Nghiên cứu đặc điểm bộ gen của một số chủng enterovirus 71 gây bệnh chân tay miệng ở Việt Nam năm 2011 – 2013

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong những năm gần đây, bệnh Tay chân miệng (TCM) đã trở thành vấn
đề quan tâm hàng đầu của các nước trên thế giới, nhất là các nước đang phát
triển, trong đó có Việt Nam. Do sự gia tăng của bệnh, số người nhập viện
ngày càng nhiều dẫn đến tình trạng quá tải ở nhiều bệnh viện. Trong khi đó,
nhận thức và thực hành các biện pháp phòng bệnh của người dân còn hạn chế
và tập quán ăn uống và sinh hoạt của người dân chưa đảm bảo vệ sinh. Đến
nay, chúng ta vẫn chưa tìm được phương pháp điều trị và vắc xin dự phòng
một cách hiệu quả. Các vụ dịch TCM thường xảy ra hàng năm từ tháng 3 đến
tháng 11. Enterovirus 71 (EV-A71) là một trong những căn nguyên quan trọng
liên quan đến các vụ dịch TCM ở khắp nơi trong khu vực Châu Á Thái Bình
Dương nhất là ở Việt Nam [1].Vụ dịch năm 2011 và 2013 với số ca mắc hàng
năm trên 100 000 người, gây tử vong trên 200 trẻ, căn nguyên phân lập được
chủ yếu là Enterovirus 71 (EV-A71) với trên 68%, các chủng lưu hành có
genotype là C4 hoặc C4A. Cho đến nay, các nhà khoa học vẫn chưa hiểu rõ
đặc điểm di truyền các chủng EV - A71 gây bệnh TCM trong vụ này [2].
Các vụ dịch TCM do EV - A71gây nên, đặc biệt các nhóm, dưới nhóm, đôi
khi kèm theo sự tái tổ hợp di truyền của các chủng. Do đó, hiểu biết những thay
đổi trong bộ gen của EV - A71 là cần thiết, đóng vai trò trong việc nghiên cứu
dịch tễ học, chẩn đoán, điều trị và phát triển vắc-xin phòng bệnh. Có nhiều kỹ
thuật xác định sự thay đổi di truyền của các chủng vi rút nói chung, trong đó
cóEV - A71. Trong những năm gần đây giải trình tự gen thế hệ mới (NGS) là
một công nghệ mới giúp giải mã nhanh chóng chính xác toàn bộ bộ gen của EV
- A71. Mặc dù kỹ thuật NGS được phát triển từ năm 2005, nhưng ở Việt Nam
đây vẫn còn là kĩ thuật mới và có rất ít các nghiên cứu về ứng dụng kĩ thuật này
vào phân tích các đặc điểm di truyền của EV - A71.

2

Chính vì vậy chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu đặc điểm bộ gen
của một số chủng enterovirus 71 gây bệnh chân tay miệng ở việt nam
năm 2011 – 2013”. Với mục tiêu:
1.

Xác định trình tự toàn bộ bộ gen của một số chủng EV - A71 gây
bệnh TCM ở Việt Nam năm 2011 – 2013 bằng kỹ thuật giải trình tự
gen thế hệ mới.

2.

So sánh sự biến đổi về mặt di truyền giữa các chủng EV - A71.


3

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN
1.1. Bệnh Tay Chân Miệng
1.1.1. Sơ lược về bệnh TCM
Bệnh TCM có thời gian ủ bệnh trung bình từ 3 đến 6 ngày. Đầu tiên, vi
rút thường cư trú ở niêm mạc má hay niêm mạc hồi tràng và sau 24 giờ, vi rút
lan đến các hạch bạch huyết. Nhiễm vi rút huyết thường xảy ra nhanh chóng
sau đó và vi rút di chuyển đến niêm mạc miệng và da. Vào ngày thứ 7 sau khi
nhiễm bệnh, kháng thể trung hòa tăng cao và vi rút bị thải loại.
Các dấu hiệu tiền triệu bao gồm sốt nhẹ, mệt mỏi, đau bụng và đau trong
miệng. Trong giai đoạn toàn phát, bệnh nhân có biểu hiện sốt, đau đầu, nôn,
mệt mỏi, đau họng, loét miệng, ăn không ngon, tiêu chảy. Khám có thể thấy

các vết loét, xung quanh có viền đỏ, thường ở niêm mạc miệng, có thể thấy ở
lưỡi, vòm họng, lưỡi gà, a-mi-đan, lợi hoặc ở trên da lòng bàn tay, bàn chân
và ở kẽ ngón tay, ngón chân. Ở trẻ em dưới 5 tuổi, các triệu chứng điển hình
hơn ở người lớn. Các tổn thương trên da ban đầu thường là dạng dát sau đó
nhanh chóng tiến triển thành các phỏng nước hình oval, đường kính từ 210mm, màu xám trên nền ban hồng. Ở trẻ sơ sinh, các tổn thương này có thể
ở thân mình, đùi và mông. Trong trường hợp không điển hình chỉ có rất ít
phỏng nước xen kẽ với hồng ban, hoặc chỉ có hồng ban mà không có phỏng
nước hoặc chỉ loét miệng đơn thuần.
Một số trường hợp có biến chứng hệ thần kinh trung ương. Biểu hiện
lâm sàng thường hay gặp nhất là viêm màng não, liệt mềm cấp, viêm não. Các
biến chứng ít gặp hơn bao gồm mất điều hòa tiểu não, hội chứng GuillainBarré, viêm tủy cắt ngang, tăng áp lực nội sọ lành tính, tỷ lệ tử vong trong số
các trường hợp mắc từ 40-80%. Các biến chứng khác là phù phổi cấp, xuất
huyết, suy tuần hoàn. Nhiều biến chứng có thể cùng phối hợp xảy ra trên cùng
một bệnh nhân.


4

Bệnh TCM thường xảy ra thành dịch từ nhỏ đến lớn đe dọa sức khỏe tính
mạng của trẻ em. Y văn thế giới cũng đã ghi nhận những vụ dịch TCM xảy ra
ở Đài Loan, Trung Quốc, Singapore. Tại Việt Nam, giai đoạn 2011-2013 số ca
mắc và tử vong do bệnh TCM tăng đột biến, trong khi đó, chúng ta vẫn chưa
tìm được phương pháp điều trị và vắc xin dự phòng.
-

+

+

-

Phân độ lâm sàng [4], [5]:

+

Độ 1: Chỉ loét miệng và/hoặc tổn thương da.

