NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN VIRÚT GÂY BỆNH CÒI (Monodon baculovirus) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) BẰNG KỸ THUẬT PCR

 

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN VI-RÚT GÂY BỆNH CÒI
(Monodon baculovirus) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon)
BẰNG KỸ THUẬT PCR

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện : BÁO THỊ XUÂN HƯƠNG
Niên khóa

: 2009 – 2013

Tháng 06/2013
i
 

 

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN VI-RÚT MBV GÂY BỆNH CÒI
(Monodon baculovius) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) BẰNG
KỸ THUẬT PCR

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

PGS.TS LÊ ĐÌNH ĐÔN

BÁO THỊ XUÂN HƯƠNG

KS. HUỲNH ĐĂNG SANG

Tháng 06/2013
ii
 

 

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành cảm ơn:
Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh.
Ban chủ nhiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học cùng toàn thể thầy cô đã truyền đạt
kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tại trường.
PGS. TS. Lê Đình Đôn đã giúp đỡ tôi trong quá trình làm thực tập tốt nghiệp.
KS. Huỳnh Đăng Sang đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, tận tình giúp đỡ tôi trong
quá trình thực tập tại Viện Công Nghệ Sinh học và Môi trường – Trường Đại học Nông

Lâm Thành phố Hồ Chí Minh.
Chị Lê Tố Trâm (Sở Nông nghiệp và Phát triển nông thôn tỉnh Cà Mau), đã giúp
đỡ trong thời gian tôi đi lấy mẫu ở Cà Mau.
Các em Hồ Thị Bích Trâm - lớp Công nghệ Sinh học khóa 36 đã giúp tôi trong
suốt quá trình thực tập.
Bạn bè thân yêu của lớp Công nghệ Sinh học khóa 35 đã chia sẻ cùng tôi những
vui buồn cũng như hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ, động viên tôi trong suốt 4 năm qua.
Thành kính ghi nhớ công ơn cha mẹ cùng những người thân trong gia đình đã
luôn là chỗ dựa vững chắc cho con, động viên, khuyến khích, tạo mọi điều kiện cho con
học tập tốt.
Tp. Hồ Chí Minh, tháng 12 năm 2013.
Sinh viên thực hiện

Báo Thị Xuân Hương

i
 


 

TÓM TẮT

Vi-rút gây bệnh còi (MBV) là một trong những vi-rút được xếp vào danh sách các
tác nhân gây bệnh đứng thứ 2 trên tôm. MBV gây chết ở giai đoạn cuối của tôm

postlarval (tỉ lệ chết hơn 90%) và giai đoạn juvenile (tỉ lệ chết hơn 70%). Cho đến nay,
công tác phòng bệnh vẫn là biện pháp hiệu quả nhất để hạn chế thiệt hại do bệnh còi.
Trong đó việc thả nuôi tôm giống sạch bệnh là điều cần thiết. Do đó, cần có quy trình
chẩn đoán giúp phát hiện MBV ở giai đoạn bệnh chưa tiến triển trên tôm giống và tôm
nhằm phát triển công tác sản xuất giống sạch bệnh cũng như hỗ trợ cho công tác phòng
ngừa dịch bệnh.
Trong đề tài này, các mẫu gan tôm sú và mẫu tôm post được tiến hành ly trích và
chạy PCR. Kết quả ly trích mẫu gan tôm cho thấy, DNA tổng số xuất hiện rõ và đồng đều
ở các mẫu, tuy nhiên băng di vẫn còn smear, do lượng DNA bị đứt gãy và protein chưa
được loại bỏ hoàn toàn. Kết hợp đo OD để kiểm tra độ tinh sạch của DNA ly trích. Mẫu
tôm post nhiễm MBV cũng được tiến hành ly trích DNA và chạy PCR, mẫu DNA ương
tính với MBV cũng được giải trình tự và kết quả giải trình tự cũng cho thấy quy trình

PCR được khảo sát có khả năng phát hiện chính xác MBV trên mẫu tôm bệnh. Trong
nghiên cứu này quy trình ly trích DNA từ mẫu gan tôm sú, mẫu tôm post và quy trình
PCR đã được xây dựng thành công và có thể ứng dụng trong chẩn đoán bệnh còi.

ii
 


 

SUMMARY
The virus causes scurvy (MBV) is one of the viruses classified in the list of

pathogens No. 2 on the shrimp. MBV lethal in the final stages of postlarval shrimp (90%
mortality) and juvenile stages (70% mortality). So far, disease prevention is still the most
effective measures to limit damage caused by scurvy. In this work stocking Pathogen is
essential. Therefore, there should be procedures to help detect MBV diagnosed in
advanced stage of the disease not on shrimp and shrimp to the development of diseasefree seed production as well as support for the prevention of the disease.
In this subject, the liver sample prawn and DNAs were conducted post extraction
and PCR. Results shrimp extracted liver samples showed that total DNA appeared clear
and uniform in the sample, but still portable tape smear, due to the fault of DNA and
protein is not completely eliminated. Combining OD measurements to check the purity of
extracted DNA. Post MBV infected shrimp samples were carried out DNA extraction and
PCR, DNA samples were also run computer with MBV sequencing and sequencing
results also showed that the PCR process is surveyed accurately detect MBV on shrimp

samples. In this study the process of DNA extraction from liver samples prawn, shrimp
samples and post PCR process has been successfully developed and can be applied in the
diagnosis of scurvy.
Key word: PCR, Monodon baculovius, diagnosis.

iii
 


 

MỤC LỤC

Lời cám ơn........................................................................................................................... i
Tóm tắt................................................................................................................................ ii
Summary............................................................................................................................iii
Mục lục .............................................................................................................................. iv
Danh sách các chữ viết tắt .................................................................................................. v
Danh sách các bảng ........................................................................................................... vi
Danh sách các hình ............................................................................................................ vi
Chương 1 MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
1.1 Đặt vấn đề ..................................................................................................................... 1
1.2 Mục tiêu ........................................................................................................................ 2
1.3 Nội dung thực hiện ....................................................................................................... 2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU.................................................................................. 3

2.1 Tình hình nuôi tôm ở Việt Nam ................................................................................... 3
2.2 Tình hình dịch bệnh trên tôm và tác hại của nó ........................................................... 6
2.3 Một số bệnh phổ biến trên tôm sú ................................................................................ 6
2.3.1.Bệnh đốm trắng – WSSV (White Spot Baculo Vi-rút) ............................................. 6
2.3.2. Bệnh đầu vàng – (Yellow head diseases) ................................................................. 7
2.3.3. Bệnh đỏ toàn thân ..................................................................................................... 7
2.3.4. Hội chứng taura ........................................................................................................ 7
2.4 Bệnh còi trên tôm ........................................................................................................ 8
2.4.1. Tác nhân gây bệnh .................................................................................................... 9
2.4.2. Dấu hiệu bệnh lý....................................................................................................... 9
2.4.3. Phân bố ................................................................................................................... 10
2.4.4. Loài và giai đoạn cảm nhiễm ................................................................................. 10

