trực tiếp giảng dạy truyền đạt những kinh nghiệm, kiến thức
khoa học quý báu.
Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy cô, đồng nghiệp và bạn bè đã tận
tình giúp đỡ, tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành luận văn này. Tôi luôn
trân trọng và biết ơn sự giúp đỡ hết mình đó.
Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ nghiên cứu thuộc Phòng Công
nghệ DNA ứng dụng - Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học
và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ trong quá trình thực hiện luận văn. Tôi
cũng xin cám ơn Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ gen đã cung cấp
kinh phí, thiết bị cũng nhƣ cho phép tôi sử dụng các kết quả nghiên cứu
thuộc đề tài NV07-PTNTDD2015.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô và các cán bộ của cơ sở đào tạo
thuộc Trƣờng Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã giúp đỡ và tạo
điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập cũng nhƣ quá trình
thực hiện đề tài.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, giúp
đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Tác giả luận văn

Hà Đăng Chiến
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

iii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
Ký hiệu
bp

Tên tiếng Anh
Base Pairs

Tên tiếng Việt
Cặp bazơ nitơ
Cộng sự

CS
DNA

Deoxyribonucleic Acid

dNTP

Deoxynucleoside Triphosphate

E.coli

Escherichia coli

EtBr

Ethidium Bromide

EDTA

Ethylene Diamine Tetraacetic Acid

GP5

Glycoprotein 5

IPTG

Isopropylthio-β-Galactoside

kb

Kilobase

kDa

Kilodalton

LB

Luria Bertani

MES

2-(N-morpholino)Etansulfonic acid

OD

Optical Density

Mật độ quang

PCR

Polymerase Chain Reaction

Phản ứng chuỗi trùng hợp

PRRS

Porcine Reproductive and
Respiratory Syndrome

Hội chứng rối loại hô hấp
và sinh sản ở lợn

PRRSV

Porcine Reproductive and
Respiratory Syndrome virus

Virus gây hội chứng rối loại
hô hấp và sinh sản ở lợn

RNA

Ribonucleic Acid

RNase

Ribonuclease

SDS

Sodium Dodecyl Sulphate

TAE

Tris-Acetate-EDTA

TBS

Tris-Buffered Saline

TTBS

Tween Tris-Buffered Saline

Môi trƣờng dinh dƣỡng cơ
bản nuôi cấy vi khuẩn

Vòng/ phút

v/p
X-gal

5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-BetaD-Galacto-Pyranoside

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


iv

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................. i
LỜI CẢM ƠN ..................................................................................................ii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ............................................................... iii
MỤC LỤC ...................................................................................................... iv
DANH MỤC HÌNH........................................................................................ vi
MỞ ĐẦU ......................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài ......................................................................................... 1
2. Mục tiêu nghiên cứu: ................................................................................... 2
3. Nội dung nghiên cứu: .................................................................................. 2
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................. 3
1.1. Tổng quan về PRRS ................................................................................. 3
1.1.1. Khái niệm PRRS................................................................................. 3
1.1.2. Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn ..................................... 3
1.1.3. Virus gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản (PRRSV) .............. 8
1.2. Protein tái tổ hợp .................................................................................... 11
1.2.1. Giới thiệu .......................................................................................... 11
1.2.2. Glycoprotein (GP5) .......................................................................... 12
1.2.3. Sản xuất protein tái tổ hợp dựa trên ORF5 ...................................... 13
1.2.4. Vector biểu hiện pET 32a(+) và chủng biểu hiện BL21 ................. 14
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................... 16
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

v

2.1. Vật liệu.................................................................................................... 16
2.1.1. Nguyên liệu ....................................................................................... 16
2.1.2. Hóa chất và môi trƣờng .................................................................... 18
2.1.3. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm ......................................................... 19
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ........................................................................ 19
2.2.1. Tạo dòng gen gp5 ............................................................................. 19
2.2.2. Tạo vector tái tổ hợp mang gen gp5 ................................................ 21
2.2.3. Phƣơng pháp biểu hiện và tinh sạch protein GP5 ........................... 25
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................... 29
3.1. Tạo dòng vector mang gen mã hóa protein GP5 .................................... 29
3.2. Thiết kế vector tái tổ hợp mang gen mã hóa protein GP5 ...................... 32
3.3. Biểu hiện và tinh sạch protein GP5 trong E.coli .................................... 34
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................... 41
1. Kết luận ...................................................................................................... 41
2. Đề nghị....................................................................................................... 41
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................. 42

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


vi

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc hệ gen của virus PRRS ................................................... 10
Hình 2.1. Sơ đồ vector tách dòng pBT .......................................................... 16
Hình 2.2. Cấu trúc vector biểu hiện pET 32a(+) ........................................... 17
Hình 3.1. Kết qủa điện di sản phẩm colony - PCR khuẩn lạc mang gen GP5 ...... 30
Hình 3.2. Kết quả cắt kiểm tra và tinh sạch pBT-GP5 .................................. 31

Hình 3.3. Kết quả cắt kiểm tra plasmid pET 32a(+) bằng enzyme cắt giới hạn
SacI và HindIII .............................................................................................. 32
Hình 3.4. Kết quả cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng enzyme cắt giới hạn
SacI và HindIII .............................................................................................. 34
Hình 3.5. Kết quả điện di SDS-PAGE dịch nuôi vi khuẩn mang vector tái
tổ hợp ………. ........................................................................................ 35
Hình 3.6. Kết quả phân tích Western blot với kháng thể anti-His-tag (pha
loãng 1:1000 lần) ........................................................................................... 36
Hình 3.7. Khảo sát nồng độ Imidazol để tinh sạch sản phẩm ...................... 38
Hình 3.8. Kết quả điện di kiểm tra GP5 tinh sạch bằng sắc ký ái lực Ni-NTA..... 39

