Nghiên cứu sàng lọc và các đặc tính sinh học của một số nấm đảm trong sinh tổng hợp EPS, kháng vi sinh vật, tạo laccase từ các vùng sinh thái khác nhau (LV thạc sĩ)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
-----------***----------

HOÀNG THỊ NHUNG

NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC VÀ CÁC ĐẶC TÍNH SINH
HỌC CỦA MỘT SỐ NẤM ĐẢM TRONG SINH TỔNG
HỢP EPS, KHÁNG VI SINH VẬT, TẠO LACCASE
TỪ CÁC VÙNG SINH THÁI KHÁC NHAU

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Hà Nội, 2015


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
-----------***---------HOÀNG THỊ NHUNG

NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC VÀ CÁC ĐẶC TÍNH SINH
HỌC CỦA MỘT SỐ NẤM ĐẢM TRONG SINH TỔNG
HỢP EPS, KHÁNG VI SINH VẬT, TẠO LACCASE
TỪ CÁC VÙNG SINH THÁI KHÁC NHAU
Chuyên ngành: Vi Sinh Vật
Mã số: 60420103

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

PGS. TS. Đặng Thị Cẩm Hà

Hà Nội, 2015


Luận văn Thạc sĩ sinh học

Hoàng Thị Nhung- CHK17

LỜI CẢM ƠN
Trước hết, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới PGS. TS. Đặng Thị
Cẩm Hà đã kiên trì chỉ bảo, quan tâm hướng dẫn và dìu dắt tôi trong suốt quá trình học
tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, giúp tôi có thêm nhiều kiến thức và kinh nghiệm
quý báu trong nghiên cứu khoa học.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban Lãnh đạo Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật,
Ban giám hiệu Trường Đại học Thái Nguyên, cùng các Thầy cô giáo đã tham gia giảng
dạy trong suốt khóa học.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới TS. Đinh Thị Thu Hằng cùng tập thể cán bộ của
phòng Công nghệ sinh học tái tạo môi trường và các nghiên cứu sinh đã tận tình giúp đỡ
tôi lấy mẫu và trong suốt quá trình thực hiện luận văn.
Tôi cũng xin cảm ơn đến PGS. TS Thành Thị Thu Thủy đã giúp đỡ tôi bổ trợ
thêm những kiến thức mới. Cảm ơn GS. Bram Brouwer và công ty BioDetection
Systems B.V- BDS, Hà Lan đã thực hiện các phân tích sử dụng công nghệ DR-CALUX
để có kết quả mới trong luận văn này.
Cuối cùng, tôi xin dành lời cảm ơn tới chồng và con trai - là chỗ dựa tinh thần và
những người thân trong gia đình là chỗ dựa vững chắc, động viên, giúp đỡ trong suốt
thời gian qua.
Một lần nữa, xin chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quý báu đó !
Hà Nội,

tháng 12 năm 2015

Học viên cao học

Hoàng Thị Nhung

Trang i


Luận văn Thạc sĩ sinh học

Hoàng Thị Nhung- CHK17

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi.
Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố
trong bất kỳ công trình nào khác.

Tác giả luận văn

Hoàng Thị Nhung

Trang ii


Luận văn Thạc sĩ sinh học

Hoàng Thị Nhung- CHK17

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ..................................................................................................................... i
LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................................. ii
MỤC LỤC ........................................................................................................................ iii
BẢNG CHỮ VIẾT TẮT................................................................................................... vi
DANH MỤC CÁC BẢNG ............................................................................................. viii
DANH MỤC CÁC HÌNH................................................................................................. ix
MỞ ĐẦU ............................................................................................................................1
PHẦN 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................................3
1.1. Tổng quan về nấm ăn và nấm dược liệu (MMS).................................................3
1.2. Lịch sử nghiên cứu và sử dụng nấm ....................................................................5
1.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới...........................................................5
1.2.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam ...........................................................7
1.3. Polysaccharide từ nấm- nguồn carbonhydrate có hoạt tính sinh học tự nhiên ....8
1.4. Tách chiết và xác định các đặc tính của polysaccharide từ nấm .........................9
1.5. Đặc điểm cấu trúc của polysaccharide phân lập từ nấm ...................................11
1.6. Phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) trong nghiên cứu cấu trúc của
polysaccharide ...................................................................................................12
1.7. Tính chất vật lý của polysaccharide ..................................................................15
1.7.1. Khối lượng phân tử của polysaccharide ................................................15
1.7.2. Độ hòa tan của polysaccharide từ nấm ..................................................15
1.8. Vai trò của polysaccharide từ nấm đối với sức khỏe ........................................16
1.8.1. Tính kháng u, điều trị ung thư và miễn dịch của polysaccharide ..........16
1.8.2. Hạ lipid máu và hạn chế đường huyết ...................................................20
1.8.3. Tính chống oxy hóa của polysaccharide từ nấm....................................21
1.8.4. Prebiotic từ nấm .....................................................................................22
1.8.5. Tính kháng virus của polysaccharide từ nấm ........................................23
1.8.6. Hoạt tính kháng khuẩn của polysaccharide từ nấm ...............................24
1.9. Laccase và ảnh hưởng của nó đến sức khỏe con người ....................................26
Trang iii

Luận văn Thạc sĩ sinh học

Hoàng Thị Nhung- CHK17

1.9.1. Tổng quan về laccase .............................................................................26
1.9.2. Ứng dụng của laccase trong lĩnh vực bảo vệ sức khỏe ..........................27
1.10. Phương pháp phân tích sàng lọc DR-Calux...................................................28
PHẦN 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ....................................................................35
2.1. Vật liệu ...............................................................................................................35
2.1.1. Vi sinh vật ..............................................................................................35
2.1.2. Hóa chât và thiết bị ................................................................................35
2.2. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................................36
2.2.1. Phương pháp phân lập các chủng nấm ...................................................36
2.2.2. Phương pháp phân loại nấm dựa vào trình tự xác định trình tự ITS .....36
2.2.3. Chuẩn bị giống .......................................................................................37
2.2.4. Phương pháp xác định sinh khối và hàm lượng exopolysaccharide ......37
2.2.5. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme laccase...................................37
2.2.6. Đánh giá ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh
trưởng và sinh tổng hợp polysaccharide và enzyme laccase ................38
2.2.6.1. Đánh giá anh hưởng của pH .......................................................38
2.2.6.2. Đánh giá ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy ...............................38
2.2.6.3. Đánh giá ảnh hưởng của nguồn nitơ ...........................................39
2.2.6.4. Đánh giá ảnh hưởng của nguồn carbon ......................................39
2.2.7. Xác định hàm lượng protein, carbonhydrate tổng số của EPS thô ........39
2.2.8. Đánh giá khả năng kháng vi sinh vật kiểm định ....................................40
2.2.9. Xác định thành phần của polysaccharide .............................................41
2.2.10. Xác định hoạt tính của EPS và sinh khối nấm lên một số chức năng
của tế bào .............................................................................................41