2.4.5. Phương thức lây nhiễm........................................................................................... 10
2.4.6. Chẩn đoán bệnh ...................................................................................................... 10
2.4.6.1 Dự chuẩn .............................................................................................................. 10
iv
 


 

2.4.6.2 Kiểm khẳng định .................................................................................................. 11
2.4.7 Các biện pháp kiểm soát bệnh ................................................................................. 12
2.5 Phương pháp Polymerase Chain Reaction (PCR) ..................................................... 12

2.6. Phương pháp phân tích định tính và định lượng thô nucleic acid ............................. 13
2.6.1 Phương pháp điện di DNA trên gel ......................................................................... 13
2.6.2 Phương pháp định lượng bằng quang phổ kế .......................................................... 13
2.7 Giải trình tự DNA....................................................................................................... 13
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu .............................................................................. 15
3.2 Vật liệu và hóa chất .................................................................................................... 15
3.2.1 Vật liệu .................................................................................................................... 15
3.2.2 Hóa chất ................................................................................................................... 15
3.3 Phương pháp nghiên cứu ............................................................................................ 16
3.3.1 Thu mẫu và bảo quản mẫu ...................................................................................... 16
3.3.2. Phương pháp ly trích DNA..................................................................................... 16

3.3.3. Phương pháp PCR xác định tôm nhiễm MBV ....................................................... 17
3.3.4. Phương pháp đo OD ............................................................................................... 18
3.3.5 Giải trình tự sản phẩm PCR được khuếch đại ......................................................... 18
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Kết quả ly trích DNA từ mẫu tôm .............................................................................. 29
4.2 Xây dựng quy trình PCR có khả năng phát hiện vi-rút MBV trên tôm sú. ................ 20
4.3 Ứng dụng quy trình phát hiện vi-rút MBV trên mẫu tôm post thu thập được ........... 22
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1 Kết luận ...................................................................................................................... 24
5.2 Đề nghị ....................................................................................................................... 24
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................ 25
PHỤ LỤC

v
 


 

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Bp

base pair

Ctv

Cộng tác viên

DNA

Deoxyribonucleic acid

dNTP

Deoxyribonucletide triphosphate

ĐBSCL

Đồng bằng sông Cửu Long

EDTA

Ethylene Diamine Tetra acetic Acid

HPV

Hepatopanceatic parvovi-rút

IMNV

Infectiuos meonecrosis virus

IHHNV

Infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus

NTTS

Nuôi trồng thủy sản

OD

Opitical density

PCR

Polymera chain reaction

PCI

Phenol: Clochrofrom: Isoamyl alcohol

PL

Postlarval

SDS

Sodium Dodecyl Sulfate

Taq

Thermus aquaticus

TBE

Tris Borate EDTA

TE

Tris – EDTA

TSV

Taura syndrome virus

UV

Ultraviolet radiation

V

Volt (đơn vị hiệu điện thế)

YHV

Yellow head virus

WSSV

White Spot Syndrome Virus

NTTS

Nuôi trồng thủy sản

vi
 

 

DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 3.1. Trình tự đoạn mồi xác định MBV .................................................................15
Bảng 3.2. Thành phần phản ứng PCR ...........................................................................17
Bảng 3.3. Chương trình nhiệt PCR................................................................................17

DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hinh 2.1 Triệu chứng tôm sú nhiễm bệnh MBV chậm lớn màu xanh sẫm ......................9
Hinh 2.2 Nguyên tắc PCR ..............................................................................................12
Hình 4.1 Tôm nghi ngờ nhiễm MBV ............................................................................19

Hình 4.2 Kết quả ly trích DNA tổng số từ 8 mẫu tôm sú ...............................................21
Hình 4.3 Kết quả chạy PCR của 8 mẫu DNA tổng số ....................................................23

vii
 


 

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1.

Đặt vấn đề
Ngày nay, thủy sản là một trong những ngành có vai trò quan trọng và đem lại

hiệu quả kinh tế đáng kể cho đất nước. Với tổng sản lượng thủy sản năm 2012 ước đạt
5.745 ngàn tấn, tăng 5,1% so với năm 2011, trong đó: sản lượng thủy sản khai thác ước
đạt 2.633 ngàn tấn, tăng 3,9%; sản lượng nuôi trồng thủy sản ước đạt 3.112 ngàn tấn,
tăng 6,2% cùng kì năm 2011 (Theo thông tin từ Ngành Nông nghiệp và Phát triển Nông
Thôn thống kê năm 2012). Tuy nhiên, khi nghề nuôi tôm càng phát triển thì dịch bệnh
xảy ra ngày càng nhiều nhất là các bệnh do vi-rút gây ra như bệnh đốm trắng (WSSV),
hội chứng Taura (TSV), bệnh đầu vàng (YHV), bệnh hoại tử gan tụy (HPV), bệnh còi
(MBV), bệnh hoại tử cơ/ đục cơ (IMNV), bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan biểu

mô (IHHNV). Cơ quan Quốc tế về Dịch bệnh Động vật (năm 2003) đã xếp MBV vào
danh sách các tác nhân gây bệnh đứng thứ 2 trên tôm, vi-rút thường gây bệnh trên tôm sú
ở giai đoạn tôm ấu trùng (hatchery-reared larval), tôm hậu ấu trùng (postlarval) và tôm
đang lớn (juvenile). Bệnh còi không gây chết tôm ồ ạt nhưng làm cho tôm chậm lớn.
MBV gây chết ở giai đoạn cuối của tôm postlarval (tỉ lệ chết hơn 90%) và giai đoạn
juvenile (tỉ lệ chết hơn 70%) (Thông tin từ Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ
Chí Minh), tôm bố mẹ trưởng thành có thể mang vi-rút và truyền sang tôm ấu trùng. Việc
sử dụng đàn tôm giống mang sẵn tác nhân gây bệnh là một nguyên nhân quan trọng làm
bùng phát dịch bệnh còi. Hiện tại chưa có thuốc đặc hiệu để trị bệnh nên công tác phòng
ngừa tổng hợp bao gồm tẩy trùng ao nuôi, ngăn cản sự xâm nhập của các vi sinh vật
mang mầm bệnh vào ao nuôi và sử dụng tôm giống sạch bệnh được khuyến cáo như một
biện pháp an toàn sinh học (Escobedo Bonilla, 2008). Vì thế, nhu cầu kiểm tra tôm bố

mẹ, tôm giống sạch vi-rút gây bệnh còi trước khi thả nuôi là một vấn đề quan trọng nhằm
hạn chế nguy cơ bùng phát dịch bệnh. Kỹ thuật PCR được biết đến là một phương pháp
có độ nhạy, độ chính xác cao và thời gian phát hiện nhanh. Đề tài: “Nghiên cứu phát hiện
vi-rút gây bệnh còi (Monodon baculovirus) trên tôm sú (Penaeus monodon) bằng PCR”
1
 


 

được thực hiện nhằm mục đích xây dựng quy trình cho phép phát hiện sớm và chính xác
sự hiện diện MBV trên tôm sú ở Việt Nam.

