Xác định tác nhân vi khuẩn gây bệnh đốm trắng nội tạng ở cá bớp rachycentron canadum nuôi tại khánh hòa

i

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu trƣờng đại học Nha
Trang, các thầy cô giáo bộ môn Viện Công nghệ Sinh học và Môi trƣờng, đã tạo điều
kiện tốt nhất và cung cấp đầy đủ các kiến thức chuyên ngành để tôi có cơ hội thực tập
và hoàn thành đề tài tốt nghiệp này.
Xin chân thành cảm ơn TS. Trần Vĩ Hích, ngƣời thầy đã hết lòng hƣớng dẫn và
truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài.
Xin cảm ơn tập thể lớp 55SH2 đã gắn bó với tôi trong suốt 4 năm học qua và
cảm ơn các anh, chị, bạn bè trong bạn bè trong phòng thí nghiệm đã tận tình giúp đỡ
trong thời gian tôi hoàn thành đề tài.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình ngƣời thân đã ở bên cạnh
động viên trong những lúc khó khăn nhất
Trong quá trình thực tập không tránh khỏi những sai sót, kính mong các thầy cô
giáo, anh chị và các bạn đóng góp ý kiến để em tiếp thu và hoàn thiện hơn.


ii

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................................................... i
MỤC LỤC ............................................................................................................................................ ii
DANH MỤC BẢNG ......................................................................................................................... iv
DANH MỤC HÌNH ẢNH ............................................................................................................... iv
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .............................................................................................. vi
MỞ ĐẦU ............................................................................................................................................... 1
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN ............................................................................................................ 3
1.1 Một số đặc điểm sinh học của cá bớp ..................................................................................... 3

1.1.1 Đặc điểm hình thái .............................................................................................. 3
1.1.2 Phân bố ............................................................................................................... 4
1.1.3 Đặc điểm sinh trưởng, sinh dưỡng...................................................................... 4
1.1.4 Môi trường sống .................................................................................................. 5
1.2 Tình hình nuôi cá bớp trên thế giới và Việt Nam................................................................ 5
1.2.1 Tình hình nuôi cá bớp trên thế giới .................................................................... 5
1.2.2 Tình hình nuôi cá bớp ở Việt Nam ...................................................................... 6
1.3 Tình hình phát triển bệnh trên cá bớp..................................................................................... 6
1.4 Bệnh đốm trắng nội tạng trên động vật thuỷ sản................................................................. 8
1.4.1 Dấu hiệu bệnh lý ................................................................................................. 8
1.4.2 Một số loại bệnh có xuất hiện đốm trắng trên nội tạng ...................................... 8
1.4.3 Bệnh đốm trắng nội tạng trên cá bớp ................................................................. 9
1.5 Tổng quan về vi khuẩn Photobacterium damselae ........................................................... 10
1.5.1 Phân loại khoa học............................................................................................ 10
1.5.2 Đặc điểm hình thái ............................................................................................ 10
1.5.3 Đặc điểm gây bệnh của vi khuẩn Photobacterium damselae ........................... 11
2.1 Phân lập vi khuẩn ....................................................................................................................... 15
2.1.1 Phương pháp thu và xử lý mẫu ......................................................................... 15
2.1.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn ....................................................................... 15
2.1.3 Phương pháp giữ chủng giống các vi khuẩn phân lập được ............................ 15
2.2 Xác định các đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn ............................................... 16


iii

2.2.1 Xác định đặc điểm hình thái của vi khuẩn ........................................................ 16
2.2.2 Xác định các đặc tính sinh hoá của vi khuẩn.................................................... 17
2.2.2.1.Tiến hành kiểm tra bằng bộ kit API 20E .................................................... 17
2.2.2.2.Các phản ứng bổ sung ................................................................................ 18
2.2.3.Xác định thành phần protein màng của các chủng vi khuẩn ............................ 18

2.3.Xác định độc lực của các chủng vi khuẩn ........................................................................... 20
2.3.1.Thí nghiệm cảm nhiễm ...................................................................................... 21
2.3.2.Thí nghiệm xác định giá trị LD50 ...................................................................... 22
2.4.Kiểm tra khả năng kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn................................ 22
CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................................... 24
3.1.Kết quả phân lập vi khuẩn gây bệnh đốm trắng nội tạng trên cá bớp nuôi tại Khánh
Hoà ........................................................................................................................................................ 24
3.2.Kết quả định danh các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc .................................................... 27
3.2.1.Kết quả xác định các đặc điểm hình thái .......................................................... 27
3.2.2.Kết quả xác định các đặc tính sinh hoá ............................................................ 28
2.3.3.Kết quả phân tích protein màng của vi khuẩn .................................................. 34
3.3.Kết quả xác định độc lực của các chủng vi khẩn phân lập đƣợc................................... 35
3.3.1.Kết quả cảm nhiễm ............................................................................................ 35
3.3.2 Kết quả xác định giá trị LD50 của chủng vi khuẩn Bt-X ................................... 38
3.4 Kết quả kiểm tra khả năng kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn ....................... 40
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................................................................... 42
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


