Kỹ thuật nuôi cấy và dung hợp tế bào trần

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Tiểu luận chủ đề :
KỸ THUẬT NUÔI CẤY VÀ DUNG HỢP TẾ BÀO TRẦN

Giảng viên hướng dẫn: PGS. TS. Nguyễn Thị Lý Anh

1


A, ĐẶT VẤN ĐỀ

 Tế bào trần được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực thí nghiệm và có vai trò quan trọng
trong nghiên cứu khoa học và thực tiễn.

 Kỹ thuật nuôi cấy và dung hợp tế bào trần cho phép mở rộng nguồn gen của các loài thực

vật, tạo ra các dòng tế bào sản xuất mới mang các đặc tính di truyền ưu việt của cả bố và mẹ.

 Vậy Tế bào trần là gì? Kỹ thuật nuôi cấy và dung hợp tế bào trần như thế nào?
Chúng ta cùng tìm hiểu?

3


I, Khái niệm protoplast

II. So sánh đặc điểm nuôi cấy tế bào trần với nuôi cấy tế bào vẫn còn

NỘI DUNG

thành

III, Các kỹ thuật cụ thể

IV, Các ứng dụng

V, Quy trình minh họa
4


I. KHÁI NIỆM PROTOPLAST, THẾ NÀO LÀ LAI TẾ BÀO SOMA?

 Tế bào trần (protoplast) là tế bào thực vật bị tách bỏ thành tế bào, chỉ còn màng sinh chất bao
bọc khối tế bào chất và nhân tế bào.

Protoplast

5


•
•

Khi hai hay nhiều tế bào trần dung hợp với nhau sẽ hợp thành một tế bào
hợp tế bào trần.

dung

Nếu các tế bào trần có nguồn gốc từ các tế bào soma (tế bào sinh dưỡng) thuộc các

giống, loài, hoặc chi khác nhau dung hợp với nhau
hiện tượng dung hợp tế bào
soma (lai soma)

Tế bào giống, loài A

Tế bào lai soma

Tế bào giống, loài B

5


Tế bào trần có thể được tạo ra bằng nhiều cách:
từ dịch huyền phù tế bào
tế bào mô sẹo
từ mô tươi nguyên trạng như lá
Đặc điểm: Để trên môi trường dinh dưỡng thì sau 5- 10 ngày sẽ tạo vách tế bào và
phân chia.

y
Hu

ền

ù
ph

TB

Mô

sẹ o

6


Tại sao phải nuôi cấy tế bào trần

Sự tiếp cận đến MSC

nghiên cứu và thao tác trên các thuộc tính của màng tế
bào, điều mà không thể thực hiện được khi bị bao phủ bởi vách tế bào.

 Do tính sẵn sàng có thể sử dụng tế bào trần cho các phương pháp phá vỡ tế bào

để nhanh chóng thâu nhận các bào quan và các đại phân tử mà không gặp phải sự
biến dạng hư hỏng như các phương pháp ly trích thông thường.

Do mỗi một tế bào cách ly với tế bào khác trong quần thể tế bào trần và là một hệ
thống đơn bào nên có thể thao tác tương tự như quần thể vi sinh vật

7


II. SO SÁNH ĐẶC ĐIỂM NUÔI CẤY TẾ BÀO TRẦN VỚI NUÔI CẤY TẾ BÀO VẪN CÒN
THÀNH
Ưu thế
Tế bào không có màng cứng, ở trạng thái đơn bào, mật độ tế bào thu được trên một đơn vị thể tích môi trường
có thể rất cao.

Tế bào trần có khả năng tái sinh rất mạnh

Cho phép khả năng biến nạp các gen thuận lợi vào tế bào thực vật mà trước kia thường bị vỏ tế bào
ngăn cản.

Cho phép khả năng dung hợp tế bào-gắn hai tế bào trần lại thành một tế bào với hai bộ thông tin di
truyền của hai tế bào

Tế bào lai thu đực từ dung hợp hai tế bào trần, được tái sinh và phát triển thành một cây lai

8


Tồn tại

Quá trình cô lập nuôi cấy phải hoàn thiện
Chưa có phương pháp hiệu quả để tuyển chọn các sản phẩm phù hợp.

9


III, CÁC KỸ THUẬT CỤ THỂ

1. Kỹ thuật tách tế

2. Kỹ thuật nuôi cấy tế

3. Kỹ thuật dung hợp tế

bào trần

bào trần

bào trần

10


1. Kỹ thuật tách tế bào trần

a)
1.
2.
3.

Nguyên tắc
Enzyme xenlulolaza, pectinaza và hemixenluloza để phân giải thành TB và giải phóng các tế
bào trần
Sau khi thành TB được tách ra, tế bào trần phải được phóng thích vào môi trường có áp suất
thẩm thấu cao để tránh nước xâm nhập vào không bào,gây vỡ tế bào chất, bằng việc bổ sung
các chất tạo áp suất thẩm thấu như saccrose, manitol...
Nồng độ chất tạo áp suất thẩm thấu và thời gian lưu giữ tối đa thay đổi cho thích hợp với
từng đối tượng cây trồng

11


b, Các bước tiến hành

i. Chọn nguyên liệu

ii. Xử lý gây co nguyên
sinh chất

iv. Tách và làm sạch
protoplast

iii. Pp tách protoplast

v. Xác định chất lượng
tế bào trần

12


i. Chọn nguyên liệu

Ex vitro: Từ mô lá non (cần phải khử trùng)

ii. Xử lý gây co nguyên sinh chất
loạilá,
bỏ,môcác
được
.Trước khi thành tế bàoInbịvitro:
sẹo,tếtếbào
bàocần
huyền
phù ngâm trong dung dịch

gây co nguyên

sinh chất

.Các dung dịch thường được sử dụng như: manitol hoặc sorbitol, đường saccarozo 0.2 M....