1.2.

Mục tiêu
Áp dụng thành công quy trình ly trích DNA tôm sú của Caipang và ctv (2004).
Xây dựng thành công quy trình có khả năng phát hiện MBV bằng kỹ thuật PCR.

1.3

Nội dung thực hiện
Hoàn thiện quy trình ly trích DNA từ mẫu gan và mẫu tôm post.
Thiết lập và tối ưu quy trình PCR có khả năng phát hiện MBV.
Ứng dụng quy trình PCR phát hiện MBV trên một số mẫu tôm post được thu thập

từ các hộ nuôi thuộc huyện Cần Giờ.

2
 


 

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Tình hình nuôi tôm ở Việt Nam
Nghề nuôi tôm ở Việt Nam đã tồn tại từ thập niên 70 với hình thức nuôi tôm

quảng canh. Trong đó, diện tích tôm nuôi ở ĐBSCL ở thời kì này đạt khoảng 70.000 ha.
Nghề nuôi tôm ở Việt Nam thật sự phát triển từ sau năm 1987 và nuôi tôm thương phẩm
phát triển mạnh vào những năm đầu thập kỷ 90. Tuy nhiên, sự bùng nổ của nghề nuôi
tôm thương phẩm được đánh dấu vào năm 2000 khi chính phủ ban hành nghị quyết 09,
cho phép chuyển đổi một phần diện tích trồng lúa, làm muối năng suất thấp, đất hoang
hóa sang nuôi trồng thủy sản. Diện tích nuôi tôm đã tăng từ 250.000 ha năm 2000 lên đến
478.000 ha năm 2001. Song song, với việc mở rộng diện tích, sản lượng tôm nuôi cũng
tăng mạnh từ những năm 90 và đặc biệt là từ sau năm 2000 Việt Nam đã trở thành một
trong năm nước có sản lượng tôm nuôi cao nhất thế giới (Bộ thủy sản, 2006). Năm 2003
tổng diện tích tôm nuôi khoảng 518.557 ha đạt sản lượng hơn 258.034 tấn. Theo báo cáo
sơ bộ của tổng cục thống kê năm 2007 tổng diện tích nuôi tôm của cả nước khoảng
625.600 ha đạt sản lượng khoảng 315.435 tấn. Trong đó, ĐBSCL là vùng có diện tích và

sản lượng tôm chiếm khoảng 60 – 80% diện tích và sản lượng cả nước (Nguyễn Thanh
Phương và Trần Ngọc Hải, 2004). Các loài tôm được nuôi chính ở Việt Nam là tôm sú
(Penaeus monodon), tôm he mùa (Penaeus merguiensis), tôm nương (Penaeus
orientalis), tôm đất (Metapenaeus ensis), trong đó tôm sú là loài nuôi chủ đạo, đóng góp
sản lượng cao nhất. Gần đây tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) cũng được nhập về
nuôi ở nước ta (trích dẫn từ Bộ Thủy sản, 2006).
2.2 Tình hình dịch bệnh trên tôm và tác hại của nó
Cùng với sự phát triển, tốc độ gia tăng diện tích và sản lượng tôm nuôi là tình hình
dịch bệnh không ngừng bùng phát. Đây cũng là một trong những nguyên nhân quan trọng
làm giảm đáng kể sản lượng tôm nuôi.
Tại Việt Nam trong hai năm 1994 – 1995 hiện tượng tôm nuôi chết hàng loạt và
lan rộng trên hầu hết các tỉnh ven biển phía Nam đã gây thiệt hại trên dưới 250 tỉ

3
 


 

đồng. Các công trình nghiên cứu liên quan đến việc xác định các tác nhân gây bệnh
chính trên tôm nuôi ở ĐBSCL cho thấy ngoài tác nhân gây bệnh thuộc nhóm Vibrio
còn ghi nhận sự xuất hiện của hai tác nhân gây bệnh vi-rút quan trọng là MBV
(Monodon Baculovirus) và WSSV (White spot syndrome virus) (Nguyễn Văn Hảo và
ctv, 1997).
Kết quả nghiên cứu của Đỗ Thị Hòa và ctv (2004) cho thấy tại các tỉnh miền

Trung có khoảng 70% bể PL có MBV dương tính. Khi đưa PL xuống ao đất để ương
thành tôm giống, tỷ lệ nhiễm MBV trên đàn giống tăng cao, gần 90% ao ương nhiễm
MBV. Tôm bố mẹ dùng trong các trại sản xuất tôm sú giống ở miền Trung bị nhiễm
MBV từ 60 – 70%.
Đầu năm 2001, tôm sú đã chết hàng loạt, trên diện rộng ở ĐBSCL, được coi là
“đại dịch tôm sú’'. Tại các vùng mới chuyển đổi, đã có 20.854 ha bị thiệt hại; một số
vùng ở Cà Mau thiệt hại tới hơn 80%. Nôn nóng chuyển đổi tự phát, không có kỹ thuật,
hạ tầng thủy lợi chưa có là những nguyên nhân chính làm cho bệnh đốm trắng phát tán và
lan tràn. Vụ đầu năm 2002, bệnh tôm lại tái diễn ở ĐBSCL, được xác định là do hạ tầng
chưa cải thiện, môi trường nuôi quá xấu. Đến hết tháng 9/2003, số diện tích nhiễm bệnh
ở Kiên Giang là hơn 8.000 ha, Cà Mau bị hơn 232 ha; nhất là MiềnTrung thất bại nặng nề
khi Khánh Hoà, Phú Yên, Quảng Nam, Ninh Thuận có hàng nghìn ha tôm bị nhiễm bệnh.