+

Độ 2: Biến chứng thần kinh hoặc tim mạch mức độ trung bình.

•

Rung giật cơ.

•

Đi loạng choạng.

•

Ngủ gà.

•

Yếu liệt chi.

•

Mạch nhanh >150 lần/phút (khi trẻ nằm yên và không sốt).

•

Sốt cao ≥ 3905C (nhiệt độ hậu môn).

Độ 3: Biến chứng nặng về thần kinh, hô hấp, tim mạch.
•

Co giật, hôn mê (Glasgow < 10 điểm).

•

Khó thở: Thở nhanh, rút lõm ngực, SpO2 < 92% (không oxy hỗ trợ).

•

Mạch nhanh >170 lần/phút hoặc tăng huyết áp.

Độ 4: Biến chứng rất nặng, khó hồi phục
•

Phù phổi cấp.

•

Sốc, truỵ mạch.

•

SpO2 < 92% với oxy qua gọng mũi 6 lít/phút.

•

Ngừng thở.

Phân loại mức độ bệnh [6]:
+

Bệnh nhẹ: bệnh nhân độ 1 và độ 2a.

+

Bệnh nặng: bệnh nhân từ độ 2b trở lên.

1.1.2. Tác nhân gây bệnh TCM [7]


5

Bệnh TCM do nhóm vi rút đường ruột (Enterovirus) gây nên.
Enterovirus gây bệnh cho người gồm các nhóm: Poliovirus (PV),
Coxsackievirus A (CVA), Coxsackievirus B (CVB), Echovirus (ECV) và
Enterovirus 68 đến 71 (EV68-71). Trong đó, tác nhân chủ yếu gây bệnh TCM
làEV - A71và CVA16.EV - A71 có thể gây ra các biến chứng thần kinh nặng và
dẫn đến tử vong, còn các vi rút đường ruột khác thường ở thể nhẹ.
1.1.3. Một số kĩ thuật phát hiện EV - A71 trong phòng xét nghiệm
Các mẫu bệnh phẩm có thể dùng để xác định căn nguyên bao gồm phân,
dịch ngoáy họng, ngoáy hậu môn, dịch nốt phỏng và dịch não tuỷ. Mỗi loại
bệnh phẩm có ưu nhược điểm riêng.
-

Nuôi cấy
Nuôi cấy vi rút là kỹ thuật gây nhiễm vi rút (có trong mẫu bệnh phẩm)

lên dòng tế bào nuôi thích hợp nhằm tăng sinh phát triển, từ đó có thể xác
định được vi rút. Dòng tế bào thích hợp cho nuối cấy Enterovirus nói chúng là
tế bào L20B có nguồn gốc từ tế bào Lympho chuột và tế bào RD có nguồn
gốc từ sarcom mô liên kết ở người.
-

Phản ứng trung hòa
Phát hiện kháng thể IgM kháng EV - A71 đang được phát triển, nhưng có

thể cho kết quả dương tính giả và giá trị dự báo dương tính thấp.
-

Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang
Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang gián tiếp: gián tiếp sử dụng kháng thể

đơn dòng kháng EV - A71 cho kết quả nhanh nhưng giá thành cao [8] [9].
-

Kỹ thuật khuếch đại gen kỹ thuật RT – PCR (Reverse transcription –
polymerase chain reaction)
Một số tác giả sử dụng cặp mồi cặp mồi MD91/MD90 khuyếch đại vùng

gen ở đầu 5’UTR PCR primers và cặp mồi MAS01S/MAS02A khuếch đại
vùng gen VP1 [10].
-

Kỹ thuật giải trình tự gen


6

Kỹ thuật này giúp định danh nhanh chóng chính xác vì mỗi loại vi rút có
một trình tự rất riêng biệt, không trùng lẫn với những loài khác. Các phương
pháp giải trình tự gen cổ điển chỉ.
1.1.4. Điều trị bệnh TCM
-

Nguyên tắc điều trị [4]:
Hiện nay chưa có thuốc điều trị đặc hiệu, chỉ điều trị hỗ trợ (không

dùng kháng sinh khi không có bội nhiễm).
Theo dõi sát, phát hiện sớm và điều trị biến chứng.
Bảo đảm dinh dưỡng đầy đủ, nâng cao thể trạng.
-

Điều trị cụ thể [4]:
+

Độ 1:
•

Điều trị ngoại trú và theo dõi tại y tế cơ sở.

•

Tái khám mỗi 1-2 ngày trong 5-10 ngày đầu của bệnh

•

Dặn dò dấu hiệu nặng cần tái khám ngay: Sốt cao ≥ 39 0C; thở
nhanh, khó thở; rung giật cơ, chới với, run chi, quấy khóc, bứt rứt
khó ngủ; Co giật, hôn mê; yếu liệt chi; da nổi vân tím.

+

-

Chỉ định nhập viện:
•

Biến chứng thần kinh, tim mạch, hô hấp (từ độ 2).

•

Sốt cao ≥ 390C.

•

Nôn nhiều.

•

Nhà xa: không có khả năng theo dõi, tái khám.

Độ 2: Điều trị nội trú tại bệnh viện huyện hoặc tỉnh
+

Điều trị như độ 1.

+

Nằm đầu cao 30o, cổ thẳng.

+

Điều trị chống suy hô hấp, co giật

+

Immunoglobµlin (nếu có).

+

Theo dõi mạch, nhiệt độ, huyết áp, nhịp thở, tri giác, ran phổi, mạch


7

mỗi 4- 6 giờ.
+
-

Đo độ bão hòa oxy SPO2 và theo dõi mạch liên tục (nếu có máy).

Độ 3: Điều trị nội trú tại bệnh viện tỉnh hoặc bệnh viện huyện nếu đủ điều kiện.
+

Chống suy hô hấp, chống phù não, chống co giật.

+

Điều trị hạ đường huyết, điều chỉnh rối loạn nước, điện giải, toan kiềm.

+

Dùng thuốc vận mạch Dobutamin khi suy tim mạch

+

Immunoglobµlin (nếu có).

+

Theo dõi mạch, nhiệt độ, huyết áp, nhịp thở, tri giác, ran phổi, SpO 2,
mỗi 1- 2 giờ.

