BÀI GIẢNG XOẮN KHUẨN LEPTOSPIRA

XOẮN KHUẨN LEPTOSPIRA

PXN Vi khuẩn 3
Khoa Vi sinh Miễn dịch
Viện Pasteur Tp HCM


MỤC TIÊU
1.Giới thiệu xoắn khuẩn Leptospira

2. Các kỹ thuật xét nghiệm chẩn đoán Leptospira

3. Các biện pháp phòng bệnh


Lịch sử
1886 　 Adolf Weil, phát hiện ra bệnh Leptospirosis còn gọi là bệnh Weil.
1914 Ryo-kichi Inada và Yasushi Ido, tìm thấy xoắn khuẩn leptospires
1917 Hideyo Noguchi xác định giống (Genus) Leptospira

Dr. Ryokichi Inada

Dr. Hideyo Noguchi


Phân loại


Con đường lan truyền

Con đường lan truyền


Dịch tễ

CERoPath(2013): 500 000 ca/năm
Vùng Đông Nam Á: khu vực dịch tễ đặc biệt cao


TÍNH CHẤT VI SINH HỌC
Hình thể và cấu trúc

•
•
•
•

Mảnh, xoắn, di động, có móc neo hai đầu
Kích thước 0.25 x 6-25µm
Màng ngoài có cấu trúc giống vi khuẩn Gram âm chứa LPS
Sự đa dạng cấu trúc của LPS tạo ra sự đa dạng về kháng nguyên (serovar)

Tính chất nuôi cấy:

•
•

Là vi khuẩn ưa khí
Phát triển tốt trên môi trường EMJH ( Ellinghasue-McCullough-Jonson-Harris) giàu
dinh dưỡng.

•
•
•

o
o
Nhiệt độ thích hợp: 28 C – 30 C
pH: 6.8 – 7.2
Thời gian nuôi cấy: 6 – 14 ngày.


Kính hiểm vi nền đen

Kính hiểm vi nền đen (Dark-field microscope) được sử dụng để quan sát Leptospira .
Leptospires nổi bật như sợi chỉ bạc trên nền đen .

Objective

Position of
specimen

Reflected light

Condenser

Light entering
the condenser

Sức đề kháng

•
•
•

Tồn tại trong nước, ở môi trường có pH toan thì không phát triển được.
 Leptospira chịu được lạnh.
Chất mật trong gan làm Leptospira ngừng hoạt động, tan ra từ 10 – 15 phút. Ở
dịch dạ dày trong 30 phút

•

0
Leptospira bị chết ở 56 C /10 phút, bị diệt bởi dd Javelle và phenol


Cơ chế gây bệnh

•

Nhiễm: tiếp xúc trực tiếp với đất, nước, nước tiểu của động vật mang bệnh: Leptospira xâm nhập qua
da hoặc kết mạc.

•

Sau khi nhiễm, Leptospira xuất hiện trong máu, xâm nhiễm đến các mô và cơ quan, khu trú ở thận và
thải qua nước tiểu. ( vài tuần đến vài tháng sau khi nhiễm bệnh).

Đáp ứng miễn dịch:

Phản ứng lại bằng việc tiết ra kháng thể kháng Leptospira.

 Kháng thể xuất hiện sau 5–7 ngày (10 ngày).
 IgM> IgG,
 Tồn tại nhiều tháng, nhiều năm, nhưng hiệu giá thấp.
 Kháng thể đặc hiệu với serovar.


Leptospirosis
Bệnh khó chẩn đoán
Sốt

Vàng da

Tổn thương thận

Viêm não

Xuất huyết


Thu thập mẫu
Phụ thuộc vào giai đoạn nhiễm bệnh:

Leptospires: trong máu 10 ngày sau khi phát bệnh.
Dịch cơ thể, nước tiểu: vài ngày

1.

Mẫu máu: Tube có heparin : nuôi cấy 10 ngày đầu nhiễm

2.

Máu , huyết thanh: nên lấy hai lần cách nhau 5- 7 ngày.

3.

Nước tiểu (để nuôi cấy): cần sạch, cấy vào môi trường trong vòng hai giờ. Đôi khi cần trung hòa nếu
mẫu nước tiểu acid.

4.

o
Mô, dịch cơ thể: cấy ngay vào môi trường, vận chuyển 4 C


CHẨN ĐOÁN PHÒNG THÍ NGHIỆM
Huyết thanh học

•
•
•
•

Microscopic agglutination test (MAT)
ELISA
IFA
Western blot

Phát hiện vi khuẩn

•
•

Nuôi cấy Leptospira từ máu, nước tiểu hoặc mô
Immuochromatography

Sinh học phân tử

•
•

PCR
Real time-PCR


Leptospira Microscopic:
Agglutination Test


Patient serum

MAT

Y

Y

Y
Y

Y

Y

Y

Y

Y

Y
1~2 　 h

Y
Y

Y

Y

Leptospira
8
(1 X 10 cells)

Antigen-antibody reaction

Agglutination

MICROSCOPIC AGGLUTINATION TEST
MAT: agglutination-lysis test: Martin & Pettit (1918)
modified l(Borg- Petersen & Fagroeus, 1949; Carbrey, 1960; Cole et al., 1973; Postic et al., 2000;
Schüffner & Mochtar, 1926; Wattet al., 1988; Wolff, 1954).

