Phát hiện gen mcr 1 và xác định độ nhạy cảm với colistin của các chủng e coli phân lập từ phân lợn tại ba vì – hà nội, năm 2016

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
.........***........

NGUYỄN HỒNG HÀ

PHÁT HIỆN GEN MCR-1 VÀ XÁC ĐỊNH
ĐỘ NHẠY CẢM VỚI KHÁNG SINH COLISTIN CỦA
CÁC CHỦNG E. COLI PHÂN LẬP TỪ PHÂN LỢN
TẠI BA VÌ – HÀ NỘI
Chuyên ngành : Vi sinh
Mã số

: 62726801

LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC
Người hướng dẫn khoa học:
PGS.TS. Nguyễn Vũ Trung

HÀ NỘI - 2017


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành cảm ơn: Ban giám hiệu, Phòng Đào tạo sau đại học
và Bộ môn Vi sinh – Trường Đại học Y Hà Nội đã tạo mọi điều kiện thuận lợi
cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn.
Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Nguyễn Vu
Trung trưởng Bộ môn Vi sinh - Trường Đại học Y Hà Nội, người thầy đã hết

lòng dạy bảo, dìu dắt tôi trong suốt quá trình học tập và trực tiếp hướng dẫn
tôi hoàn thành luận văn này, người đã giúp tôi trưởng thành hơn trong con
đường nghiên cứu khoa học.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo và các cán Bộ môn Vi sinh
– Trường Đại học Y Hà Nội, các anh chị của Đơn vị Nghiên cứu lâm sàng
Đại học Oxford - Hà Nội đã hết lòng dạy dỗ, chỉ bảo tôi trong quá trình học
tập và thực hiện luận văn.
Tôi xin cảm ơn sự động viên, giúp đỡ của bạn bè trong suốt quá trình
học tập và hoàn thành luận văn.
Cuối cùng, tôi cũng xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới gia
đình đã dành cho tôi sự yêu thương, chăm sóc tận tình, đã động viên, giúp đỡ
và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn
thành luận văn.
Hà Nội, ngày 12 tháng 9 năm
2017
Nguyễn Hồng Hà


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số
liệu, kết quả được nêu trong khóa luận này là trung thực và chưa được công
bố trong bất kỳ một nghiên cứu nào khác.
Hà Nội, ngày 12 tháng 9 năm
2017
Tác giả
Nguyễn Hồng Hà


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
DNA

ESBL
KPC

mcr-1
MRSA
VRSA
ndm-1

MBL
PCR
MIC

Deoxyribonucleic Acid
Acid deoxyribonucleic
Extended-spectrum beta-lactamases
Enzym beta lactamase phổ mở rộng
Klebsiella pneumoniae carbapenemase
Klebsiella
pneumonia
sinh
enzym
carbapenemase
Mediated colistin resistance – 1
Gen kháng colistin trung gian plasmid - 1
Methicillin - resistant Staphylococcus aureus
Tụ cầu vàng kháng methicillin
Vancomycin - resistant Staphylococcus aureus
Tụ cầu vàng kháng vancomycin
New Delhi Metallo - beta - lactamase -1
Gen quy đinh sinh enzym Metallo beta

lactamase New Delhi - 1
Metallo - beta – lactamase
Enzym metallo - beta – lactamase
Polymerase Chain Reaction
Phản ứng khuếch đại chuỗi
Minimal Inhibitory Concentration
Nồng độ ức chế tối thiểu

XDR

Extreme Drug Resistance
Kháng thuốc mở rộng

BLAST

Basic Local Aligment Search Tool
Công cụ tìm kiếm trình tự trên ngân hàng gen

CLSI

Clinical and Laboratory Standard Institute
Viện Tiêu chuẩn Lâm sàng và Xét nghiệm