-

Độ 4: Điều trị nội trú tại bệnh viện trung ương, hoặc bệnh viện tỉnh, huyện
nếu đủ điều kiện.Xử trí tương tự độ 3.

-

Điều trị biến chứng: suy hô hấp, suy tuần hoàn, chống phù não

-

Immunoglobµlin (nếu có):
+

Chỉ định từ độ 2 và độ 3.

+

Liều: 1g/kg/ngày truyền tĩnh mạch trong 6- 8 giờ x 2 ngày liên tiếp.

+

Riêng độ 2 cần đánh giá lại lâm sàng trước chỉ định liều thứ 2. Không
dùng liều 2 nếu lâm sàng cải thiện tốt.

1.1.5. Phòng bệnh
Hiện chưa có vắc xin phòng bệnh đặc hiệu.
Áp dụng các biện pháp phòng bệnh đối với bệnh lây qua đường tiêu hoá
Phòng bệnh tại các cơ sở y tế:
Cách ly theo nhóm bệnh.
Nhân viên y tế: Mang khẩu trang, rửa, sát khuẩn tay trước và sau khi
chăm sóc.
Khử khuẩn bề mặt, giường bệnh, buồng bệnh bằng Chloramin B 2%.
Xử lý chất thải theo quy trình phòng bệnh lây qua đường tiêu hoá.
Phòng bệnh ở cộng đồng: Vệ sinh cá nhân, rửa tay bằng xà phòng (đặc


8

biệt sau khi thay quần áo, tã, sau khi tiếp xúc với phân, nước bọt).

1.2. Đặc điểmEV - A71 [1]
EV-A71 thuộc họ (family) Picornaviridae. Do không có màng bao lipid
nên các Enterovirus đều bền vững trong môi trường vật chủ, kể cả khi tiếp
xúc với dịch vị ở dạ dày và chúng có thể tồn tại trong nhiệt độ phòng vài
ngày. Các vi rút này không bị hòa tan bởi các dung môi hữu cơ (như ether và
chloroform), cồn. Tuy nhiên vi rút bị bất hoạt ở nhiệt độ trên 56 oC, khử trùng
bằng chlo, formaldehyde và tia cực tím. EV - A71 và các Enterovirus khác
cũng đã được tìm thấy ở trên mặt nước, nước ngầm và trong suối nước nóng.
Chu kỳ sống và sự nhân lên của vi rút: Chu kỳ sống của vi rút xảy ra
hoàn toàn trong tế bào chất. Giống như các loài Enterovirus khác, chu kì sao
chép của EV - A71 tương tự như Polioviruses.
-

Hấp phụ và xâm nhập: Vi rút xâm nhập vào tế bào vật chủ thích hợp nhờ các
receptor đặc hiệu. Vi rút xâm nhập theo cơ chế nhập bào thông qua clathrin
(clathrin-mediated endocytosis).

-

Dịch mã: Bộ gen ARN sợi (+) có trình tự nucleotide giống với trình tự của
mARN nên có chức năng như mARN và được dịch mã thành polyprotein. Sau
đó, nhờ protease phân cắt polyprotein thành các protein cấu trúc và các
protein không cấu trúc (enzyme) để thực hiện các chức năng khác nhau.

-

Tổng hợp ARN của vi rút: ARN polymerase phụ thuộc ARN của vi rút dùng
ARN sợi (+) để tạo ra ARN sợi (-). Sau đó, ARN polymerase phụ thuộc ARN
này lại dùng ARN sợi (-) làm khuôn để tạo ra nhiều bộ gen của vi rút là ARN
sợi (+).

-

Lắp ráp và giải phóng: Các protein cấu trúc tham gia lắp ráp tạo capsid. ARN
của virion được đóng gói trong capsid và tạo thành hạt vi rút trưởng thành.
Các hạt vi rút mới được tổng hợp sẽ được giải phóng bằng sự ly giải của tế
bào vi rút được phóng thích tiếp tục lây nhiễm.
1.2.1. Phân loại


9

Sau khi được phân lập đầu tiên năm 1969,EV - A71 gây trên 28 dịch
TCM vừa và nhỏ [11]. Trong hơn 15 năm qua, các vụ dịch lớn ở khu vực
Đông Nam EV - A71. Dựa vào các kết quả giải tŕnh tự gen VP1 xác định có 4
nhóm EV - A71 độc lập là A, B, C và D. Các vi rút sẽ đươc xếp vào cùng một
genotype nếu có trình tự vùng gen VP1 giống nhau 92% trở lên. Nhóm A có
duy nhất chủng BrCr được phân lập ở Mỹ năm 1969. Trong vụ dịch nhỏ TCM
do EV - A71 tại Trung Quốc, có một chủng được xếp vào nhóm A, tuy nghiên
nguồn gốc của vi rút này chưa rõ ràng [11].
Nhóm D có một chủng duy nhất được phân lập ở Ấn Độ năm 2002.
Nhóm B được chia làm 6 dưới nhóm (subgenotype): B1–5 và B0. Giữa B1 và
B2 có 12% khác biệt về nucleotide. Chủng B1 và B2 là các chủng lưu hành
mạnh vào những năm 1970 và 1980 [12]. Chủng B3, B4, B5 được cho rằng
lưu hành từ năm 1997[13]. Chủng B5, lần đầu tiên được phân lập tại Nhật
Bản và Sarawak (Malaysia) vào năm 2003. Đây là căn nguyên tạo nên vụ dịch
ở B-ru-nây, Sarawak và Đài Loan năm 2006. Chủng B0 được mô tả, phân lập
ở Châu Âu từ 1963 đến 1967 [14].
Nhóm C cũng được chia thành 5 dưới nhóm (subgenotype): C1-5. C1
được phân lập tại Châu Âu và Mỹ năm 1987. C2 mới nổi từ năm 1995. C3 –

C5 liên quan đến những vụ dịch ở Nam Á từ năm 1997 [1] [15]. Trong vụ
dịch TCM lớn nhất do EV - A71 gây ra ở Trung Quốc giữa năm 2008 có 201
chủng C4 được ghi nhận là lưu hành rộng rãi.
1.2.2. Cấu trúc bộ gen của EV - A71 [16]
Bộ gen của EV - A71 chứa một sợi dương ARN dài khoảng 7400
nucleotid chưa tính phần PolyA. Về mặt di truyền nó rất gần với CV-A16.
Cấu trúc gen gồm vùng 5’-UTR, khung đọc mở (ORF) mã hóa một
polyprotein, 3’-UTR, phần PolyA.
Vùng 5’-UTR gồm 742 nucleotid, tại đây có 6 cấu trúc mã hóa stem-loop