Riêng thiệt hại của Khánh Hoà ước tính 26,6 tỷ đồng, Bình Định 40 tỷ. Khảo sát của
Trung tâm nghiên cứu thuỷ sản (NCTS) III cho thấy, nếu tôm bố mẹ bị nhiễm bệnh, tôm
giống có nguy cơ nhiễm cao, đặc biệt với bệnh MBV. Tôm giống sản xuất trong nước
hiện tập trung ở miền Trung. Trong đó, riêng Khánh Hoà đã có hơn 1.000 trại, cung cấp
khoảng 7 tỷ tôm PL cho cả nước. Với mật độ xây dựng trại giống ngày càng dầy, việc
tuân thủ quy hoạch và các tiêu chuẩn xử lý thải hạn chế, ấu trùng tôm có nguy cơ nhiễm
bệnh cao. Phòng bệnh học của Trung tâm NCTS III, đã phát hiện 30/54 mẫu kiểm tra
tôm bố mẹ nhiễm MBV, với mẫu tôm PL bị nhiễm là 40,5% (trích dẫn từ Mai Phương và
Hà Yên, 2003).
Theo báo cáo kết quả của ngành NTTS năm 2003, cả nước có 546.757 ha nuôi tôm
nước lợ thương phẩm. Trong đó, diện tích có tôm nuôi bị bệnh và chết là 30.083 ha. Các
4

 


 

tỉnh thành ven biển từ Ðà Nẵng đến Kiên Giang có tới 29.200 ha nuôi tôm bị chết nhiều,
chiếm 97,06% diện tích có tôm bị chết trong cả nước. Các bệnh xảy ra với tôm cũng chủ
yếu là bệnh đốm trắng (WSSV), bệnh MBV, bệnh do vi khuẩn Vibrio, bệnh do ký sinh
trùng, do dinh dưỡng và gần đây xuất hiện thêm bệnh phân trắng, teo gan ở một vài nơi.
Kết quả kiểm tra bệnh ở tôm giống nhập về Hải Phòng và Quảng Ninh trong năm qua do
Trạm nghiên cứu NTTS nước lợ thực hiện cho thấy tỷ lệ nhiễm vi-rút đốm trắng từ 25 –
46,6%, trung bình 38,9% tỷ lệ nhiễm MBV từ 43,3 – 60%. Và trong số 4 nguồn cung cấp

giống về cho 2 tỉnh vùng Ðông Bắc Bộ này, có tới 3 nguồn có quá nửa số giống bị nhiễm
bệnh MBV. Tại các tỉnh Nam Bộ theo báo cáo năm 2003 của Viện NTTS II thì tỷ lệ
nhiễm bệnh đốm trắng trên mẫu tôm có biểu hiện bệnh thu ở đầm nuôi quảng canh cải
tiến là 56%, còn bệnh MBV là 50% (Hà Anh, 2007).
Theo kết quả nghiên cứu của Trung tâm Quản lý bệnh thủy sản Khoa Thủy sản
trường Đại học Cần Thơ từ năm 2001 – 2003 thì tỷ lệ nhiễm bệnh đốm trắng trên tôm giống
tại các tỉnh ĐBSCL là 13,1% và MBV là 33,8% (Đặng Thị Hoàng Oanh và ctv, 2004).
Năm 2005, phòng kiểm dịch giống thủy sản Cà Mau cho biết qua số mẫu kiểm
dịch đã có tới 83% mẫu tôm giống ở tỉnh bị nhiễm MBV. Trung tâm khuyến ngư tỉnh
Bạc Liêu năm 2006 đã xét nghiệm 2.326 mẫu tôm phát hiện có gần 50% số mẫu kém chất
lượng; trong đó có 941 mẫu nhiễm MBV, 184 mẫu nhiễm vi-rút đốm trắng. Ở Trung tâm
khuyến ngư Kiên Giang, qua kiểm tra 100 mẫu tôm giống, số lượng tôm bị nhiễm bệnh

còi chiếm đến 40% lượng tôm sú giống nhập về (Cung Diễm, 2006).
Trong đầu vụ nuôi tôm sú năm 2008, hiện đã có gần 100.000 ha nuôi tôm sú ở Sóc
Trăng, Bạc Liêu, Cà Mau, Kiên Giang, Trà Vinh… bị chết, mức độ thiệt hại từ 30 - 90%.
Riêng ở Kiên Giang ước lượng mức thiệt hại do tôm chết đã trên 15 tỷ đồng. Trong đó,
điển hình như huyện Vĩnh Thuận là 17.247 ha chiếm 88,98%; huyện An Minh 15.904 ha
chiếm 50,25%; huyện U Minh hượng 3.653 ha chiếm 52,35%; và An Biên 2.475 ha
chiếm 30,11% diện tích thả nuôi (Song Huỳnh, 2008).
Tại huyện Mỹ Xuyên – Sóc Trăng là nơi có mô hình nuôi tôm – lúa được các nhà
khoa học ở các viện, trường đại học trong cả nước đánh giá mang tính bền vững cao. Tuy
nhiên, đến khoảng trung tuần tháng 4 – 2008, nơi đây có hơn 2.500 ha tôm nuôi bị chết,
5
 

 

chiếm gần 80% diện tích. Nhiều hộ nuôi tôm ở Trà Vinh cũng lâm vào cảnh tương tự.
Khi tôm được 2,5 tháng tuổi thì bị bệnh đốm trắng, đầu vàng… tình trạng tôm chết hàng
loạt cũng đang diển biến phức tạp tại các huyện Châu Thành. Cầu Ngang, Duyên
Hải…Cùng thời gian này, tại các Trạm kiểm dịch động vật thủy sản thuộc Chi cục Bảo
vệ nguồn lợi thủy sản tỉnh Trà Vinh đã phát hiện và vận động các hộ sản xuất, kinh doanh
tự tiêu huỷ hơn 24,5 triệu con tôm sú giống có mang mầm bệnh MBV, đỏ thân, phát
sáng... Trong đó, có trên 22,2 triệu con con tôm giống sản xuất tại địa phương và gần 2,3
triệu con nhập ngòai tỉnh (Duy Hoàng, 2008).

Phần lớn các diện tích tôm bị chết là do người nuôi thả giống trước lịch thời vụ.
Trong thời gian đầu, tôm phát triển tốt, nhưng sau đó thì bị bệnh đốm trắng, một số khác
thì bị đỏ thân. Hiện nay, ĐBSCL mỗi năm cần khoảng 22 đến 25 tỷ con giống. Trong khi
đó, nguồn tôm giống ở các địa phương chỉ đáp ứng khoảng 30 đến 35%, còn lại phải
thu mua con giống từ các tỉnh miền Trung nhưng theo thống kê thì nguồn tôm giống ở
các tỉnh này có tỷ lệ nhiễm bệnh rất cao từ 65 – 70%. Theo Sở Thủy sản Bạc Liêu, qua
kiểm tra trên 355 mẫu tôm giống tại các cơ sở bán tôm giống đã phát hiện có 52,4%
(186/355) mẫu bị nhiễm bệnh MBV; 10,4% (37/355) mẫu bị nhiễm bệnh đốm trắng; 11%
(39/355) mẫu bị nhiễm bệnh đầu vàng (Nguyễn Kiểm, 2008).
Theo báo cáo của ngành thủy sản các tỉnh ĐBSCL cho biết, tôm sú hiện vẫn tiếp
tục chết tại nhiều tỉnh ven biển trên diện tích hàng ngàn hécta, nâng diện tích tôm chết
từ đầu năm đến nay trên 120.000 ha, nhiều gần 3 lần tháng 3 – 2008, tập trung tại Cà

Mau với 57.789 ha, Kiên Giang 40.000 ha, Bạc Liêu 19.000 ha (Thảo An, 2008).
2.3.