MỤC LỤC


DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC BIỂU ĐỒ


DANH MỤC HÌNH


9

ĐẶT VẤN ĐỀ
Vi khuẩn kháng kháng sinh đã trở thành mối đe dọa với y tế toàn cầu.
Nhiều vi khuẩn gây bệnh đã kháng với nhiều loại kháng sinh thế hệ mới, phổ
rộng thậm chí nhiều chủng vi khuẩn đã kháng lại với tất cả các kháng sinh
theo khuyến cáo điều trị. Các vi khuẩn Gram âm đã và đang là những vi
khuẩn gây bệnh thường gặp và kháng kháng sinh với tỉ lệ cao [1]. Tại Việt
Nam, trong số các vi khuẩn gây bệnh được phân lập, vi khuẩn Gram âm
chiếm đa số với tỉ lệ phân lập được là 78,5%, trong đó, Escherichi coli đóng
vai trò quan trọng trong các nhiễm trùng đường tiết niệu, viêm màng não,
nhiễm khuẩn huyết, nhiễm trùng đường mật. E. coli là vi khuẩn tồn tại trong
tự nhiên, trong đường tiêu hóa của gia súc. Đây là nguồn lây truyền quan
trọng đối với nhiều nhiễm trùng ở người. Nhiều chủng E. coli đã kháng lại với
các cephalosporin thế hệ 3, 4, thậm chí với cả các kháng sinh nhóm
carbapenem [2], làm cho việc lựa chọn kháng sinh điều trị gặp nhiều khó
khăn. Trên lâm sang hiện nay, colistin là kháng sinh cuối cùng được sử dụng
đối với các trường hợp nhiễm khuẩn do vi khuẩn Gram âm đa kháng kháng
sinh gây ra.
Đã có các nghiên cứu chỉ ra mối liên quan chặt chẽ giữa việc sử dụng
kháng sinh và tính đề kháng kháng sinh trên các chủng vi khuẩn đặc biệt trên
các chủng trên động vật. Đáng chú ý là khi gần đây tình trạng kháng colistin
đang gia tăng một cách báo động, với sự xuất hiện của các chủng vi khuẩn
Gram âm trong đó có E. coli mang gen mcr-1. Báo cáo đầu tiên về vi khuẩn

mang gen này được Liu và cộng sự đăng trên tạp chí Lancet năm 2015. Sau
đó đã phát hiện các chủng vi khuẩn này ở nhiều nơi trên thế giới như Trung
Quốc, Châu Phi, Mỹ, Brazil và nhiều quốc gia khác [3][4][5]. Ở Việt Nam,
còn thiếu những nghiên cứu xác định tỷ lệ mang gen mcr-1 và xác định mức


10

độ nhạy cảm kháng sinh colistin ở các chủng E. coli, nhất là các chủng tồn tại
ở gia súc, chính vì lý do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu.
“Phát hiện gen mcr-1 và xác định độ nhạy cảm với colistin của các
chủng E. coli phân lập từ phân lợn tại Ba Vì – Hà Nội, năm 2016.” với
hai mục tiêu:
1.

Xác định tỉ lệ mang gen mcr-1 ở các chủng E. coli phân lập từ phân

2.

lợn tại Ba Vì - Hà Nội, năm 2016.
Xác định mức độ nhạy cảm với colistin của các chủng E. coli mang gen
mcr-1 phân lập từ phân lợn tại Ba Vì - Hà Nội, năm 2016.


11

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
CHƯƠNG 1: Escherichia coli
Escherichia coli (E. coli) do Theodore Escherich (1857 - 1911), một nhà

vi khuẩn học người Áo, phát hiện lần đầu tiên năm 1885. Chi Escherichia
thuộc họ vi khuẩn đường ruột, tồn tại và phát triển như vi hệ trong ruột của
người cũng như các loài gia súc. Trong các loài thuộc chi này, E. coli được
chọn là loài điển hình và có vai trò quan trọng nhất trong y học. Chúng có khả
năng truyền từ động vật sang người và trong quá trình đó chúng cũng truyền
các gen kháng thuốc từ động vật sang người.

CHƯƠNG 2: Đặc điểm sinh học [6]
CHƯƠNG 3: Hình thể:
E. coli là trực khuẩn Gram âm, có lông quanh thân, di động được, rất ít
khi có vỏ, không sinh nha bào.

CHƯƠNG 4: Nuôi cấy :
•

E. coli phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường, nhiệt
độ thích hợp 37⁰C, có thể phát triển được ở nhiệt độ 5 - 40⁰C. Hiếu và kỵ

•

khí tuỳ tiện.
Môi trường canh thang: Nuôi cấy sau 3 - 4 giờ vi khuẩn phát triển làm đục
nhẹ môi trường, sau 2 ngày trên mặt môi trường có váng mỏng, những

•

ngày sau vi khuẩn lắng xuống đáy ống.
Môi trường thạch thường: Nuôi cấy sau 8 - 10 giờ có thể nhìn thấy khuẩn
lạc riêng rẽ, khuẩn lạc to, tròn, lồi, mặt nhẵn, bờ đều, đường kính khoảng

•

1,5 mm.
Môi trường chọn lọc, thạch MacConkey khuẩn lạc màu hồng đỏ, không
mọc trên môi trường SS.

CHƯƠNG 5: Tính chất sinh vật hoá học :


12

•

Lên men các đường glucose, lactose, levulose, galactose, xylose, ramnose,

•
•

manit, có sinh hơi.
Không lên men đường adonit và inozit.
Nghiệm pháp IMVIC: Dùng để phân biệt E. coli với các vi khuẩn đường
ruột khác, gồm có các phản ứng.
+ Phản ứng sinh indol (I): E. coli có I (+).
+ Phản ứng đỏ metyl (M): E. coli có phản ứng đỏ M (+).
+ Phản ứng Voges Proskauer (V): Phản ứng này dùng để kiểm tra khả
+
+

•

năng sinh ra acetyl - metyl cacbinol E. coli có phản ứng V (-)
Phản ứng kiểm tra lên men đường inozitol (I): Trên thực tế không làm.
Phản ứng tìm khả năng sử dụng cacbon từ citrate (C): E. coli phản ứng

citrat trong môi trường Simon âm tính C (-).
Ngoài ra E. coli không phân giải được ure, không sinh H₂S sau 48 giờ.