10

trong đó stem-loop I là stem-loop hình lá tham gia vào quá trình tổng hợp
ARN của vi rút còn stem-loop II đến VI gồm các các trình tự tiếp nhận
ribosome ở bên trong ((internal ribosome entry site – IRES) liên quan đến
quá trình dịch mã protein. Vùng 5’-UTR của EV - A71 giống với polioviru và
có thể chia thành 3 vùng: vùng 5′ terminal cloverleaf vì nucleotide 1 đến 89
hoặc 101 nucleotid, vùng IRES có kích thước từ nucleotide 123–126 đến
nucleotide 602–605, và vùng siêu biến đổi khoảng 120 nucleotid.
Khung đọc mở mã hóa một polyprotein gồm protein cấu trúc P1 dài 2586
nucleotid, protein không cấu trúc P2 (1,734 nt) và P3 (2,259 nt), tham gia vào
sự sao chép ARN của vi rút. Polyprotein được chia thành 11 protein gồm 4
protein capsid thuộc P1 là VP1, VP2, VP3, VP4 và 7 protein không cấu trúc
gồm P2 có 2A, 2B, 2C và P3 có 3A, 3B, 3C, 3D [12]. VP1, VP2, VP3 tạo
thành tiểu đơn vị pentamer, gồm 60 bản sao được kết nối để tạo thành capsid
có cấu trúc khối đa diện đều, các vùng này có nhiều các quyết định kháng
nguyên tuy nhiên các kháng thể trung hòa đã được xác định chủ yếu từ các
kháng nguyển của vùng VP1, trong khi đó VP4 gắn vào mặt trong của vỏ
capsid. Ở vùng 2A chứa gen mã hóa enzyme protease đóng vai trò trong sự

phân cắt protein của tế bào vật chủ trong đó có dystrophin là thành phần chính
của tế bào cơ tim [17].
Vùng VP1 gồm 891 nucleotid, vùng này gây ảnh hưởng đáng kể đến sự
biến đổi về gen, về đặc điểm hình thái và thích hợp cho qua trình phát sinh
loài của vi rút. Vùng gen mã hóa protein VP1 được chứng minh là vùng gen
kháng nguyên, quyết định đến tính kháng nguyên và tính độc lực của vi rút.
Những đột biến trong vùng VP1dễ dẫn đến thay đổi thành phần acid amin và
đặc tính gây bệnh của vi rút, từ đó có thể hình thành biến chủng mới
Vùng không dịch mã 3’-UTRs (81nt) chứa 3 cấu trúc mã hóa stem-loop
X, Y, Z [18].
Phần PolyA gắn ở đầu 3’


11

Hình 1.1. Cấu trúc gen của EV - A71 [19]
Những đột biến chuỗi nucleotide trong 5’-UTR, VP3, và gen ARN
polymerase phụ thuộc ARN ở 3D đóng vai trò quan trọng trong cơ chế gây
bệnh và gây độc thần kinh [19]. Đột biến nucleotide từ vỏ capsid VP1, VP2
và một nucleotide trong stem-loop II của vùng 5’-UTR tăng khả năng nhiễm
bệnh và tử vong [19].
1.3. Kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ mới (NGS) [20]
Thông tin di truyền của mọi cơ thể sinh vật được mã hóa trong phân tử
ADN (acid deoxynucleic), đây là một chuỗi xoắn kép gồm hai mạch đơn được
tạo thành từ bốn loại nucleotide gồm A (adenine), C (cytosine), G (guanine)
và T (thymine). Các nucleotide này nối tiếp nhau theo một trình tự xác định,


12

và khác nhau ở từng loài, thậm chí ở từng các thể. Giải trình tự ADN là kỹ
thuật giúp xác định sự sắp xếp của bốn loại nucleotide A, T, C, G trên phân tử
ADN, nhờ đó nghiên cứu được đặc điểm di truyền ở mức độ sinh học phân tử.
Hiện nay, giải trình tự gen đang là xu thế phát triển và được ứng dụng cao
trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu khác nhau như giải trình tự để định danh,
định type vi khuẩn, vi rút, nhận dạng cá thể, nhận dạng loài, xác định đột biến
gen, ứng dụng trong sản xuất vắc-xin, điều trị đích ung thư.... Các phương
pháp giải trình tự cổ điển luôn bị hạn chế bởi nhiều mặt như thời gian, số
lượng, quy mô, độ phân giải, cản trở các nhà khoa học có được những thông
tin quan trọng từ nghiên cứu của họ. Để khắc phục những hạn chế đó, đòi hỏi
sự ra đời của giải trình tự gen thế hệ mới (NGS). Hệ thống NGS thương mại
xuất hiện đầu tiên năm 2005 bởi 454 Life Sciences. Với cách tiếp cận giải
trình tự hoàn toàn khác, giải trình tự gen thế hệ mới đã tạo ra một cuộc cách
mạng mang tính đột phá trong nghiên cứu về hệ gen.
Nguyên lý của giải trình tự gen thế hệ mới tương tự với phương pháp
Sanger đều dựa vào giải trình tự các đoạn ADN nhỏ, các đoạn này được phát
hiện dựa vào tín hiệu phát ra từ các đoạn bổ sung được tổng hợp từ sợi ADN
khuôn. Giải trình tự gen thế hệ mới có hơn 1 triệu các phản ứng diễn ra song
song tạo ra hàng trăm gigabase trong dữ liệu của một trình tự và cho phép giải
trình tự nhanh chóng một lượng lớn các cặp base của toàn bộ bộ gen. Với khả
năng giải trình tự nhanh, giải trình tự gen thế hệ mới cho phép giải trình tự
đầy đủ bộ gen trong vài giờ hoặc vài ngày.
NGS gồm 3 bước
-

Chuẩn bị thư viện: Trong bước này các đoạn ADN có độ dài phù hợp được
chuẩn bị bằng cách cắt đứt các phân tử ADN dài hoặc tổng hợp các đoạn
ADN ngắn (bằng PCR hoặc lai).