PHẦN 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..........................................................................44
3.1. Phân lập và phân loại các chủng nấm nghiên cứu .............................................44
3.2. Khả năng sinh trưởng, sinh tổng hợp EPS và hoạt tính laccase của các
chủng nấm…………… .....................................................................................48
3.3. Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của dịch nuôi cấy một số chủng nấm ...54
Trang iv


Luận văn Thạc sĩ sinh học

Hoàng Thị Nhung- CHK17

3.4. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sự tạo sinh khối, sinh tổng hợp EPS
và laccase của 2 chủng nấm Earliella sp. FPT31 và Ganoderma sp. FMD12..56
3.4.1. Ảnh hưởng của pH môi trường ..............................................................56
3.4.2. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy .........................................................59
3.4.3. Ảnh hưởng của nguồn nitơ .....................................................................61
3.4.4. Ảnh hưởng của nguồn carbon ................................................................63
3.4.5. Ảnh hưởng của nồng độ glucose ............................................................65
3.4.6. Khả năng sinh trưởng, sinh tổng hợp EPS và laccase của FPT31 khi
kết hợp các yếu tố môi trường

67

3.5. Hàm lượng carbonhydrate và protein của EPS thô thu được từ FPT31 và
FMD12 ............................................................................................................70
............................................................................................................................
3.6. Thành phần và cấu trúc EPS của FMD12 và FPT31 ......................................72
3.7. Hoạt tính in vitro của EPS từ 2 chủng nấm FMD12 và FPT31 ......................75
PHẦN 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..........................................................................77

4.1. Kết luận ...........................................................................................................77
4.2. Kiến nghị ........................................................................................................78
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................79

Trang v


Luận văn Thạc sĩ sinh học

Hoàng Thị Nhung- CHK17

BẢNG CHỮ VIẾT TẮT
ABTS

2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid)

AR

Androgen Receptor

CALUX

Chemical Activated Luciferase Gene Expression

COSY

Corelated Spectrscopy

CVD

Cardiovascular Disease

D2O

Deuterium oxide

dce

Dried crude exopolysaccharide

DMEM/F12

Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12

DMSO

Dimethylsulfoxide

DNS

3,5-dinitrosalicylic acid

đtg

Đồng tác giả

EPS

Exopolysaccharide

ER

Estrogen Receptor

FCS

Fetal calf serum

GC

Gas Chromatography

GR

Glucocorticoid Receptor

HIV

Human Immunodeficiency Virus

HMBC

Heteronuclear Multiple Bond Coherence

HMQC

Heteronuclear Multiple Quantum Coherence

HPLC

High- Performance Liquid Chromatography

IC50

Concentration Inhibiting 50% Of Groth

IFN

Interferon

IL

Interleukin

IPS

Intracelular Polysaccharide

ITS

Internal transcribed spacer

IZD

Internal Zone Diameter

Trang vi


Luận văn Thạc sĩ sinh học

Hoàng Thị Nhung- CHK17

NEAA

Non-Essential Amino Acid

MAE

Microwave- Assisted Extraction

MIC

Minimal Inhibitory Concentration

MMs

Medicinal Mushrooms

MRSA

Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus

MRSE

Methicillin-Resistant Staphylococcus epidermidis

MS

Mass Spectrometry

MW

Molecular Weight

NK

Natural killer

NMR

Nuclear Magnetic Resonance

NOESY

Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy

Nrf2

Nuclear factor(erythroid-derived 2)-like 2

PBS

Phosphate Buffered Saline

PDA

Potato Dextro Aga

PDB

Potato Dextro Broth

PGM

Potato Glucose Malt

PLE

Pressurized Liquid Extraction

PR

Progesterone Receptor

PSK

Polysaccarit–K

PSP

Polysaccharopeptide

ROESY

Rotating Frame Overhauser Enhancement Spectroscopy

SEC

Size-Exclusion Chromatography

SFE

Supercritical Fluid Extraction

TNF

Tumor Necrosis Factor

TSB

Tryptone Soya Broth

UAE

Ultrasonic- Assited Extraction

VREF

Vancomycinresistant Enterococcus faecium

Trang vii


Luận văn Thạc sĩ sinh học

Hoàng Thị Nhung- CHK17

DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang

Bảng 1.1

Một số phương pháp tách chiết polysaccharide từ nấm

10

Bảng 1.2

Độ chuyển dịch hoá học δ(ppm) từ cơ sở dữ liệu SUGABASE của
dạng glucose và galactose

14

Bảng 1.3

Một số polysaccharide có hoạt tính kháng ung thư từ các nấm điển
hình

19

Bảng 1.4

Một số DR- Calux thông dụng

30

Bảng 2.1

Thành phần thí nghiệm đánh giá khả năng ức chế sự sinh trưởng của
vi sinh vật

36

Bảng 2.2

Sơ đồ hút mẫu cho phân tích sàng lọc CALUX

38

Bảng 3.1

Độ tương đồng giữa các nấm thuộc Ganoderma từ các vùng

40

Bảng 3.2

Hình thái các chủng nấm và khả năng sinh trưởng, sinh tổng hợp
polysaccharide và enzyme laccase của chúng

44

Bảng 3.3

Khả năng ức chế sự sinh trưởng 2 chủng vi khuẩn B. cereus và M.
luteus của dịch nuôi cấy chủng FMD12

50

Bảng 3.4

Sự sinh trưởng và khả năng tổng hợp EPS theo thời gian của FPT31
và FMD12

55

Bảng 3.5

Khả năng sinh trưởng, sinh tổng hợp EPS và laccase của FPT31
trên môi trường chứa đường và cao nấm men ở nồng độ khác nhau

62

Bảng 3.6

Điều kiện nuôi cấy của 2 chủng nấm FPT31 và FMD12 với một số
nghiên cứu quốc tế

64

Bảng 3.7

Hàm lượng đường và protein trong EPS thô của FPT31 và FMD12

66

Bảng 3.8

Kết quả sàng lọc hoạt tính in vitro của EPS từ 2 chủng nấm FPT31
và FMD12 bằng Calux