Một số bệnh phổ biến trên tôm sú

2.3.1. Bệnh đốm trắng
Tác nhân gây bệnh: hội nghị vi-rút học quốc tế lần thứ 12 (Paris, 2002) các tác giả:
Vlak và ctv đã phân loại vi-rút gây hội chứng đốm trắng là một giống mới Whispovirus
thuộc họ mới Nimaviridave.
Vi-rút dạng hình trứng, kích thước 120 x 275 nm, có một đuôi phụ ở một đầu, kích
thước 70 x 300 nm. Vi-rút có ít nhất 5 lớp protein, trọng lượng phân tử từ 15 – 28
kilodalton. Vỏ bao có hai lớp protein, nucleocapsid có 3 lớp. Nhân cấu trúc dsDNA:

6
 


 

không có thể ẩn. Khi tôm xuất hiện các đốm trắng, quan sát thấy rất nhiều các thể vùi. Ở
trong nhân của tế bào mang, biểu bì ruột, dạ dày và tế bào biểu bì dưới vỏ, cơ quan
lympho, các nhân hoại tử và sưng to. Khi môi trường nuôi tôm xấu bệnh dễ xuất hiện.

2.3.2. Bệnh đầu vàng
Tác nhân gây bệnh: Vi-rút hình que kích thước 44 ± 6 x 173 ± nm. Nhân của vi-rút

có đường kính gần bằng 15 nm, chiều dài lên tới 800 nm. Cấu trúc acid nhân là RNA có
đặc điểm gần giống họ Rhabdoviridae hoặc nhóm vi-rút dạng sợi của họ
Paramyxoviridae.
2.3.3. Bệnh đỏ toàn thân
Tác nhân gây bệnh: có thể do các chất độc từ các vi sinh vật hay do nhiễm vi
khuẩn. Cho tôm ăn thức ăn có tạp hôi thối lâu ngày là nguyên nhân gây bệnh. Các vi
khuẩn gây độc và gây bệnh này trú ở gần gan tụy của tôm. Các loại tôm đều mắc bệnh
này. Bệnh xảy ra ở tất cả các giai đoạn nhưng phổ biến ở tôm giống và tộm trưởng thành.
Dấu hiệu bệnh lý: được biểu hiện qua các giai đoạn khác nhau, tôm mới nhiễm
bệnh có màu vàng hơi xanh. Giai đoạn tiếp theo, tôm trở nên có màu đỏ từ mang, các đầu
chân, và sau đó đến toàn bộ cơ thể. Giai đoạn nặng, sắc tố bình thường của tôm bị mất
hoàn toàn. Trên đầu ngực của tôm có nhiều chất dịch nhờn, rất tanh và hôi thối. Gan tụy

bị phá hủy và có màu vàng nhợt nhạt không bình thường. Tôm bệnh chết hàng loạt.
Biện pháp phòng bệnh: không cho tôm ăn thức ăn tươi sống quá dư thừa. Chuẩn bị
ao kỹ trước khi nuôi, quản lý chất lượng nước ao tốt để hạn chế bệnh xảy ra.
2.3.4. Hội chứng taura
Nguyên nhân gây bệnh: do Piconavirus gây ra, thường xuất hiện ở giai đoạn tôm
post. Bệnh có hai biểu hiện mãn tính và cấp tính, gây chết 80 – 95% đối với tôm nhỏ và
40% đối với tôm lớn.
Dấu hiệu bệnh lý: biểu hiện mãn tính gây thoái hóa vỏ. Xuất hiện những đốm đen
trên vỏ và cơ thể. Biểu hiện cấp tính vỏ mềm, trên thân và đuôi xuất hiện các đốm màu
đỏ, các đốm này càng ngày lang rộng. Tôm bơi yếu, mất phương hướng. Chết nhanh hoặc
chết ngay sau khi lột xác.

7
 


 

Biện pháp phòng bệnh: hiện chưa có biện pháp chữa trị. Bệnh có thể lây sang
chiều ngang hoặc chiều dọc, khả năng loại trừ bệnh phụ thuộc vào viêc loại bỏ hoàn toàn
nguồn tôm lây nhiễm, tiệt trùng cơ sở nuôi tránh tái nhiễm trùng (từ các thiết bị nuôi ở
gần đó, tôm tự nhiên hoặc các vật mang bệnh cận lâm sàng) và thả lại tôm giống mới
sạch vi-rút hội chứng Taura từ nguồn tôm bố mẹ sạch bệnh vi-rút hội chứng Taura. Áp
dụng các biện pháp phòng bệnh tổng hợp.

2.4.

Bệnh còi trên tôm sú

2.4.1. Tác nhân gây bệnh
Tác nhân gây bệnh MBV là vi-rút type A baculovirus monodon, có cấu trúc nhân
là DNA hai mạch, có lớp vỏ bao, dạnh hình que (Lightner, 1996). Chủng MBV của tôm sú
từ Ấn Độ Thái Bình Dương có kích thước nhân 42 ± 3 x 246 ± 15 nm, kích thước vỏ bao
75 ± 4 x 324 ± 33 nm. Chủng PMV của tôm (P. plebejus, P.monodon, P. merguiensis) từ
Úc có kích thước nhân 45 - 52 x 260 - 300 nm, kích thước vỏ bao 60 x 420 nm (Mari và
ctv, 1993 được trích dẫn từ Bùi Quang Tề, 2006).
Vi-rút ký sinh ở tế bào biểu mô hình ống gan tụy và tế bào biểu bì phía trước ruột

giữa, vi-rút tái sản xuất bên trong nhân tế bào vật nuôi, bao gồm các giai đoạn sau:
Giai đoạn tiềm ẩn: sau khi tế bào nhiễm MBV là giai đoạn sớm của tế bào chất
biến đổi.
Giai đoạn 1: nhân tế bào trương nhẹ, các nhiễm sắc thể tan ra và di chuyển ra sát
màng nhân. Tế bào chất mất dần chức năng của chúng và hình thành giọt mỡ. Vi-rút bắt
đầu gây ảnh hưởng.
Giai đoạn 2: nhân trương to, số lượng vi-rút tăng, xuất hiện thể ẩn trong nhân.
Giai đoạn 3: tế bào bị bệnh, nhân tăng lên 2 lần đường kính, 6 lần thể tích. Bên
trong nhân có một đến nhiều thể ẩn, trong thể chứa đầy các vi-rút. Các vi-rút phá hủy tế
bào ký chủ, tiếp tục di chuyển sang các tế bào khác hoặc theo chất bài tiết của tôm ra môi
trường, tạo thành vi-rút tự do tồn tại trong bùn và nước (Trần Thị Tuyết Hoa, 2008).
2.4.2. Dấu hiệu bệnh lý