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


vii

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Tên thiết bị thí nghiệm .................................................................. 19
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR ........................................................... 20
Bảng 2.3. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR ............................................... 20
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng cắt pBT mang gen GP5 ............................. 22
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng cắt pET 32a(+) .......................................... 22
Bảng 2.6. Thành phần phản ứng ghép nối gen .............................................. 24
Bảng 2.7. Thành phần gel điện di protein (SDS-PAGE)............................... 26

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


1

MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS - Porcine
Reproductive and Respiratory Syndrome), tại Việt Nam còn gọi là bệnh “lợn
tai xanh” (Blue Ear), đƣợc xem là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm nhất trên
lợn từng đƣợc ghi nhận trên thế giới và đƣợc ghi nhận lần đầu tiên tại Bắc
Mỹ năm 1987, do lợn mắc bệnh thƣờng bị xung huyết ở tai, lúc đầu đỏ sẫm
sau đó tím xanh. Đặc trƣng của bệnh, với lợn cái, PRRS gây hậu quả nghiêm
trọng nhƣ sảy thai, đẻ non, lợn con sinh ra yếu ớt, chết non, tình trạng bệnh
âm ỉ gây rối loạn sinh sản nhƣ động dục kéo dài, chậm động dục trở lại. Đối
với lợn đực giống, PRRS làm giảm số lƣợng tinh dịch, chất lƣợng tinh dịch
kém, ảnh hƣởng đến tỷ lệ thụ thai và chất lƣợng đàn con [9]. “Lợn tai xanh”
là bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm, do virus PRRS (PRRSV), thuộc họ
Arteriviridae, bộ Nidovirales gây ra. Bệnh lây lan nhanh và làm chết nhiều
lợn nhiễm bệnh [1].
Hiện nay, PRRS đã và đang trở thành dịch ở nhiều nƣớc trên thế giới,
gây tổn thất nặng nề cho nền kinh tế. PRRS lần đầu tiên đƣợc phát hiện ở
Hoa Kỳ vào năm 1987, châu Âu tại Đức năm 1990, tại Hà Lan năm 1991 và
tại châu Á vào đầu những năm 1990 [36]. Tại Việt Nam, PRRSV đƣợc phát
hiện trên đàn lợn nhập từ Mỹ năm 1997 bằng phản ứng huyết thanh học. Gần
đây, từ tháng 3 năm 2007 đến nay, liên tiếp xảy ra các đợt dịch bệnh ở nhiều
địa phƣơng trong cả nƣớc, gây thiệt hại hàng trăm tỷ đồng cho ngành chăn
nuôi do phải tiêu huỷ lợn bệnh nhằm ngăn chặn nguồn virus lây nhiễm [7].
Virus PRRS có tính thích ứng rất cao đối với các đại thực bào ở phổi.
Hệ gen của PRRSV là phân tử RNA sợi đơn dƣơng, có cấu trúc tƣơng tự cấu
trúc của Coronavirus, gồm 7 khung đọc mở gối lên nhau mã hóa cho 7
protein của virus gồm: GP1, GP2, GP3, GP4, GP5, M và N. Trong số đó,
protein GP5 (glycoprotein 5) đƣợc mã hoá bởi ORF5, là một protein đƣợc

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

2

glycosyl hoá, gắn với màng bọc ngoài của PRRSV, có tính kháng nguyên
mạnh và chịu trách nhiệm gây bệnh của virus.
Protein GP5 là đích chủ yếu của các kháng thể trung hoà, tham gia vào
cơ chế “lẩn tránh” đáp ứng miễn dịch cơ thể vật chủ của PRRSV, do ngăn
cản hiện tƣợng trình diện kháng nguyên virus của các đại thực bào với các tế
bào có thẩm quyền miễn dịch trong cả đáp ứng miễn dịch dịch thể và qua
trung gian tế bào (CMI-cell mediated immunity). Ngoài ra, GP5 còn tham
gia hiện tƣợng “chết theo chƣơng trình” (apoptosis) của các tế bào trong cơ
thể bị nhiễm PRRSV. Sự biến đổi của GP5 là một trong những nguyên nhân
làm gia tăng khả năng lây nhiễm và gây bệnh của PRRSV, làm cho bệnh
dịch PRRS ngày càng phức tạp, do làm giảm hiệu quả phòng bệnh của các
vaccine phòng bệnh đang lƣu hành.
Chính vì vậy, nghiên cứu protein tái tổ hợp GP5 của PRRSV là thực
sự cần thiết, giúp cho chẩn đoán xác định bệnh và sản xuất vaccine tái tổ hợp
thế hệ mới nhằm khống chế, giảm bớt thiệt hại do virus PRRSV gây ra.
Từ những cơ sở lý luận khoa học và những nghiên cứu của các nhà khoa
học trong và ngoài nƣớc chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu
biểu hiện và tinh sạch protein tái tổ hợp glycoprotein (GP5) của vius gây
hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (PRRSV)”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Thiết kế đƣợc vector biểu hiện protein tái tổ hợp GP5. Biểu hiện và
tinh sạch đƣợc protein tái tổ hợp GP5 của Porcine Reproductive and
Respiratory Syndrome virus.
3. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu tạo dòng vector mang gen gp5: Dựa trên thông tin về
trình tự nucleotide của gen gp5 đã công bố, thiết kế các cặp mồi phù hợp để

phân lập kiểm tra và nhân gen bằng PCR.