CHƯƠNG 6: Sức đề kháng
•
•

Đun E. coli ở 55°C trong 1 giờ hoặc 60°C trong 30 phút sẽ bị tiêu diệt.
Dễ bị diệt bởi các thuốc sát trùng thông thường.

CHƯƠNG 7: Kháng nguyên
•

E. coli có các kháng nguyên O, kháng nguyên H và kháng nguyên K.
Kháng nguyên O: Có khoảng 157 quyết định kháng nguyên O được đánh

•
•

số 1, 2, 3, 4 ...
Kháng nguyên H: Có tới 52 quyết định kháng nguyên H.
Kháng nguyên K: Gồm có kháng nguyên L và B không chịu nhiệt và

•

kháng nguyên А, M chịu nhiệt, kháng nguyên bề mặt K thường ngăn cản

hiện tượng ngưng kết О của vi khuẩn sống. Nếu đun sôi 1 giờ để phá huỷ
kháng nguyên K, hiện tượng ngưng kết О lại xuất hiện. Có khoảng 100
kháng nguyên K.

CHƯƠNG 8: Phân loại :
•

E. coli được đánh số theo thứ tự kháng nguyên O, kháng nguyên K và H

CHƯƠNG 9: Khả năng gây bệnh :
•

Gây bệnh ở đường tiêu hoá:


13

Nhóm ETEC (Enterotoxigenic E. coli): Là tác nhân gây tiêu chảy giống
tả (V. cholerae), có thể gây bệnh bằng một hoặc cả hai độc tố là:
+

LT (Labile toxin): Độc tố không bền với nhiệt độ, có kháng nguyên gần
giống choleragen của vi khuẩn tả. Nó tác động lên adenylcyclase, làm

+

tăng AMP vòng, dẫn tới hút nước và điện giải vào lòng ruột.
ST (Stabile toxin): Độc tố bền vững với nhiệt độ. Tác dụng của nó trên
guanylcyclase, làm tăng GMP vòng và dẫn đến hút nước và điên giải
vào lòng ruột như tác dụng của AMP vòng.

Nhóm EIEC (Enteroinvasive E. coli): Gây bệnh bằng sự xâm nhập của

E. coli vào đại tràng và gây bệnh bằng nội độc tố giống Shigella. Triệu chứng
lâm sàng như bệnh lỵ trực khuẩn.
Nhóm EPEC (Enteropathogenic E. coli): Trong thực nghiệm, vi khuẩn
thuộc nhóm này tạo ra độc tố tác động trên tế bào vero (từ đó có tên là độc tố
vero) độc tố này tương tự như độc tố của Shigella dysenteriae. Nó tác động
vào tế bào biểu mô ruột và phá huỷ nhung mao của tế bào này.
EHEC (Enterohaemorhagic Е. coli): Cơ chế gây bệnh của nhóm này
chưa được biết rõ. Nhưng người ta khẳng định rằng, nó có một độc tố, có
kháng nguyên và cơ chế tác dụng gần như ngoại độc tố của Shigella shiga.
EAEC (Enteroadherent E. coli): Gây bệnh do bám dính vào niêm mạc
ruột làm cản trờ sự hấp thu chất dinh dưỡng.
•

Gây bệnh ngoài đường tiêu hoá
E. coli có thể gây nhiễm trùng đường tiết niệu, sinh dục, nhiễm trùng

đường gan - mật, nhiễm khuẩn vết thương, vết bỏng, viêm phế quản, viêm
phổi, viêm tai giữa, viêm xoang, viêm màng não mủ ở trẻ sơ sinh, nhiễm
khuẩn huyết.

CHƯƠNG 10: Mức độ kháng kháng sinh của E. coli gây bệnh
Tại Việt Nam, E. coli gây bệnh đã giảm nhạy cảm với cephlosporin thế
hệ 3 và có tỉ lệ kháng cao với cotrimoxazole dao động từ 60-80% tại hầu hết


14

các bệnh viện. Tỉ lệ kháng với carbapenems thấp hơn 2%, trừ Bệnh viện Bệnh

Phổi Trung ương báo cáo tỉ lệ đề kháng đáng xem xét lên tới 47,7% [2].