71

Trang viii


Luận văn Thạc sĩ sinh học

Hoàng Thị Nhung- CHK17
DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang

Hình 1.1

Cơ chế tham gia miễn dịch của β- glucan từ nấm

18

Hình 1.2

Sơ lược về DR- Calux

29

Hình 3.1

Cây phát sinh chủng loại của các chủng nấm thuộc chi Ganoderma
trong nghiên cứu

41

Hình 3.2

Cây phát sinh chủng loại của các chủng nấm trong nghiên cứu

42

Hình 3.3

Khả năng kháng Bacillus cereus và Micrococus luteus của dịch
nuôi từ nấm FPT31 và FMD12

49

Hình 3.4

Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh trưởng, sinh tổng hợp
enzyme laccase và EPS của FPT31 và FMD12

53

Hình 3.5

Hoạt tính enzyme laccase của chủng FPT31 theo thời gian nuôi
cấy

54

Hình 3.6

Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên khả năng sinh trưởng, sinh tổng hợp
enzyme laccase và EPS của FPT31 và FMD12

57

Hình 3.7

Ảnh hưởng của nguồn carbon đến khả năng sinh trưởng, sinh tổng
hợp laccase và EPS của FPT31 và FMD12

59

Hình 3.8

Ảnh hưởng của nguồn nồng độ glucose đến khả năng sinh trưởng,
sinh tổng hợp laccase và EPS của FPT31 và FMD12

61

Hình 3.9

Phổ HSQC của EPS sinh từ chủng FMD12

68

Hình 3.10

Phổ HSQC của EPS sinh từ chủng FPT31

69

Trang ix


Luận văn Thạc sĩ sinh học

Hoàng Thị Nhung- CHK17

MỞ ĐẦU
Giới nấm có khoảng 1,5 triệu loài tuy nhiên chỉ có 14.000 loài trong đó là nấm
đảm Basidomycetes. Một vài trong số những chi này đã được trồng trên quy mô công
nghiệp trên toàn thế giới bao gồm Pleurotus (nấm sò), Lentinula (nấm hương),
Auricularia (mộc nhĩ), Agaricus (nấm Thiên Chúa), Flammulina (nấm kim châm),
Hypsizygus (nấm ngọc châm), Ganoderma (nấm Linh Chi), Inonotus obliquus (nấm đen),
Coprinus (nấm đùi gà), Agrocybe (nấm trân châu) và Volvariella (nấm rơm). Nấm được
sử dụng cho rất nhiều ứng dụng trong công nghệ sinh học đặc biệt là trong các ngành sản
xuất thực phẩm, enzyme, bổ sung cho chế độ ăn kiêng, các hợp chất có dược tính, thực
phẩm bổ sung [111] và nhiều ứng dụng khác.
Một thành phần quan trọng của nấm chiếm được sự quan tâm lớn của khoa học là
polysaccharide. Các polysaccharide từ nấm được thu nhận từ Ganoderma, Lentinus,
Oyster, Flammulina, Cordyceps, Coriolus và Pleurotus đều đã được chứng minh là có
nhiều hoạt tính sinh học bao gồm miễn dịch, kháng u, chống ung thư, kháng khuẩn,
kháng virus, chống oxy hóa, các đặc tính liên quan đến đường huyết và tim mạch. Ngoài
ra các enzyme laccase cũng đang được chứng minh vai trò quan trọng của nó trong lĩnh
vực bảo vệ sức khỏe con người.
Nấm được sử dụng chủ yếu thông qua ăn trực tiếp (nấm ăn) và sắc lấy nước uống
hoặc dùng hàng ngày cũng ở dạng sản phẩm uống (thực phẩm chức năng và thuốc) được
tách chiết từ các hợp chất có hoạt tính sinh học trong nấm. Cho đến nay hầu hết các sản
phẩm từ nấm đều được thu nhận trực tiếp từ quả thể của nấm tự nhiên hay nấm trồng
thông qua quá trình tách chiết phức tạp và sử dụng nước nóng hay các dung môi hữu cơ

khác nhau. Lên men chìm là một giải pháp được đưa ra để khắc phục những nhược điểm
của một số phương pháp tách chiết truyền thống như thời gian thu nhận, hiệu suất tách
chiết, khả năng kiểm soát mức độ an toàn thực phẩm trong suốt quá trình sản xuất và sự
phức tạp của quá trình thu nhận sản phẩm cuối cùng để tạo hàng hóa thương mại. Vì vậy,

Trang 1


Luận văn Thạc sĩ sinh học

Hoàng Thị Nhung- CHK17

việc lựa chọn môi trường thích hợp cho nấm sinh tổng hợp một lượng lớn các hợp chất
có hoạt tính sinh học mà quan trọng là polysaccharide có ý nghĩa lớn.
Các hoạt tính sinh học của polysaccharide bị ảnh hưởng bởi các đặc điểm về cấu
trúc của chúng như thành phần hóa học, khối lượng phân tử, các liên kết glycosidic và
dàng cấu hình. Vì vậy, việc nghiên cứu các đặc điểm về cấu trúc của polysaccharide có ý
nghĩa trong việc xác định các hoạt tính sinh học của chúng từ đó ứng dụng chúng vào
các mục đích thích hợp.
Công nghệ phân tích sàng lọc bằng CALUX đã trở thành một công cụ sinh học
mới bắt đầu được sử dụng trong việc phát hiện các chất hay các cụm chất có tác dụng ở
mức độ tế bào từ các mẫu sinh phẩm và môi trường dựa vào sự biểu hiện của gen đích
gắn với promoter chỉ thị là luciferase. Hiện nay, CALUX là phương pháp hữu hiệu để
không chỉ xác định nồng độ dioxin hay các chất đích đang được mong muốn tìm mà
công cụ này còn được ứng dụng trong các lĩnh vực như an toàn thực phẩm cho người.
Các lĩnh vực như nước uống, chất lượng môi trường, dược phẩm/ hóa chất, thức ăn chăn
nuôi, sản phẩm tiêu dùng, các phép thử ở bệnh viện, các sản phẩm sinh học tế bào, các
nguyên liệu đối chứng tham khảo và các sản phẩm khác v.v. là đối tượng mà công nghệ
CALUX có thể phân tích. Việc đánh giá các chất có hoạt tính sinh học được tách chiết từ
nấm lên các chức năng của tế bào giúp định hướng một cách rõ ràng hơn về khả năng