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


3

- Nghiên cƣ́u thi ết kế vector tái tổ hợp pET 32a(+) mang gen mã hóa
cho protein GP5.
- Biểu hiện GP5 trong E. coli BL21 và tinh sạch protein tái tổ hợp (GP5 )
bằng sắc ký ái lực Ni-NTA.
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về PRRS
1.1.1. Khái niệm PRRS
Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (Porcine Reproductive and
Respiratory Syndome, PRRS), là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm cho lợn. Biểu
hiện đặc trƣng là các rối loạn sinh sản ở lợn cái nhƣ sảy thai, thai chết lƣu, lợn
sinh ra chết yểu, cũng nhƣ lợn con theo mẹ và lợn cái hậu bị còn thể hiện viêm
đƣờng hô hấp rất nặng nhƣ: sốt, ho, khó thở, chết với tỷ lệ cao [6], [20]…
Bệnh còn đƣợc gọi bằng một số tên khác nhƣ:
Bệnh bí hiểm ở lợn (Mystery Disease Syndome). Hội chứng vô sinh và
hô hấp ở lợn, viết tắt là SIS (Swine Infertility and Respiratory Syndromde).
Hội chứng hô hấp và sảy thai ở lợn, viết tắt là PEARS (Porcine Endemic and
Respiratory Syndrome). Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn
(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome). Bệnh lợn tai xanh (Blueear Disease).
Năm 1992, Hội nghị quốc tế về bệnh này đƣợc tổ chức tại St. Paul,
Minnesota (Mỹ) đã nhất trí dùng tên hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở
lợn (PRRS) và đƣợc tổ chức Thú Y thế giới công nhận. Bệnh đƣợc gây ra
bởi virus PRRS, tồn tại dƣới dạng hạt virion gây nhiễm.
1.1.2. Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn

* Cơ chế gây bệnh và các phƣơng pháp lan truyền
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


4

Virus gây PRRS có trong dịch mũi, nƣớc bọt, phân và nƣớc tiểu của
lợn ốm hoặc lợn mang trùng và phát tán ra môi trƣờng; tinh dịch của lợn đực
giống nhiễm virus cũng là nguồn lây lan bệnh. Ở lợn cái mang thai, virus có
thể từ mẹ xâm nhiễm sang bào thai và gây bệnh.
Virus gây PRRS có thể xâm nhập vào cơ thể lợn theo đƣờng hô hấp,
tiêu hóa và đƣờng âm đạo. Sau khi xâm nhập, đích tấn công chủ yếu của
virus là các đại thực bào ở phế nang. Đây là tế bào duy nhất có receptor phù
hợp với cấu trúc hạt của virus, vì thế chúng hấp thụ và thực hiện quá trình
nhân lên chỉ trong loại tế bào này và phá hủy nó. Ở lợn mắc bệnh, một tỷ lệ
lớn các tế bào đại thực bào trong nang phổi bị virus xâm nhập rất sớm và phá
hủy làm giảm khả năng phòng vệ của phổi. Lúc đầu, PRRSV có thể kính
thích sự tăng sinh của đại thực bào nhƣng sau 2-3 ngày, virus này sẽ giết chết
chúng, các virion đƣợc giải phòng ồ ạt xâm nhiễm sang các tế bào khác, tiếp
tục quá trình nhân lên và phá hủy đại thực bào. Trong cơ thể lợn ốm do mắc
PRRS có tới 40% tế bào đại thực bào bị virus giết chết [17]. Trong hệ thống
miễn dịch của cơ thể, đại thực bào đóng vai trò vô cùng quan trọng, cả trong
đáp ứng miễn dịch đặc hiệu và không đặc hiệu, đây là loại tế bào trình diện
kháng nguyên thiết yếu. Khi đại thực bào bị phá hủy bởi PRRSV mở đầu cho
quá trình miễn dịch không xảy ra đƣợc, cơ thể lợn rơi vào trạng thái suy
giảm miễn dịch và dễ dàng mắc các bệnh nhiễm trùng thứ phát, điều này có thể
thấy rõ ở những đàn lợn vỗ béo chuẩn bị giết thịt, khi bị nhiễm PRRSV sẽ có sự
tăng đột biến về tỷ lệ viêm phổi kế phát do những vi khuẩn vốn sẵn có trong
đƣờng hô hấp nhƣ Mycoplasma hyopneumoniae, P. multocida, S. suis, A.
pleuropneumoniae... Tiêu Quang An và Nguyễn Hữu Nam (2011) [1] khi xác

định một số vi khuẩn kế phát gây chết lợn trong vùng dịch PRRS ở huyện
Văn Lâm, tỉnh Hƣng Yên năm 2010 đã cho thấy lợn mắc PRRS thƣờng kế
phát bệnh do các nhóm vi khuẩn đƣờng hô hấp và đƣờng ruột nhƣ A.
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


5

pleuropneumoniae, P. multocida, S.suis, Escherichia coli, Salmonella sp,
Clostridium

perfringens.