-

Gắn ADN và làm giàu: Các phân tử được gắn với mồi dùng để tách thành
các đoạn ngắn đơn, được cố định vào một chất nền, mỗi phân tử dạng đơn


13

đóng vai trò như một mẫu cho sự khuếch đại.
-

Giải trình tự ADN: Sự trùng hợp ADN kết hợp với đọc trình tự.
NGS ngày càng phát triển và ứng dụng nhiều vào các lĩnh vực đặc biệt là

nghiên cứu bộ gen của vi sinh vật giúp con người ngày càng hiểu rõ hơn về sự
đa dạng sinh thái, tiến hóa, hoạt động của vi sinh vật từ đó chúng ta có thể
kiểm soát được sự bùng phát của các tác nhân gây bệnh. NGS có tính ứng
dụng rất to lớn trong lĩnh vực vi rút học. Những tiến bộ trong công nghệ NGS
có thể cung cấp cho chúng ta nhiều thông tin bao gồm định danh chính xác vi
rút, xác định chính xác đặc điểm kháng thuốc, kiểu gen và đường lây truyền
của chúng trong bệnh viện, trong cộng đồng cũng như độc lực của các loại vi
rút này. Do đó, công nghệ NGS sẽ giúp tăng cường điều tra dịch tễ học của vụ
dịch, từ đó áp dụng các biện pháp kiểm soát để can thiệp kịp thời tại bệnh
viện và tại cộng đồng. Ngoài ra, thông tin từ các kết quả nghiên cứu giúp cho
các nhà lâm sàng quản lý, chăm sóc một cách tốt nhất bệnh nhân. NGS có thể
được sử dụng để phát hiện và giám sát kháng thuốc, kể cả trong việc đánh giá
và sử dụng các thuốc kháng vi rút mới, giúp cho các nhà hoạch định chính
sách xây dựng và phát triển các chiến lược quốc gia về giám sát tình trạng
kháng thuốc trong bệnh viện và cộng đồng.
Kỹ thuật NGS giúp định danh rất chính xác các vi rút mới nổi trong
những mẫu bệnh phẩm từ bệnh nhân, động vật như phát hiện một Arena virus

mới có liên quan đến nhóm các bệnh nhân ghép tạng, Bundibugyo Ebolavirus,
xác định căn nguyên vi rút gây bùng phát các dịch bệnh. NGS còn ứng dụng
trong nghiên cứu đặc điểm bộ gen, phân biệt những kiểu gen khác nhau dựa
trên sự khác nhau ở một số nucleotide trong cùng một gen. Xác định kiểu gen
giúp nghiên cứu dịch tễ học phân tử của các vi rút gây bệnh truyền nhiễm.
Một trong những ứng dụng phổ biến của NGS tái thiết lập bộ gen của vi rút
như các vi rút cúm gây đại dịch, vi rút HIV, vi rút Herpes. Bên cạnh đó, NGS


14

còn giúp nghiên cứu giúp phát hiện các đột biến nucleotide tồn tại trong quần
thể [21], mà không một kỹ thuật nào có thể xác định được. Nghiên cứu về bộ
gen của HCV cho thấy có thể tồn tại 2 đến 3 đột biến trên một gen, đây là một
trong những nguyên nhân giúp vi rút thoát được sự đáp ứng miễn dịch và liệu
pháp điều trị. Một trong những ứng dụng điển hình của NGS là phát hiện các
đôt biến kháng thuốc của vi rút như đột biến kháng thuốc xảy ra trên gen N
của vi rút cúm, đột biến kháng thuốc do đột biến vùng ADN Polymerase của
vi rút viêm gan B, nghiên cứu đột biến kháng thuốc, tính đa hình quần thể của
vi rút HIV [22], sự thoát đáp ứng miễn dịch của vi rút [23] [24], xác định các
chủng lưu hành của một số vi rút gây dịch, đóng vai trò quan trọng trong việc
sản xuất các vắc xin phòng bệnh.
1.4. Các nghiên cứu ứng dụng NGS đối với EV - A71
EV-A71 vẫn là mối đe dọa nghiêm trọng đến sức khỏe trẻ sơ sinh và trẻ
nhỏ. Do đó sự hiểu biết về bộ gen của EV - A71 là rất cần thiết. Từ khi ra đời,
kỹ thuật NGS được ứng dụng nghiên cứu bộ gen của EV - A71, Le Van Tan và
cộng sự đã giải trình tự toàn bộ bộ gen của 22 mẫu bệnh phẩm dương tính với
EV71 tại thành phố Hồ Chí Minh cho thấy có 107 vị trí có những biến đổi
nhỏ (10 – 15 biến đổi/ mẫu) [25]. Năm 2014 Long Chen và cộng sự đã tiến
hành giải trình tự toàn bộ bộ gen của 7 chủng EV - A71 gây tử vong ở Thâm

Quyến, Trung Quốc năm 2014 và cho thấy bộ gen của các chủng này chiều
dài 7,405 nucleotides (nt), chưa tính chiều dài của đuôi poly(A), vùng 5’UTR
742 nt, tiếp theo là khung đọc mở mã hóa cho protein cấu trúc P1(2,586 nt),
protein không cấu trúc P2 (1,734 nt) và P3 (2,259 nt) và 3-UTR (81nt). Tỷ lệ
các nucleotide A, C, G, and U của 7 bộ gen của EV - A71 lần lượt là 27,05 –
27,27%, 23,97 – 24,19%, 23,70 – 23,92%, và 24,83 – 25,02%, tỷ lệ G+C là
47,67 – 48,11%, các chủng này có mối quan hệ rất gần với các chủng EV A71 địa phương. Các chủng này thuộc chủng C4a [16]. Chia-Pei Lin và cộng


15

sự đã giải trình tự toàn bộ một chủng EV - A71 gây bệnh TCM ở Đài Loan và
cho thấy: bộ gen của chủng này có 7,262 nt bao gồm cả phần poly(A), vùng
5’UTR có 665 nt, tiếp đó là khung đọc mở, P1 (2,586 nt), P2 (1,734 nt), P3
(2,259 nt), 3’UTR (18 nt). Tỷ lệ A, U, G, và C lần lượt là 27,2%, 24,9%,
23,8%, và 24,2%, với G+C là 48,0% [26]. Nghiên cứu của Wen HL và cộng
sự trên 6 chủng ở Trung quốc cho thấy có 298 vị trí biến đổi, trong đó có 3 vị
trí

(Val(P814)/Ile(P814)