ứng dụng của chúng để tạo thuốc, thực phẩm chức năng, thực phẩm bổ sung cho người,
vật nuôi và cây trồng.
Xuất phát từ những lý do trên, đề tài “Nghiên cứu sàng lọc và các đặc tính sinh
học của một số nấm đảm trong sinh tổng hợp EPS, kháng vi sinh vật, tạo laccase từ
các vùng sinh thái khác nhau” đã được tiến hành. Nội dung chính của đề tài bao gồm:
-

Phân lập, sàng lọc và tuyển chọn nấm có khả năng sinh tổng hợp EPS và
enzyme laccase từ các mẫu nấm thu thập từ Vườn Quốc gia Xuân Sơn- tỉnh
Phú Thọ; Vườn Quốc gia Ba Vì- thành phố Hà Nội; rừng keo tỉnh Bình

Trang 2


Luận văn Thạc sĩ sinh học

Hoàng Thị Nhung- CHK17

Phước; rừng bị rải chất độc hóa học là A Lưới- tỉnh Thừa Thiên Huế và Mã
Đà- tỉnh Đồng Nai;
-

Phân loại 2 chủng nấm bằng phương pháp xác định trình tự vùng ITS;

-

Lựa chọn môi trường thích hợp cho sự sinh trưởng, sinh tổng hợp EPS và
laccase của 2 chủng nấm Ganoderma sp. FMD12 và Earliella sp. FPT31;

-

Đánh giá khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của dịch nuôi cấy 2 chủng
nấm Ganoderma sp. FMD12 và Earliella sp. FPT31;

-

Xác định sơ bộ thành phần và tỷ lệ các đường tạo thành EPS của 2 chủng nấm
trên.

-

Đánh giá một số hoạt tính sinh học của EPS bằng kỹ thuật CALUX để định
hướng ứng dụng.

Trang 3


Luận văn Thạc sĩ sinh học

Hoàng Thị Nhung- CHK17

PHẦN 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Tổng quan về nấm ăn và nấm dược liệu (MMs- Medicinal Mushrooms)
Nấm sợi và nấm mũ được phân bố rộng rãi và phong phú trên toàn thế giới. Các

ước tính gần đây về nấm cho thấy số lượng nấm vào khoảng 500 000 đến hơn 5 tỉ loài,
được công bố hơn 20 năm trước [46]. Cho đến nay, có khoảng 3 tỉ loài nấm được chấp
nhận sử dụng chung. Trong khi đó, hiện nay có 110 000 loài nấm đã được mô tả. Số

lượng các loài nấm trên trái đất hiện nay ước tính khoảng 150 00 – 160 000. Chưa hết,
có lẽ chỉ có 10% số loài có tên được khoa học biết đến [133]. Một phân tích về nguồn
gốc của các loài nấm mới cho khoa học đã được mô tả và công bố trong cuốn Biên lục
về Nấm xuất bản 10 năm trước cho thấy khoảng 60% các loài nấm mới được mô tả là từ
các vùng nhiệt đới.
Nấm được tiêu thụ trên toàn thế giới không chỉ do đặc tính cảm quan mà còn thu
hút được nhiều sự quan tâm do lợi ích của chúng đối với sức khỏe con người. Hiện nay
nấm được đánh giá cao về giá trị dinh dưỡng cũng như dược lý của chúng. Nấm có thể
được coi là một loại thực phẩm tốt cho sức khỏe vì chúng có hàm lượng protein và hàm
lượng chất xơ cao, với một lượng vitamin và khoáng chất đáng kể và lượng chất béo
thấp. Chúng là một nguồn dược phẩm lớn, mới nhưng chưa được khai thác. Hơn nữa,
nấm ngày càng thu hút sự quan tâm bởi chúng có thể được ứng dụng để tạo thực phẩm
chức năng và là nguyên liệu cho sự phát triển của các loại thuốc và các sản phẩm dinh
dưỡng do để bổ sung vào chứa một loạt các phân tử có hoạt tính sinh học như β- glucans,
polyphenol, phytosterol, tecpen. Quan trọng nhất đối với y học hiện đại là nấm dược liệu
(MMs) là nguồn polysaccharide vô hạn (đặc biệt là β- glucan) và các phức hợp
polysaccharide- protein có khả năng chống ung thư và tăng khả năng miễn dịch. Hầu hết
các Basidiomycetes bậc cao đều chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học với phân tử
lượng thấp hoặc cao (triterpenes, lactones, alkaloids và các hợp chất khác) trong quả thể
nấm, sợi nấm và dịch nuôi cấy [133], [128], [8], [27].

Trang 4


Luận văn Thạc sĩ sinh học

Hoàng Thị Nhung- CHK17

MMs được so sánh với thuốc thảo dược và được xác định có thể là các nấm lớn,
hầu hết thuộc nấm đảm và một vài thuộc nhóm nấm sợi. Chúng được sử dụng ở dạng

chiết xuất hoặc dạng bột để ngăn ngừa, giảm thiểu hay chữa trị bệnh, và/ hoặc bổ sung
cho người một chế độ ăn uống khỏe mạnh và cân bằng.
Nấm dược liệu và nấm ăn có khoảng 130 chức năng để có thể sử dụng làm thuốc
do có khả năng kháng ung thư, tăng khả năng miễn dịch, chống lão hóa, kháng các bệnh
tim mạch, chống tăng cholesterol, kháng vi rút, kháng khuẩn, kháng ký sinh trùng, kháng
nấm, khử độc, bảo vệ gan, chống các ảnh hưởng của đái đường. Nấm được sử dụng vào
các liệu pháp tăng miễn dịch, và đã được chứng minh là có hiệu quả như chống viêm,
chống oxy hóa, kháng u, hoặc là kháng virus và là các nhân tố kháng khuẩn.
Rất nhiều, nếu không nói là tất cả, các nấm mũ bậc cao chứa các hợp chất có hoạt
tính sinh học không chỉ có trong quả thể nấm, trong sợi nấm qua nuôi cấy mà còn có
trong môi trường nuôi cấy. Các polysaccharide từ nấm đang được quan tâm đặc biệt bởi
các đặc tính hữu ích của chúng. Các dữ liệu khoa học về các polysaccharide từ nấm và
các sản phẩm chuyển hóa thứ cấp được tổng hợp lại khoảng 700 loài. Số lượng các
polysaccharide có hoạt tính sinh học hoặc các phức hợp polysaccharide- protein từ các
nấm thuốc có mặt để tăng cường các phản ứng miễn dịch bẩm sinh và phản ứng miễn
dịch thu được và tạo ra hoạt tính kháng ung thư ở người và động vật. Cho đến nay các cơ
chế về hoạt động kháng ung thư của chúng vẫn còn chưa được hiểu một cách rõ ràng.
Polysaccharide và các sản phẩm chuyển hóa thứ cấp có khối lượng phân tử thấp giữ vai
trò đặc biệt quan trọng do đặc tính kháng ung thư và tăng khả năng miễn dịch của chúng
[134].
1.2.