Kết

quả

phân

lập

đƣợc

vi

khuẩn

A.

pleuropneumoniae với tỷ lệ cao nhất 63.33% và thấp nhất là P. multocida

10%[2]. Các tác giả nhận định các nhóm vi khuẩn kế phát trên đã làm cho
dịch PRRS trầm trọng và phức tạp hơn.
* Các biện pháp phòng bệnh
Hiện nay chƣa có thuốc điều trị đặc hiệu lợn mắc PRRS, do vậy việc
phòng bệnh bằng vaccine và vệ sinh phòng bệnh, tiêu độc khử trùng hiện
đang là hai biện pháp hữu hiệu ở nhiều cơ sở chăn nuôi lợn. Để chủ động
phòng chống dịch, cần thực hiện đồng bộ, kiên quyết các giải pháp phòng,
chống dịch nhƣ: Phát hiện sớm, bao vây xử lý kịp thời các ổ dịch; công tác
tuyên truyền thực hiện sâu rộng tới các ngành, các cấp và ngƣời dân tham gia
chăn nuôi; đặc biệt có sự chỉ đạo quyết liệt của chính quyền các cấp từ Trung
ƣơng tới các địa phƣơng. Trƣờng hợp có tỷ lệ lợn trong đàn kiểm tra huyết
thanh dƣơng tính cao thì tiêu hủy là phƣơng pháp hiệu quả. Tuy nhiên,
phƣơng pháp tiêu hủy rất tốn kém và có thể dẫn đến mất đi những giống
thuần. Điều này cho thấy trong chăn nuôi lợn việc chẩn đoán sớm những con
lợn mang trùng mà chƣa có dấu hiệu lâm sàng là rất cần thiết và cấp bách.
Các biện pháp quản lý không đƣợc kết hợp để cải thiện điều kiện chăn nuôi
thì nguy cơ dịch viêm phổi vẫn sẽ tồn tại [35].
* Tình hình dịch bệnh trên thế giới và ở Việt Nam
+ Trên thế giới
Từ năm 2005 trở lại đây, 27 nƣớc và vùng lãnh thổ thuộc tất cả các
châu lục trên thế giới đã báo cáo cho Tổ chức Thú y thế giới khẳng định phát
hiện có bệnh Tai xanh lƣu hành.
Hiện nay, hội chứng này đã trở thành dịch địa phƣơng ở nhiều nƣớc
trên thế giới, kể cả các nƣớc có ngành chăn nuôi lợn phát triển nhƣ Mỹ, Hà
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


6

Lan, Đan Mạch, Anh, Pháp, Đức... và đã gây ra những tổn thất rất lớn về

kinh tế cho ngƣời chăn nuôi lên đến hàng trăm triệu đô la [27]. Nhƣ hàng
năm Mỹ phải chịu tổn thất cho bệnh Tai xanh gây ra khoảng 560 triệu USD.
Các nƣớc trong khu vực có tỷ lệ bệnh Tai xanh lƣu hành rất cao. Ở Trung
Quốc là 80%. Đài Loan là 94,7% - 96,4%, Philippine là 90%, Thái Lan là
97%, Malaysia là 94%, Hàn Quốc là 67,4% - 73,1%[5].
Tại Trung Quốc: Theo báo cáo của đoàn chuyên gia quốc tế và chuyên
gia của Trung Quốc đã đƣợc phát hành vào tháng 12/2007, kể từ năm 2006,
đàn lợn của Trung Quốc đã bị ảnh hƣởng nghiêm trọng bởi "Hội chứng sốt
cao ở lợn" do nhiều nguyên nhân, trong đó chủ yểu là virus PRRS và các loại
mầm bệnh này đã làm hàng triệu lợn bị ốm, chết và phải tiêu hủy. Kết quả
nghiên cứu toàn diện của Trung Quốc đã khẳng định chủng virusPRRS gây
bệnh tại nƣớc này là chủng độc lực cao, đặc biệt có sự biến đổi của virus
(thiếu hụt 30 acid amin trong gen). Năm 2007, các tỉnh Anhui, Hunan,
Guangdong, Shandong, Liaoning, Jilin và một số tỉnh khác bị ảnh hƣởng
nặng buộc Trung Quốc phải tiêu hủy tới 20 triệu lợn để ngăn chặn dịch lây
lan. Trƣớc diễn biến phức tạp của dịch Tai xanh, Bộ Nông Nghiệp Trung
Quốc đang thực hiện chƣơng trình phòng chống bệnh rất quy mô, riêng
chƣơng trình nghiên cứu, sản xuất vaccine đã đƣợc cam kết chi khoảng 280
triệu Nhân dân tệ tƣơng đƣơng với 36,5 triệu USD [25].
Tại Hồng Kông và Đài Loan đã xác định có cả hai chủng Châu Âu và
Bắc Mỹ cùng lƣu hành, đặc biệt trong cùng một con lơn ở Hồng Kông đã
xác định nhiễm cả hai chủng nêu trên; dịch Tai xanh cũng đƣợc thông báo ở
Thái Lan từ các năm 2000 - 2007. Thông báo cho biết các virus gây bệnh
Tai xanh đƣợc phân lập từ nhiều địa phƣơng thuộc nƣớc này gồm cả chủng
dòng châu Âu và chủng dòng Bắc Mỹ. Trong đó, số virus thuộc chủng dòng
châu Âu chiếm 66,42%, còn các virus thuộc chủng dòng Bắc Mỹ chiếm
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