13


iii, Phương pháp tách protoplast
Có 2 phương pháp phân lập protoplast

 phương pháp cơ học: dựa trên cơ sở phá các mối liên kết của mô bằng các dao sắc
nhọn và giải phóng các protoplast riêng rẽ. Phương pháp này cho hiệu quả thấp

14


Phương pháp dùng enzyme
Thường phải dùng cả ba loại enzyme: Xellulolaza, hemixelluloza, pectinaza.
Có hai pp sử dụng enzyme:

Sử dụng tuần tự (qua 2 bước)
Sử dụng hỗn hợp cả 3 enzyme
phương pháp dùng enzyme có hiệu quả cao hơn rất nhiều so với phương pháp
cơ học, phương pháp này cho phép tách được hàng gram protoplast

15

iv, Tách và làm sạch protoplast

•

Bằng cách lọc và ly tâm

16


v, Xác định chất lượng của tế bào trần

 Quan sát dưới kính hiển vi, các TB có dạng hình cầu

thành tế bào đã bị loại

bỏ

 Để phát hiện thành tế bào cách tốt nhất là dùng calcofluor:
 Calcofluor bám vào các phân tử xenlulozo phát ánh sáng huỳnh quang với
màu xanh rực rỡ khi soi dưới tia cực tím.



Nếu các tế bào trần đã bị loại cellulose thì hiển vi trường có màu tối thẫm, các tế
bào trần sẽ không nhìn thấy được ngoại trừ sự tự phát ánh sáng huỳnh quang đỏ
của các lạp thể.

17

 Xác định khả năng sống sót của tế bào trần: quan sát dưới kính hiển vi.
Tế bào chất của những tế bào xuất hiện ở dạng dòng chảy hoặc chuyển đông tròn,
trông như các hạt nhỏ trong nguyên sinh chất là những tế bào sống.

 Một phương pháp khác là kết hợp kính hiển vi huỳnh quang kết hợp với nhuộm xanh
Evan để xác định sức sống của tế bào trần.

18


2. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào trần

•

Thường gồm 2 giai đoạn:

Nuôi cấy để tế bào trần tái sinh thành
TB và phân chia tạo cụm nhỏ TB

Nuôi cấy tạo mô sẹo và tái sinh cây
hoàn chỉnh

 Trong tối hay trong điều kiện sáng yếu, trong MT lỏng có
lắc hay MT bán lỏng.

 Môi trường cần giàu dinh dưỡng và chất phù hợp.

 Nuôi cấy trong điều kiện chiếu sáng với QCK phù hợp, trên
MT đặc.

 Chú ý hàm lượng và tỷ lệ auxin và xytokinin để tái sinh
được cây từ callus.

19


Gđ 1

Sự phân chia của protoplast
20


Gđ 2

Tạo mô sẹo, tái sinh cây và sự phát triển của cây con từ protoplast

21


3. Kỹ thuật dung hợp tế bào trần
Dung hợp là hiện tượng cắt đứt màng sinh chất nơi tiếp xúc giữa 2 tế bào trần khác loài do tác động
của nhân tố bên ngoài. Sau đó là sự tái tổ chức các màng ban đầu thành một và bao lấy tế bào chất và
2 nhân cha mẹ.
Có 2 loại dung hợp:
Dung hợp đối xứng: dung hợp 2 tế bào trần cùng có nhân ở mức bội thể như nhau
Dung hợp không đối xứng: Tạo ra thể lai tế bào chất hay còn gọi là Cybrid. Ở đây chủ yếu là
trộn tế bào chất (DNA của ty thể và lạp thể). Một trong hai tế bào trần sẽ bị diệt nhân trước khi dung
hợp. Kết quả tạo ra các thể heteroplastid

22

23


Có 2 phương pháp dung hợp tế bào trần:
i, Dung hợp bằng hóa chất: NaCl, KCl, NaNO3, dextran sunfat, polyvinyl alcohol…..

Xử lý với NaNO3:
 là phương pháp ra đời sớm nhất (1970), do giả Cummins và Cocking đã dung hợp
thành công tế bào trần tách từ đầu rễ của ngô và yến mạch.



Để cảm ứng dung hợp, các tế bào trần được xử lý với hỗn hợp dung dịch có 5,5%
NaNO3 và 10% saccarozơ, trong 30 phút,ở nhiệt độ 350C



Phương pháp này cho hiệu suất thấp

24


Xử lý với nồng độ Ca2+ cao và pH cao
 Hỗn hợp tế bào trần tách từ thịt lá được ủ trong môi trường kiềm mạnh có 0,05M
CaCl2, 0,4M 9%(W/w) manitol, pH cao(8-10) và ly tâm nhẹ ở 50g trong 3 phút,
0
tiếp theo đem ủ trong nước ở nhiệt độ 37 C trong 45 phút.



Bằng phương pháp này, Keller và Melchers(1973) đã dung hợp thành công tế bào
trần tách từ mô dậu của 2 dòng thuốc lá

25