Lịch sử nghiên cứu và sử dụng nấm

1.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Việc sử dụng các loài nấm trong các liệu pháp điều trị đã xuất hiện ít nhất từ thời
kì đồ đá mới. Trải qua hàng nghìn năm, các loài nấm được đánh giá là có giá trị cho con
người là nấm ăn và nấm dược liệu. Các nghiên cứu hiện đại xác nhận và ghi nhận nhiều
Trang 5

Luận văn Thạc sĩ sinh học

Hoàng Thị Nhung- CHK17

kiến thức cổ xưa về nấm dược liệu. Một lĩnh vực khoa học liên ngành tập trung vào
nghiên cứu nấm dược liệu đã được phát triển và ngày càng chứng tỏ tính ưu việt và độc
đáo của các hợp chất chiết xuất từ một loạt các loài nấm trong ba thập kỷ gần đây. Các
thử nghiệm lâm sàng hiện đại được tiến hành ở Nhật Bản, Trung Quốc, Hàn Quốc, Nga
và một số nước khác dựa trên các nấm đã biết nguồn gốc. Đông y học cổ đại đã nhấn
mạnh tầm quan trọng của một số loài nấm như nấm Linh chi (Ganoderma lucidum), nấm
hương (Lentinus edode). Nấm cũng đóng vai trò quan trọng trong điều trị các bệnh ảnh
hưởng đến dân cư vùng nông thôn ở các nước châu Âu. Các loài quan trọng nhất là
Inonotus obliquus, Fomitopsis officinalis, Piptoporus betulinus, Fomes fomentarius.
Những loài này được sử dụng trong điều trị rối loạn tiêu hóa, các dạng ung thư khác
nhau, hen phế quản, đổ mồ hôi đêm …Từ lâu, nấm đã được sử dụng trong điều trị bệnh
ở Trung Mỹ (đặc biệt là chi Psilocybe), ở châu Phi, Algeria và Ai Cập. Vai trò đặc biệt
của nấm hương bay được tìm thấy trong Shaman giáo ở Siberia và Tây Tạng, trong Phật
giáo và huyền thoại Celtic [107], [129], [133], [18].
Ngày nay, nấm dược liệu được sử dụng trong các lĩnh vực như làm thực phẩm
ăn kiêng (sản lượng nấm thế giờ là 30 tấn vào năm 2012); sản phẩm bổ sung vào chế độ
ăn uống (sản phẩm của lĩnh vực này phát triển mộtt cách nhanh chóng và có giá trị hơn
18 tỷ USD/ năm); một loại thuốc mới được gọi là “dược phẩm nấm”; nhân tố kiểm soát
sinh học tự nhiên trong bảo vệ thực vật với các hoạt tính kháng côn trùng, diệt nấm, diệt
khuẩn, diệt cỏ, diệt tuyến trùng, kháng vi rút ở thực vật. Trong mỹ phẩm, các hợp chất
khác của MMs, bao gồm polysaccharide như β-glucans, glucuronoxylomannan (GXM ),
sacchachitin, tyrosinase và các enzyme khác được các công ty mỹ phẩm sử dụng do khả
năng tạo màng của chúng, kích hoạt các yếu tố tăng trưởng biểu bì, chống oxy hóa,
chống dị ứng, kháng khuẩn, va hoạt tính kháng viêm, kích thích hoạt động của collagen,
ức chế bạch biến tự miễn dịch và điều trị mụn trứng cá [133], [134], [54].

Trang 6


Luận văn Thạc sĩ sinh học

Hoàng Thị Nhung- CHK17

1.2.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam
Từ xưa, người Việt Nam đã sử dụng nấm Linh chi dùng làm dược liệu. Từ thời Lê
Quý Đôn (1726-1784), nấm Linh chi được đánh giá rất cao. Các chế phẩm từ Linh chi
(Ganoderma) được sử dụng để điều trị nhiều bệnh như: gan, tiết niệu, tim mạch, ung thư,
AIDS, suy nhược cơ thể, tiểu đường, giảm đau, giải độc trong cơ thể, đào thải chất
phóng xạ, giảm cholesterol trong máu, mất ngủ, loét dạ dày, làm tăng hệ thống miễn
nhiễm của cơ thể, tê thấp v.v. Tuy nhiên những nghiên cứu về nấm dược liệu và nấm ăn
cũng chủ yếu dừng lại ở thống kê, đánh giá và xác định sự đa dạng và giá trị tài nguyên
của loại nấm này ở các khu vực khác nhau như Thừa Thiên Huế [1], Vườn Quôc gia Bù
Gia Mập [6], vùng Thanh- Nghệ Tĩnh [5], tỉnh Tây Ninh [4].
Một nghiên cứu của Lê Xuân Thám và đtg (2011) đã xác định được thành phần
hóa học của mẫu nấm Linh Chi đen Amauroderma subresinosum Murr phân lập từ Vườn
Quốc Gia Cát Tiên bằng kỹ thuật sắc ký khí (GC). Nghiên cứu đã xác định được 14 axit
béo, trong đó axit béo chưa bão hòa 11-octadecaenomic có nồng độ cao nhất (khoảng
51,01% tổng lượng axit béo đã được xác định). Ngoài ra, các axit béo là lignoceric, 14methylpentadecaenoic, 8,11-octadecenoic cũng đã được xác định và làm sáng tỏ về cấu
trúc [104].
Trần Thị Hồng Hà và đtg (2012) đã tách chiết và xác định hàm lượng các
polysaccharide từ quả thể nấm hầu thủ Hericium erinaceus. Phân đoạn chiết bằng NaOH
4% cho tổng lượng polysaccharide chiếm 80% , bao gồm các dạng tan và không tan
trong nước. Một lượng ít polysaccharide được tổng hợp trong dịch nuôi cấy nấm.
Polysaccharide tan trong phân đoạn chiết NaOH 2% có hoạt tính ức chế sự hình thành
khối u tế bào ung thư gan (Hep-G2) thể hiện bằng việc giảm kích thước khối u xuống