7

33,58%. Phần lớn ở những quốc gia này hiện còn đang lƣu hành virus gây
bệnh Tai xanh chủng châu Âu hoặc Bắc Mỹ, là những chủng virus cổ điển
độc lực thấp [13].
Tháng 9/2007, Nga là nƣớc thứ 3 đã báo cáo chính thức có dịch bệnh
Tai xanh do chủng virus PRRS thể độc lực cao gây [16].
+ Tại Việt Nam
Ở Việt Nam, bệnh đƣợc phát hiện lần đầu tiên vào năm 1997 trên đàn
lợn nhập từ Mỹ vào các tỉnh phía Nam, 10 trong số 51 con có huyết thanh
dƣơng tính với PRRS và cả đàn đƣợc tiêu hủy ngay [6]. Tuy nhiên, theo điều
tra ở một số địa bàn thuộc thành phố Hồ Chí Minh và các tỉnh lân cận cho
thấy 25% mẫu huyết thanh lợn có kháng thể virut PRRS (596/2308 mẫu) và
5/15 trại (chiếm 33%) có lƣu hành huyết thanh bệnh lợn Tai xanh. Năm
2003, tỷ lệ huyết thanh dƣơng tính với bệnh tai xanh trên lợn nuôi tập trung
ở Cần Thơ là 66,86%. Nhƣ vậy, PRRS đã đƣợc phát hiện ở Việt Nam từ năm
1997, tuy nhiên, từ năm 1997 đến trƣớc tháng 3 năm 2007 chƣa phát hiện
các ổ dịch lâm sàng trên đàn lợn. Việc xảy ra các ổ dịch lần đầu ở các tỉnh
phía Bắc có liên quan đến tình hình dịch ở các nƣớc láng giềng. Theo thông
báo của các tổ chức quốc tế, trong năm 2006, dịch xảy ra nghiêm trọng ở
một số nƣớc trong khu vực. Từ tháng 3 năm 2007 đến nay, liên tiếp xảy ra
các đợt dịch bệnh ở nhiều địa phƣơng trong cả nƣớc, gây thiệt hại hàng trăm
tỷ đồng cho ngành chăn nuôi do phải tiêu huỷ lợn bệnh nhằm ngăn chặn
nguồn virus lây nhiễm. Mặc dù chƣa có những nghiên cứu cụ thể về tốc độ
lây lan của virus, nhƣng quan sát dịch tễ học đợt dịch lần thứ nhất (tháng 3, 4
năm 2007) cho thấy chỉ một thời gian ngắn sau khi Hải Dƣơng có dịch thì
sáu tỉnh lân cận của vùng đồng bằng Bắc Bộ là Hƣng Yên, Quảng Ninh,
Thái Bình, Bắc Ninh, Bắc Giang, Hải Phòng. Số lợn mắc bệnh 31.750 con,
số lợn chết và xử lý 7.296 con [15].
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

8

1.1.3. Virus gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản (PRRSV)
Qua nghiên cứu giải mã gen của virus tại Mỹ và Trung Quốc cho thấy
các chủng PRRSV tại Việt Nam có mức tƣơng đồng về amino acid từ 99%
đến 99,7% so với chủng virus gây bệnh thể độc lực cao ở Trung Quốc và đều
bị mất 30 axít amin. Điều này cho thấy các chủng PRRSV ở nƣớc ta hiện nay
thuộc dòng Bắc Mỹ, có độc lực cao giống chủng ở Trung Quốc [16].
Nhiều nghiên cứu của các tác giả trong nƣớc từ năm 2009 đến nay đã
nhận định PRRSV tại Việt Nam hiện nay đƣợc xác định thuộc chủng Bắc
Mỹ dòng Trung Quốc [3], [8], [10], [14].
 Đặc tính sinh học của virus
Virus gây PRRS rất thích hợp với đại thực bào, đặc biệt là đại thực
bào hoạt động ở vùng phổi. Virus nhân lên ngay bên trong đại thực bào, sau
đó phá huỷ và giết chết đại thực bào (tới 40%). Đại thực bào bị giết chết nên
sức đề kháng của lợn mắc bệnh bị suy giảm nghiêm trọng. Do vậy lợn mắc
PRRS thƣờng dễ bị nhiễm khuẩn thứ phát. Virus không gây ngƣng kết với
các loại hồng cầu gà, dê, thỏ, chuột, hồng cầu type O của ngƣời. Virus phát
triển tốt trên môi trƣờng tế bào đại thực bào phế nang lợn, trên tế bào dòng
CL 2621, tế bào MA 140 với bệnh tích phá huỷ tế bào, sau 2- 6 ngày tế bào
co tròn, tập trung thành cụm dày lên, nhân co lại cuối cùng bong ra [17]. Tuy
có một số khác biệt về di truyền và kiểu hình nhƣng các chủng virus Bắc Mỹ
và các chủng virus Châu Âu lại cùng gây ra các triệu chứng lâm sàng về hô
hấp và sinh sản ở lợn rất giống nhau. Dựa vào những kết quả nghiên cứu tổn
thƣơng đại thể và vi thể của tổ chức phổi lợn mắc bệnh, ngƣời ta chia ra hai
nhóm virus là nhóm virus có độc lực cao và nhóm virus có độc lực thấp.
Nhóm virus có độc lực cao thƣờng gây ra các tổn thƣơng ở tổ chức phổi lợn
bệnh nặng hơn nhóm virus có độc lực thấp. Năm 2007, Kegong Tian và Yu
khi nghiên cứu về sự biến đổi về độc lực của PRRSV tại Trung Quốc cho

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


9

rằng virus đã có sự biến đổi về độc lực và hậu quả lợn nhiễm virus này có tỷ
lệ chết cao, trên 20% trong tổng số nhiễm bệnh [34].
 Sức đề kháng và khả năng gây bệnh của virus
+ Sức đề kháng của virus.
Virus gây PRRS có thể tồn tại một năm ở nhiệt độ lạnh từ -20 đến -70
o

