Xác định gen kháng thuốc của các chủng Salmonella gây ngộ độc thực phẩm được phân lập từ thịt tươi tại một số địa điểm ở Hà Nội (LV thạc sĩ)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGUYỄN THỊ NHÃ QUYÊN

XÁC ĐỊNH GEN KHÁNG THUỐC
CỦA CÁC CHỦNG SALMONELLA GÂY NGỘ ĐỘC
THỰC PHẨM ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ THỊT TƯƠI
TẠI MỘT SỐ ĐỊA ĐIỂM Ở HÀ NỘI

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

THÁI NGUYÊN - 2017


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGUYỄN THỊ NHÃ QUYÊN

XÁC ĐỊNH GEN KHÁNG THUỐC
CỦA CÁC CHỦNG SALMONELLA GÂY NGỘ ĐỘC
THỰC PHẨM ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ THỊT TƯƠI
TẠI MỘT SỐ ĐỊA ĐIỂM Ở HÀ NỘI
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 60.42.02.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Nghiêm Ngọc Minh

THÁI NGUYÊN - 2017


i
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do tôi trực tiếp thực
hiện với sự giúp đỡ của cán bộ, nhân viên phòng Hệ gen học vi sinh - Viện
nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam dưới sự
hướng dẫn khoa học của PGS. TS. Nghiêm Ngọc Minh. Các số liệu, kết quả
trình bày trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố ở bất kỳ
công trình nào khác.
Thái Nguyên, tháng 5 năm 2017
Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Nhã Quyên


ii
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân
thành và sâu sắc nhất của mình tới PGS.TS. Nghiêm Ngọc Minh - Trưởng
phòng Hệ gen học vi sinh - Viện Nghiên cứu hệ gen - Viện Hàn lâm Khoa
học và Công nghệ Việt Nam, người đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi trong
quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn.
Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu; phòng Đào tạo; khoa Công
nghệ sinh học Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên, các quý
thầy, cô trực tiếp giảng dạy, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên
cứu khoa học.
Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Võ Thị Bích Thủy, ThS. Nguyễn Hoài Thu
và các anh chị em, cán bộ phòng Hệ gen học vi sinh - Viện Nghiên cứu hệ gen Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã nhiệt tình hướng dẫn, giúp

đỡ và đóng góp nhiều ý kiến quý báu để tôi hoàn thành luận văn này.
Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè cùng tất cả các thầy cô luôn
luôn động viên, khuyến khích và giúp đỡ tôi trong tiến trình tôi học tập và làm
luận văn này.
Trong quá trình làm luận văn không tránh khỏi những sai sót, tôi mong
nhận được sự đóng góp quý báu từ phía thầy cô và bạn bè để tôi có thể có
được kết quả tốt hơn.
Thái Nguyên, tháng 5 năm 2017
Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Nhã Quyên


iii
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................. i
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................. ii
MỤC LỤC ....................................................................................................... iii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT .............................. vi
DANH MỤC BẢNG ...................................................................................... vii
DANH MỤC HÌNH ...................................................................................... viii
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài ....................................................................................... 1
2. Mục tiêu nghiên cứu.................................................................................. 2
3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................. 2
4. Ý nghĩa khoa học của đề tài ...................................................................... 2
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 3
1.1.Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn Salmonella ....................................... 3
1.1.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới.................................................. 3
1.1.2. Tình hình nghiên cứu trong nước.................................................... 5

1.2. Một số đặc điểm của vi khuẩn Salmonella ............................................ 7
1.2.1. Đặc điểm hình thái .......................................................................... 8
1.2.2. Đặc tính nuôi cấy ............................................................................ 8
1.2.3. Đặc tính hóa sinh........................................................................... 10
1.2.4. Cấu trúc của Salmonella ............................................................... 10
1.2.5 Các yếu tố gây bệnh của Salmonella ............................................. 12
1.3. Tình hình ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn Salmonella ....................... 13
1.3.1. Ngộ độc thực phẩm ....................................................................... 13
1.3.2. Ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn Salmonella ................................ 14
1.4. Hiện tượng kháng kháng sinh của Salmonella..................................... 15
1.4.1. Hiện tượng kháng kháng sinh của vi khuẩn .................................. 15


iv
1.4.2. Hiện tượng kháng kháng sinh của Salmonella ............................. 15
1.5. Gen kháng kháng sinh .......................................................................... 16
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................. 19
2.1. Vật liệu ................................................................................................. 19
2.1.1. Thu thập và phương pháp lấy mẫu ................................................ 19
2.1.2. Hóa chất nghiên cứu ..................................................................... 19
2.2. Phương pháp nghiên cứu...................................................................... 20
2.1.1. Nuôi cấy và phân lập vi khuẩn Salmonella................................... 20
2.2.2. Định type vi khuẩn Salmonella ..................................................... 21
2.2.3. Thử khả năng kháng kháng sinh ................................................... 21
2.2.4. Phương pháp xác định một số gen kháng kháng sinh của chủng
Salmonella Typhimurium bằng phương pháp RT-PCR ......................... 22
2.3. Phương pháp xử lý số liệu.................................................................... 25
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 26
3.1. Thu thập mẫu ở một số loại thịt tươi .................................................... 26
3.2. Nuôi cấy, phân lập vi khuẩn Salmonella spp. trên các môi trường