24,4% và mật độ hình thành khối u 61,5% so với đối chứng âm [2].
Tuy nhiên, những nghiên cứu được tổng hợp ở trên mới chỉ tập trung vào chi
Ganoderma và ứng dụng của chúng trong y học. Trong khuôn khổ luận văn thạc sỹ này
học viên cao học không chỉ nghiên cứu, khảo sát về khả năng sinh tổng hợp
polysacchride của một số Ganoderma mà còn tập trung nghiên cứu khả năng sinh trưởng,
Trang 7


Luận văn Thạc sĩ sinh học

Hoàng Thị Nhung- CHK17

sinh tổng hợp expolysaccharide và enyme laccase của dịch lên men từ nấm phân lập mới
từ rừng ở các vùng khí hậu khác nhau. Đồng thời đánh giá khả năng kháng một số vi
sinh vật kiểm định; xác định thành phần và cấu trúc của polysaccharide trong dịch nuôi
cấy của 2 chủng nấm lựa chọn; đánh giá một số hoạt tính in vitro lên các chức năng của
tế bào. Từ đó, có hướng ứng dụng thích hợp cho mỗi chủng nấm, đặc biệt trong lĩnh vực
thực phẩm bố sung cho người và gia súc, gia cầm.
1.3.

Polysaccharide từ nấm- nguồn carbonhydrate có hoạt tính sinh học tự nhiên
Trong số các hoạt chất sinh học có trong nấm, polysaccharides chiếm được sự

quan tâm hơn cả chủ yếu là do đặc tính tuyệt vời của trong miễn dịch, các chất chống
oxy hóa, chống viêm, hoặc kháng u. Polysaccharide là một polymer mà trong đó
monomer là các phân tử đường đơn. Một vài polysaccharide đã được phân lập từ các
nấm nguyên liệu. Khi tất cả các monosaccharide tạo thành carbohydrate cùng loại thì các
polymer này được gọi là homopolysaccharide hoặc homoglycan. Tuy nhiên, nếu có
nhiều hơn một loại monosaccharide có mặt trong cấu trúc, chúng được gọi là
heteropolysaccharide hoặc heteroglycan. Như vậy, các heteropolysaccharide được hình

thành bởi các loại đường khác nhau [22], [120] và phức hợp polysaccharide-protein [11]
cũng có thể được tìm thấy trong một số nấm nhất định.
Các đặc điểm về cấu trúc như tính chất của monomer, các loại hình liên kết và
vị trí liên kết, cũng như số lượng và vị trí của các nhánh có trong chuỗi polymer sẽ ảnh
hưởng mạnh đến cấu trúc không gian 3 chiều cùng với kích thước phân tử từ đó sẽ xác
định các tính chất và hoạt tính của polysaccharide [16]. Tương tự, các tính chất vật lý
như khả năng hòa tan, độ nhớt, độ đông đặc, có thể ảnh hưởng đến các hoạt tính sinh học
vì chúng có thể làm thay đổi tính sẵn sàng sinh học của polysaccharide [95]. Do đó, việc
xác định một cách rõ ràng các cấu trúc và tính chất vật lý phân tử của các
polysaccharides có trong nấm là vô cùng quan trọng để dự đoán các hoạt tính sinh học
của chúng.

Trang 8


Luận văn Thạc sĩ sinh học
1.4.

Hoàng Thị Nhung- CHK17

Tách chiết và xác định các đặc tính của polysacchride từ nấm
Việc tách chiết polysaccharide liên quan đến việc phân tách các carbohydrate từ

nấm nguyên liệu. Các phương pháp tách chiết thông thường thường khuấy mẫu vào dung
môi [27]. Các dung dịch thường được sử dụng là nước ở nhiệt độ phòng, nước sôi, thậm
chí là dung dịch NaOH, KOH (2%). Phần còn lại được tách ra bằng cách ly tâm còn
polysaccharides được kết tủa với ethanol theo tỷ lệ 2: 1 ( v / v ) .
Trong một số trường hợp, nước hoặc dung môi cơ bản không đủ mạnh để tách
các polysaccharide không tan thì giải pháp có thể sử dụng các dung dịch có tính axit
mang tính khả thi cao. Một số axit, bao gồm acetic, formic, clohydric, axit phosphoric,

đã được thử nghiệm trong quá trình phân tách β- (1-3)-glucans không tan [94].
Các kỹ thuật tách chiết bằng dung môi thường sử dụng một lượng lớn các dung
môi hữu cơ độc hại, thường là mất nhiều thời gian, và có sản lượng thu nhận thấp và độ
chọn lọc cũng thấp. Thêm vào đó, với các phương pháp tách chiết này, các chất cần tách
chiết có thể tiếp xúc với nhiệt độ quá cao,cần ánh sáng và oxy, đòi hỏi phải có thời gian
tách chiết dài, dẫn đến sự hoạt động của các enzyme phân hủy glucan. Trong thời gian
tách chiết, một số hợp chất có hoạt tính sinh học có thể dễ dàng bị mất do sự ion hóa,
thủy phân và oxy hóa. Do đó, các kỹ thuật phức tạp hơn như tách chiết bằng áp suất chất
lỏng (PLE), tách chiết có siêu âm hỗ trợ hoặc dùng vi sóng có thể là một giải pháp tốt để
phân tách các polysaccharides. Bảng1.1 tổng hợp các kỹ thuật chính và các điều kiện cần
thiết cho việc chiết xuất các polysaccharide từ nấm.

Trang 9


Luận văn Thạc sĩ sinh học

Hoàng Thị Nhung- CHK17

Bảng 1.1. Một số phương pháp tách chiết polysaccharide từ nấm
Điều kiện tách chiết

Ưu, nhược điểm

Kỹ thuật tách
chiết
Tách chiết bằng áp
suất chất lỏng
(PLE)

10.1 MPa; 28°C; 70 phút

- Thân thiện với môi trường;
Lentinus
- Lượng dung môi sử dụng ít, thường là edodes
nước;
- thời gian thực hiện ngắn;
- Là phương pháp tự động và sử dụng
oxy, ánh sáng từ môi trường.