Trên tôm ấu trùng (Postlarvae): khi tôm mới bị nhiễm MBV dấu hiệu bệnh lý
không rõ ràng. Tôm nhiễm bệnh nặng có một số dấu hiệu sau: yếu, bơi lội lờ đờ, có dải
8
 


 

trắng trên lưng của phần bụng. Tôm có màu tối hoặc xanh lơ hay xanh đen, sinh trưởng
chậm và chuyển giai đoạn không đều. Các phần phụ và vỏ kitin có hiện tượng hoại tử, có
nhiều sinh vật bám: ký sinh trùng đơn bào, tảo bám và vi khuẩn dạng sợi. Tôm yếu dần,
dạt vào bờ, bơi trên tầng mặt nhưng chưa chết hoặc chết rải rác nếu các yếu tố môi trường

ổn định. Nếu các yếu tố môi trường biến động lớn tôm chết hàng loạt, tỷ lệ chết có thể lên
đến 100% (Trần Thị Hà và Nguyễn Chiến Văn,2008)
Trên tôm thịt: Khi bị nhiễm bệnh thường có màu tối đen, tôm kém ăn, còi cọc, chậm lớn,
chu kỳ lột xác kéo dài. Trên mang và bề mặt cơ thể có hiện tượng hoại tử, có nhiều sinh
vật bám (như vi khuẩn dạng sợi, ký sinh trùng đơn bào và tảo bám). Gan tụy teo lại, có
màu trắng hơi vàng và bị phá huỷ nhanh.
Mẫm cảm với các loại mầm bệnh khác như: Vi khuẩn Vibrio, vi-rút đốm trắng.
Tôm yếu dần, bơi dạt vào bờ. Tỷ lệ chết dần tới 90%.

Hình 2.1 Triệu chứng tôm sú nhiễm bệnh MBV chậm lớn, màu xanh sẫm
(Bùi Quang Tề, 2003).
2.4.3. Phân bố

Theo tài liệu kỹ thuật thủy sản FAO, 2005. Bệnh MBV được ghi nhận từ
Ôxtrâylia, Đông Phi, Trung Đông, nhiều nước ở Ấn Độ - Thái Bình Dương, và từ Bắc Á
đến Đông Á. Các vi-rút dòng MBV cũng được tìm thấy ở các vùng nuôi tôm sú
P.monodon ở Địa Trung Hải và Tây Phi, Tahiti và Hawaii, cũng như ở một vài nơi thuộc
Bắc và Nam Mỹ, và vùng Caribbe.
9
 


 

Ở Việt Nam bệnh MBV được phát hiện nhiều nhất trên tôm sú nuôi ở các tỉnh ven

biển phía Nam (tháng 10 – 11/1994, Bùi Quang Tề). Tiếp theo Đỗ Thị Hoà từ tháng
11/1994 – 7/1995 cũng đã nghiên cứu phát hiện bệnh MBV trên tôm sú nuôi ở các tỉnh
Nam Trung Bộ.
2.4.4. Phương thức lây nhiễm
Theo tài liệu kỹ thuật thủy sản FAO, 2005. MBV lây truyền qua đường tiêu hóa
do vi-rút có trong phân của tôm nhiễm bệnh, hoặc do tôm ăn thịt tôm đã chết hoặc vừa
chết. Tôm trưởng thành bị nhiễm bệnh cũng có khả năng truyền sang con của chúng
thông qua làm bẩn khối trứng đã đẻ ra do phân.
2.4.5. Vật chủ cảm nhiệm
Các Baculovirus dòng MBV, theo tên gọi tìm thấy chủ yếu ở tôm Penaeus monodon
nuôi. Những loài tôm cùng nuôi khác cũng bị nhiễm vi-rút dòng MBV, nhưng lại không
kết hợp với bệnh lý trầm trọng hoặc không phát triển các nguồn bệnh khác với tôm sú.

2.4.6. Phương pháp chẩn đoán
2.4.6.1.

Dự chuẩn

Theo tài liệu kỹ thuật thủy sản FAO, 2005. Các quan sát chung (Mức độ I): khi bị
bệnh tôm có dấu hiệu giảm sức tăng trưởng, ngừng ăn và ngừng làm vệ sinh thân, lờ đờ
và tăng tình trạng đóng bẩn trên toàn thân. Một số tôm còn xuất hiện đường ruột giữa
màu trắng xuyên qua lớp cutin phần bụng. Bệnh thường xuất hiện ở giai đoạn ấu trùng,
tôm trưởng thành cũng có khả năng mắc bệnh nhưng không có triệu chứng rõ rệt. Các
dấu hiệu này không đặc trưng cho MBV.
2.4.6.2 Kiểm khẳng định

Tiêu bản ướt của mô tươi (Mức độ I/II): có thể quan sát MBV bằng kính hiển vi để
thấy các thể ẩn hình đơn cầu hoặc đa cầu hoặc đơn bán cầu hoặc đa bán cầu ở trong nhân
phình to của gan tụy hoặc biểu mô ruột giữa. Các thể ẩn của bệnh MBV có đường kính
0,1 – 20 μm. Các thể ẩn được nhuộm màu bằng dung dịch 0,05% malachite green, khi đó
các thể ẩn sẽ bắt màu đậm hơn các thể hình cầu có cùng kích thước ở xung quanh (nhân
tế bào, các hạt tiết, các giọt lipid,…).

10
 


 

Mô bệnh học (Mức độ II ): cố định các mô từ tôm sống hay còn trong tình trạng
sắp chết bằng dung dịch Davidson. Sau đó dung dịch cố định được tiêm trực tiếp vào
khối gan tụy và các mô này được cố định từ 24 – 48 giờ trước khi chuyển sang lưu trữ
trong ethanol 70%. Bước xử lý tiếp theo là đúc mẫu paraffin , sau đó mẫu được cắt với độ
dày 5 – 7 μm rồi được nhuộm bằng thuốc nhuộm Haematoxylin và Eosin theo phương
pháp nhuộm của Harris, hoặc của Giemsa hoặc theo các phương pháp nhuộm Gram.
Phương pháp nhuộm Gram biểu mô của Brown và Brenn cho thấy được sự khác biệt của
chúng trong các mô xung quanh.
Nhuộm phát huỳnh quang với phloxine (Mức độ II): dung dịch 0,001% phloxine
được dùng làm tiêu bản ép mô, làm cho các thể ẩn của bệnh MBV bắt huỳnh quang màu
xanh – vàng khi quang sát dưới kính hiển vi huỳnh quang (lọc cản sáng 0 – 515 nm, và

lọc kích ứng ở 490 nm) (Thurman và ctv, 1990).
Kính hiển vi điện tử (Mức độ III): bệnh MBV có 2 dạng thể ẩn khi quan sát dưới
kính hiển vi điện tử (Ramasamy và ctv, 2000). Dạng thứ nhất có một dãy trong suốt các
thể đa diện nằm cách nhau 5 – 7 nm ở bên trong một lớp mạng, chứa các thể vi-rút ẩn có
màng kép với kích thước 267 ± 2 x 78 ± 3 nm. Các thể ẩn dạng 2 chứa các thể không
trong suốt, dạng hạt có đường kính 12 nm, chúa hầu hết là các thể vi-rút hiện rõ với kích
thước 326 ± 4 x 73 ± 1 nm.
Ngoài ra, cũng có thể dùng các phương pháp hiện đại để chẩn đoán và nghiên cứu
vi-rút này như dùng kỹ thuật PCR (Mức độ III) để nhận biết ADN đặc trưng của MBV,
phát hiện các vi thể vi-rút MBV trong nhân tế bào biểu mô gan tụy.
2.4.7 Các biện pháp kiểm soát bệnh
Theo tài liệu kỹ thuật thủy sản FAO, 2005. Mật độ nuôi cao, hóa chất và các stress

do môi trường đã làm tăng tính độc của bệnh MBV ở các loài tôm dễ bị nhiễm bệnh trong
điều kiện nuôi.
Việc phòng tránh nhiễm bệnh bằng cách chọn tôm bố mẹ không bị nhiễm MBV
bằng phương pháp kiểm tra phân, tẩy uế bề mặt của ấu trùng nauplius hoặc các trứng đã
thụ tinh bằng formalin, iodophore, và lọc sạch nước biển.

11
 


 

Có thể tiệt trùng các dịch bệnh MBV ở một số cơ sở nuôi trồng thủy sản bằng cách
cho tiêu hủy đàn tôm đã bị nhiễm bệnh, khử trùng dụng cụ nuôi, tránh vi-rút tái nhiễm
(từ các phương tiện nuôi khác ở bên cạnh, tôm tự nhiên,...).
2.5 Phương pháp Polymerase Chain Reaction (PCR)
PCR là phương pháp nhân nhanh một đoạn phân tử DNA mục tiêu trong ống
nghiệm. Phản ứng PCR được thực hiện trên cơ sở sinh tổng hợp DNA theo nhiều chu kỳ
nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 trình tự như sau: biến tính, bắt cặp, kéo dài (Bùi Chí
Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999). Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả phản ứng PCR: độ
dài của mồi khoảng 17 – 30 nucleotide; tỷ lệ G – C lý tưởng trong đoạn mồi vào khoảng
50% để nhiệt độ bắt cặp của đoạn mồi là không quá thấp; các đoạn mồi không nên chứa
hơn 3 nucleotide giống nhau xếp liên tiếp; tránh sử dụng các đoạn mồi có thể nhân lên
các đoạn gen phụ; hai đoạn mồi không được có trình tự nucleotide bổ sung lẫn nhau;

nhiệt độ lúc bắt đầu phản ứng PCR tức là lúc cho enzym tổng hợp DNA vào, không nên
thấp hơn nhiệt độ bắt cặp của đoạn mồi (Nguyễn Ngọc Hải, 2007).

Hình 2.2 Nguyên tắc PCR
12
 


 

2.6.

Phương pháp phân tích định tính và định lượng thô nucleic acid
Sau khi thu nhận nucleic acid ở dạng sạch, người ta có thể tiến hành phân tích định

tính và định lượng chúng bằng một số phương pháp như: phương pháp điện di DNA trên
gel, phương pháp định lượng bằng quang phổ kế.
2.6.1. Phương pháp điện di DNA trên gel
Điện di là kỹ thuật để tách và định lượng acid nucleic với kích thước và hàm
lượng khác nhau. Kỹ thuật này dựa trên một đặc tính cơ bản của acid nucleic là các đại
phân tử tích điện âm do sự có mặt của gốc PO43- trên bề mặt. Do đó, khi acid nucleic
trong điện trường với cường độ dòng điện và hiệu điện thế thích hợp, chúng sẽ di chuyển
dần về phía cực dương và các đoạn DNA có kích thước lớn sẽ di chuyển chậm hơn so với
các đoạn DNA có kích thước nhỏ, nhờ vậy mà các đoạn DNA có kích thước khác nhau

có thể phân tách tạo các băng DNA khác nhau trên gel. Gel được sử dụng trong kỹ thuật
điện di là gel agarose (với các phân tử DNA có kích thước lớn) hoặc polyacryamid (các
phân tử DNA có kích thước nhỏ) (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1997).
2.6.2 Phương pháp định lượng bằng quang phổ kế
Nguyên tắc của phương pháp dựa vào sự hấp thu mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước
sóng 260 nm (OD260nm – Optical Density260nm) của các mẫu đo cho phép xác định nồng độ
nucleic acid trong mẫu dựa vào sự tương quan sau: một đơn vị OD260nm tương ứng với
một nồng độ là 50 μg/ml cho một dung dịch DNA sợi đội và 40 μg/ml cho một dung dịch
RNA hay DNA sợi đơn. Tuy nhiên cách tính này chỉ đúng với các dung dịch nucleic acid
sạch. Để kiểm tra độ sạch của dung dịch, người ta đo thêm giá trị OD ở 280 nm
(OD280nm). Bước sóng 280 nm là bước sóng mà các protein có mức hấp thụ cao nhất
nhưng các protein cũng có thể hấp thu ánh sáng ở bước sóng 260 nm như các nucleic

acid, do đó là sai lệch giá trị thật của nồng độ nucleic acid. Một dung dịch nucleic acid
được xem là sạch khi tỷ số OD260nm/OD280nm nằm trong khoảng 1,8 – 2 (Hồ Huỳnh Thùy
Dương, 1997).
2.7