C; trong điều kiện 4oC virus có thể sống một tháng; nhiệt độ cao virus đề

kháng kém ở 37oC chịu đƣợc 48 giờ, 56oC bị chết sau một giờ, virus thích
hợp ở pH 5 -7. Với các chất sát trùng thông thƣờng và môi trƣờng có pH
axit, virus dễ dàng bị tiêu diệt. Dƣới tác động của ánh nắng mặt trời hoặc tia
tử ngoại vô hoạt virus nhanh chóng [10], [12].
+ Khả năng gây bệnh của virus
Ngƣời và các động vật khác không mắc PRRS, tuy nhiên trong các loài
thuỷ cầm chân màng có vịt trời (Mallard duck) lại mẫn cảm. Virus có thể nhân
lên ở loài động vật này và chính đây là nguồn reo rắc mầm bệnh trên diện rộng
nên rất khó khống chế [18]. Virus gây bệnh cho lợn ở tất cả các lứa tuổi, nhƣng
lợn con và lợn cái mang thai thƣờng mẫn cảm hơn cả. Lợn rừng là động vật
mang trùng và có thể coi là nguồn dịch thiên nhiên [12]. Về độc lực, các nghiên
cứu cho thấy virus gây PRRS tồn tại dƣới 2 dạng đó là dạng cổ điển và dạng
biến thể độc lực cao. Dạng cổ điển có độc lực thấp, ở dạng này khi lợn mắc
bệnh thì có tỷ lệ chết thấp, chỉ từ 1 - 5% trong tổng đàn. Dạng biến thể độc lực
cao gây nhiễm bệnh cho lợn lây lan nhanh, trầm trọng và chết nhiều [34].
+ Cấu trúc và chức năng của virus

Cấu trúc:

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


10

Hình 1.1. Cấu trúc hệ gen của virus PRRS
Dƣới kính hiển vi điện tử PRRSV là loại có vỏ bọc, hình cầu, có kích
thƣớc từ 45 - 80 nm, chứa nhân nucleocapsid có kích thƣớc từ 25 - 35 nm,
trên bề mặt có gai nhô ra rõ, có vỏ là lipid [17]. Virus gây PRRS là ARN
virus với bộ gen là một phân tử ARN sợi đơn dƣơng, có những đặc điểm
chung của nhóm Arterivirus. Sợi ARN này có kích thƣớc khoảng 15
kilobase, có chín ORF (open reading frame) mã hoá cho chín protein cấu
trúc. Tuy nhiên, có sáu phân tử protein chính có khả năng trung hoà kháng
thể bao gồm bốn phân tử glycoprotein, một phân tử protein xuyên màng (M)
và một protein nucleocapsid (N) [12]. Qua các nghiên cứu cho thấy sợi đơn
RNA của virus bao gồm một bộ gen có khoảng 15 kb, mã hóa 9 ORFs [7].
Bộ gen PRRSV bao gồm hai gen ORF1a và ORF1b là polymerase và bẩy
gen cấu trúc là ORF2a, 2b, 3, 4, 5, 6 và 7. ORF1a và ORF1b cấu thành
khoảng 75% bộ gen của virus và đƣợc đặc trƣng bởi một quá trình khung
ribosome chuyển dịch thành một polyprotein lớn mà sự phân tách làm phát
sinh các protein không cấu trúc (NSP) bao gồm cả RNA phụ thuộc
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


11

Polymerase. Các khung đọc mở ORF2a, 3, 4 và 5 tất cả mã hóa cho các
protein glycosyl hóa là GP2a, GP3, GP4, GP5 tƣơng ứng. Các ORF2b mới

đƣợc định nghĩa mã hóa các protein nhỏ nhất của các hạt virus đƣợc chỉ định
GP2b. ORF7 mã hóa các protein nuclocapsid không glycosyl hóa (N) [24].
- Chức năng:
ORF1a và ORF1b nằm ở đầu 5’ của genome, chiếm hơn hai phần ba
bộ gen và mã hóa cho RNA Polymerase của virus đƣợc xem là protein chịu
trách nhiệm trong quá trình nhân lên của virus.
ORF2 đến ORF7 nằm ở phía sau của ORF1b, ở đầu 3’ của genome,
mã hóa cho các protein cấu trúc liên quan đến việc hình thành virion.
Sản phẩm của các ORF 5, 6, 7 bao gồm các protein chính của virus.
Cho đến nay ngƣời ta đã xác định đƣợc 3 protein cấu trúc chính của PRRS
đó là: Protein nhân (N-nucleocapsid) trọng lƣợng phân tử khoảng 15 kDa
định bởi ORF7, protein màng (M-membrane) trọng lƣợng khoảng 19 kDa
quy định bởi ORF6 và protein vỏ glycoprotein (E-envelope, GP5) trọng
lƣợng khoảng 24-25 kDa quy định bởi ORF5. Những nghiên cứu gần đây
cho thấy rằng ORF 2, 3 và 4 của Lelystad virus(LV), chủng Châu Âu của
PRRS virus có lẽ mã hóa cho 3 membrane-associated glycoprotein khác là:
29-30 kD GP2, 45-50 kD GP3, 31-35kD GP4 [22], [23], [33].
1.2. Protein tái tổ hợp
1.2.1. Giới thiệu
Hiện nay nhu cầu sử dụng kháng nguyên là protein trong chuẩn đoán
bệnh lý cũng nhƣ sản xuất vaccine là rất cao. Tuy nhiên, PRRSV thƣờng khó
nuôi trên môi trƣờng tế bào. Chúng chỉ phát triển tốt trên môi trƣờng đại thực
bào túi phổi heo (PAM) và một số dòng tế bào thận khỉ Châu Phi. Hiện tại