[112]

Chiết xuất dòng
siêu tới hạn (SFE)

35 MPa; tốc độ dòng 10
kg/h CO2; 25°C ; 4 giờ

- Sử dụng CO2 như các dung môi chiết;
Ganoderma
- Thân thiện với môi trường;
lucidum
- Nhiệt độ tương đối thấp và các dung
môi hữu cơ được loại bỏ trong quá trình
chiết xuất sẽ tránh được sự phân hủy các
thành phần có hoạt tính sinh học;
- Hiệu suất tách chiết sẽ tốt.

[37]

Tách chiết bằng
siêu âm hỗ trợ
(UAE)
Chiết xuất bằng vi
sóng hỗ trợ (MAE)

Cường độ siêu âm 230 W;
70°C; 62 phút; tỷ lệ nước:
vật liệu 30 mL/g
Cường độ vi sóng 400 W;
74,64°C; 29,37 phút; tỉ lệ
nước: vật liệu 32,7:1
Cường độ siêu âm 50 W;
Cường độ vi sóng 284 W;
701 giây; tỷ lệ nước: vật
liệu 11,6:1

- Ưu điểm là nhanh, không tốn kém và
hiệu quả tương tự với các kỹ thuật tách
chiết thông thường;
- Lượng dung môi sử dụng ít;
- Quá trình chuẩn bị mẫu nhanh chóng.

Agaricus
bisporus

[126], [58]

Agaricus
blazei

[121], [109]

Chiết xuất kết hợp
vi sóng và siêu âm
(UMAE)

Trang 10

Nấm

-Giảm thời gian chiết nhưng làm tăng Ganoderma
hiệu suất chiết và tiết kiệm năng lượng.
lucidum

Tài liệu tham khảo

[29], [21]


Luận văn Thạc sĩ sinh học

Hoàng Thị Nhung- CHK17

Theo Lindequist và đtg (2005) thì 80- 85% các sản phẩm từ nấm dược liệu
được thu nhận từ quả thể và chỉ 15- 20% được thu nhận từ sợi nấm và dịch nuôi cấy
thông qua lên men chìm [121]. Tuy nhiên, lên men chìm đã được chứng minh là có
hiệu quả và khả năng kiểm soát tốt hơn cho quá trình sinh tổng tổng hợp các hợp chất
có dược tính từ Basidomysetes [33], [12], [8]. Bước đầu tiên để thành công trong lên
men chìm là chọn lọc môi trường thích hợp cho mỗi chủng nấm để sinh tổng hợp một

lượng lớn các chế phẩm sinh học. Ngoài ra, quá trình thu nhận exopolysaccharide từ
lên men lỏng cũng có nhiều ưu điểm hơn so với thu nhận từ quả thể. Thời gian lên
men chỉ khoảng 10-15 ngày so với nuôi cấy để thu quả thể có thể kéo dài đến 3 tháng
[66]. Dịch lên men chỉ qua bước kết tủa với ethanol ở 4oC trong khi một số
polysaccharide được thu nhận từ quả thể nấm tốn nhiều thời gian, qua nhiều bước
phức tạp để tách chiết và tách phân đoạn như tủa đường trong ethanol, lặp lại các
bước tách chiết bằng nước nóng và dung dịch ammonium oxalate của NaOH, sau đó
các polysaccharide đã được tách chiết lại trải qua nhiều bước làm sạch để sử dụng
cho các nghiên cứu tiếp theo. Hiệu suất tách chiết từ dịch lên men cũng cao hơn so
với các phương pháp tách chiết từ quả thể [56]. Với những ưu điểm này, lên men
chìm để thu một lượng lớn các hợp chất có hoạt tính sinh học đang lựa chọn và
nghiên cứu nhằm tìm ra phương pháp khả thi nhất.
1.5.

Đặc điểm cấu trúc của polysaccharide phân lập từ nấm
Các phân tích về cấu trúc của các polysaccharide giúp xác định các đặc điểm

phân tử như khối lượng phân tử, thành phần chuỗi, cấu hình và các dạng đồng phân,
trình tự các monosaccharide, sự có mặt và vị trí các nhánh, sự có mặt của các liên kết
interglycosidic. Ngày nay, có một loạt các kỹ thuật đặc trưng để có được các thông
tin chi tiết về cấu trúc của các polysaccharide.
Kích thước phân tử thường được xác định bằng phương pháp sắc ký loại trừ
kích thước (size-exclusion chromatography- SEC) bằng cách so sánh với các vật liệu
tiêu chuẩn.
Thành phần monosaccharide có thể được nghiên cứu bằng cách thủy phân
các polysaccharide trong axit và sau đó phân tích các loại đường tạo thành bằng

Trang 11

Luận văn Thạc sĩ sinh học

Hoàng Thị Nhung- CHK17

phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (high- performance liquid chromatographyHPLC ) bằng sắc ký khí ( gas- chromatography- GC ) [14].
Sự có mặt và vị trí xuất hiện của các nhánh có thể được xác định thông qua
sự hình thành các dẫn xuất như methyl acetate alditol, trimetylsilyl, acetyl,
trifluoroacetyl, methaneboronate, acetal hoặc sự kết hợp của chúng và các phân tích
tiếp theo có thể làm sáng tỏ bằng sắc ký khí khối phổ (GC/MS) [13]. MS là một kỹ
thuật vô cùng hữu ích vì nó chỉ đòi hỏi một lượng mẫu tương đối thấp (picograms
hoặc ít hơn) và không cần polysaccharide quá tinh khiết. Mặc dù các phân tích về cấu
trúc của polysaccharide bằng MS có thể được thực hiện đối với nhiều
olygosaccharides không dẫn xuất và các phức glyco nhưng các polysaccharides được
O- methyl hóa vẫn được sử dụng để tăng tính ổn định của các ion và độ nhạy của MS.
GC/MS cung cấp thông tin về vị trí của liên kết glycosid, sự có mặt của các nhánh và
thành phần monosaccharide trong các carbohydrate phức tạp.
Polysaccharide có mặt trong tự nhiên ở cả 2 dạng cấu hình α và β; tuy nhiên
các tính chất vật lý về cơ bản khác nhau phụ thuộc vào loại liên kết. Do đó, việc làm
sáng rõ các cấu hình liên kết là một vấn đề quan trọng trong nghiên cứu cấu trúc của
polysaccharide. Cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) là một công cụ ưu việt để có được
các thông tin về thành phần các monosaccharide và cấu hình anomeric, các liên kết
trong chuỗi và xa hơn nữa là các kết quả phân tích sự methyl hóa [72].
1.6. Phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear magnetic resonance- NMR)
trong nghiên cứu cấu trúc của polysaccharide
Phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân đã được sử dụng rộng rãi trong phân
tích cấu trúc và cấu hình không gian của các polysaccharide trong dung dịch. Giá trị
độ dịch chuyển hóa học và các hằng số tương tác thu được từ phổ NMR sẽ cung cấp
các thông tin về loại đường và cấu hình anomeric.
Phổ 1H-NMR của polysaccharide có thể khẳng định độ tinh khiết của mẫu
(không có mặt của các tín hiệu các oligonucleotide, protein hay lipid). Phổ cũng có

thể cho biết số monosaccharide thực từ số các cộng hưởng proton anomer thông qua
các tín hiệu trong khoảng 4,3 đến 5,8 ppm. Nếu các cấu hình là α thì sự thay đổi hóa
Trang 12