ở

VP1,

Val(P1148)/Ile(P1148)

ở

3A

và

Ala(P1728)/Cys)/Val(P1728) ở 3C) được bảo tồn ở các chủng gây độc thần
kinh và có sự biến đổi xảy ra ở cấu trúc thứ cấp của 5’-UTR. John và cộng sự
đã giải trình tự 14 chủng EV - A71 gây dịch TCM ở Thái Lan năm 2012 –
2014 và đánh giá sự đa dạng của các chủng lưu hành. Sự đa dạng về các
nucleotide lớn nhất là giữa chủng phân lập từ bệnh nhân tử vong và các chủng
khác và phát hiện có sự tái tổ hợp di truyền [27]. Năm 2014 Long Chen và
cộng sự đã tiến hành giải trình tự toàn bộ bộ gen của 7 chủng EV - A71 gây tử
vong ở Thâm Quyến, Trung Quốc năm 2014 và cho thấy các chủng này có
mối quan hệ rất gần với các chủng EV - A71 địa phương, các chủng này thuộc
týp C4a [16].


16

CHƯƠNG 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
2.1.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Nghiên cứu được tiến hành tại khoa Xét nghiệm – bệnh viện Bệnh Nhiệt
đới Trung ương từ 3/2016 đến 12/2016.
2.1.2. Lựa chọn đối tượng nghiên cứu
-

Tiêu chuẩn chọn mẫu:
+

20 chủng EV - A71 phân lập từ bệnh nhân TCM do EV - A71 từ vụ dịch

năm 2011 đến 2013, được lưu giữ tại Khoa Xét Nghiệm – Bệnh viện
Bệnh Nhiệt đới Trung ương.

+

Các chủng này được phân lập từ bệnh nhân được chẩn đoán bệnh TCM
có phân độ lâm sàng từ 2b trở lên.
Đây là các chủng được phân lập trong Đề tài cấp Nhà nước “Nghiên cứu

Đặc điểm lâm sàng, Dịch tễ học, Phương pháp chẩn đoán, Điều trị, Dự phòng
Bệnh Tay Chân Miệng tại Việt Nam và Đề xuất chủng vi rút để sản xuất vắc
xin” năm 2011 - 2013 của Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương.
-

Tiêu chuẩn loại trừ: các chủng cho kết quả giải trình tự không tốt

2.2. Vật liệu nghiên cứu
2.2.1. Trang thiết bị, dụng cụ
-

Máy chạy PCR, Biorad, Mỹ.

-

Máy đo nồng độ ADN Cubit, Invitrogen/Thermo Fisher

Scientific, Mỹ.
-

Máy giải trình tự gen thế hệ mới Miseq, Illumina, Mỹ.

-

Giá từ.

-

Block nhiệt


17

-

Ống Eppendoft 1,5ml free-ARN

-

Plate 96 giếng 0,3ml, miếng dán Microseal B

-

Đầu côn, Pippet các cỡ 10µl, 100µl, 1000µ.

-

Găng tay, khẩu trang.

2.2.2. Sinh phẩm hóa chất
2.2.2.1. Hóa chất tách ARN: QIAamp viral ARN extraction kit (QIAGEN)

2.2.2.2. Hóa chất đánh giá ADN bằng máy Qubit: Qubit Working Solution
gồm 1µl QuBit reagent và 199 µl QuBit Buffer.
2.2.2.3. Bộ kit chuẩn bị thư viện
Bộ TruSeq Strand mARN LT sample Prep (ILMN). Gồm các hóa chất
Hóa chất tinh sạch, cắt ARN
+

Bead Binding Buffer (BBB)

+

Bead Washing Buffer (BWB)

+

Elution Buffer (ELB)

+

Fragment, Prime, Finish Mix (FPF)

+

Resuspension Buffer (RSB)

+

ARN Purification Beads (RPB)

- Hóa chất tổng hợp chuỗi cDNA thứ nhất (st cDNA)

+

First Strand Synthesis Act D Mix (FSA)

+

Episcrip reverse transcriptase enzyme (Epicenter)

- Hóa chất để tổng hợp chuỗi cDNA thứ 2 (ds cDNA)
+

Resuspension Buffer (RSB)

+

Second Strand Marking Master Mix (SMM)

+

AMPure XP Beads 90µl/ mẫu.

+

Ethanol (EtOH) 80%

- Hóa chất gắn đuôi PolyA ở đầu 3’: A-Tailing Mix (ATL)
- Hóa chất gắn adapter


18

+

Resuspension Buffer (RSB)

+

TruSeq Stranded mARN LT Sample Prep Kit contents:

+

ARN Adapter Indices (AR001–AR016, AR018– AR023, AR025, AR027

+

Ligation Mix (LIG)

+

Resuspension Buffer (RSB)

+

Stop Ligation Buffer (STL)

- Hóa chất làm giàu cDNA
+

PCR Master Mix (PMM)

+

PCR Primer Cocktail (PPC)

+

Resuspension Buffer (RSB)

+

AMPure XP Beads 50µl/mẫu

+

Ethanol (EtOH) 80%
Hóa chất để chuẩn hóa nồng độ: Tris-HCl 10 mM, pH8.5 with 0.1%

Tween 20
2.2.2.4. Hóa chất chạy máy Miseq
Bộ MiSeq Reagent kit 300 cycle V2 gồm các hóa chất: Reagent
Cartridge, HT1, lọ dung dịch PR2, MiSeq Flow Cell.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
Mô tả, phân tích dữ liệu phòng xét nghiệm.
2.3.1. Quy trình kỹ thuật: theo hướng dẫn sử dụng của bộ kit TruSeq Strand
mARN LT sample Prep (ILMN).


19

Chủng được lưu giữ bảo ở -800C

Tách ARN.

Chuẩn bị thư viện.
Trộn các mẫu lại với
Đưa
nhau
mẫu vào máy Miseq

sạch và cắt ARN thành
Tổngcác
hợpđoạn
cDNA
ngắn.
thứ nhất.
Gắn đuôi
Gắnđầu
index-adapter
3’. Làm giàu các đoạn
Định ADN
lượng thư viện.
Tổng
hợp cDNA
thứPoly
2. A vào

Sơ đồ 2.1. Quy trình kỹ thuật.
2.3.1.1. Bảo quản chủng vi rútEV - A71
Các chủng đươc lưu giữ dưới dạng huyền dịch trong ống cryotube 2ml
trong môi trường bảo quản thích hợp.
2.3.1.2. Tách ARN từ các mẫu bệnh phẩm

Sử dụng bộ QIAamp viral ARN extraction kit (QIAGEN) theo quy trình
của hãng. Gồm các bước:
-

Cho 560 µl AVL có chứa 5,6µl carrier ARN vào ống có thể tích 1,5 ml.