Hình 1.1 Tỉ lệ đề kháng của E. coli với một số kháng sinh thường dùng
trong điều trị [2]


15

Bảng 1.1: Tỉ lệ E. coli sinh ESBL ở 14 bệnh viện năm 2009 [2]

Tỉ lệ sinh ESBL của các chủng E. coli và Klebsiella phân lập được tại
các bệnh viện có sự khác biệt, cao nhất ở Bệnh viện bệnh Nhiệt đới Trung
ương với tỉ lệ 54,7% trên E. coli, sau đó là Bệnh viện Chợ Rẫy với tỉ lệ 49%
(Bệnh viện đa khoa lớn nhất khu vực phía Nam), Bệnh viện Việt Đức tỉ lệ là
57,3% (Bệnh viện chuyên khoa về phẫu thuật), Bệnh viện Bình Định và hai
bệnh viện Nhi (Nhi Trung ương và Nhi đồng I) với tỉ lệ gần 40% trên E. coli.
Đây cũng là các bệnh viện có tỉ lệ E coli kháng cephalosporins thế hệ 3 cao
hơn các bệnh viện khác.

CHƯƠNG 11: Kháng sinh colistin
Colistin là kháng sinh thuộc nhóm polymixin (polymyxin E), được phát
hiện đầu tiên vào những năm 1940 nhưng đến cuối những năm 1950 mới
được đưa vào sử dụng. Trước đây, colistin đã được sử dụng chống lại nhiễm
trùng gây ra bởi vi khuẩn Gram âm kháng thuốc. Tuy nhiên, những báo cáo về
tác dụng phụ gây độc trên thận và độc thần kinh đã khiến các bác sĩ lâm sàng
cân nhắc trong việc sử dụng kháng sinh này, đặc biệt với sự xuất hiện của


16

những loại kháng sinh khác ít độc hơn (như aminoglycosides ... ). Giữa những
năm 1970 và 1990, colistin không thường được sử dụng và số lượng những
nghiên cứu phân tích việc sử dụng cũng như dược lực học của colistin là rất
hiếm. Tuy nhiên gần đây, kháng sinh này đã được sử dụng trở lại với vai trò là
lựa chọn điều trị cuối cùng đối với những vi khuẩn đa kháng như
Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae,
E. coli. Do các vi khuẩn Gram âm này ngày càng đóng vai trò quan trọng
trong những trường hợp nhiễm khuẩn và mức độ kháng kháng sinh ngày càng
tăng, colistin đóng vai trò ngày càng quan trọng. Tuy nhiên hiện nay đã ghi
nhận những chủng vi khuẩn Gram âm kháng lại colistin. Mặc dù cơ chế chính
xác gây ra kháng colistin vẫn chưa được xác định, nhưng có giả thiết cho rằng
hệ thống điều hòa gen PmrA - PmrB và PhoP - PhoQ đóng vai trò trong sự đề
kháng colistin. Và gần đây nhất đã có những nghiên cứu đưa ra sự liên quan
mật thiết giữa gen mcr-1 trên plasmid vi khuẩn và sự kháng colistin trên lâm
sàng, cũng như cơ chế kháng colistin do gen trên của vi khuẩn [3] [4].

CHƯƠNG 12: Cơ chế tác dụng và phổ kháng khuẩn, dạng
sử dụng, thải trừ thuốc.

Hình 1.2 Công thức hóa học của kháng sinh colistin
Colistin có hai dạng sử dụng colistin sulfate dùng tại chỗ và
colistimethate natri dùng toàn thân. Điều quan trọng cần lưu ý là hai dạng


17

này không thể thay thế lẫn nhau. Colistin sulfate mang điện tích dương và
ổn định, trong khi colistimethate natri mang điện tích âm và không ổn định về
mặt hóa học cả trong thực nghiệm lẫn trong cơ thể [11],[12]. Tuy nhiên,
colistimethate natri là dạng an toàn hơn nên được sử dụng đường tĩnh mạch vì

tần suất gây độc thấp hơn [13]. Vì là dạng tiền thuốc và không ổn định về mặt
hóa học, colistimethate natri dễ dàng bị thủy phân để tạo nên những dẫn xuất
sulfomethylate không hoàn chỉnh, có dạng giống như colistin sulfate một
dạng hoạt động của thuốc [13]. Sự thủy phân colistimethate natri thành
colistin này là một bước quan trọng trong hoạt tính kháng khuẩn của thuốc.
Trước khi colistin được tạo thành, colistimethate natri có rất ít hoặc không có
hoạt tính kháng khuẩn và được xem là dạng bất hoạt của colistin [13].
Colistimethate natri bị thải trừ chủ yếu qua thận, một phần thuốc sẽ được
biến đổi để tạo thành colistin có hoạt tính trong cơ thể. Colistin được tái hấp
thu tích cực tại ống thận và vì vậy được lọc bởi những cơ chế ngoài thận khác
[14],[15].
Cơ chế về khả năng diệt khuẩn của colistin được cho là rất giống với cơ
chế của polymyxin B, một đại diện khác của nhóm polymyxin đó là tác động
và làm thay đổi tính chất lớp màng vi khuẩn, gây tổn thương và phá hủy tế
bào vi khuẩn [16]. Do colistin mang nhiều điện tích dương, vừa ưa nước vừa
ưa lipid, những điện tích dương này tương tác theo cơ chế cân bằng điện tích
với lớp màng ngoài của vi khuẩn Gram âm và thế chỗ cho những ion mang
điện tích dương của lớp màng lipid, đặc biệt là calci và magie [17]. Dẫn đến
phá vỡ lớp màng ngoài và giải phóng lipopolysaccharide [18]. Sự thay đổi
tính thấm của màng tế bào vi khuẩn dẫn đến sự rò rỉ thành phần trong tế bào
và sau đó là ly giải tế bào và chết tế bào, vì vậy chúng có tác dụng diệt khuẩn
[8] [11]. Colistin cũng có khả năng gắn kết và trung hòa phân tử
lipopolysaccharide của vi khuẩn, đây chính là hoạt tính kháng nội độc tố của
thuốc [7]. Colistin có phổ kháng khuẩn hẹp mà hầu như chỉ có tác dụng với