Phát hiện: kháng thể và xác định hiệu giá
Không thể được chuẩn hóa, vì: kỹ thuật này sử dụng kháng nguyên sống và bị ảnh hưởng bởi nhiều
yếu tố: thời gian cấy, nồng độ kháng nguyên, chất lượng kháng nguyên có thể ảnh hưởng đến hiệu
giá.
(Borg-Petersen & Fagroeus, 1949; Carbrey, 1960).


Nguyên tắc phản ứng

•

Kết hợp kháng nguyên và huyết thanh bệnh nhân, sử dụng kính hiển vi nền đen
để đánh giá mức độ ngưng kết.

•

Điểm ngưng kết được xác định: tỉ lệ ngưng kết và tỉ lệ kháng nguyên tự do là
50%: 50% khi so sánh với chứng âm ( là kháng nguyên pha loãng 1:2 trong
phosphate-buffered saline (International Committee on Systematic Bacteriology,
1984).


Quy trình

1. Pha loãng và kiểm tra chất lượng kháng nguyên: mật độ 1-2x108 di động tốt, không
tạp.
2. Pha loãng huyết thanh 1:25 (dd đệm)
3. Thực hiện theo quy trình (WHO 2003)
Thực hiện chứng âm: kháng nguyên + dung dịch đệm
4. Nếu đánh giá dương tính với serovar nào thì tiến hành phản ứng định lượng với
serovar đó và xác định hiệu giá ngưng kết


Sơ đồ định tính
Kháng nguyên 1 (KN)

Kháng nguyên 2

Kháng nguyên 3

Kháng nguyên n

Kháng nguyên chứng

Kháng nguyên 1+ dd đệm

Kháng nguyên 2+ dd đệm

Kháng nguyên 3+ dd đệm

Kháng nguyên 4+ dd đệm

Mẫu huyết thanh 1

HT 1 + KN1

HT 1 + KN2

HT 1 + KN3

HT 1 + KNn

Mẫu huyết thanh 2

HT 2+ KN1

HT 2+ KN2

HT 2+ KN3

HT 2+ KNn

Mẫu huyết thanh

HT + KN1

HT n+ KN2

HT + KN3

HT + KNn


Sơ đồ định lượng

Mẫu chứng

HT 1

HT 1

KN X + dd đệm

KN Y + dd đệm

Pha loãng 1:50

Pha loãng

Pha loãng

Pha loãng

1:100

1:200

1:400

KN X + HT

KN X + HT

KN X + HT

KN X + HT

1:25

1:50

1:100

1:200

KN Y+ HT

KN Y+ HT

KN Y + HT

KN Y + HT

1:25

1:50

1:100

1:200

Pha loãng 1:n

etc

etc


Các serovar sử dụng trong phương pháp MAT
TT

SPECIES

SEROGROUP

SEROVAR

STRAIN

1

L. interrogans

Australis

australis

Ballico

2

L. interrogans

Autumnalis

autumnalis

Akiyami A

3

L. interrogans

Bataviae

bataviae

Van Tienen

4

L. interrogans

Canicola

canicola

Hond Utrecht IV

5

L. borgpetersenii

Ballum

castellonis

Castellon 3

6

L. interrogans

Icterohaemorrhagiae

copenhageni

Wijnberg

7

L. interrogans

Pyrogenes

pyrogenes

Salinem

8

L. interrogans

Icterohaemorrhagiae

tonkini

LT 96 68

9

L. interrogans

Icterohaemorrhagiae

icterohaemorrhagiae

Verdun

10

L. kirschneri

Cynopteri

cynopteri

3522 C

11

L. kirschneri

Grippotyphosa

grippotyphosa

Moskva V

12

L. borgpetersenii

Sejroe

hardjobovis

Sponsela

13

L. interrogans

Hebdomadis

hebdomadis

Hebdomadis

14

L. borgpetersenii

Javanica

javanica

Veldrat Bataviae 46

15

L. noguchii

Panama

panama

CZ 214 K

16

L. biflexa

Semaranga

patoc

Patoc 1

17

L. interrogans

Pomona

pomona

Pomona

18

L. borgpetersenii

Tarassovi

tarassovi

Mitis Johnson

19

L. weilii

Tarassovi

vughia

LT 09 68

20

L. interrogans

Sejroe

hardjo

Hardjo Prajitno

21

L. interrogans

Sejroe

saxkoebing

Mus24

22

L. interrogans

Canicola

canicola

Chiffon

24

L. fainei

Hurstbridge

hurstbridge


MAT

Positive: More than 50% of Leptospira are agglutinated

Titer=1:5120


Lưu ý

•
•

Kiểm tra mẫu chứng âm: 100 % kháng nguyên tự do
Kiểm tra kháng nguyên đúng: cần tiến hành thường xuyên (tránh nhiễm chéo hoặc
ghi tên chưa đúng): specific reference antisera/ monoclonal antibodies.

•

Thao tác pha loãng huyết thanh: chính xác