-

Cho 140 µl dịch vi rút nuôi cấy vào ống đã có chứa hỗn hợp AVL và
carrier ARN, trộn đều.

-

Ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút.

-

Thêm 560 μl of Ethanol (96–100%) vào hỗn hợp trên, trộn đều.

-

Chuyển toàn bộ hỗn hợp lên cột lọc, ly tâm 8000 rpm trong 1 phút,
chuyển cột lọc sang ống hứng mới.

-

Cho 500 AW1 vào cột lọc, ly tâm 8000 rpm trong 1 phút, chuyển cột
lọc sang ống hứng mới.

-

Cho 500 AW2 vào cột lọc, ly tâm 14000 rpm trong 3 phút, chuyển cột


20

lọc sang ống hứng mới.
-

Ly tâm khan với tốc độ 15000 rpm trong 1 phút.

-

Chuyển cột lọc sang ống 1,5 ml, cho 60 µl dung dịch AVE vào, ủ ở
nhiệt độ phòng trong 1 phút.
Ly tâm 8000 rpm trong 1 phút, vứt bỏ cột lọc, cất ARN trong tủ -200C.

-

2.3.1.3. Chuẩn bị thư viện


Tinh sạch, cắt ARN thành các đoạn ngắn.

Quy trình
Tạo plate RBP

+

Rã đông hóa chất ở nhiệt độ phòng, tạo Plate dán nhãn RBP

+

Cho 50µl ARN mỗi mẫu vào mỗi giếng.

+

Cho 50 µl dung dịch RPB vào mỗi giếng, dùng pippet trộn đều.

+

Dán plate bằng miếng Microseal B.

+

Ủ plate RBP ở 650C trong 5 phút, giữ ở 40C, ngay sau khi plate đạt
40C, để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, loại bỏ dịch nổi
Rửa RBP

+

Bỏ miếng dán, đặt plate lên giá từ.

+

Cho 200 µl dung dịch BWB vào mỗi giếng, dùng pippet trộn đều, để
ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, nhấc plate khỏi giá từ, hút bỏ dịch nổi.

+

Thêm 50µl dung dịch EB vào mỗi giếng, trộn đều.

+

Ủ plate ở 80oC trog 2 phút, giữ ở 25oC.
Tạo RFB

+

Thêm 50µl dung dịch BBB vào mỗi giếng của plate RBP, dùng pippet
trộn đều, để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.

+

Đặt plate RBP lên giá từ trong 5 phút, hút bỏ dịch nổi.

+

Thêm 200 µl BWB vào mỗi giếng của plate RBP, dùng pippet trộn đều.

+

Đặt plate ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, hút bỏ dịch nổi, nhấc plate


21

khỏi giá từ.
+

Thêm 19,5 µl dung dịch FPF vào mỗi giếng của plate RBP, dùng
pippet trộn đều.

+

Dán plate bằng miếng Microseal B.
Ủ RFP: ủ plate RBP ở 940C trong 8 phútgiữ ở 40C. Ngay khi plate đạt

-

40C thì nhấc plate RBP ra.


Tổng hợp chuỗi cDNA thứ nhất (st DNA)
Tạo CDP

+

Rã đông và vortex hóa chất First Strand Synthesis Act D Mix (FSA) ở
nhiệt độ phòng, tạo plate dán nhãn CDP.

+

Bỏ miếng dán ở plate RBP, đặt plate lên giá từ, giữ ở nhiệt độ phòng
trong 5 phút.

+

Chuyển 17 µl dịch nổi từ plate RBP sang plate CDP.

+

Thêm 50µl EpiScript™ Reverse Transcriptase

vào ống chứa First

Strand Synthesis Act D Mix, sau đó thêm 8µl hỗn hợp này vào mỗi
giếng của plate CDP, dùng pippet trộn đều.
Tạo quy trình nhiệt để tổng hợp chuỗi st cADN.

-



250C
10 phút
0
42 C
15 phút
0
40 C
15 phút
0
Giữ ở 4 C
Tổng hợp chuỗi cDNA thứ 2 (ds cDNA)
-

Rã đông hóa chất ở nhiệt độ phòng. Tạo một plate có dán nhãn CCP

-

Thêm SMM
+

Thêm 5µl dung dịch RSB vào mỗi giếng của plate CDP, dán plate
CDP, lắc ở 1600rpm trong 20s.

+
-

Ủ plate CDP ở 160C trong 60 phút, sau đó để ở nhiệt độ phòng.
Tinh sạch CDP


22

+

Cho 90 µl hỗn hợp AMPure XP beads vào mỗi giếng của plate CCP.

+

Chuyển toàn bộ hỗn hợp của plate CDP sang các giếng của CCP.

+

Dán đĩa CCP, lắc ở nhiệt độ phòng trong 15 phút, sau đó ly tâm 280g
x 1 phút, bỏ miếng dán.

+

Đặt plate CCP lên giá từ, để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.

+

Hút bỏ 135 µl dịch nổi từ mỗi giếng của plate CCP.

+

Thêm 200 µl dung dịch Ethanol 80% vào mỗi giếng, để 30s ở nhiệt
độ phòng, hút bỏ dịch nổi. Thực hiện bước này 2 lần

+

Để plate CCP ở nhiệt độ phòng trong 15 phút, cho khô

+

Thêm 17,5 µl dung dịch RSB vào mỗi giếng, dán plate CCP, lắc
1800rpm trong 2 phút, sau đó ly tâm 280g x 1 phút, để ở nhiệt độ
phòng trong 2 phút, gỡ bỏ miếng dán.

+

Đặt plate CCP lên giá từ trong 5 phút, tạo một plate dán nhãn ALP.

+

Chuyển 15 µl dịch nổi (ds cADN) từ mỗi giếng của plate CCP sang
plate ALP mới.



Gắn đuôi Poly A ở đầu 3’
-

Rã đông và vortex hóa chất ở nhiệt độ phòng: A-Tailing Control (CTA),
A-Tailing Mix (ATL)

-

Thêm 2,5µl dung dịch RSB vào mỗi giếng của plate ALP, 12,5 µl dung
dịch ATL, dùng pippet trộn đều, dán plate ALP.