18

các vi khuẩn Gram âm thường gặp. Quan trọng nhất là colistin có thể chống
lại những vi khuẩn Gram âm đa kháng như A. baumannii, P. aeruginosa, và

K. pneumoniae trong điều kiện thực nghiệm. Colistin cũng có hoạt tính chống
lại những vi khuẩn khác như Stenotrophomonas maltophilia, E. coli,
Salmonella species, Shigella species, Haemophilus influenzae, Bordetella
pertussis, và Legionella pneumophila [7].

CHƯƠNG 13: Cơ chế đề kháng colistin của vi khuẩn
• Một số cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn nói chung:
+

Đề kháng sinh thông qua các enzym:
Kháng carbapenem: Các vi khuẩn Gram âm đa kháng là có sự xuất hiện
các enzym kháng thuốc ESBL, KPC, hay nhóm enzym MBLs.
Kháng aminoside: Do enzym làm biến đổi nhóm Aminoglycoside

+

Đề kháng sinh qua thay đổi tính thấm của màng tế bào vi khuẩn
Kháng carbapenem: Do thay đổi protein, porin, bơm đẩy ngược ở màng
tế bào.

+

Kháng kháng sinh thông qua thay đổi đích tác động
Kháng quinolon: Do đột biến gen gyrA, parC, mexR

• Cơ chế đề kháng colistin chủ yếu là do sự thay đổi tính thấm của màng
Lipopolysarcarid (LPS) của tế bào vi khuẩn, là đích tác động chủ yếu của
colistin. Đây là cơ chế kháng của các loài vi khuẩn đặc trưng như E. coli, K.
pneumoniae, và P. aeruginosa [19]. Một cách khác gây nên kháng colistin là do
sự giảm hoạt động của các kênh protein hoặc các kênh calci, magie ở màng

ngoài tế bào vi khuẩn hoạt động của những kênh này lại phụ thuộc pH và nồng
độ các ion môi trường [9].


19

Hình 1.3 Cơ chế kháng colistin của gen mcr-1 [19]

CHƯƠNG 14: Tình trạng kháng colistin
Gần đây theo một số nghiên cứu, hình thái học và cấu trúc tế bào của
những vi khuẩn kháng colistin được phát hiện là rất khác so với những tế bào
nhạy cảm colistin. Một nghiên cứu dựa trên kính hiển vi lực nguyên tử được
thực hiện trên những chủng kháng colistin và cả chủng nhạy colistin ở những
giai đoạn sinh trưởng khác nhau. So với những vi khuẩn kháng colistin có
hình cầu ở giai đoạn tăng sinh (theo hàm logarit) sớm và giữa, những tế bào
nhạy cảm với thuốc được phát hiện có dạng trực khuẩn hình que, với sự hiện
diện của tiêm mao ở tất cả các giai đoạn. Số lượng và độ dài của tiêm mao ở
những tế bào vi khuẩn kháng colistin giảm nhiều và đây có thể là lý do việc
những tế bào này kháng colistin liên quan đến việc chúng không có khả năng
tạo được biofilm. Hơn nữa, những tế bào kháng colistin đa dạng về cấu trúc
hơn cũng như có kết cấu bề mặt trơn láng hơn. Trong giai đoạn ổn định,
những tế bào ở dạng L-form được bắt gặp nhiều hơn ở nhóm nhạy cảm với
thuốc, trong nhóm kháng thuốc lại cho thấy những tế bào đa hình thái hơn
trong giai đoạn này. Điều đáng chú ý là mức độ hủy hoại màng ngoài vi khuẩn
sau điều trị bằng colistin là tương tự ở cả tế bào nhạy và kháng thuốc, điều
này cho thấy khả năng những tế bào kháng colistin vẫn duy trì sự tương tác