cơ bản .......................................................................................................... 27
3.1.1. Kết quả xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella spp. trong
mẫu thịt lợn, gà, bò ................................................................................. 27
3.1.2. Kết quả giám định các đặc tính sinh hóa của các chủng vi khuẩn
Salmonella spp. phân lập được ............................................................... 29
3.2. Kết quả định type vi khuẩn Salmonella phân lập được ....................... 30
3.3. Kết quả xác định tính kháng kháng sinh của các chủng Salmonella
Typhimurium gây ngộ độc thực phẩm phân lập được ................................ 32
3.4. Kết quả phát hiện và đánh giá gen kháng thuốc của các chủng
Salmonella Typhimurium gây ngộ độc thực phẩm phân lập được ............. 35
3.4.1 Kết quả tách chiết RNA tổng số: Lựa chọn 3 chủng Salmonella
Typhimurrium S181, S360, S384 để tiến hành tách chiết RNA. ............ 35


v
3.4.2. Kết quả RT-PCR phát hiện các gen kháng kháng sinh của chủng
Salmonella Typhimurium. ...................................................................... 35
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 43
1. Kết luận ................................................................................................... 43
2. Kiến nghị ................................................................................................. 43
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 45


vi
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
bp

: Base pair

cs

: Cộng sự

dH2O

: Nước khử ion

DNA

: Deoxyribonucleic acid

dNTP

: deoxyribonucleotide triphosphates

EDTA

: Ethylene Diamine Tetraacetace Axit

EtBr

: Ethidium Bromide

Kb

: Kilobase

OD

: Optical density

PCR

: Polymerase Chain Reaction

RNA

: Ribonucleic acid

RT-PCR

: Reverse transcription - Polymerase Chain Reaction

TAE

: Tris-acetate-EDTA


vii
DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1.

Trình tự mồi và nhiệt độ gắn mồi của các gen sử dụng trong
nghiên cứu .......................................................................... 24

Bảng 3.1

Danh sách thu thập mẫu thịt tươi tại một số địa điểm ở Hà Nội 26

Bảng 3.2.

Tỷ lệ phân lập vi khuẩn Salmonella spp. từ các mẫu thịt ........... 27

Bảng 3.3.

Kết quả giám định đặc tính nuôi cấy và hình thái khuẩn lạc của
các chủng Salmonella spp. trong quá trình phân lập .................. 29

Bảng 3.4.

Kết quả giám định một số đặc tính sinh hoá của các chủng vi
khuẩn Salmonella spp. phân lập được ........................................ 30

Bảng 3.5.

Kết quả xác định serotype của các chủng vi khuẩn
Salmonella spp. .......................................................................... 31

Bảng 3.6.

Tổng hợp kết quả kháng các nhóm kháng sinh của 3 type
Salmonella Typhimurium (ST) phân lập được ........................... 33

Bảng 3.7.

Kết quả đánh giá gen kháng kháng sinh của các chủng
Salmonella Typhimurium S181, S360, S384 ............................. 41


viii

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1.

Vi khuẩn Salmonella ............................................................... 8

Hình 2.1.

Sơ đồ nuôi cấy và phân lập vi khuẩn Salmonella theo tiêu
chuẩn ISO 6579 - 2005.......................................................... 20

Hình 3.3.

Kết quả mức độ kháng các nhóm kháng sinh của 3 type
Salmonella Typhimurium (ST) phân lập được ....................... 33

Hình 3.4.

Kết quả điện di đồ sản phẩm RNA tổng số của 3 chủng
Salmonella 1,2,3: S181, S360, S384 ...................................... 35

Hình 3.5.

Kết quả RT-PCR phát hiện sự có mặt của gen 16S (550 bp) của
chủng Salmonella Typhimurium S181, S360, S384............... 36

Hình 3.6.

Kết quả RT-PCR phát hiện sự có mặt của gen tetA (494bp), sull II
(434bp, avrA (192bp), aadA (228bp), blaTEM (310bp), gyrB
(219bp), prmA (187bp) của chủng Salmonella Typhimurium S181,

S360, S384 M: thang chuẩn (DNA 1Kb).................................... 37

Hình 3.7.

Tỷ lệ biểu hiện gen tetA, sull II, avrA, aadA, blaTEM, gyrB,
prmA/16S rRNA của chủng Salmonella Typhimurium được
phân tích bằng phương pháp RT-PCR. Gen 16S rRNA được
dùng để so sánh ..................................................................... 39


1

MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Trong những năm gần đây, vấn đề ngộ độc thực phẩm ngày càng trở
nên cấp thiết, các báo cáo cho thấy phần lớn các vụ ngộ độc thực phẩm là
do vi sinh vật. Đã có nhiều cảnh báo nhưng ngộ độc thực phẩm vẫn đang
gia tăng và ngày càng nghiêm trọng. Theo số liệu thống kê của Cục vệ sinh
An toàn thực phẩm, Bộ Y tế, mỗi năm Việt Nam có chừng 250-500 vụ ngộ
độc thực phẩm với 7.000-10.000 nạn nhân và 100 - 200 ca tử vong. Tính
riêng năm 2008, có 205 vụ ngộ độc thực phẩm, với 7828 người mắc, 161
người chết, trong đó 7,8% số vụ do nguyên nhân vi sinh vật gây ra. Sáu
tháng đầu năm 2014, có 67 vụ ngộ độc thực phẩm với 2048 người mắc, 24
trường hợp tử vong.
Có rất nhiều loài vi sinh vật gây ngộ độc thực phẩm như Clostridium
butolinum, Escherichia coli, Listeria monocytogenes... Trong đó, Salmonella
được biết đến là vi khuẩn hàng đầu gây ngộ độc thực phẩm trên thế giới với
các triệu chứng như buồn nôn, nhức đầu, sốt nhẹ, sau đó xuất hiện nôn mửa
và tiêu chảy nhiều lần, có thể lẫn máu. Thường thì bệnh nhân có thể tự khỏi,
nhưng đối với trẻ em, người già hoặc người bị suy giảm miễn dịch bệnh có

thể gây nguy hiểm đến tính mạng. Mặc dù nhiễm trùng đường ruột do các
chủng Salmonella thường tự khỏi, nhưng việc điều trị kháng sinh để ngăn
chặn quá trình lây lan nhiễm trùng vẫn là điều cần thiết.
Việc lạm dụng kháng sinh trong điều trị cả người và động vật có thể
ảnh hưởng đến khả năng kháng thuốc của Salmonella. Các chủng Salmonella
gây ngộ độc thực phẩm kháng thuốc phân lập được là mối đe dọa trực tiếp
đến sức khỏe của con người do các chủng kháng thuốc này sẽ cản trở việc
điều trị và là mối đe dọa gián tiếp khi sự kháng có thể được chuyển giao cho
các mầm bệnh khác ở người. Do vậy việc giám sát tính mẫn cảm kháng sinh
là quan trọng và cần thiết.