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


12

ngƣời ta chƣa thành công trong việc tuyển lựa các dòng tế bào này trong nuôi

cấy nhân tạo. Các dòng tế bào thận khỉ thƣờng không nhạy cảm cho tất cả các
chủng virus PRRS. Chính vì thế phƣơng pháp sản xuất protein tái tổ hợp cho
PRRSV là hƣớng đi đúng và mang lại nhiều ƣu điểm, đặc biệt sản xuất protein
tái tổ hợp mã hóa bởi ORF5 mang tính ứng dụng cao trong các thử nghiệm
nhƣ dùng làm vật liệu trong các kit chẩn đoán, tạo vaccine tái tổ hợp thế hệ
mới… Sản xuất protein tái tổ hợp mở ra khả năng tạo số lƣợng lớn kháng
nguyên dùng làm vật liệu trong chẩn đoán nhất là khi dịch bệnh bùng phát.
Sản xuất protein tái tổ hợp cũng góp phần khắc phục đƣợc nhƣợc điểm hiện
tại là khó nuôi cấy PRRSV trên môi trƣờng tế bào nhƣ đã nêu ở trên.
1.2.2. Glycoprotein (GP5)
ORF5 của PRRSV mã hóa cho protein vỏ GP5 có kích thƣớc khoảng
25 kDa. GP5 nằm trên bề mặt màng virus chính là vị trí tiếp xúc của PRRSV
khi nó nhiễm vào vật chủ. GP5 là một trong những glycoprotein vỏ phong
phú và đa dạng nhất, là một tác nhân gây cảm ứng chính của kháng thể trung
hòa trong cơ thể. Nó bao gồm ba vị trí glycosylation đƣợc cho là N-linked
N34, N44, N51 nơi mà vị trí trung hòa virus đƣợc đặt tại đó [21]. Plagemann
và cs (2002) đã sử dụng bản đồ peptit để chỉ ra rằng các vị trí trung hòa virus
chính của PRRSV đƣợc đặt tại vị trí giữa của GP5 từ acid amin 36 đến 52.
GP5 đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ chống lại PRRSV. Vì vậy
GP5 rất đƣợc quan tâm nghiên cứu trong việc phân tích dịch tễ học và tiến
hóa phân tử cũng nhƣ biến đổi vật liệu di truyền của chủng virus này. Điển
hình là các peptide tín hiệu, vùng ngoại bào virus, vùng xuyên màng và vùng
nội bào virus, các điểm trung hòa virus và những đột biến quan trọng: 13 (R
 Q), 151 (R  G). Đây là những mô hình có vai trò quan trọng làm thay
đổi yếu tố ảnh hƣởng đến độc lực virus. Hai đột biến trên OFR5 đƣợc xem là
chỉ thị cho độc lực của chủng vaccine, đó là đột biến R13 thành Q13 và
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


13

R151 thành G151. Đột biến Q13 nằm trên trình tự peptide tín hiệu giả định là
trình tự sẽ bị loại bỏ sau dịch mã. Đột biến này có thể ảnh hƣởng đến sự vận
chuyển GP5 đến màng của mạng lƣới nội chất. Sự thay đổi G151 nằm trên
phần ƣa nƣớc của glycoprotein, đây là một trong những dấu hiệu đột biến
liên quan đến sự suy yếu của PRRSV.
Protein GP5 đóng vai trò quan trọng trong việc nhận biết, xâm lấn,
phản ứng miễn dịch của bệnh lợn tai xanh. Đây là một đối tƣợng đƣợc dùng
để nghiên cứu và đã đƣợc một số công trình phân lập, thiết kế biểu hiện
thành công trên E.coli [27], [32].
1.2.3. Sản xuất protein tái tổ hợp dựa trên ORF5
Protein tái tổ hợp đƣợc sản xuất bằng cách chèn gen ORF5 mã hóa
cho protein GP5 vào sau promoter của pET 32a(+). Kết quả tạo ra plasmid
tái tổ hợp là pET 32a(+)/GP5, có thể biểu hiện đƣợc protein có kích thƣớc
25kDa trong tế bào E.coli chủng BL21. Protein này có kích thƣớc tƣơng tự
với kích thƣớc protein GP5 biểu hiện trong tế bào túi phổi heo và vẫn giữ
đƣợc cấu trúc kháng nguyên của Protein GP5 tự nhiên. Hiện nay ngƣời ta tập
trung hƣớng nghiên cứu ứng dụng protein tái tổ hợp dựa trên ORF5 của virus
PRRS trong sản xuất vaccine vì protein GP5 đƣợc quy định bởi ORF này
có chứa những epitope trung hòa chính quan trọng của PRRSV [25].
Để tăng cƣờng đáp ứng miễn dịch của vật chủ đối với kháng nguyên
của PRRSV, các vector tái tổ hợp biểu hiện các protein của virus đƣợc gắn
với các protein khác nhau hoặc cùng biểu hiện nhiều protein của virus
cùng lúc. Chuột tiêm GP5 và M biểu hiện từ vector replication-defective
adenovirus có hàm lƣợng kháng thể trung hòa cao hơn đáng kể so với chuột
chỉ tiệm vector biểu hiện GP5 hoặc M riêng rẽ [35].