20

với lớp màng ngoài. Những phát hiện này đã minh chứng rằng những nghiên
cứu chuyên biệt nhằm xem xét những cơ chế gen đằng sau sự khác biệt về
hình thái học và cấu trúc tế bào rất cần được thực hiện, để qua đó ta có thể
hiểu được nhiều hơn về sự đề kháng đối với colistin [20].
Như đã đề cập, ở những vi khuẩn đa kháng như E. coli, K. pneumoniae,
A. baumannii và P. aeruginosa sự cần thiết của những điều trị thay thế đã dẫn
đến sự trở lại của colistin. Mặc dù colistin cho thấy hiệu quả trong điều trị
nhiều loại nhiễm trùng khác nhau [8] nhưng việc sử dụng colistin nhằm điều
trị nhiễm trùng gây ra do bốn tác nhân trên gặp khó khăn bởi sự xuất hiện tình
trạng kháng thuốc. Sự gia tăng đề kháng colistin là một vấn đề rất đáng ngại.
Colistin là lựa chọn điều trị cuối cùng đối với những tác nhân gây bệnh này,
việc kháng thuốc có thể rất nguy hiểm cho bệnh nhân nếu không còn lựa chọn
điều trị nào khác.
Nhu cầu về kháng sinh thay thế trong điều trị E. coli, K. pneumoniae
ngày càng gia tăng cùng với sự gia tăng của men carbapenemases, men βlactamase phổ rộng (ESBL) và men metallo - beta- lactamase (MBL) sản sinh
ra từ những chủng khác nhau của những loại vi khuẩn này. Mặc dù những báo
cáo về sự đề kháng colistin của nhóm tác nhân này vẫn còn thưa thớt nhưng
chúng vẫn rất có ý nghĩa, bởi những lựa chọn điều trị hiện tại và trong tương
lai đối với E. coli, K. pneumoniae sinh ESBL và MBL rất hạn chế.
Trong một nghiên cứu tiến hành trên 18 mẫu phân lập được K.
pneumoniae kháng colistin (MIC > 8 mg/L) từ 13 bệnh nhân trong hơn 16
tháng tại một trung tâm chăm sóc đặc biệt ở Hy Lạp [21]. Tất cả những bệnh
nhân này đều có thời gian sử dụng colistin (trung bình 27 ngày) và nhập viện
điều trị (69 ngày) kéo dài, điều này có thể đóng góp vào việc gia tăng kháng
thuốc. Gần đây nhất, 6,8% (15 trong số 221 mẫu phân lập) [22] và 27,3% (6
trong số 22 mẫu phân lập) [23] mẫu K. pneumoniae phân lập được đã cho
thấy kháng colistin lần lượt tại miền nam Hàn Quốc và Australia. Cho thấy


21

tình trạng sử dụng kháng sinh này kéo dài là một điều kiện phát sinh tất yếu
các chủng vi khuẩn kháng thuốc.
Gen mcr-1 kháng colistin lần đầu tiên được phát hiện nằm trên plasmid
pHNSHP45 theo bài cáo của Liu và cộng sự [3]. Plasmid pHNSHP45 có kích
thước là 64015bp với tỉ lệ GC trung bình chiếm 43%, gồm 60 khung đọc mở
và có khung IncI2 (kích thước khoảng 50 kb) kiểu điển hình mã hóa gen sao
chép, chuyển ngang, duy trì và ổn định các chức năng. Gen mcr-1 có kích
thước dài 1626bp với tỉ lệ GC chiếm 49%, thuộc nhóm enzyme vận chuyển
phosphoethanolamine giúp gắn nhóm phosphoethanolamine vào lipid A làm
thay đổi cấu trúc màng vi khuẩn [24]. Hiện nay các vi khuẩn mang gen mcr-1
này đang là mối quan tâm hàng đầu của các nhà khoa học là do các vi khuẩn
mang gen này có khả năng đề kháng với tất cả các loại kháng sinh hiện có và
khả năng lan truyền không chỉ giới hạn trong một loài mà còn lan truyền một
cách nhanh chóng thông qua các plasmid sang các loài vi khuẩn khác. Đây là
một nguy cơ quan trọng tác động tới sức khỏe con người và làm tăng nguy cơ
lan truyền của vi khuẩn mang gen mcr-1 ở trong cộng đồng. Sự xuất hiện của
các vi khuẩn mang gen kháng thuốc này báo hiệu sự mở đầu của một giai
đoạn mới về tình trạng vi khuẩn kháng kháng sinh trên thế giới.
Theo báo cáo mới nhất tại Đan Mạch năm 2016, số lượng các chủng E.
coli có gen mcr-1 trong các chủng kháng kháng sinh sinh ESBL và có gen
AmpC trong bộ gen là 3% với bệnh phẩm phân lập từ máu người và trong thịt
gà [24]. Tại bệnh viện các trường Đại học ở Hy Lạp đã phân lập và thử
nghiệm độ nhạy cảm với nhiều loại kháng sinh với các chủng vi khuẩn khác
nhau, trong đó có E. coli với mức độ kháng các kháng sinh trên thử nghiệm
nhạy cảm kháng sinh là kháng impenem 55%, meropenem 25%, doripenem
30%, colistin 15%, netilmicin 25%, tigecyclin 25%. Tại Đức là một trong
những nước sử dụng colistin cao nhất ở Châu Âu, các nhà khoa học đã phát

22

hiện ra mcr-1 ở các chủng E. coli phân lập từ lợn và từ vết thương của một
người bị nhiễm trùng kháng carbapenem.

CHƯƠNG 15: Tình trạng sử dụng kháng sinh colistin trên
lâm sàng và trong chăn nuôi
Tính đến cuối năm 2015, số lượng tiêu thụ của colistin trong chăn nuôi
đã lên đến 11,942 tấn (tương ứng với 229,5 triệu USD). Nếu tình hình không
được kiểm soát, rất có thể đến cuối năm 2021, con số này sẽ còn cao lên đến
mức báo động 16,500 tấn với tỉ lệ gia tăng hằng năm là 4,75% [3]. Trước đây,
chúng ta cũng đã từng lo lắng về việc đề kháng kháng sinh như MRSA,
VRSA. Các nhà khoa học đã cảnh báo về việc vancomycin sẽ trở nên không
còn tác dụng đối với các vi khuẩn kháng thuốc. Tuy nhiên, thực tế trong vòng
15 năm cho thấy, chỉ có 14 ca trên toàn nước Mỹ là không chữa được với các
vi khuẩn kháng vancomycin. Song tình hình hiện tại lại là một cục diện hoàn
toàn khác, colistin đã bị lạm dụng quá nhiều trong chăn nuôi, điều này khiến
cho việc xuất hiện và lan truyền gen đề kháng từ động vật sang người bị mất
kiểm soát và không hề được chú ý. Sự phát triển của các vi khuẩn có khả năng
đề kháng tất cả các loại kháng sinh là hoàn toàn có thể xảy ra, vấn đề chỉ nằm
ở thời gian. Với việc chưa kiểm soát chặt chẽ được lượng thuốc kháng sinh sử
dụng trong chăn nuôi, Việt Nam cũng không nằm ngoài cục diện này. Năm
2015, theo thống kê có trên 17 loại kháng sinh được sử dụng tại các trang trại
chăn nuôi. Trong đó, các loại kháng sinh được sử dụng phổ biến là
norfloxacin,

tylosin,

gentamycin,

doxycyclin,

tiamulin,

colistin

và

enrofloxacin.

CHƯƠNG 16: Các nghiên cứu trên thế giới và tại Việt Nam về tình hình
kháng colistin ở E. coli


23

CHƯƠNG 17: Trên thế giới
Đối với kháng colistin ở vi khuẩn Gram âm gây bệnh trên người, y văn
chỉ ghi nhận cơ chế đề kháng do đột biến gen trên nhiễm sắc thể của vi khuẩn.
Tuy nhiên, trong một nghiên cứu mới được công bố ngày 18/11/2015 trên tạp
chí Truyền nhiễm của Lancet, Yi-Yun Liu, Yang Wang và cộng sự đã công bố
một gen mcr-1 trên plasmid có thể lan truyền gen kháng colistin trên người và
động vật ở Quảng Đông, Trung Quốc. Gen mcr-1 được phát hiện ở vi khuẩn
Gram âm từ 15% mẫu thịt sống từ chợ, 21% động vật ở lò mổ trong năm
2011-2014, và 1% ở các bệnh nhân nội trú bị các bệnh nhiễm trùng. Gen mcr1 giống với gen phosphoethanolamine transferase, có trong một số vi khuẩn
sinh và vi khuẩn sống trong môi trường [3]. Gần đây nhất tại Mỹ, Bộ Quốc
phòng Mỹ thông báo đã xác định được gen kháng colistin đầu tiên mcr-1 ở E.
coli trên người. Ngoài ra họ còn tìm kiếm được gen kháng colistin này của E.
coli trên các mẫu thức ăn gia súc, thịt, và một mẫu duy nhất từ ruột lợn [4].
Tại Brazil, theo một nghiên cứu mới nhất được công bố ngày 8/8/2016 cũng

đã phát hiện ca lâm sàng đầu tiên nhiễm E. coli có mang gen mcr-1 [5]. Ở
châu Âu đã đưa ra các khuyến cáo về tình trạng gia tăng gen kháng colistin
mcr-1 do việc sử dụng kháng sinh một cách bừa bãi trong thức ăn chăn nuôi
và vai trò của việc sàng lọc gen mcr-1 trên các mẫu bệnh phẩm từ người cũng
như các mẫu từ môi trường.