2
Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn và tầm quan trọng của việc bảo vệ sức
khỏe con người chúng tôi đã tiến hành đề tài "Xác định gen kháng thuốc
của các chủng Salmonella gây ngộ độc thực phẩm được phân lập từ thịt
tươi tại một số địa điểm ở Hà Nội”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Xác định được gen kháng thuốc của chủng Salmonella gây ngộ độc
thực phẩm phân lập từ thịt tươi tại một số địa điểm ở Hà Nội.
3. Nội dung nghiên cứu
- Xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella trong các mẫu thịt tươi (gồm:
thịt lợn, thịt gà, thịt bò) thu thập tại các địa điểm khác nhau trên địa bàn Hà Nội.
- Nuôi cấy, phân lập và định type các chủng Salmonella từ các mẫu thịt,
xác định các chủng Salmonella gây ngộ độc thực phẩm.
- Kiểm tra sự biểu hiện của gen kháng thuốc từ chủng Salmonella
Typhymurium gây ngộ độc thực phẩm phân lập được.
4. Ý nghĩa khoa học của đề tài
Xác định được các gen kháng thuốc của chủng vi khuẩn Salmonella
gây ngộ độc thực phẩm giúp cho việc nghiên cứu các bộ kit chẩn đoán nhanh

vi khuẩn Salmonella trong thực phẩm.


3
Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn Salmonella
1.1.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Năm 1891, Jensen đã phân lập được Salmonella Dublin từ bệnh phẩm của
bê bị tiêu chảy. Cũng vào năm đó Salmonella typhimurium được phát hiện ở
vùng Greiswald và Breslau (Đức). Vào năm 1983, tại Breslau đã xảy ra một vụ
ngộ độc thịt do ăn phải thịt bò ốm, kết quả ngộ độc đã xảy ra ở người [61].
Vi khuẩn Salmonella được phân lập từ thịt lợn chết bởi bệnh phó thương
hàn thường gặp ở miền Tây của nước Mỹ là S. choleraesuis var kunzendorf, S.
typhimurium và S. typhisuis [28]. Trong một vài trường hợp, ở lợn còn tìm
thấy S. dublin và S. enteritidis. Hai serotype S. dublin và S. enteritidis cũng gặp
ở lợn con đang theo mẹ.
Từ những năm 1990 trở lại đây tỷ lệ nhiễm Salmonella ở Châu Âu đều
không giảm, trong năm 2007 có khoảng 152.000 ca nhiễm Salmonella trên
người được phát hiện tuy nhiên con số thực tế có thể cao gấp 10 lần.
Salmonellosis là bệnh nhiễm trùng đường ruột phổ biến thứ hai tại Hoa Kỳ.
Trung tâm kiểm soát và phòng ngừa dịch bệnh Hoa Kỳ (CDC) ước tính có hơn
1 triệu người nhiễm Salmonella, ơ Mỹ mỗi năm và trung bình có khoảng
20.000 ca nhập viện và gần 400 trường hợp tử vong do nhiễm Salmonella, theo
một báo cáo năm 2011 [60]. Tháng 11/2013, tại thành phố Brisbane của
Queensland (Australia) cũng xảy ra vụ ngộ độc thực phẩm nghiêm trọng do vi
khuẩn Salmonella khiến 1 phụ nữ 77 tuổi thiệt mạng và hơn 220 người nhiễm
bệnh. Nguyên nhân gây ra vụ việc do vi khuẩn Salmonella có trong trứng, thịt
gia cầm và các loại thịt chưa được nấu chín [40]. Theo thông tin mới nhất được
công bố vào 2/4/2015 bởi tổ chức Y tế thế giới (WHO), cho thấy mối đe dọa từ