-

Ủ plate ALP: cài đặt quy trình nhiệt
Lid 1000C
370C
700C
Giữ ở 40C



30 phút
5 phút

Gắn adapter
-

Thêm 2,5µl dung dịch RSB vào mỗi giếng của plate ALP, 2,5 µl dung


23

dịch LIG, cho thêm 2,5µl dung dịch ARN Adapter Index và mỗi giếng
của plate ALP, dùng pippet trộn đều, dán plate.
-

Ly tâm plate ALP ở 280g x 1 phút.

-

Ủ plate ALP ở 300C trong 10 phút, bỏ miếng dán.

-

Thêm 5µl dung dịch STL vào mỗi giếng, dùng pippet trộn đều.

-

Tinh sạch plate ALP
+

Cho 42 µl dung dịchAMPure XP Beads vào mỗi giếng của Plate ALP,
dùng pippet trộn đều.

+

Để plate ở nhiệt độ phòng trong 15 phút, sau đó đặt plate lên giá từ

trong 5 phút.

+

Hút bỏ 79,5 µl dịch nổi.

+

Đặt plate lên giá từ, thêm 200µl Ethanol 80% vào mỗi giếng, để ở
nhiệt độ phòng 30 giây, hút bỏ dịch nổi. Thực hiện bước này 2 lần.

+

Để plate ALP ở nhiệt độ phòng trong 15 phút, nhấc plate ra khỏi giá từ.

+

Thêm 52,5 µl dung dịch RSB vào mỗi giếng ALP, dùng pippet trộn
đều, ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 phút.

+

Đặt plate lên giá từ, để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.

+

Chuẩn bị một plate mới ghi nhãn CAP, chuyển 50

l dịch từ plate

ALP sang các giếng của plate CAP.
+

Thêm 50 µl dung dịch AMPure XP Beads vào các giếng của plate
CAP, dùng pippet trộn đều, để ở nhiệt độ phòng trong 15 phút, sau đó
đặt plate lên giá từ để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.

+

Hút bỏ 95µl dịch nổi.

+

Đặt plate lên giá từ, thêm 200µl Ethanol 80% vào mỗi giếng, để ở
nhiệt độ phòng 30 giây, hút bỏ dịch nổi. Thực hiện bước này 2 lần.

+

Để plate CAP ở nhiệt độ phòng trong 15 phút, nhấc plate ra khỏi giá từ.

+

Thêm 22,5 µl dung dịch RSB vào mỗi giếng CAP, dùng pippet trộn
đều, ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 phút.


24



+

Đặt plate lên giá từ, để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.

+

Chuyển 20µl dịch nổi sang một plate mới dán nhãn PCR.

Làm giàu các đoạn ADN
Cho 5µl hỗn hợp PPC, 25µl hỗn hợp PMM vào mỗi giếng của plate

-

PCR.
-

Dán plate, lắc ở 1600rpm trong 20 giây, ly tâm 280g x 1 phút.

-

Cài đặt quy trình nhiệt thực hiện phản ứng PCR

-

- Lid 1000C
- 980C
30 giây
-15 chu kỳ với:
980C
10 giây

0
60 C
30 giây
0
72 C
30 giây
0
-72 C
5 phút
0
-Giữ ở 4 C
Tinh sạch PCR plate
+

Bỏ miếng dán plate.

+

Thêm 50µl hỗn hợp AMPure XP Beads vào các giếng của 1 plate mới
dãn nhãn CPP.

+

Chuyển toàn bộ hỗn hợp trong các giếng từ plate PCR sang plate
CPP, dán plate CPP, lắc ở 1800 rpm trong 2 phút, để ở nhiệt độ phòng
trong 5 phút, ly tâm 280g x 1 phút, bỏ miếng dán.

+

Đặt plate lên giá từ, để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, hút bỏ 95µl

dịch nổi.

+

Đặt plate lên giá từ, thêm 200µl Ethanol 80% vào mỗi giếng, để ở
nhiệt độ phòng 30 giây, hút bỏ dịch nổi. Thực hiện bước này 2 lần.

+

Để plate CPP ở nhiệt độ phòng trong 15 phút, nhấc plate ra khỏi giá từ.

+

Thêm 32,5 µl dung dịch RSB vào mỗi giếng CPP, dùng pippet trộn đều,
ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 phút, ly tâm 280g x 1 phút, bỏ miếng dán.

+

Đặt plate lên giá từ, để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút,


25

+


Chuyển 30µl dịch nổi sang một plate mới dán nhãn TSP1

Định lượng thư viện
-

Đo nồng độ ADN bằng Qubit

-

Sử dụng: máy Qubit, các ống đo chuyên dụng và bộ kit: dsADN HS
Assay
Pha hóa chất Qubit Working Solution theo tỷ lệ 1 µl QuBit reagent: 199

-

µl QuBit Buffer.
Pha hỗn hợp dung dịch đo nồng độ ADN trong các ống đo chuyên dụng

-

theo các bước như sau:
+

Standard : 10 µl standard trong 190 µl Qubit working solution

+

Mẫu cần đo nồng độ ADN: 2 µl mẫu trong 198 µl Qubit working
solution.



Đưa standard và mẫu vào máy Qubit và đo nồng độ ADN.

Quy trình chuẩn hóa mẫu
-

Chuyển 10 µl mỗi mẫu từ plate TSP1 sang một giếng mới dán nhãn
DCT.

-

Chuẩn hóa nồng độ trong mỗi giếng về 10 nM, sử dụng Tris-HCl 10
mM, pH 8.5 with 0.1% Tween 20.

-

Dán nhãn plate, lắc plate ở 1000rpm trong 2 phút, ly tâm ở 280g x 1
phút, bỏ miếng dán.



Trộn các mẫu lại với nhau: Chuyển 10µl hỗn hợp trong mỗi giếng vào một
ống tube dán nhãn PDP, dùng pippet trộn đều

2.3.1.4. Đưa mẫu vào máy Miseq


Chuẩn bị
Điều chỉnh Block nhiệt cho ống 1.5ml ở 960C.
Rã đông hóa chất Miseq Reagent để ở nhiệt độ phòng: bằng cách ngâm

trong bể nước ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ, chú ý mực nước ngâm phải dưới