CHƯƠNG 18: Tại Việt Nam
Hiện nay còn thiêu những nghiên cứu được thực hiện về việc sàng lọc gen
kháng colistin mcr-1 của E. coli trên mẫu ở người cũng như mẫu phân động vật
và xác định mức độ nhạy cảm kháng sinh của các chủng mang gen đó.

CHƯƠNG 19: Các kỹ thuật kháng sinh đồ [27]
CHƯƠNG 20: Kỹ thuật khoanh giấy khuếch tán


24

Nguyên lý: Kháng sinh trong khoanh giấy sẽ khuếch tán vào đĩa thạch
Mueller - Hinton đã được ria cấy các chủng vi khuẩn cần thử nghiệm. Mức độ
nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh sẽ được biểu hiện bằng đường kính các
vòng ức chế vi khuẩn xung quanh khoanh giấy kháng sinh.
• Ưu điểm: Giá thành rẻ, đơn giản và dễ thực hiện
• Nhược điểm: Kĩ thuật này chỉ phát hiện được mức độ nhạy cảm với nồng
độ kháng sinh đã biết trước và chỉ có tính chất định tính.

CHƯƠNG 21: Kỹ thuật xác định nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế sự
phát triển của vi khuẩn (MIC)
Kĩ thuật kháng sinh hòa đều trong môi trường lỏng hoặc môi trường thạch
Nguyên lý: Các chủng vi khuẩn thử nghiệm được nuôi cấy trong các
ống canh thang hoặc trên các đĩa thạch Mueller-Hinton có nồng độ kháng sinh

khác nhau theo tiêu chuẩn của CLSI và được ủ ở 37⁰C qua đêm (khoảng 18
giờ). Nồng độ kháng sinh tối thiểu có tác dụng ức chế vi khuẩn được xác định
khi quan sát bằng mắt thường với ống canh thang là sự làm đục môi trường
của vi khuẩn, với đĩa thạch là sự xuất hiện khuẩn lạc.
• Ưu điểm: Kĩ thuật được chuẩn thức được áp dụng nhằm xác định nồng độ
kháng sinh nhỏ nhất ức chế sự phát triển của vi khuẩn, kết quả giúp các
bác sỹ lựa chọn và tính toán liều kháng sinh cho bệnh nhân.
• Nhược điểm: Giá thành cao, phức tạp, đòi hỏi trang thiết bị và cán bộ có
kinh nghiệm để thực hiện.
Kĩ thuật thanh giấy E-test
Nguyên lý: E-test kết hợp nguyên lý của cả hai phương pháp khoanh
giấy khuếch tán và kháng sinh đồ pha loãng.
•
•

Ưu điểm: Đơn giản dễ thực hiện, cho được cả kết quả MIC cụ thể.
Nhược điểm: Kết quả bị ảnh hưởng bởi ngoại cảnh như môi trường thạch
kĩ thuật nuôi cấy.


25

Sử dụng hệ thống máy tự động
Nguyên lý: Giống như nguyên lý của kháng sinh đồ pha loãng nhưng
được cài đặt trong hệ thống máy tự động và đọc kết quả sau mỗi 15 phút, kết
quả cuối cùng sẽ đọc sau 18-24 giờ.
•

Ưu điểm: Tiện lợi, cho kết quả có độ chính xác cao.

•

Nhược điểm: Chi phí cao do cần dùng trang thiết bị, sinh phẩm hóa chất
đắt tiền, cần có những người được đào tạo mới có thể sử dụng máy.

CHƯƠNG 22: Xác định gen liên quan đến kháng colistin, mcr-1 của E.
coli bằng PCR [28]
Phương pháp PCR (polymerase chain reaction) do Karl Mullis và cộng
sự phát minh ra năm 1985 là phương pháp in vitro để nhân lên một đoạn DNA
nào đó, có độ nhạy rất cao, mà chỉ cần một số lượng mẫu ban đầu hạn chế.
Kĩ thuật này dựa trên nguyên lý tất cả các DNA polymerase khi hoạt
động tổng hợp một mạch DNA mới từ khuôn đều cần sự hiện diện của những
mồi chuyên biệt. Mồi là những đoạn DNA có độ dài khoảng từ 18-40
nucleotit, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và DNA
polymerase sẽ dùng dNTPs nối dài mồi hình thành mạch DNA mới bổ sung
với DNA khuôn (tùy vào mục đích nghiên cứu, sẽ lựa chọn mồi riêng để có
được đoạn DNA cần tổng hợp). Nhờ đó, từ một khối lượng mẫu ban đầu hạn
chế tạo ra đủ lượng DNA cần thiết có thể quan sát được dưới ánh sáng UV sau
khi điện di sản phẩm PCR trên gel agarose.
Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm
3 bước: Giai đoạn biến tính tách đôi sợi DNA (denaturation), giai đoạn bắt
cặp (annealing), giai đoạn kéo dài (elongation – extension).