các bệnh truyền nhiễm qua thực phẩm do vi khuẩn gây lên. Những con số được


4
công bố khiến người tiêu dùng trên toàn thế giới không khỏi hoang mang. Bao
gồm 582 triệu các ca mắc phải một trong 22 căn bệnh truyền qua thực phẩm;
351.000 số ca tử vong liên quan đến an toàn thực phẩm trong đó có 52.000 ca
tử vong do vi khuẩn Salmonella gây nên, 37.000 số ca tử vong do vi khuẩn
E.coli, 35.000 người chết do norovirus (loại virus là nguyên nhân hàng đầu gây
nên dịch bệnh từ thực phẩm bị ô nhiễm tại Hoa Kỳ), và 40% là tỷ lệ người ở độ
tuổi dưới 5 mắc các bệnh truyền nhiễm qua thực phẩm.
Điều đáng chú ý nhất ở vi khuẩn Salmonella là sự gia tăng khả năng
kháng thuốc của vi khuẩn này. Trong những năm gần đây, tốc độ gia tăng tính
kháng kháng sinh của vi khuẩn Salmonella đã được báo cáo nhiều ở các nước
phát triển và cả những nước đang phát triển (Báo cáo của Bộ Y tế, 2008). Các
nhà nghiên cứu của Wellcome Trust đã lập bản đồ mã gen trên 1.832 đối
tượng nhiễm khuẩn Salmonella typhimurium thu thập từ 63 quốc gia trong
khoảng thời gian từ năm 1992 đến 2013 cho thấy gần một nửa số vi khuẩn
không hề bị tiêu diệt bởi những loại kháng sinh theo quy chuẩn. Trong nghiên
cứu mô tả các dữ liệu từ các chương trình giám sát tỷ lệ vi khuẩn kháng thuốc
trong thịt gà của Brazil (PREBAF) từ thời gian tháng 9/2004 đến tháng
7/2006 cho thấy trong 2.679 mẫu thịt gà thu thập được tại 15 bang thuộc 5
khu vực địa lý của đất nước có tới 8,9% (trung bình 2,7%) mẫu nhiễm
Salmonella spp. Trong đó chủ yếu nhiễm 4 loài Enteritidis (48,8%), Infantis
(7,6%), Typhimurium (7,2%) và Heidelberg (6,4%), nhưng nguy hiểm là các
chủng đa kháng thuốc xuất hiện với tỷ lệ cao 53,2% (133 chủng/250 chủng
thử nghiệm kháng thuốc) [43]. Trong nghiên cứu 236 mẫu nước sông ở Đài
Loan, có 54 mẫu (chiếm 22,9%) nhiễm Salmonella ssp, 15 chủng Salmonella
được phân lập xuất hiện cả một số typ thường gây nhiễm trùng cho người và
gia súc, bao gồm Albany (27,8%), Newport (14,8%), Bareilly (13,0%), Derby

(11,1%) và Typhimurium (7,4%). Đặc biệt 51,9% các mẫu kháng với ít nhất 1


5
trong 8 loại kháng sinh được thử nghiệm do trong các chủng vi khuẩn này tồn
tại các gen kháng thuốc [43].
Các nhà khoa học cũng đã chứng minh rằng trong bộ gen của các loài
vi khuẩn Salmonella gây bệnh có một loạt các gen liên quan đến việc ứng phó
với điều kiện thiếu dưỡng chất, sức đề kháng kháng sinh, sự trao đổi chất sắt
và các phản ứng sốc nhiệt [58]. Một số gen hilA, prgH, invF được phát hiện
có mối quan hệ rất lớn đến khả năng kháng tetracycline của 2 chủng vi khuẩn
Salmonella Typhimurium DT 104 và DT 193 [32]. Ngoài ra, amR là một yếu
tố phiên mã của protein Rama, một yếu tố đa kháng quan trọng cũng được tìm
thấy trong vi khuẩn [72] hoặc các gen kháng thuốc của Salmonella
Typhimurium và Salmonella Newport thường được đặt trên plasmid CMY-2
[39]. Sahu (2013) cũng đã phát hiện ra 1 vùng đột biến tại locus 1 có khả năng
đa kháng thuốc ở vi khuẩn S. typhimurium [59].
Hiện nay, trên thế giới vẫn tiếp tục có các nghiên cứu về các gen kháng
thuốc của vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm, đặc biệt là vi khuẩn Salmonella
nhằm xác định chính xác cơ chế đa kháng thuốc của các vi khuẩn Salmonella
gây ngộ độc thực phẩm.
1.1.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
Tại Việt Nam, một số nghiên cứu về sự ô nhiễm Salmonella đã được
thực hiện và công bố. Salmonella thường được tìm thấy trên thịt gà, thịt lợn,
đồ nguội, trứng sống, nghêu sò ... là nguyên nhân của 70% vụ ngộ độc. Trong
tổng số 1.416 mẫu thịt và sản phẩm từ thịt qua kiểm tra đã phát hiện tới
40,9% số mẫu nhiễm khuẩn Salmonella gây các bệnh về đường tiêu hóa. Vi
khuẩn Salmonella và bệnh do chúng gây ra cho người và gia súc cũng đã
được bắt đầu từ những năm 50. Viện Parteur Sài gòn trong những năm 19511953 đã phân lập được 6 chủng Salmonella ở người (4 chủng từ máu, 2 chủng
từ nước tiểu). Cũng ở Sài gòn, trong thời gian này cũng đã phân lập được 35

chủng từ 360 lợn, trong đó có 23 mẫu là S. choleraesuis [1].


6
Lê Văn Tạo và Nguyễn Thị Vui (1994) đã phân lập và xác định
serotype của vi khuẩn Salmonella gây bệnh ở lợn, kết quả cho thấy: 50% các
chủng được phân lập thuộc S. Choleraesuis; 12,5% S. Enteritidis; 6,25% S.
Typhimurium và một số loại còn lại thuộc các serotype khác [18].
Trần Xuân Hạnh (1995) đã phân lập và giám định vi khuẩn Salmonella
ở lợn tại Thành phố Hồ Chí Minh cho kết quả: S. Typhisuis ở lợn bệnh là
16,9%; ở lợn bình thường 6-16 tuần tuổi là 4,2%; S. Paratyphi ở lợn 6-16 tuần
tuổi là 2,8% [6].
Năm 2003, Võ Thị Bích Thủy nghiên cứu tình hình nhiễm Salmonella
trên thực phẩm tại Hà Nội thấy tỷ lệ nhiễm cao nhất ở giò sống là 46,67%,
tiếp theo là thịt bò 40%, thịt gà 39,29%, thấp nhất là thịt lợn 33,33% [25].
Cũng trong năm này, Lê Minh Sơn đã xác định tỷ lệ nhiễm Salmonella trong
thịt lợn giết mổ tiêu dùng nội địa từ 10,91-16,67% và thịt lợn xuất khẩu trung
bình 1,42% [15]. Tô Liên Thu (2005) đã xác định tỷ lệ nhiễm Salmonella của
các mẫu thịt gà ở Hà Nội là rất cao 33% các mẫu lấy tại siêu thị, 40% các mẫu
lấy tại chợ [22].
Tại các lò mổ là một trong những địa điểm rất quan trọng có nguy cơ
cao ô nhiễm Salmonella vào thân thịt sau khi giết mổ. Trần Thị Hạnh và cs
(2009) đã công bố tỷ lệ nhiễm Salmonella tại các cơ sở giết mổ lợn công
nghiệp và cho kết quả: Chất chứa manh tràng của lợn là 59,18%, ở mẫu lau
thân thịt là 70%, mẫu lau hậu môn là 66%, mẫu lau nền chuồng nhốt lợn chờ
giết mổ là 40%, mẫu lau sàn nhà giết mổ là 28%, còn các mẫu nước kiểm tra
không phát hiện Salmonella. Tại các cơ sở giết mổ lợn theo phương thức thủ
công cho thấy tỷ lệ nhiễm Salmonella ở chất chứa manh tràng của lợn chờ
giết mổ là 87,5%, ở các mẫu lau thân thịt là 75%, mẫu lau hậu môn là 55%,
mẫu lau nền chuống nhốt lợn chờ giết mổ là 70%, mẫu lau sàn giết mổ là

80%, mẫu nước là 50% [7].


7
Ở nước ta, chăn nuôi lợn, gia cầm và thủy sản thường được bổ sung
nhiều loại kháng sinh với mục đích kích thích tăng trưởng, phòng bệnh và
điều trị, do vậy nồng độ kháng sinh tồn dư trong thịt thường cao gấp vài lần
so với các quốc gia khác. Các nhà nghiên cứu Nhật Bản và Việt Nam đã thực
hiện nghiên cứu về sự lan tràn của các chủng Salmonella kháng kháng sinh
trong thịt lợn và thịt gia cầm bán lẻ ở miền Bắc Việt Nam. Kết quả phát hiện
được 118 mẫu dương tính với vi khuẩn Salmonella phân lập từ 283 mẫu thịt
bán lẻ (135 mẫu thịt lợn, 148 mẫu thịt gà) [65].
Cùng với các quá trình nghiên cứu chi tiết về vi khuẩn, các biện pháp
phòng bệnh đã được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu, trong đó có
vacxin phòng bệnh. Nguyễn Văn Lãm (1968) đã tiến hành nghiên cứu chế
vacxin phó thương hàn lợn con từ chủng Salmonella chuẩn của Trung Quốc.
Hiện nay, các loại vacxin phòng bệnh phó thương hàn đã được một số công ty,
xí nghiệp thuốc thú y sản xuất như vacxin nhược độc chủng TS-177, vacxin có
bổ trợ như vacxin keo phèn hay vacxin nhũ hóa có bổ trợ dầu [8].
Trong những năm gần đây, ở Việt Nam hầu hết các nghiên cứu chỉ
tập trung vào tìm hiểu tính kháng kháng sinh và các gen kháng kháng sinh
ở các vi sinh vật gây bệnh phân lập từ các mẫu bệnh phẩm hoặc động vật.
Các nghiên cứu về gen cũng như cơ chế kháng kháng sinh của các vi sinh
vật gây bệnh phân lập từ thực phẩm chưa được đề cập nhiều, đặc biệt là
nhóm vi khuẩn Salmonella Typhimurium gây ngộ độc thực phẩm. Như vậy,
việc nghiên cứu vi khuẩn Salmonella Typhimurium gây ngộ độc thực phẩm
một cách toàn diện để từ đó đề ra biện pháp phòng chống bệnh hiệu quả,
giữ gìn vệ sinh an toàn thực phẩm, bảo vệ sức khỏe con người là một yêu
cầu cần thiết.
1.2. Một số đặc điểm của vi khuẩn Salmonella

Vi khuẩn Salmonella thuộc họ vi khuẩn đường ruột do Salmon và
Smith phát hiện vào năm 1886 khi xác định Salmonella Choleraesuis là


8
nguyên nhân gây bệnh dịch tả lợn (Hog Cholera) [17]. Trực khuẩn Salmonella
thuộc bộ Enterobacteriales, họ Enterobacteriaceae. Giống Salmonella gồm
hai loài: S. Enterica và S. Bongori đã được phân chia thành trên 3000
serotype theo bảng phân loại Kauffmann-White trên cơ sở cấu trúc của kháng
nguyên thân O, kháng nguyên lông H và đôi khi có cả kháng nguyên vỏ
(kháng nguyên K).
1.2.1. Đặc điểm hình thái
Vi khuẩn Salmonella là trực khuẩn hình gậy ngắn, hai đầu tròn, có kích
thước khoảng 0,4 - 0,6 x 1 - 3 m, không hình thành giáp mô và nha bào, có
lông và di động được (trừ Salmonella Pullorum-gallinarum).

Hình 1.1. Vi khuẩn Salmonella
Vi khuẩn bắt màu gram âm. Vi khuẩn có cả kháng nguyên thân O
(Ohne Hauch) và kháng nguyên lông H (Hauch), chỉ có một số loài như
Salmonella Typhi, Salmonella Paratyphi, Salmonella Dublin có thể chứa
kháng nguyên Vi (là loại kháng nguyên có khả năng ngưng kết kháng thể O
khi nó phát triển nhiều).
1.2.2. Đặc tính nuôi cấy
Salmonella là trực khuẩn vừa hiếu khí vừa yếm khí, nhiệt độ thích hợp
cho sự phát triển là 37oC, độ pH 7,2 - 7,6. Vi khuẩn có sức chịu đựng tốt


9
trong các điều kiện nuôi cấy. Chúng có thế sống sót trong môi trường thạch ở
nhiệt độ -10oC trong 115 ngày, sống từ 4-8 tháng trong thịt ướp muối với tỷ lệ

29% ở nhiệt độ 6-12oC. Có rất nhiều môi trường dinh dưỡng chọn lọc được
dùng trong phân lập Salmonella, hiện nay thường dùng như Brilliant Green
Agar (BGA), Bismuth Sulfite Agar (BSA), Triple Sugar Ion (TSI), Xylose
Lysine

Deroxycholate

(XLD),

Mueller

Kauffmann,

Xylose

Lysine

Tetrathionate 4 (XLT4), Modified Semisolid Rappaport Vassiliadis (MSRV),
Rambach, Kligler [58].
Khi nuôi cấy vi khuẩn Salmonella trong môi trường nước thịt: Sau vài
giờ đã vẩn đục, sau 18 giờ canh trùng đục đều. Nếu nuôi lâu trong ống
nghiệm thì đáy có cặn, trên bề mặt môi trường có màng mỏng.
Trên môi trường BSA: Sau 18 giờ nuôi cấy ở 37 oC, vi khuẩn
Salmonella mọc lên những khuẩn lạc đặc trưng, xung quanh khuẩn lạc màu
nâu thẫm, càng vào giữa khuẩn lạc càng đậm chuyển gần sang màu đen,
khuẩn lạc có màu ánh kim.
Trên môi trường thạch thường: Khuẩn lạc dạng S (smooth) tròn, trong
sáng hoặc xám, nhẵn bóng, rìa gọn và hơi lồi ở giữa, đường kính từ 1 1,5mm, thi thoảng thấy khuẩn lạc dạng R (rough), nhám, mặt trong mờ.
Trên môi trường BGA: Vi khuẩn Salmonella thể hiện tính kiềm, hình
thành khuẩn lạc màu đỏ.

Trên môi trường XLD: Vi khuẩn hình thành khuẩn lạc màu đen do H2S
được tạo ra từ phản ứng điển hình của vi khuẩn Salmonella.
Trên môi trường TSI: Vi khuẩn hình thành những khuẩn lạc nhạt màu,
mặt nghiêng trên môi trường có màu đỏ, màu hồng ở đáy cùng với sản sinh ra
H2S làm cho môi trường có màu đen.
Trên môi trường MSRV: Là môi trường chọn lọc những Salmonella có
khả năng di động, vi khuẩn di động ra xung quanh môi trường tạo thành vòng
màu trắng có thể quan sát được.


10
Trên môi trường XLT4: Vi khuẩn hình thành khuẩn lạc trung bình, màu
đen, bóng, hơi lồi.
Trên môi trường Rambach: Vi khuẩn hình thành những khuẩn lạc trung
bình, màu đỏ tím, bóng.
Trên môi trường Kligler: Mặt nghiêng môi trường không đổi màu do vi
khuẩn không lên men đường lactose, phần thạch đứng môi trường đổi màu do
vi khuẩn lên men đường glucose làm thay đổi pH của môi trường và sinh H2S
có màu đen.
1.2.3. Đặc tính hóa sinh
Không len men đường : lactose, sucrose, andonitol, ...
Lên men sinh hơi các loại đường: glucose, mannitol, sorbitol, ...
Phản ứng indol âm tính (-), urease âm tính (-), Voges - Proskauer (VP)
âm tính (-), H2S dương tính (+), Metyl - Red (MR) dương tính (+).
Khả năng trao đổi chất đặc trưng của Salmonella là phân hủy nitrat
thành nitrit, phân hủy đường glucose sinh hơi, phân hủy H2S và sử dụng citrat
làm nguồn cung cấp cacbon duy nhất.
Đặc tính sinh hóa có ý nghĩa lớn trong quá trình phân lập và giám định
vi khuẩn, chính vì vậy khi xét nghiệm mẫu vật xác định sự có mặt của
Salmonella cần thiết phải tiến hành các phản ứng sinh hóa.

1.2.4. Cấu trúc của Salmonella
Vi khuẩn Salmonella có 3 loại kháng nguyên, đó là những chất khi xuất
hiện trong cơ thể thì tạo ra kích thích đáp ứng miễn dịch và kết hợp đặc hiệu
với những sản phẩm của sự kích thích đó, gồm: kháng nguyên thân O, kháng
nguyên lông H và kháng nguyên vỏ K. Vi khuẩn thương hàn (S. Typhi) có
kháng nguyên V (Virulence) là yếu tố chống thực bào giúp cho vi khuẩn
thương hàn phát triển bên trong tế bào bạch cầu.
* Kháng nguyên thân O (O - Antigen)
Kháng nguyên thân O nằm ở thành tế bào vi khuẩn, có cấu trúc
lipopolysaccharide (LPS) là thành phần chính cấu tạo nên lớp màng ngoài của


11
thành tế bào vi khuẩn gram âm. Kháng nguyên O chịu nhiệt và kháng cồn, bị
biến tính khi xử lý bằng formaldehyde. Kháng nguyên O gồm 2 nhóm chính:
- Polysaccharid không có nhóm hydro, không mang tính đặc trưng của
kháng nguyên và chỉ tạo sự khác biệt về hình thái khuẩn lạc từ dạng S sang
dạng R và dẫn đến giảm độc lực của vi khuẩn [61].
- Polysaccharid nằm ở ngoài có nhóm hydro quyết định tính kháng
nguyên và đặc trưng cho từng serotype.
Kháng nguyên O được xem như một nội độc tố mà nó được cấu tạo
bởi nhóm hỗn hợp glyco - polypeptip có thể tìm thấy ở màng ngoài của vỏ
bọc vi khuẩn.
* Kháng nguyên lông H (H - Antigen)
Kháng nguyên lông H là protein nằm trong thành phần lông của vi
khuẩn, là loại kháng nguyên không chịu nhiệt, rất kém bền vững so với kháng
nguyên O, bị phá hủy ở nhiệt độ 600C sau 1 giờ, dễ phá hủy bởi cồn và axit
yếu [19]. Kháng nguyên H gồm 2 pha:
- Pha 1: có tính đặc hiệu, gồm 28 loại kháng nguyên được biểu thị bằng
chữ mẫu Latint thường: a,b,c,...,z.

- Pha 2: Không có tính đặc hiệu, gồm 6 loại được biểu thị bằng chữ số
Ả rập: 1,2,3,4,5,6 hay Latinh thường: e,n,x,...
* Kháng nguyên vỏ K (K - Antigen)
Theo Quinn và cs (2004), kháng nguyên vỏ chỉ có ở một số loài như S.
Typhi, S. Paratyphi, S. Dublin cũng có thể mang kháng nguyên vỏ. Kháng
nguyên K có thể làm che các kháng nguyên thân O. Cũng theo tác giả, nếu
đun sôi huyễn dịch của các loài Salmonella này trong 10 - 12 phút sẽ phá hủy
được kháng nguyên vỏ.
Kháng nguyên vỏ là một loại kháng nguyên có khả năng ngưng kết
kháng thể O khi phát triển nhiều. Kháng nguyên này chỉ gặp ở 2 serotype là:
S. Typhi và S. Paratyphi C.


12
1.2.5 Các yếu tố gây bệnh của Salmonella
* Các yếu tố không phải là độc tố
Các yếu tố không phải là độc tố bao gồm: kháng nguyên O, kháng
nguyên H và kháng nguyên K, yếu tố bám dính, khả năng xâm nhập vào tế
bào, khả năng tổng hợp sắt, khả năng kháng kháng sinh. Các yếu tố này với
cơ chế, phương thức tác động khác nhau tạo điều kiện bất lợi cho cơ thể vật
chủ và tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn tác động gây bệnh. Chính vì thế
các yếu tố không phải là độc tố đóng vai trò hết sức quan trọng trong quá
trình sinh bệnh của vi khuẩn Salmonella.
Khả năng kháng kháng sinh: Việc sử dụng rộng rãi các loại thuốc
kháng sinh để phòng trị bệnh, kích thích sinh trưởng của gia súc, gia cầm đã
tạo ra nhiều giống vi khuẩn có khả năng kháng thuốc, mang plasmid kháng
kháng sinh, tồn tại rất lâu trong cơ thể người, vật nuôi và môi trường. Khi vi
khuẩn có sẵn những yếu tố gây bệnh thì khả năng kháng kháng sinh sẽ làm
tăng tính gây bệnh của vi khuẩn lên nhiều lần. Khả năng kháng kháng sinh có
thể thay đổi, phụ thuộc vào địa phương, thời điểm làm kháng sinh đồ và loại

vật nuôi.
* Các yếu tố độc tố
Vi khuẩn Salmonella sản sinh ra các độc tố chính là độc tố đường ruột
(enterotoxin), nội độc tố (endotoxin) và độc tố tế bào (cytotoxin) [35].
Quá trình gây bệnh trong đường tiêu hóa của Salmonella lần đầu tiên
được mô tả bởi một thí nghiệm trên chuột lang vào năm 1967 [71]. Thí
nghiệm cho thấy qua một quá trình sinh sản trên bề mặt thành ruột,
Salmonella sẽ xuyên qua lớp màng và xâm nhập vào bên trong tế bào biểu
mô, đặc biệt ở đoạn hồi tràng. Tại đây nó gây tổn thương cho các tế bào biểu
mô ruột. Trong giai đoạn này, vi khuẩn bị thực bào, song các đại thực bào
không phá hủy được vi khuẩn hoàn toàn. Kết quả là sau 24 giờ xâm nhập, vi
khuẩn đã phát triển trong đại thực bào và mô lympho ruột. Đồng thời với sự


13
phát triển nhanh về số lượng vi khuẩn là việc xuất hiện thể bệnh cấp tính, sự
tập trung các đại thực bào, phản ứng viêm tạo thành huyết khối, gây rối loạn
tuần hoàn cục bộ vi mạch ở lớp dưới niêm mạc. Hậu quả là dẫn tới hoại tử ở
niêm mạc ruột tại điểm bị vi khuẩn tấn công. Ngoài ra, quá trình gây bệnh của
vi khuẩn luôn bắt đầu bằng chứng nhiễm trùng huyết sau và 24 - 72 giờ bệnh
nhân mới xuất hiện triệu chứng tiêu chảy dữ dội. Khả năng gây bệnh, tăng
độc tố của vi khuẩn Salmonella sẽ tăng lên khi sức đề kháng của cơ thể giảm.
1.3. Tình hình ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn Salmonella
1.3.1. Ngộ độc thực phẩm
Ngộ độc thực phẩm đang trở thành nỗi lo hàng đầu của người dân, bởi
đây là nguyên nhân gây nhiều căn bệnh đường tiêu hóa và thậm chí là ung thư.
Ngộ độc thực phẩm hay còn gọi là trúng độc thức ăn do ăn phải những
thức ăn có chứa chất độc, thường xảy ra một cách đột ngột hàng loạt (nhưng
không phải là các bệnh dịch do vi khuẩn), có những triệu chứng của một bệnh
cấp tính, biểu hiện bằng nôn mửa, ỉa chảy và các triệu chứng khác đặc hiệu cho

mỗi loại ngộ độc.
Thực phẩm có nguồn gốc động vật như thịt bò, thịt lợn, thịt gà và các
sản phẩm được chế biến từ chúng rất khó kiểm soát về độ an toàn vệ sinh,
trong khi đó lại có nhiều người sử dụng và sử dụng thường xuyên nên nguy
cơ ngộ độc có thể xảy ra bất cứ lúc nào và mọi nơi. Theo báo cáo của Bộ Y tế
(2001), hơn 60% thức ăn đường phố và thực phẩm chế biến sẵn bị nhiễm vi
khuẩn gây bệnh đường ruột. Hiện nay thực phẩm được xác định là nguồn lan
truyền chủ yếu, ước tính 70% trường hợp tiêu chảy có liên quan đến thực
phẩm ô nhiễm [42]. Trong nhóm các vi khuẩn gây bệnh truyền qua thực
phẩm, các nhà khoa học đã đặt ra mối quan tâm nhiều nhất tới vi khuẩn
Salmonella.