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

14

1.2.4. Vector biểu hiện pET 32a(+) và chủng biểu hiện BL21
- Vector biểu hiện pET 32a(+)
Hệ thống vector hiểu hiện pET cho phép dòng hóa và biểu hiện protein
tái tổ hợp ở dạng dung hợp với một homo oligohistidine (6xHis) trong tế bào
E. coli. Sự biểu hiện của gen mục tiêu đƣợc kiểm soát bởi promotor T7 và
nhờ hoạt tính của T7 RNA Polymerase của tế bào chủ đƣợc biến đổi bởi
phage T7. Vector biểu hiện này chứa đoạn DNA mã hóa oligohistidine gọi là
His-tag, đoạn này có thể chứa 6, 8 hoặc 10 acid amin. Vector biểu hiện pET
32a(+) có đầy đủ các yếu tố di truyền đảm bảo chức năng cơ bản của một
plasmid nhƣ: sao mã, phiên mã độc lập và ổn định qua các thế hệ tế bào.
Ngoài ra, hệ vector pET 32a(+) còn có nhiều đặc điểm quan trọng, vƣợt trội
hơn so với các hệ biểu hiện khác.
Gen ngoại lai đƣợc điều khiển bởi promoter T7 – đây là promoter
mạnh và có tính đặc hiệu cao, có khả năng biểu hiện protein ngoại lai lớn
chiếm 10 – 30 % tổng số protein tế bào, có độ nhạy cao với các chất cảm ứng
nên có thể điều khiển dễ dàng sự biểu hiện của gen ngoại lai. Không giống
nhƣ các promoter khác có nguồn gốc từ tế bào E. coli, T7 RNA Polymerase
là một enzyme hoạt động rất mạnh, có tốc độ kéo dài chuỗi nhanh gấp 5 lần
so với các RNA Polymerase có nguồn gốc từ E. coli.
Trên vector đã thiết kế một đoạn gen Trx mã hóa protein Thioredoxin.
Thioredoxin đƣợc phân lập đầu tiên từ E. coli và tìm thấy ở nấm, virus, vi
khuẩn, thực vật…Trong hệ biểu hiện E. coli, Thioredoxin chiếm khoảng
40% tổng protein của tế bào, là một protein oxi hóa khử có khối lƣợng phân
tử 19,5kDa, đƣợc biết đến trong tất cả các sinh vật, đóng vai trò quan trọng
trong nhiều quá trình sinh học bao gồm cả tín hiệu oxi hóa khử.
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

15

Thioredoxin góp phần làm tăng khả năng biểu hiện của gen ngoại lai
khi dung hợp. Ngoài ra vị trí cắt của enterokinase đƣợc thiết kế trƣớc vùng
đa điểm cắt tách protein tái tổ hợp ra khỏi Thioredoxin.
Tất cả các ƣu điểm trên cho thấy pET 32a(+) không chỉ thiết kế riêng
cho việc biểu hiện gen ngoại lai mà còn thuận lợi cho việc tinh sạch trong
quá trình thu nhận protein tái tổ hợp.
- Chủng biểu hiện E.coli BL21 [31]
Hệ gen của chủng E. coli BL21 đã đƣợc cải biến một số gen là opmT,
hsdS, gal, dcm, λ DE3:
Gen ompT: là một gen mã hóa cho protease nằm trên màng ngoài tế
bào, chủng khuyết gen ompT giúp tránh việc các protein tái tổ hợp bị phá
hủy ngay trong tế bào.
Gen hsdS: là một gen có chức năng phân giải plasmid ngoại lai xâm
nhập tế bào chủ, chủng BL21 khuyết hsdS để quá trình biến nạp vector tái tổ
hợp đƣợc hiệu quả hơn.
Gen gal: chủng BL21 (DE3) khuyết gen gal giúp tránh việc tế bào sử
dụng galactose làm nguồn cacbon cho sinh trƣởng.
Gen dcm: là gen methyl hóa trình tự (CCAGG và CCTGG), chủng
khuyết gen dcm tránh việc trình tự gen ngoại lai bị methyl hóa dẫn đến sai
khác trong việc biểu hiện protein tái tổ hợp.
T7 RNA Polymerase (λDE3 và lacUV5): BL21 (DE3) có hệ promoter
lacUV dùng để điều khiển quá trình biểu hiện, đây là promoter đã đƣợc đột biến,
và đƣợc tạo ra từ phage λ, promoter này mạnh hơn bất kỳ promoter của hệ biểu
hiện vi khuẩn tự nhiên nào.

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

16

Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
2.1.1. Nguyên liệu
Gen mã hóa cho glycoprotein (GP5) của vius Porcine Reproductive
and Respiratory Syndrome (PRRSV) do Phòng Công nghệ tế bào thực vật –
Viện Công nghệ sinh học cung cấp.
Vector tách dòng pBT do Phòng Công nghệ tế bào thực vật – Viện
Công nghệ sinh học cung cấp.

Hình 2.1. Sơ đồ vector tách dòng pBT

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


17

Vector biểu hiện pET 32a(+) do Phòng Công nghệ tế bào thực vật –
Viện Công nghệ sinh học cung cấp.

Hình 2.2. Cấu trúc vector biểu hiện pET 32a(+)

Tế bào khả biến E.coli chủng DH5 (α) và chủng BL21 (DE3) do Viện
công nghệ sinh học cung cấp.

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN