Xác định điều kiện biểu hiện thích hợp trong escherichia coli cho bacteriocin dlazu6 có tiềm năng kháng ung thư từ dorea longicatena

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG
---------------o0o---------------

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

XÁC ĐỊNH ĐIỀU KIỆN BIỂU HIỆN THÍCH HỢP TRONG
Escherichia coli CHO BACTERIOCIN DLAZU6 CÓ TIỀM
NĂNG KHÁNG UNG THƯ TỪ Dorea longicatena

Giảng viên hướng dẫn : PGS.TS NGUYỄN VĂN DUY
ThS. NGUYỄN THỊ KIM CÚC
Sinh viên thực hiện

: LỤC THỊ LUYỄN

Mã số sinh viên

: 55130975

Khánh Hòa: 2017


TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
---------------o0o---------------

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

XÁC ĐỊNH ĐIỀU KIỆN BIỂU HIỆN THÍCH HỢP TRONG
Escherichia coli CHO BACTERIOCIN DLAZU6 CÓ TIỀM
NĂNG KHÁNG UNG THƯ TỪ Dorea longicatena

GVHD: PGS.TS Nguyễn Văn Duy
ThS. Nguyễn Thị Kim Cúc
SVTH: Lục Thị Luyễn
MSSV: 55130975

Khánh Hòa, tháng 6/2017


i

LỜI CẢM ƠN
Thực tế không có sự thành công nào mà không gắn liền với sự hỗ trợ, giúp đỡ dù
ít hay nhiều, dù trực tiếp hay gián tiếp của người khác. Trong suốt 4 năm học tập tại
trường, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ của các thầy cô giáo, gia đình
và bạn bè. Với lòng biết ơn sâu sắc nhất tôi xin gửi đến quý thầy cô giáo trong Viện
Công nghệ sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nha Trang đã hướng dẫn, truyền
đạt kiến thức cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trường.
Và đặc biệt tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến PGS.TS Nguyễn Văn
Duy và Ths. Nguyễn Thị Kim Cúc đã cùng với tri thức và tâm huyết của mình truyền
đạt cho tôi vốn kiến thức quý báu; đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và chia sẻ những ý
kiến bổ ích để cho tôi hoàn thành tốt luận văn của mình. Với vốn kiến thức được tiếp
thu trong quá trình học không chỉ là nền tảng cho quá trình nghiên cứu khóa luận mà
còn là hành trang quý báu để tôi bước vào đời một cách vững chắc và tự tin.
Bên cạnh đó tôi cũng đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ nhiệt tình của quý thầy cô
giáo, các nhân viên quản lý phòng thí nghiệm, các anh chị và bạn bè.

Tôi vô cùng cảm ơn những tình cảm tốt đẹp của người thân trong gia đình, bạn bè
đã luôn ủng hộ, động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian
học tập và hoàn thành khóa luận của mình.

Nha Trang, tháng 6 năm 2017
Sinh viên
Lục Thị Luyễn


ii

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................... i
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ...................................................................................... iv
DANH MỤC BẢNG ....................................................................................................... v
DANH MỤC HÌNH ....................................................................................................... vi
LỜI MỞ ĐẦU ...............................................................................................................vii
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 1
1.1. Tổng quan về ung thư và liệu pháp chống ung thư ............................................... 1
1.1.1. Tổng quan về ung thư ..................................................................................... 1
1.1.2. Nguyên nhân gây ung thư và phương pháp điều trị ung thư .......................... 2
1.2. Tổng quan về peptide kháng ung thư .................................................................... 5
1.3. Tình hình nghiên cứu bacteriocin kháng ung thư ................................................. 8
1.3.1. Bacteriocin kháng ung thư .............................................................................. 8
1.3.2. Azurin, laz và một số bacteriocin kháng ung thư khác ................................ 10
1.4. Giới thiệu về bacteriocin Dlazu6 từ Dorea longicatena ..................................... 14
1.4.1. Giới thiệu về Dorea longicatena .................................................................. 14
1.4.2. Giới thiệu về gen mã hóa bacteriocin Dlazu6 .............................................. 15
1.5. Biểu hiện gen trong Escherichia coli .................................................................. 16
1.5.1 Vi khuẩn biểu hiện E. coli BL21 ................................................................... 16

1.5.2. Vector biểu hiện trong E. coli ....................................................................... 18
1.5.3. Ảnh hưởng của các yếu tố đến sự biểu hiện protein ..................................... 19
1.6. Tinh chế protein tái tổ hợp trong E. coli ............................................................. 21
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 23
2.1. Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu ..................................................... 23
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ................................................................................... 23
2.1.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ................................................................ 23
2.2. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................. 23
2.2.1. Chủng vi khuẩn ............................................................................................. 23
2.2.2. Hóa chất và enzyme ...................................................................................... 25
2.2.3. Máy móc và thiết bị chuyên dụng................................................................. 25
2.3. Phương pháp nghiên cứu..................................................................................... 27


iii

2.3.1. Kiểm tra sự biểu hiện protein Dlazu6 trong E. coli Bl21 ............................. 28
2.3.2. Khảo sát điều kiện biểu hiện protein Dlazu6 từ chủng E. coli tái tổ hợp ..... 29
2.3.3. Kỹ thuật điện di biến tính trên gel polyacrylamide (SDS-PAGE) ............... 30
2.3.4. Phương pháp tăng khả năng hòa tan của protein ......................................... 35
2.3.5. Tinh chế protein bằng cột Hispur Ni-NTA ................................................... 39
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .................................. 41
3.1. Kiểm tra biểu hiện gen dlazu6 trong E. coli BL21 ............................................. 41
3.2. Khảo sát điều kiện cảm ứng biểu hiện gen dlazu6 trong E. coli ......................... 43
3.3. Khảo sát khả năng hòa tan protein GST-6xHis-TEV-Dlazu6 bằng phương pháp
siêu âm ....................................................................................................................... 48
3.4. Bước đầu tinh chế protein mục tiêu bằng cột HisPur Ni-NTA ........................... 52
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 57
PHỤ LỤC

iv

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Ký hiệu
AMP

Viết đầy đủ
Cationic Antimicrobial Peptides

Ghi chú
Peptide kháng khuẩn
tích điện dương

APS

Ammonium persulfate

DNA

Deoxyribonucleic Acid

DTT

Dithiothreitol

EDTA

Disodium ethylenediamine tetraacetate

FPLC

Fast protein liquid chromatography

Chất sắc ký lỏng nhanh

HBV

Hepatitis B virus

Virus viêm gan siêu vi B

HCV

Hepatitis B virus

Vius viêm gan C

HIV

Human Immunodeficiency Virus infection

Virus gây suy giảm miễn
dịch ở người

IMAC

Immobilized Metal ion Affinity Chromatography

Sắc tố cố định vô hiệu
hóa kim loại
Chất cảm ứng

IPTG

Isopropyl-beta-D-thiogalacctopyranoside

kDa

Kilo Dalton

LB

Luria Bertani Broth

Môi trường nuôi cấy

mRNA

Messenger RNA

RNA thông tin

PAGE

Polyacrylamide Gel Electrophoresis

Điện di trên gel
Polyacrylamide

PEG

Polyethylene glycol

PMSF

Phenylmethylsulfonyl fluoride

RNA

Ribonucleic acid

SDS

Sodium dodecyl sulphate

TEMED Tetramethylethylenediamine
WHO

World Health Organization

Tổ chức Y tế Thế giới


v

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Các bacteriocin có hoạt động chống lại các dòng tế bào ung thư khác nhau..13
Bảng 1.2. So sánh bacteriocin Dlazu6 được mã hóa bởi gen dlazu6 có ít nhất hai tính

chất tương tự với Azurin hoặc P28-Azurin ......................................................16
Bảng 2.1. Thành phần và các dung dịch điện di protein .................................................33


vi

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Mô hình gắn kết giữa Azurin-p28 đối với protein đích ung thư p53 ............11
Hình 1.2. Cấu trúc Laz ..................................................................................................12
Hình 1.3. Hình ảnh kiểm tra sự biểu hiện và mức độ tan của protein GST-6xHis-TEVChazu5 ở E. coli BL21 .....................................................................................14
Hình 1.4. Tinh sạch protein bằng sắc lý ái lực .............................................................. 22
Hình 1.5. Hình ảnh điện di SDS-PAGE các phân đoạn tinh sạch của protein NLI-IF
..........................................................................................................................22
Hình 2.1. Plasmid pET42a(+) tái tổ hợp chứa gen dlazu6 ............................................24
Hình 2.2. Sơ đồ tổng quát chung của đề tài ...................................................................27
Hình 2.3. Cấu trúc protein trước và sau khi biến tính bới SDS.....................................32
Hình 2.4. Điện di trên gel polyacrylamide ....................................................................34
Hình 3.1. Kết quả kiểm tra sự biểu hiện và mức độ tan của protein GST-6xHis-TEVDlazu6 trong E. coli BL21 ...............................................................................41
Hình 3.2. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ IPTG ở 24°C đến biểu hiện và tính tan của
protein GST-6xHis-TEV-Dlazu6 .....................................................................44
Hình 3.3. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ IPTG ở 30°C đến biểu hiện và tính tan của
protein GST-6xHis-TEV-Dlazu6 .....................................................................45
Hình 3.4. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ IPTG ở 37°C đến biểu hiện và tính tan của
protein GST-6xHis-TEV-Dlazu6 .....................................................................46
Hình 3.5. Khảo sát biểu hiện và tính tan của protein dung hợp Dlazu6 theo nhiệt độ ..47
Hình 3.6. Kết quả khảo sát khả năng hòa tan của protein GST-6xHis-TEV-Dlazu6 theo
quy trình 1 và 2 .................................................................................................49
Hình 3.7. Kết quả khảo sát khả năng hòa tan của protein GST-6xHis-TEV-Dlazu6
bằng phương pháp sonication kết hợp với dịch ly giải ....................................51
Hình 3.8. Kết quả tinh chế protein GST-6xHis-TEV-Dlazu6 .......................................54

vii

LỜI MỞ ĐẦU
Trong một vài năm gần đây, số lượng bệnh nhân được phát hiện là mắc bệnh ung
thư và số ca tử vong do ung thư tăng đột biến, và ung thư đã được xem là căn bệnh của
xã hội thời hiện đại. Các loại hoá chất độc hại từ các sản phẩm gia dụng, tia cực tím,
khói bụi công nghiệp, môi trường sống bị ô nhiễm, thói quen sinh hoạt thiếu khoa học,
bia rượu, thuốc lá … đã đẩy nhanh số ca mắc bệnh ung thư trên khắp thế giới. Theo dự
báo của các nhà khoa học Anh thì ở thế kỷ 21 ung thư tiếp tục là căn bệnh có tỉ lệ tử
vong cao trên thế giới. Khoa học vẫn chưa thể tìm ra cách điều trị dứt điểm các trường
hợp khối u ác tính, và ung thư vẫn được xem là căn bệnh nan y khó chữa.
Theo ước tính của Tổ chức ung thư Liên hợp quốc, số người bị tử vong do ung thư
sẽ lên tới khoảng hơn 13,2 triệu người vào năm 2030. Hiệp hội nghiên cứu ung thư quốc
tế - IARC cũng cho biết, khoảng 21,4 triệu trường hợp mới mắc ung thư sẽ được phát
hiện vào năm 2030 và sẽ tập trung chủ yếu tại các nước nghèo, nơi có mức sống thấp và
tỉ lệ mắc bệnh cao nhất thế giới.
Có nhiều phương pháp điều trị ung thư như phẫu thuật, hóa trị, xạ trị, nội tiết, miễn
dịch, … nhưng các phương pháp này đều có nhược điểm nhất định của nó. Phẫu thuật
chỉ hiệu quả cho ung thư giai đoạn đầu, còn khu trú nếu khối ung thư đã di căn phẫu trị
chỉ có hiệu lực tạm thời, không có hiệu lực hoặc thậm chí còn kích thích sự di căn và
phát triển của khối ung thư. Khi sử dụng xạ trị và hóa trị, không những ức chế, tiêu diệt
tế bào ung thư mà còn làm tổn thương các tế bào xung quanh, điều này làm ảnh hưởng
lớn đến sức khỏe người bệnh và hơn thế nữa là hiện tượng kháng thuốc của tế bào ung
thư. Và hiện nay, phương pháp điều trị ung thư bằng cách tiếp cận với những sản phẩm
từ tự nhiên, vi sinh vật sống đã và đang được quan tâm trở lại. Protein và peptide từ vi
khuẩn là những sản phẩm được nghiên cứu nhiều nhất. Đặc biệt, peptide và bacteriocin,
sản phẩm tiết của vi khuẩn, chất kháng khuẩn có bản chất protein đang hứa hẹn là những
chất chống ung thư an toàn và hiệu quả. Trong số các peptide kháng khuẩn này, Azurin

là một peptide kháng khuẩn trong Pseudomonas kháng ung thư đã được nghiên cứu và
thử nghiệm lâm sàng. Giả thuyết đặt ra rằng liệu có phải Azurin là bacteriocin duy nhất
trong hệ vi sinh vật đường ruột người có khả năng kháng ung thư? Nguyen và Nguyen
(2015) đã tiến hành sàng lọc các gen mã hóa cho bacteriocin tương tự Azurin kháng ung
thư từ hệ gen của 66 loài vi khuẩn ưu thế trong hệ vi sinh vật đường ruột người bằng


viii

phương pháp tin sinh học. Kết quả cho thấy có 14 bacteriocin giả định tương tự Azurin
và p28-Azurin, nhất là về các vùng chức năng sinh học trong cấu trúc, tỉ lệ axit amin kỵ
nước và khả năng gắn kết với protein p53 của tế bào ung thư. Bacteriocin Dlazu6 được
mã hóa bởi trình tự gen p1seq11 (Dlazu6) từ Dorea longicatena là 1 trong 14 ứng cử
viên này. Gen dlazu6 đã được tạo dòng thành công trong plasmid pET42a(+) và được
biến nạp vào vi khuẩn E. coli BL21, để kiểm tra và khảo sát sự biểu hiện protein Dlazu6
thì đề tài: “Xác định điều kiện biểu hiện thích hợp trong Escherichia coli cho
bacteriocin Dlazu6 có tiềm năng kháng ung thư từ Dorea longicatena” được thực
hiện dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Nguyễn Văn Duy.
 Mục tiêu đề tài: “Xác định điều kiện biểu hiện thích hợp trong Escherichia coli cho
bacteriocin Dlazu6 có tiềm năng kháng ung thư từ Dorea longicatena và bước đầu tinh
chế bacteriocin Dlazu6”.
 Nội dung nghiên cứu
- Khảo sát điều kiện thích hợp cho biểu hiện gen dlazu6 từ Dorea longicatena
trong Escherichia coli.
- Bước đầu tinh chế bacteriocin Dlazu6.
 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
Ý nghĩa khoa học
- Đây là một trong những nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam về biểu hiện bacteriocin
tương tự Azurin kháng ung thư, nhất là các peptide và protein có nguồn gốc từ hệ vi sinh
vật đường ruột người.

- Kết quả của nghiên cứu này được dùng làm cơ sở cho việc thử hoạt tính kháng
ung thư trên động vật và người.
Ý nghĩa thực tiễn
- Nghiên cứu này làm cơ sở cho việc phát triển thuốc kháng ung thư mới có tính
đặc hiệu cao và hiệu ứng phụ thấp có nguồn gốc từ vi sinh vật đường ruột.


1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về ung thư và liệu pháp chống ung thư
1.1.1. Tổng quan về ung thư
Ung thư là quá trình bệnh lý trong đó một số tế bào thoát ra khỏi sự kiểm soát, sự
biệt hóa sinh lý của tế bào và tiếp tục nhân lên. Những tế bào này có khả năng xâm lấn
và phá hủy các tổ chức xung quanh. Đồng thời chúng di trú và đến phát triển ở nhiều cơ
quan khác nhau và hình thành nên di căn. Các biến chứng cấp tính như: xuất huyết ồ ạt,
chèn ép não, ngạt thở. Tiến triển nặng dần tiến đến rối loạn chức năng của các cơ quan
do khối di căn như thiểu năng hô hấp, suy chức năng gan thận. Sự thoái triển dần dần,
kéo dài dẫn đến suy kiệt và cuối cùng bệnh nhân tử vong.
Ung thư là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây tử vong trên toàn thế giới.
Trong năm 2012, có khoảng 14 triệu trường hợp ung thư được phát hiện mới và có đến
8,2 triệu ca tử vong liên quan đến ung thư (Ferlay và cs, 2015). Các loại ung thư được
chuẩn đoán phổ biến nhất là ung thư phổi (1,82 triệu ca), ung thư gan (745 000 ca), ung
thư dạ dày (723 000 ca), ung thư đại thực tràng (694 000 ca), ung thư vú (1,67 triệu ca),
ung thư thực quản (4 000 000 ca) (Ferlay và cs, 2015).
Số lượng các ca ung thư mới được dự đoán sẽ tăng khoảng 70% trong vòng hai
thập kỷ tới. Dự đoán số trường hợp ung thư hàng năm sẽ tăng lên từ 14 triệu trong 2012
lên 22 triệu trong vòng 2 thập kỷ tới. Hơn 60% số các ca ung thư mới hàng năm trên thế
giới xảy ra ở Châu Phi, Châu Á, trung và Nam Mỹ, chiếm 70% số các ca tử vong ung
thư trên thế giới. Đối với nam giới, 5 ung thư phổ biến nhất được chuẩn đoán trong năm

2012 là phổi, tuyến tiền liệt, đại thực tràng, dạ dày và gan. Còn đối với nữ giới là ung
thư vú, đại thực tràng, cổ tử cung và dạ dày (Nguyễn Nghiêm Luật, 2015).
Khoảng 30% các trường hợp tử vong liên quan đến ung thư là do 5 yếu tố nguy cơ
hàng đầu về hành vi và chế độ ăn uống: trọng lượng cơ thể cao (béo phì), ăn ít rau quả
tươi, ít tập thể dục, nghiện thuốc lá hoặc rượu. Thuốc lá là yếu tố nguy cơ quan trọng
nhất đối với ung thư, gây ra hơn 20% các ca tử vong ung thư và khoảng 70% các ca tử
vong do ung thư phổi trên toàn cầu. Ngoài ra, các bệnh nhiễm virus HBV, HCV và một
số type Human Papilloma Virus (HPV) là nguyên nhân của trên 20% số các ca tử


2

vong do ung thư ở các nước thu nhập thấp và thu nhập trung bình (Nguyễn Nghiêm
Luật, 2015).
Ở Việt Nam, trong năm 2012, số lượng các ung thư gặp phổ biến ở nam giới là:
gan 16.815 ca, phổi 16.082 ca, dạ dày 9,406 ca, đại trực tràng 4.561 ca và mũi họng
3.301 ca; còn các ung thư gặp phổ biến ở nữ giới là: vú 11.067 ca, phổi 5.783 ca, gan
5.182 ca, cổ tử cung 5.146 ca và dạ dày 4.797 ca. Tổng số ca tử vong do ung thư năm
2012 tại Việt Nam là 91.600 ca, trong đó: số nam giới tử vong do ung thư là 58.200 ca:
ung thư gan chiếm 26,9%, phổi 24,4%, dạ dày 14,5%, miệng - thực quản 5,8%, đại trực
tràng 5,2% và do ung thư khác là 23,2%; số nữ giới tử vong do ung thư là 33.400 ca:
ung thư phổi chiếm 14,5%, gan 13,7%, vú 12,5%, dạ dày 12,1%, đại thực tràng 8% và
do ung thư khác là 39,3% (WHO, 2012).
Các tế bào trong cơ thể chúng ta liên tục phân chia để phát triển, thay thế các tế
bào chất hoặc sửa chữa lại những tế bào bị tổn thương. Một số gen trong cơ chế chịu
trách nhiệm kiểm soát quá trình phân chia tế bào, tuy nhiên dưới tác động của các yếu
tố vật lý, sinh học, hóa học hay chính sự hư hỏng trong gen dẫn đến tế bào phân chia vô
hạn, kết quả là hình thành khối gọi là u/ bướu. Những khối u có thể lành tính (không
phải ung thư) hoặc ác tính (ung thư). Những khối u lành tính không xâm lấn vào các cơ
quan và các mô xung quanh của cơ thể. Trong khi khối u ác tính có thể phân chia vô

hạn, chúng có thể xâm lấn ra ngoài phạm vi ban đầu và xâm lấn vào những mô xung
quanh, trở thành di căn nếu không được xử lý hay điều trị. Một số u lành tính là tiền ung
thư và có thể tiến triển thành ung thư nếu không được điều trị. Nhưng đa số u lành tính
không phát triển thành ung thư.
1.1.2. Nguyên nhân gây ung thư và phương pháp điều trị ung thư
 Nguyên nhân gây ung thư
Mặc dù cơ chế đặc hiệu chính xác của tế bào ung thư chưa được nghiên cứu nhưng
có thể giải thích được các yếu tố khác nhau cho hoạt động chọn lọc dựa trên sự biến đổi
bề mặt của tế bào ung thư từ các tế bào bình thường. Phospholipid trên màng đôi của
các tế bào động vật có vú bình thường thì không đối xứng giữa bề mặt bên trong và bên
ngoài. Bề mặt bên ngoài được tạo thành từ các phospholipid có chứa choline trung tính
như sphingomyelin và phosphatidylcholine, trong khi bề mặt bên trong có các


3

aminophospholipid như phosphatidylserine và phosphatidylethanolamine. Tuy nhiên,
trong tế bào ung thư có sự mất cân bằng đối với các loại phospholipid. Màng tế bào ung
thư được biết là mang điện tích âm do hàm lượng animo phosphatidylserine cao, Oglycosylated mucin, sialylated ganglioside và heparin sulfate (Kaur và Kaur, 2015).
Nguyên nhân gây ung thư gồm 2 nhóm chính là các yếu tố môi trường và tác nhân
di truyền.
Tác nhân môi trường
Tác nhân vật lý bao gồm bức xạ ion và tia cực tím: Quá trình phóng xạ đã bắn ra
các hạt làm ion hóa các thành phần hữu cơ của tế bào tạo ra các gốc tự do. Chính các
gốc tự do này tác động lên các bazơ nitơ của DNA làm rối loạn các gen tế bào tạo ra các
biến dị và đột biến gây ung thư, quái thai và dị tật.
Tác nhân sinh học như virus, kí sinh trùng và vi khuẩn khi xâm nhiễm vào cơ thể
và gây ra ung thư ở một số cơ quan. Ví dụ như trường hợp virus Epstein gây nên bệnh
ung thư hàm dưới, ung thư vòng họng. Ký sinh trùng và khuẩn như nhiễm sán lá gan
Opisthorchis viverrini gây nên bệnh viêm gan ung thư, vi khuẩn Helicobacter pylori

(HP) gây ra viêm loét dạ dày – tá tràng và ung thư biểu mô dạ dày.
Tác nhân hóa học chẳng hạn như thuốc lá có hơn 4000 hợp chất gây ung thư đã
được nghiên cứu, độc tố aflatoxin (chất từ nấm mốc Aspergillus flavus thường có ở gạo,
lạc mốc) gây ra ung thư gan. Hay Atrazine là chất gây rối loạn hoocmon và tăng nguy
cơ ung thư vú, tuyến tiền liệt, các vấn đề về sinh sản.
Tác nhân di truyền
Từ khoảng 15 năm trở lại đây nhờ những tiến bộ trong lĩnh vực nghiên cứu sinh
học phân tử người ta đã biết được sự liên hệ chặt chẽ giữa các biến đổi vật liệu di truyền
và sự xuất hiện một số bệnh ung thư.
Một số tình huống về mặt di truyền: 80 – 90% người sẽ bị ung thư do họ mang gen
gây hại U wilms, ung thư nguyên bào võng mạc 2 mắt và những bệnh nhân đa polip có
tính chất gia đình là ví dụ về các loại ung thư truyền theo tính trội theo mô hình
của Mendel. Ung thư tuyến giáp thể tủy (loại ung thư tuyến giáp có tiết ra
Thyrocalcitonine) cũng mang tính chất di truyền rõ rệt.
Những năm trở lại đây nhờ những nghiên cứu về gen, người ta đã phân lập được
các gen sinh ung thư (oncogen) thực chất các gen tiền sinh ung thư (proto-oncogen).
Dưới tác động của một vài tác nhân nào đó tiền gen sinh ung thư hoạt hóa và biến thành


4

gen sinh ung thư. Từ đó gen sinh ung thư mã hóa để sản xuất các protein và enzyme liên
quan đến quá trình phân chia và biệt hóa tế bào theo xu hướng ác tính, ví dụ trong bệnh
ung thư bạch cầu mạn thể tủy, 90% tế bào mầm tạo huyết có sự chuyển đoạn 9/22
(Nguyễn Bá Đức, 2001).
 Phương pháp điều trị ung thư
Điều trị phẫu thuật
Ngày nay 60% đến 75% các bệnh nhân ung thư được điều trị bằng phẫu thuật và
các kỹ thuật ngoại khoa còn được sử dụng để chuẩn đoán, xếp hạng cho hơn 90% các
bệnh ung thư. Khoảng ½ bệnh nhân ung thư ở giai đoạn mổ được có thể áp dụng phẫu

thuật triệt căn. Phẫu thuật có thể phối hợp với các phương pháp điều trị khác như xạ trị,
hóa trị, nội tiết, miễn dịch …
Các ưu điểm của phẫu thuật ung thư: các loại u ác tính không có sự đề kháng sinh
học đối với kỹ thuật ngoại khoa, phẫu thuật có khả năng điều trị một số ung thư ở giai
đoạn tại chỗ và tại vùng, phẫu thuật cho phép đánh giá mức độ xâm lấn của khối u cũng
như xác định đặc tính mô học của khối u làm cơ sở cho xếp loại và chỉ định điều trị.
Tuy nhiên, phương pháp này có nhiều nhược điểm: phẫu thuật có thể có các biến
chứng đe dọa đến tính mạng bệnh nhân hoặc làm mất chức năng sinh lý một số cơ quan,
bác sĩ cần cân nhắc mức độ rộng của phẫu thuật để tránh tốn thương những cơ quan
quan trọng và đó là một trong những nguyên nhân thất bại của phẫu thuật; Những tổn
thương ác tính đã vượt qua giai đoạn tại chỗ và tại vùng thì vai trò của phẫu thuật không
còn phù hợp (Lê Đình Sáng, 2010).
Điều trị tia xạ
Điều trị tia xạ là sử dụng tia bức xạ ion hóa để điều trị ung thư, là phương pháp
điều trị thứ 2 sau phẫu thuật đã được áp dụng hơn 100 năm nay.
Tuy nhiên, tia phóng xạ không chỉ diệt tế bào ung thư mà có thể diệt luôn tế bào
lành ở vùng bị chiếu gây ra các biến chứng (nếu sử dụng liều lượng không thích hợp
hoặc kỹ thuật chiếu không đúng …). Xạ trị cũng có mặt hạn chế như không dùng được
xạ trị khi ung thư đã lan ra toàn thân. Một số ung thư chống chỉ định của xạ trị như ung
thư dạ dày, đại tràng hoặc tụy ... Biến chứng của xạ trị nhiều khi khá trầm trọng ảnh
hưởng lâu dài đến sức khỏe người bệnh, gây tổn thương các mô lành, làm cho mô bị
chai cứng, các tạng rỗng (ruột, thực quản) bị teo hẹp làm khó nuốt khó tiêu, gây chảy
máu tại các chỗ lở loét, xạ trị còn có thể gây ung thư khác cho người bệnh mà sau đó


5

thường được cho là di căn. Nếu xạ trị liên tục kéo dài có thể làm cho sức khỏe kiệt quệ,
mất sức đề kháng, dễ mắc các bệnh nhiễm trùng, rụng tóc nếu không có hạn chế và bồi
dưỡng thích đáng bệnh nhân có thể chết trước khi chết vì khối ung thư (Lê Đình Sáng,

2010).
Điều trị hoá chất
Từ khi bắt đầu tiến triển, ung thư đã có thể di căn, do đó các phương pháp điều trị
tại chỗ và tại vùng như phẫu thuật và xạ trị thường không mang lại hiệu quả. Sử dụng
các thuốc điều trị ung thư đặc biệt là các hóa chất chống ung thư có thể ngăn chặn được
tiến triển của ung thư. Hóa chất chống ung thư đều là những chất gây độc tế bào. Điều
trị hóa chất dựa trên sự đáp ứng khác biệt giữa các tế bào ung thư và tế bào lành. Đặc
trưng tăng trưởng của ung thư có ảnh hưởng rất lớn đến đáp ứng hóa trị.
Trong 3 phương pháp điều trị ung thư trên thì hóa trị là sự lựa chọn chính của điều
trị. Tuy nhiên các loại thuốc điều trị thông thường không những tác dụng vào tế bào ung
thư mà còn tác dụng vào các tế bào bình thường, dẫn đến sự tổn thương do thuốc gây ra
đối với các tế bào và mô khỏe mạnh vì các loại thuốc này không có mục tiêu cụ thể là
các tế bào ung thư. Thứ hai, các tế bào ung thư thường trở nên đề kháng với hóa trị vì
các yếu tố khác nhau như tăng cường biểu hiện enzyme kháng thuốc, vận chuyển thuốc,
và do tăng khả năng sửa chữa các DNA sai hỏng trong hệ thống tế bào trung gian của
quá trình cảm ứng chu trình chết (Raguz và Yagüe, 2008).
1.2. Tổng quan về peptide kháng ung thư
Peptide là các protein có kích thước nhỏ. Một số peptide là những chất kháng
khuẩn, có khả năng tiêu diệt nhiều tế bào vi khuẩn bằng cách làm gián đoạn thông tin
giữa các tế bào và tiêu diệt chúng thông qua cơ chế kích thích hệ thống miễn dịch của
cơ thể vật chủ để quét sạch nhiễm khuẩn.
Peptide kháng khuẩn (AMPs - Antimicrobial peptides) là một phần của cơ chế bảo
vệ miễn dịch bẩm sinh của nhiều sinh vật. Mặc dù AMP cơ bản đã được nghiên cứu và
phát triển như là lựa chọn thay thế tiềm năng cho chống các bệnh truyền nhiễm, sử dụng
chúng như peptide chống ung thư (ACPs) trong điều trị ung thư hoặc một mình hoặc kết
hợp với các loại thuốc thông thường khác đã được coi là một chiến lược điều trị để khám
phá (Gaspar, 2013). Ngày nay, sự hiểu biết về tầm quan trọng sinh học và y sinh học
của peptide kháng khuẩn có thể được coi là một bước tiến hướng tới phương pháp điều
trị mới và kháng miễn dịch cho các bệnh truyền nhiễm. Peptide có thể được sử dụng

6

như: thuốc chống ung thư trực tiếp, thuốc gây độc tế bào, vắc-xin, hooc-môn, và các
mục tiêu ma túy (Jyothi, 2012).
Có 2 cơ chế của các peptide chống ung thư chống lại các tế bào ung thư đã được
đề xuất: (1) phá vỡ màng tế bào chất qua mixen hóa hoặc hình thành lỗ màng và (2) cảm
ứng quá trình chết theo chương trình. Ngoài ra, một số peptide chống ung thư đã được
báo cáo thể hiện hoạt động chống ung thư thông qua các cơ chế khác nhau. Ví dụ, peptide
buforin IIb tấn công các tế bào ung thư mục tiêu thông qua tương tác với gangliosides
bề mặt tế bào và gây ra chết theo chương trình trên ty thể. Các peptide DK 6L9 thể hiện
tính độc tế bào có chọn lọc do tương tác tĩnh điện với phosphatidylserine trên bề mặt
tiếp xúc trong các tế bào ung thư. Một ví dụ khác là brevinin-2R kích hoạt sự tự chết
của tế bào.
Nhiều năm qua trên thế giới có rất nhiều nghiên cứu về peptide kháng ung thư từ
tự nhiên hay từ tổng hợp hóa học (Gaspar và cs, 2013). Ví dụ như, peptide ACFB có
nguồn gốc từ sữa bò có khả năng ức chế sự phát triển và gây ra cái chết theo chu trình
của các tế bào ung thư buồng trứng (Zhou và cs, 2016) hoặc peptide PCN-27 hoạt động
gắn với protein HDM-2 trên tế bào ung thư tạo ra các lỗ trên màng và làm hoại tử tế bào
ung thư mà không ảnh hưởng tới tế bào bình thường (Davitt và cs, 2014).
Lycosin I là một peptide được phân lập từ nọc độc của loài nhện Lycosa
singoriensis. Lycosin thể hiện khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư trong in
vitro và có thể ngăn chặn sự phát triển của khối u trong cơ thể. Nó tự động kích thích
quá trình chết của các ty thể làm cho tế bào ung thư trở nên nhạy cảm hơn với chu trình
chết cũng như tăng cường điều hòa p27 để ngăn chặn sự gia tăng của tế bào. Năm 2012,
Liu và cộng sự đã cung cấp bằng chứng đầu tiên cho thấy độc tố nhện có thể khống chế
hiệu quả sự hình thành khối u bằng cách kích hoạt của con đường tín hiệu kép. Ngoài
ra, lycosin-I có thể là một dẫn chất hữu ích cho sự phát triển của các loại thuốc chống
ung thư mới (Liu và cs, 2012).
Thionin là AMP đầu tiên được phân lập từ thực vật. Các AMP này thuộc về một

nhóm peptide hoạt tính sinh học đang phát triển nhanh chóng trong nhóm thực vật và là
các loại peptide giàu cystein nhỏ (khoảng 5 kDa) với tính chất độc và kháng khuẩn. Một
số thionin thực vật cho thấy các hoạt động gây độc và chống ung thư như: Pyrularia,
Viscotoxin B2, Ligatoxin A và B, β-Purothionin. Các thionin pyrularia từ mistletoe


7

(Pyrularia pubera) cho thấy một hoạt động chống ung thư chống lại tế bào ung thư cổ tử
cung (HeLa) và các tế bào u ác tính chuột (B16). Tuy nhiên, thionin pyrularia gây độc
tế bào bởi vì nó gây ra phân hủy máu. Hiệu quả chống ung thư là do phản ứng tế bào
liên quan đến sự kích thích dòng Ca2+ kết hợp với sự khử cực của màng tế bào, dẫn đến
sự kích hoạt của một phospholipase nội sinh A2, và kết quả là thay đổi màng, và cuối
cùng là chết tế bào. Một nhóm thionin khác có hoạt tính chống ung thư và gây độc tế
bào là viscotoxin từ Viscum spp. Viscotoxin B2 cho thấy hoạt tính chống ung thư
sarcoma giống như osteoblast ở chuột (Julia, 2015).
Các peptide chống đột quỵ đã được chứng minh là các phân tử nhỏ có hiệu quả
(<50 axit amin) có thể hoạt động đặc biệt chống lại các tế bào ung thư bằng cơ chế gây
màng hay sự phá vỡ ty thể. Lượng điện âm tiêu cực của màng tế bào ung thư là một yếu
tố quan trọng đối với tính chọn lọc và độc tính của peptide, so với đặc tính obitterionic
điển hình của màng tế bào nhân chuẩn không phải là ung thư. Mức lưỡng cực và tỷ lệ
kỵ nước cho phép các peptide này thâm nhập qua các màng tế bào ung thư và dẫn đến
sự mất ổn định của màng (Dennison, 2006). Ví dụ, các peptide giống pleurocidin
(NRCs) được xác định từ cá có thể giết tế bào ung thư vú và tế bào biểu mô vú của người
bằng cách gây tổn thương màng bởi các tác nhân tinh vi (Hilchie, 2011). Những peptide
xuyên qua tế bào này có thể được sử dụng như là việc phân phối thuốc đặc hiệu với ung
thư. Ví dụ, peptide buffin chống ung thư không xâm lấn tế bào không chuyên biệt đã
được cải tiến để tăng cường tính đặc hiệu của ung thư mà không ảnh hưởng đến tế bào
bình thường (Lim, 2013). Ốc sên Châu Phi khổng lồ (Achatina fulica) là động vật xâm
lấn nghiêm trọng gây thiệt hại cho cây trồng nông nghiệp và cây cảnh trên toàn thế giới.

Peptide kháng sinh Mytimacin-AF được phân lập từ A. fulica là một loại peptide giàu
cystein có thể ức chế sự phát triển của nấm và vi khuẩn ít có tác dụng tán huyết lên hồng
cầu. E-kobon và cộng sự (2016) đã nghiên cứu peptid này có khả năng chống lại dòng
tế bào ung thư vú MCF-7. Các peptide tiềm năng khác từ ốc sên vẫn được tiếp tục nghiên
cứu và xác nhận thêm.
Cho đến nay đã có các hoạt tính chống ung thư khác như Azurin và exotixin A từ
Pseudomonas aeruginosa, Pep27anal từ Streptococcus pneumoniae, độc tố bạch hầu từ
Corynebacterium diphtheriae, và gần đây đã phát hiện Entap từ Enterococcus sp.
(Karpinski và Szkaradkiewicz, 2013).


8

Dermaseptin-PD-1 và dermaseptin-PD-2 thuộc họ peptide kháng khuẩn
dermaseptin có chiều dài khoảng 27-34 axit amin được phân lập từ dịch chiết da ếch
phyllomedusine, Pachymedusa dacnicolor. Hai peptide này có khả năng ức chế cao đối
với các dòng vi sinh vật thử nghiệm và các dòng tế bào ung thư hoạt động tán huyết thấp
(ShiD và cs, 2016). Một số peptide kháng ung thư từ động vật lưỡng cư khác như aurein
từ tuyến lưng của ếch xanh (Rozek và cs, 2000), gaegurin từ da của ếch Rana rugosa
(Won và cs, 2006) có hoạt tính kháng lại tế bào ung thư.
1.3. Tình hình nghiên cứu bacteriocin kháng ung thư
1.3.1. Bacteriocin kháng ung thư
Bacteriocin là tên chung của các peptide do vi khuẩn tổng hợp có hoạt tính kìm
hãm đặc hiệu hay ức chế mạnh mẽ sự sinh trưởng và phát triển của một số vi khuẩn
khác. Trong thời kỳ đầu người ta chỉ tập trung vào phát triển các chất kháng sinh, còn
các chế phẩm bacteriocin bị xem nhẹ và không được quan tâm đúng mức. Theo thời
gian sử dụng chất kháng sinh hiện tượng kháng thuốc xuất hiện và ngày càng trở nên
trầm trọng đã gián tiếp xác nhận đặc tính quý giá của các bacteriocin là nguy cơ gây ra
hiệu ứng trên của chúng rất thấp. Nhờ vậy mà việc nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng
các bacteriocin đã được phục hồi và phát triển. Các chế phẩm bacteriocin điển hình là

nisin, diplococin, subtilin, lactostrepcin, bacteriocin S50, monocin (từ Lactococcus),
pediocin A, pediocin PA- 1, pediocin AcH (từ Pediococcus), lactocidin, acidolin,
acidophilin, reuterin, lactocin F, lactocin 27, helveticin J (từ Lactobacillus), leuconocin
S, camocin UI49, micrograd (từ Leuconostoc), propionicin PLG-1, jensenin G (từ
Propionicbacterium) (Tagg và cs, 1976).
Các bacteriocin đầu tiên được phát hiện vào năm 1925 bởi Gratia từ Escherichia
coli và sau đó được đặt tên là colicin. Kể từ đó số lượng lớn các bacteriocin đã được xác
định từ một nhóm đa dạng của các chủng vi khuẩn. Hầu hết bacteriocin có hoạt tính rất
mạnh, thể hiện hoạt tính kháng khuẩn ở nồng độ nanomal. Ngược lại, các kháng sinh
peptide được sản xuất bởi các tế bào nhân chuẩn thường có hoạt tính thấp hơn 102 -103
lần (Jennsen và cs, 2006).
Bacteriocin là các peptide tích điện dương được tổng hợp từ ribosome, được tiết
ra hầu hết từ các nhóm vi khuẩn. Một số bacteriocin đã cho thấy khả năng gây độc chọn
lọc đối với các tế bào ung thư so với các tế bào bình thường. Điều này làm cho


9

bacteriocin là ứng cử viên đầy hứa hẹn để mở rộng nghiên cứu và thử nghiệm lâm sàng
trong điều trị ung thư.
Bacteriocin là các peptide tích điện dương do đó chúng ưu tiên liên kết với màng
tế bào ung thư tích điện âm so với các màng tế bào bình thường trung tính. Thứ hai, sự
kết hợp có chọn lọc của bacteriocin với tế bào ung thư có thể giải thích được do sự khác
biệt trong sự dịch chuyển màng tế bào ung thư. Các tế bào ung thư có sự liên kết màng
lỏng lẻo hơn các tế bào bình thường và điều này tạo điều kiện dễ dàng gây mất màng tế
bào. Cuối cùng, các màng tế bào ung thư có kích thước lớn hơn đáng kể so với các tế
bào bình thường làm tăng diện tích bề mặt của các tế bào ung thư dẫn đến việc gắn nhiều
peptide kháng khuẩn vào màng tế bào ung thư so với các tế bào bình thường (Kaur và
Kaur, 2015).
Bacteriocin UL4 từ Lactobacillus plantarum đã được chứng minh tăng cường hoạt

tính chống ung thư và giảm nồng độ cholesterol trong máu ở những con chuột bị ung
thư da. Đồng thời các tác giả cũng chứng minh rằng UL4 làm giảm khối u và biểu hiện
β-catenin ở chuột gây ra ung thư đại trực tràng. UL4 cũng tăng cường sản xuất IFN-γ,
TNF-α, IL-12 và IL-5, các cytokine đóng một vai trò quan trọng trong việc ức chế sinh
ung thư đại tràng. Do đó, UL4 có tiềm năng như là một tác nhân điều chỉnh đáp ứng
miễn dịch của bệnh nhân để chống lại ung thư đại trực tràng (Zakuan và Noraina, 2011).
Microcin E492 (M-E492) là một bacteriocin tiết ra bởi Klebsiella
pneumoniae RYC492 có tác dụng gây độc cho những dòng tế bào ác tính, tế bào ung
thư đại trực tràng. M-E492 gây cảm ứng quá trình chết theo chương trình của tế bào ung
thư và làm hoại tử các tế bào đó. Ngoài ra, còn có bacteriocin khác với tiềm năng kháng
ung thư như nisin, pyocin, pediocin, plantaricin A, bovicin, smegmatocin (Kaur và
Kaur, 2015).
Trong số này, nisin là đại diện điển hình lớp Ia của các bacteriocin, là một peptide
kháng khuẩn đa vòng do Lactococus lactis tiết ra, được sử dụng trong bảo quản thực
phẩm và đã được FDA công nhận. Ngoài tác dụng kháng khuẩn, nisin còn là chất kháng
ung thư đối với ung thư tế bào vảy đầu và cổ (HNSCC) bằng khả năng cảm ứng quá
trình chết theo chương trình, làm ngừng chu trình tế bào, ức chế quá trình tăng sinh tế
bào chọn lọc ở tế bào HNSCC so với tế bào sừng (Joo và cs, 2012).


10

1.3.2. Azurin, laz và một số bacteriocin kháng ung thư khác
Azurin thuộc họ protein oxi hóa khử cupredoxin, có chứa đồng xanh (Hashimoto,
2015), là một bacteriocin quan trọng được tiết ra từ vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa
có mặt trong hệ vi sinh vật đường ruột. Chúng có thể ưu tiên xâm nhập vào các tế bào
ung thư người và gây độc tế bào và cảm ứng tế bào chết theo chu trình mà không tác
động lên tế bào bình thường (Punj và cs, 2004; Yamada và cs, 2004, 2002). Azurin có
thể tương tác trực tiếp và ổn định protein p53 ức chế khối u (Punj và cs, 2004). Vùng
chức năng chịu trách nhiệm đối với quá trình xâm nhập vào tế bào ung thư của Azurin

nằm từ vị trí axit amin từ 50-77 (vùng p28- Azurin) và thông qua một số cấu trúc xoắn
alpha lưỡng cực (phân cực và không phân cực). Sự thâm nhập vào tế bào không kèm
theo sự phá màng mà vẫn có thể gây chết tế bào. Theo nghiên cứu tiền lâm sàng về động
dược học, hoạt động trao đổi chất, và độc tính của Azurin - P28 đã được đánh giá (Jia
và cs, 2011), sự bổ sung của Azurin không gây đáp ứng miễn dịch và cũng không gây
độc ở chuột và động vật linh trưởng. Hơn nữa, sự tương tác của protein - protein giữa
Azurin và p53 đã được nghiên cứu gần đây bằng phương pháp tin sinh học và kính hiển
vi lực nguyên tử (Taranta và cs, 2008, 2009).
Đoạn peptide tổng hợp dài 28 axit amin (p28) với hoạt tính kháng ung thư và xâm
nhập đặc hiệu các tế bào ung thư đã được kiểm tra độc tính trên các động vật thí nghiệm
trong đó có khỉ. Kết quả cho thấy, độc tính và đáp ứng miễn dịch không được ghi nhận.
Tương tự Azurin, bằng phương pháp kích thích động học phân tử và sử dụng kính hiển
vi lực nguyên tử, peptide p28 được ghi nhận có khả năng liên kết với protein p53 cũng
như ức chế sự hình thành mạch máu mới, và các đặc tính ức chế khối u khác. Vì vậy,
peptide p28 đã được thử nghiệm lâm sàng giai đoạn I trên người bởi công ty CDG
Therapeutics Inc, Mỹ. Độc tính và đáp ứng miễn dịch đã không được ghi nhận ở tất cả các
bệnh nhân. Kết quả thử nghiệm p28 cho thấy ung thư đã suy giảm một phần ở hai bệnh
nhân trong khi ở hai bệnh nhân khác ung thư hoàn toàn suy giảm chứng tỏ cơ chế tác động
hiệu quả của p28 (Yamada và cs, 2011).


11

Hình 1.1. Mô hình gắn kết giữa Azurin-p28 đối với protein đích ung thư p53
(Nguyễn Văn Duy, 2016)

Các nghiên cứu còn chứng minh Azurin có khả năng gắn với nhiều đích khác nhau
ở trong và ngoài tế bào của động vật có vú. Ngoài khả năng gắn với protein p53, Azurin
cũng tác động đến quá trình phân chia tế bào thông qua EphB2 tyrosine kinase
(Chaudhari và cs, 2007). Bên cạnh đó, sự ưu tiên xâm nhập của Azurin và quá trình ức

chế phosphoryl hóa VEGFR-2, FAK và Akt dẫn đến ức chế sự hình thành mạch máu, vì
vậy ức chế sự phát triển của khối u. Khả năng liên kết của Azurin với các thụ thể ephrin
cho phép tạo ra một peptide dung hợp với nicotinamide có hiệu quả cao hơn gấp 13 lần
(Micewicz và cs, 2011).
Hiệu quả của Azurin với hoạt tính kháng ung thư của vi khuẩn đã được chứng minh
thông qua chủng E. coli Nissle 1917 (EcN) biểu hiện Azurin, làm giảm 40% lượng các
hạch di căn sau 30 ngày điều trị so với nhóm đối chứng. Các kỹ thuật gần đây cho phép
thử nghiệm hoạt tính kháng ung thư của các loại thuốc có nguồn gốc từ vi khuẩn theo
các cách mới như dưới dạng các phân tử vàng nano, các hạt từ nano, axit folic, sợi
cacbon nhằm tăng cường hiệu quả của chúng. Như vậy, các sản phẩm này có thể được
đóng gói trong các tế bào vi khuẩn, một phương tiện vận chuyển thuốc hiệu quả đến các
tế bào ung thư.
Ngoài azurin, rusticyanin, một chất cupredoxin khác gây ra chu trình chết trong tế
bào ung thư ở người. Hơn nữa, một protein khác giống hệt như Azurin nhưng có biến
đổi lipid gắn kết với màng ngoài, gọi là Laz, có hoạt tính đặc hiệu đối với các khối u
não như glioblastoma và có độc tính đáng kể đối với các tế bào ung thư não, cho thấy


12

Laz phải vượt qua hàng rào máu não để tấn công vào được các tế bào khối u não. Đặc
tính này là do Laz bao gồm một trình tự peptide chứa 39 axit amin được gọi là epitope
H.8 tại đầu N (Hashimoto, 2015).

Hình 1.2. Cấu trúc Laz (Hashimoto, 2015)

Mehta và cộng sự (2016) đã nghiên cứu thành công khả năng điều trị khối u não
của p53 và Azurin trong vi khuẩn Salmonella typhimurium. Điều trị khối u não ác tính
đang là một thách thức, chủ yếu là do các hàng rào máu não cần phải vượt qua khi dùng
thuốc đặc hiệu cho các khối u. Để khắc phục những rào cản này, những chất mang là vi

khuẩn với khả năng di chuyển tích cực được lập trình để di chuyển đến vị trí khối u. Các
chất mang này có thể cảm ứng quá trình chết theo chương trình thông qua sự biểu hiện
của protein ức chế khối u p53 và Azurin trong điều kiện thiếu hụt oxi. Trên mô hình cấy
ghép u bạch huyết của người trên chuột, việc điều trị bằng chất mang vi khuẩn đem lại
tỷ lệ sống đáng kể với 19% sống trên 100 ngày ở những con vật được chữa trị so với
mức sống sót trung bình là 26 ngày đối với động vật không được điều trị. Phân tích mô
học và proteomic cũng được thực hiện để làm rõ tính an toàn và hiệu quả đối với những
con chuột mang mầm bệnh. Kết quả cho thấy không có độc tính và không ảnh hưởng
đến khả năng phục hồi thần kinh ở những con chuột được điều trị. Ở chuột không đáp
ứng điều trị, phân tích proteomic cho biết có biểu hiện của hoạt tính chống việc chết
theo chương trình và kháng thuốc. Liệu pháp sử dụng chất mang là vi khuẩn này mở ra
một con đường mới để vượt qua các hàng rào máu não trong điều trị ung thư não nhờ
hoạt tính di động của vi khuẩn trong không gian ngoại bào và có thể dẫn tới các phương
pháp điều trị phù hợp thông qua sự biểu hiện đặc hiệu khối u của các protein kháng ung
thư (Mehta và cs, 2016).
Bảng 1.1 trình bày một số bacteriocin đã được nghiên cứu kháng nhiều dòng tế
bào ung thư khác nhau từ vi sinh vật.


13
Bảng 1.1. Các bacteriocin có hoạt động chống lại các dòng tế bào ung thư khác nhau
(Kaur và Kaur, 2015)
Kích
Bacteriocin

Sinh vật sản xuất

Lớp

thước

Các dòng tế bào ung thư

Tài liệu tham khảo

(kDa)
Colicin E3

E. coli

III

9,8

P388, HeLa, HS913T
HS913T, SKUT-1,

Colicin A

E. coli

III

>20

BT474, ZR75, SKBR3,
MRC5

Fuska và cs(1978);
Smarda và cs (1978)

Chumchalova và
Smarda (2003)
Chumchalova và

Colicin E1

E. coli

III

57

MCF7, HS913T

Microcin E492

K. pneumoniae

IIa

7,9

Hela, Jurkat, RJ2.25

Hetz và cs (2002)

Pediocin PA-1

P. acidilactici PAC1.0

IIa

3,5

A-549, DLD-1

Beaulieu (2004)

Pediocin K2a2-3

P. acidilactici K2a2-3

IIa

4,6

HT2a, HeLa

Villarante và cs (2011)

Pediocin CP2

P. acidilactici

IIa

Pyocin S2

P. aeruginosa 42A

III

HeLa, MCF7, Sp2/0-Ag
14, HepG2

74

HepG2, Im9 HeLa, AS-II,
mKS-A TU-7

Smarda (2003)

Kumar và cs (2012)
Abdi-Ali và cs
(2004); Watanabe và
Saito (1980)

Nisin

L. lactis

I

3,5

MCF7, HepG2

Paiva và cs (2011)

Bovicin HC5

S. bovis HC5

I

2,4

MCF7, HepG2

Paiva và cs (2011)
Saito và cs

Smegmatocin

M. smegmatis 14468

III

75

HeLa AS-II, HGC-27

(1979); Saito và

mKS-A TU-7

Watanabe
(1979, 1981)
Zhao và cs

Plantaricin A

L. plantarum C11

II

2,4

Jurkat, GH4, Reh, Jurkat,
PC12, N2A, GH4

(2006); Sand và cs
(2007); Sand và cs
(2010); Sand và cs
(2013)


14

Hiện nay tại Việt Nam các nghiên cứu về peptide chống ung thư từ vi khuẩn và
các sản phẩm từ vi khuẩn rất hạn chế. Nghiên cứu về bacteriocin tiềm năng kháng ung
thư tương tự Azurin (Nguyen và Nguyen, 2016) là nghiên cứu về peptide kháng ung thư
đầu tiên ở Việt Nam. Nguyễn Văn Duy (2016) đã nghiên cứu biểu hiện thành công
protein dung hợp Chazu5 tương tự Azurin có khả năng kháng ung thư trong tế bào E.
coli, kết quả biểu hiện protein dung hợp được kiểm tra bằng phương pháp SDS-PAGE.

Hình 1.3. Hình ảnh kiểm tra sự biểu hiện và mức độ tan của protein GST-6xHis-TEVChazu5 ở E. coli BL21 (Nguyễn Văn Duy, 2016)

Ngoài ra có một vài nghiên cứu cơ bản hoặc ứng dụng về bacteriocin từ vi khuẩn
lactic tại Việt Nam nhằm ứng dụng cho công nghệ thực phẩm hoặc nuôi trồng thủy sản.

1.4. Giới thiệu về bacteriocin Dlazu6 từ Dorea longicatena
1.4.1. Giới thiệu về Dorea longicatena
 Vị trí phân loài của Dorea longicatena:
Giới: Bacteria
Ngành: Firmicutes
Lớp: Clostridia
Bộ: Clostridiales
Họ: Clostridiaceae
Chi: Dorea
Loài: Dorea longicatena


15

Dorea longicatena là trực khuẩn gram dương, hình que, kỵ khí, không di động. Có
tổng chiều dài trung bình 3,17982 Mb, số protein trung bình là 2929, tỷ lệ % GC là
41,45%. Đây là loài được phân lập từ phân người và là một phần của hệ thực vật đường
ruột của người bình thường, khỏe mạnh. D. longicatena có thể tăng trưởng ở nhiệt độ từ
30 - 45°C, nhưng tối ưu là 37°C, tuy nhiên khả năng tăng trưởng của vi khuẩn này bị ức
chế trong môi trường có chứa 6,5 % NaCl. Các tế bào đơn của D. longicatena có kích
thước từ 2,0 - 4,3 µm x 0,5- 0,6 µm, mỗi chuỗi tế bào gồm 4 - 200 tế bào. Trên môi
trường thạch máu Columbia và Wilkins Chalgren anaerobic (WCA) agar khuẩn lạc tròn,
lồi, mịn, sáng bóng và dính, có chất nhầy. D. longicatena có phản ứng catalase âm tính
và oxidase âm tính sau khi nuôi cấy trên môi trường WCA agar, được mô tả bởi Smibert
và Krieg (1994).
1.4.2. Giới thiệu về gen mã hóa bacteriocin Dlazu6
Gen dlazu6 từ Dorea longicatena là gen mã hóa cho bacteriocin Dlazu6, có trình
tự dài 147 bp, là 1 trong 14 bacteriocin đã được sàng lọc có những tính chất tương tự
Azurin cho nên có khả năng kháng ung thư (Nguyen và Nguyen, 2015).
Trình tự gen dlazu6

GTA CTT CCA GGG ATC CTT GCG GCA CAG AAC CAG GGA TAA
TAA AAT ATG TAA AAA TGT CAT CTC TTT TGC AGG AAA AAT CTG
CAG AGA GAT GGC ATT TTT TTA CGG ACG TGT TTA TAA TAG TGG
AGA AAT AAA TAA TAA GAG CAG ACT GGA GCT GAA TAT AGA ATA AGA
ATT CTG TAC AGG CC
Trình tự axit amin AOI 1 orf 28 (Dlazu6)
LRHRTRDNKICKNVISFAGKICREMAFFYGRVYNSGEINNKSRLELNIE
Bacteriocin giả định Dlazu6 (AOI 1 orf 28) được mã hóa bởi gen dlazu6 có tiềm
năng rất lớn, kháng ung thư tương tự Azurin bởi các đặc điểm sau: (1) không có hoạt
tính enzym, hoạt tính của enzym chỉ ra rằng chúng có rất ít cơ hội tương tác với bất kỳ
bề mặt khác hoặc làm thay đổi động học của tế bào bình thường. Điều này phù hợp với
các đặc điểm đặc biệt của Azurin mà mục tiêu của tế bào ung thư không gây độc tế bào
bình thường (2) gây đáp ứng miễn dịch, giống như Azurin, những bacteriocin Dlazu6
gây đáp ứng miễn dịch hiệu ứng phụ của thuốc loại B thấp bao gồm các tác dụng phụ