14
1.3.2. Ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn Salmonella
Vi khuẩn Salmonella sống trong phủ tạng của gia cầm, gia súc và vấy
nhiễm vào thịt khi giết mổ. Chúng có mặt ở phân và dễ dàng nhiễm vào trứng
gia cầm qua những lỗ nhỏ li ti ở vỏ. Những thức ăn giàu chất dinh dưỡng như
thịt, cá, trứng, sữa ... rất dễ bị nhiễm Salmonella trong quá trình chế biến, bảo
quản, vận chuyển nếu không đảm bảo vệ sinh. Như vậy bất cứ nguồn thực
phẩm tươi sống nào có nguồn gốc động vật như thịt gia súc, gia cầm, các sản
phẩm bơ sữa, trứng và hải sản và một số loại trái cây, rau quả đều có thể bị
nhiễm Salmonella.
Thông thường, 12-24 giờ sau khi ăn phải thực phẩm nhiễm khuẩn bệnh
nhân thấy đau bụng, buồn nôn, nôn mửa, đi ngoài phân lỏng, nhức đầu, nôn
nao, khó chịu, ra mồi hôi, mặt tái nhợt, sốt 38-40oC trong 2-4 ngày.
Salmonella là một trong những thủ phạm chính gây ngộ độc thực phẩm vào
mùa hè. Ngộ độc do Salmonella có thể biểu hiện từ nhẹ cho tới rất nghiêm
trọng và thậm chí gây tử vong. Salmonella có khả năng gây ngộ độc thực
phẩm với hậu quả không lường [49]; [64]. Chính vì Salmonella là vi khuẩn

nguy hiểm với sức khỏe của con người như vậy nên yêu cầu vệ sinh tối thiểu
đặt ra cho tất cả các loại thực phẩm là không được có loại vi khuẩn này trong
25 gram mẫu thực phẩm [34].
Trong 10 năm trở lại đây, nhiều thông báo trong và ngoài nước cho
thấy nguy cơ gia tăng nhanh số người bị bệnh và ngộ độc thực phẩm do
Salmonella. Tuy nhiên việc loại bỏ chúng ra khỏi dây truyền sản xuất chăn
nuôi cũng như thực phẩm là vấn đề hết sức khó khăn. Nhiều nước tiên tiến
trên thế giới có những chương trình phòng chống tích cực, song cho tới nay
vấn đề này vẫn chưa thực sự có hiệu quả.


15
Đặc biệt các vụ ngộ độc thường gặp chủ yếu nhất do Salmonella
Typhimurium gây ra. Salmonella Typhimurium gây viêm ruột, thời kỳ ủ bệnh
từ 12-24 giờ, có khi ngắn hơn hoặc kéo dài vài ngày. Các dấu hiệu đầu tiên là
bệnh nhân thấy nhức đầu, buồn nôn, choáng váng khó chịu, thân nhiệt tăng,
sau đó xuất hiện nôn mửa, tiêu chảy nhiều lần, phân toàn nước, đó là triệu
chứng của viêm ruột cấp tính do nội độc tố được thoát ra khi vi khuẩn bị phân
hủy trong máu cũng như trong ruột.
Ở Việt Nam, bệnh do vi khuẩn Salmonella gây ra ở gia súc, gia cầm đã
được biết đến từ lâu nhưng cho đến nay vẫn chưa được nghiên cứu nhiều, đặc
biệt trong lĩnh vực vệ sinh thực phẩm.
1.4. Hiện tượng kháng kháng sinh của Salmonella
1.4.1. Hiện tượng kháng kháng sinh của vi khuẩn
Kháng sinh là những hợp chất đặc biệt do vi sinh vật, động vật và thực
vật hay do con người tổng hợp. Có tác dụng tiêu diệt, ức chế vi sinh vật với
nồng độ rất thấp mà không gây độc cho người và vật chủ [1].
Thuốc kháng sinh được coi là một giải pháp trong việc điều trị các bệnh
do nhiễm vi khuẩn. Nhờ có thuốc kháng sinh mà chúng ta có thể kiểm soát
được nhiều dịch bệnh. Tuy nhiên, hiện nay con người đang sử dụng thuốc

kháng sinh chưa hợp lý, chính điều này đang dẫn đến hiện tượng kháng kháng
sinh của vi khuẩn.
Sự kháng lại thuốc kháng sinh của vi khuẩn về cơ bản là do gen. Nhờ
có gen kháng thuốc mà vi khuẩn có đủ khả năng để chống lại tác dụng của
thuốc kháng sinh, từ đó mà chúng có thể tồn tại và tiếp tục gây bệnh [68].
1.4.2. Hiện tượng kháng kháng sinh của Salmonella
Trong quá trình liên kết lâu dài với vật chủ, Salmonella có cơ chế tinh vi
để điều biến chức năng của tế bào vật chủ. Salmonella đã thu nhận rất nhiều
gen liên quan đến tính độc trong quá trình tiến hóa loài, đồng thời các type này