Giải trình tự DNA tự động
Giải trình tự DNA tự động dựa theo nguyên lý của phương pháp dideoxy cải tiến

dựa vào các thiết bị tự động hóa nhanh và chính xác hơn. Máy đọc trình tự trên cả hai
13
 

 

mạch đơn, do vậy có thể phát hiện và cảm giác nhầm lẫn do kỹ thuật. Trong kỹ thuật này
không phải đánh dấu chất đồng vị phóng xạ mà bằng chất huỳnh quang (fluochrome).
Mỗi loại dideoxy nucleotide được đánh dấu bằng một fluochrome có màu khác nhau.
Máy giải trình tự có thể phát hiện cùng lúc hiện tượng huỳnh quang ở bốn độ dài sóng
khác nhau. (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang 1999).
Các phương pháp xác định trình tự nucleic acid đều dựa vào 2 nguyên tắc: nguyên
tắc hóa học: dựa vào các phương pháp hóa học thủy giải đặc hiệu phân tử DNA, tạo
thành một tập hợp nhiều phân đoạn có kích thước khác nhau; nguyên tắc enzyme học:
dựa vào sự tổng hợp mạch bổ sung cho trình tự xác định nhờ DNA polymerase. Với việc

sử dụng thêm các dideoxynucleotide cùng với các deoxynucleotide thông thường, kết quả
tổng hợp cũng là sự hình thành một tập hợp nhiều đoạn DNA có kích thước khác nhau.
Các phân đoạn DNA sẽ được phân tách qua điện di trên gel polyacrylamide có khả
năng phân tách hai trình tự DNA chỉ chênh nhau một nucleotide. Việc sử dụng một đoạn
nucleotide có đánh dấu đồng vị phóng xạ, kết quả trình tự cần xác định được đọc trên bản
phóng xạ tự ghi từ bản điện di (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1997).

14
 


 

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1

Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài
Thời gian thực hiện đề tài từ tháng 12 năm 2012 đến 05 năm 2013. Mẫu tôm được

thu thập tại các vùng nuôi bị dịch. Việc nghiên cứu phát hiện MBV trên mẫu tôm nghi
ngờ nhiễm được thực hiện tại phòng thí nghiệm Sinh học phân tử của Viên Nghiên cứu
Công nghệ Sinh học và Môi trường – Trường Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.

3.2.

3.2.1.

Vật liệu và hóa chất
Vật liệu
Mẫu tôm post nhiễm MBV được tiếp nhận từ “Trung Tâm Kiểm Tra Chất Lượng

Thủy Sản Cà Mau” được sử dụng làm đối chứng dương trong quá trình nghiên cứu.
Mẫu tôm thu mua từ một số chợ ở Thành phố Hồ Chí Minh được sử dụng để lấy
mẫu gan phục vụ cho nghiên cứu quy trình ly trích.
Tám mẫu tôm post được thu thập từ 8 hộ nuôi tôm thuộc huyện Cần Giờ.
3.2.2 Hóa chất
Hóa chất điện di: Agarose (abm, Mỹ), Ethidiumbromide 10 mg/ml (Sigma, Mỹ),

loading dye, thang DNA 1000 bp (abm, Mỹ), dung dịch đệm TBE 10X.
Hóa chất ly trích DNA: NaCl, EDTA, SDS, TE 10X, Urea, Tris, Phenol:
Chlorofrom: isoamyl alcohol, Ethanol 100%, Ethanol 70%, TE buffer.
Hóa chất PCR (abm, Mỹ) gồm Taq DNA polymerase, PCR buffer 10X, MgCl2 25
mM, Nucleotides 25 mM (dNTPs), nước cất, đoạn mồi 261F và 261R.
Bảng 3.1 Trình tự đoạn mồi sử dụng trong nghiên cứu (Win và ctv, 2005)
Đoạn mồi

Trình tự

Mồi 261F

5’-TCCAATCGCGTCTGCGATACT-3’

Mồi 261R

5’-CGCTAATGGGGCACAAGTCTC-3’

15
 

Kích thước sản phẩm
261 bp

 

3.3.

Phương pháp nghiên cứu

3.3.1. Phương pháp thu mẫu và bảo quản mẫu
Mẫu tôm post được lấy ngẫu nhiên từ 8 hộ nuôi tôm thuộc huyện Cần Giờ. Tất cả
các mẫu tôm được bảo quản trong cồn 95% sao cho cồn ngập hết mẫu. Ghi tên chủ nuôi,
nơi lấy mẫu, thời gian lấy mẫu và dán vào hộp đựng mẫu. Nếu mẫu không được xét
nghiệm ngay thì phải định kỳ thay dung dịch bảo quản mẫu, mẫu được bảo quản ở 4oC.

3.3.2. Phương pháp ly trích DNA
Trong nghiên cứu này, DNA được ly trích từ mẫu gan tôm Sú và mẫu tôm post
theo quy trình của Caipang và ctv (2004) đã được chỉnh sửa. Quy trình được tiến hành
như sau:
Cho mẫu gan tôm vào eppendorf 1,5 ml và thêm 500 ml dung dịch đệm ly trích
thô DNA (10 mM Tris, 125 mM NaCl, 10 mM EDTA, 0,5% SDS và 4M Urea ở pH 7,5).
Dùng chày vô trùng nghiền cho mẫu đồng nhất.
Ủ trong một giờ ở 37oC.
Thêm 500 μl hỗn hợp phenol: chloroform: isoamyl (PCI) và lắc nhẹ, ủ trong một
giờ ở 37oC.
Ly tâm 9000 vòng trong 15 phút ở 4oC.
Hút dịch nổi vào eppendorf mới và thêm 500 μl hỗn hợp phenol: chloroform:

isoamyl (PCI) và lắc nhẹ, ủ trong một giờ ở 37oC.
Ly tâm 9000 vòng trong 15 phút ở 4oC.
Hút dịch nổi vào eppendorf mới và thêm một lượng ethanol tương đương với thể
tích dịch nổi vừa hút.
Ly tâm 9000 vòng trong 15 phút ở 4oC.
Hút bỏ phần dịch nổi lấy phần kết tủa.
Rửa tủa DNA bằng cồn 70% (1ml) và ly tâm 9000 vòng trong 10 phút ở 4oC.
Hút bỏ phần dịch nổi phía trên và để khô tự nhiên.
Hòa tan DNA kết tủa trong 30 μl 1X TE buffer (pH 7,5). Nên thực hiện phản ứng
PCR ngay sau khi tách chiết. Tuy nhiên có thể giữ mẫu ở - 20oC trong thời gian ngắn
(khoảng 1 – 2 ngày)
16