Luận văn Thạc sĩ sinh học

Hoàng Thị Nhung- CHK17

học là lớn hơn so với β. Khi tín hiệu xuất hiện ở vùng 5,0- 5,8 ppm, cấu hình anomer
là α và nếu xuất hiện ở vùng 4,3- 5,0 ppm, thì đó là anomer β. Như vậy dựa vào tỷ lệ
tích phân tương đối của các cộng hưởng anomer cũng có thể đánh giá tỷ lệ phân tử
của các monosaccharide. Về mặt này kết quả phân tích hoá học có thể phù hợp với
kết quả phân tích 1H-NMR. Nhìn chung, kết quả tính tích phân NMR là chính xác
hơn so với kết quả phân tích hoá học. Nhiều nhóm thế có thể được xác định hoặc sự
có mặt của chúng được dự đoán dựa vào phổ 1D 1H-NMR. Tiếp theo, số lượng chính
xác của các monosaccharide có thể được khẳng định chính xác nhờ vào việc khảo sát
vùng anomer của phổ 2 chiều dị hạt nhân 1H-13C-HSQC.
Độ dịch chuyển hoá học của proton anomer (4,4 –5,8 ppm) được tách biệt một
cách không hoàn toàn rõ rệt khỏi các cộng hưởng 1H ở các vị trí khác (3,2– 4,5 ppm)
trong khi độ dịch chuyển

13

C anomer (95 – 110 ppm) lại tách biệt rất rõ, không hề

trùng chập với các cộng hưởng 13C ở các vị trí còn lại (60 – 85 ppm).
Dạng vòng (hexose hay furanose) và các cấu hình anomer được suy ra từ các
thông tin kết hợp có giá trị từ độ dịch chuyển hoá học 1H (H cộng hưởng giữa 5,0 và
5,8 ppm trong khi H cộng hưởng trong khoảng 4,4 và 5,2 ppm) với hằng số tương

tác vô hướng của C-1, H-1 (1JC-1, H-1 165-175 Hz đối với  trong khi 1JC-1, H-1 158-165
Hz đối với ). Tương tác dị hạt nhân liên kết 1JC-1,H-1 có thể thu được từ phổ 1H – 13C
HSQC không khử tương tác.
Ở phổ 13C-NMR, các carbon trong vòng được tìm thấy trong khoảng 50- 85
ppm trong đó các carbon gắn với nitơ xuất hiện ở trong khoảng 65- 75 ppm. Các
carbon tham gia vào quá trình glycosyl hóa dịch chuyển xuống một khoảng 5-10 ppm.
Các nguyên tử C6 không thế được tìm thấy quanh vùng 60- 63 ppm và các carbon C6
liên kết với các đường dư khác xuất hiện quanh vùng 65- 70 ppm. Các tín hiệu carbon
của các nhóm methyl hóa được tìm thấy trong khoảng 15-30 ppm và các carbon
carbonyl hóa được tìm thấy ở 165- 185 ppm (Bảng 1.2) [72].

Trang 13


Luận văn Thạc sĩ sinh học

Hoàng Thị Nhung- CHK17

Bảng 1.2. Độ chuyển dịch hoá học δ(ppm) từ cơ sở dữ liệu SUGABASE của
dạng glucose và galactose
Monosaccharide
H-1
C-1
H-2
C-2
H-3
C-3
H-4
C-4
H-5

C-5
H-6a
C-6
H-6b

-D-Glcp

-D-Glcp

-D-Galp

-D-Galp

5,11 0,30
97,5 4.5
3.520,06
72,51,0
3,760,10
73,80,4
3,410,05
70,70,6
3,740,10
72,90,5
3,640,16
61,40,4
3,780,08

4,840,46
102,92,4
3,310,05

74,11,1
3,550,07
76,31,4
3,510,13
70,41,0
3,550,09
76,01,3
3,770,05
61,51,0
3,940,05

5,160,35
99,13,1
3,890,12
68,91,3
3,930,16
70,21,7
4,120,19
68,61,9
4,110,29
71,02,0
3,730,07
61,70,8
3,730,04

4,680,26
103,52,4
3,530,17
71,72,1
3,800,16

73,51,7
4,080,18
67,92,0
3,740,20
75,51,1
3,740,05
61,80,7
3,740,05

Các vị trí được thế của monosaccharide được gọi là vị trí aglycon tương ứng
với các nguyên tử C ở các vị trí không phải anomer của liên kết glycoside. Từ dữ liệu
NMR, vị trí liên kết được suy ra dựa trên sự tăng mạnh (> + 3ppm) về độ dịch chuyển
hoá học của

13

C so với độ dịch chuyển hoá học của các monomer không thế. Việc

phân tích này cũng mang lại thông tin giống với những phân tích khi methyl hoá. Trật
tự các đơn phân trong mạch của polysaccaride được xác định chính là chuỗi các liên
kết glycoside, thể hiện thông tin cấu trúc chính cần xác định thu được từ hai loại phổ
HMBC và NOESY.
Kỹ thuật NMR hai chiều (2D) bao gồm phổ tương quan (COSY), phổ tăng
cường định kỳ Overhauser (ROESY), hiệu ứng quang phổ hạt nhân Overhauser
(NOESY) và sự kết hợp lượng tử đa dị nhân (HMQC) làm sáng tỏ cấu trúc của
polysaccharide gồm thành phần monosaccharide, liên kết glycosidic.
1.7.

Tính chất vật lý của polysaccharide
Các tính chất vật lý như độ tan trong nước, độ nhớt, độ đặc là các yếu tố

quan trọng gần như quyết định khả năng sinh học và các hoạt động sinh lý khác. Hầu
Trang 14