iv

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1: Kết quả thu mẫu cá bớp tại các địa điểm nuôi ở Khánh Hoà. ...................... 24
Bảng 3.2: Đặc điểm hình thái các chủng phân lập từ các mẫu bệnh phẩm mang các
biểu hiện bệnh đốm trắng nội tạng ................................................................................ 26
Bảng 3.3: Kết quả các đặc tính sinh hoá của các chủng phân lập đƣợc ở cá bớp nuôi tại
Khánh Hoà và các chủng tham chiếu ATTC 17911 và chủng ATCC NCIMB 2184T.. 30
Bảng 3.4: Kết quả kiểm tra khả năng kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn phân

lập đƣợc. ........................................................................................................................ 40


v

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1: Cá bớp trƣởng thành ........................................................................................3
Hình 1.2: Biểu hiện bệnh lý của cá bị đốm trắng nội tạng ..............................................8
Hình 1.3: Hình thái vi khuẩn Photobacterium damselae dƣới kính hiển vi điện tử. .....10
Hình 2.1: Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu....................................................................14
Hình 3.1: Mẫu cá bệnh thu tại các điểm nuôi ở Khánh Hoà .........................................25
Hình 3.2: Kết quả phân lập các chủng vi khuẩn nghi ngờ gây bệnh đốm trắng nội tạng
trên môi trƣờng TSA và TCBS ...............................................................................27
Hình 3.3: Hình ảnh chủng Bt-X trên kính hiển vi quang học vật kính 40X. ................28
Hình 3.4: Hình ảnh định danh bằng bộ Kit API 20E ....................................................29
Hình 3.5: Một số phản ứng sinh hoá bổ sung của chủng Bt-V .....................................29
Hình 3.6: Kiểm tra kết quả định danh bằng API 20E profile ........................................32
Hình 3.7: Kết quả Blast trình tự hai chủng Bt-X và Bt-V trên NCBI ........................... 33
Hình 3.8: Kết quả điện di protein màng của các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc. .........34
Hình 3.9: Đồ thị thể hiện tỉ lệ chết cộng dồn sau khi gây nhiễm các chủng vi khuẩn ở
nồng độ 105, 104 CFU/ cá. ......................................................................................35
Hình 3.10: Biểu hiện bệnh của cá sau khi gây nhiễm ...................................................37
Hình 3.11: Kết quả kiểm tra và tái phân lập vi khuẩn ...................................................37
Hình 3.12: Cá đƣợc giải phẫu kiểm tra ở thời điểm 7 ngày sau khi không có cá chết ở
các nghiệm thức. .....................................................................................................38
Hìnhv 3.13: Đồ thị thể hiện tỉ lệ cá chết qua 10 gây nhiễm chủng Bt-X ở các nộng độ
tiêm 102-105 CFU /cá. ............................................................................................. 39
Hình 3.14: Tƣơng quan giữa nồng độ vi khuẩn Bt-X tiêm vào cá và tỉ lệ chết tích luỹ
của cá bớp thí nghiệm. ............................................................................................ 39

Hình 3.15: Kháng sinh đồ của chủng Bt-X ...................................................................41


vi

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Kí hiệu

Từ viết tắt

CFU

Colony Forming Unit

FAO

Fisheries Technical Paper

h

Giờ

LD50

Lethal Dose, 50%

NCBI

National Center for Biotechnology Information

OD

Optical Density

OF

Oxydative-Fermentative

16S rRNA

Gen 16S Ribosome của RNA

SDS

Sodium Dodecyl Sulfate

SDS-PAGE

Sodium Dodecyl Sulfate – Polyacrylamide Gel
Electrophoresis

TCBS

Thiosulfate Citrate Bile Salt Sucrose

TSA

Tryptic Soya Agar

TSB

Tryptic Soya broth

VP

Voges-Proskauer


1

MỞ ĐẦU

Hiện nay ngành nuôi trồng thủy sản đã và đang ngày càng có vai trò quan trọng,
đem lại hiệu quả kinh tế cao. Ngành thủy sản với sự phát triển nhanh của mình đã tạo
ra hàng loạt việc làm, nuôi trồng thủy sản chủ yếu ở quy mô hộ gia đình nên đã trở
thành nguồn thu hút một lực lƣợng lao động đông đảo tham gia vào tất cả công đoạn
sản xuất, làm giảm sức ép của nạn thiếu việc làm trên cả nƣớc.
Trong thời gian gần đây, cá bớp đã đƣợc nuôi phổ biến trong lồng bè ở vùng
biển các địa phƣơng nhƣ Hải Phòng, Quảng Ninh, Nghệ An và Vũng Tàu. Cá bớp là
một loại cá biển nuôi có tốc độ tăng trƣởng nhanh, tính thích nghi cao, kháng bệnh tốt,
tạo sản lƣợng lớn phục vụ thị trƣờng trong nƣớc và xuất khẩu, có thể nuôi quanh năm
với kỹ thuật nuôi đơn giản, cá bớp thƣơng phẩm hiện đang đƣợc nuôi phổ biến bằng
hình thức nuôi nhỏ lẻ cũng nhƣ quy mô công nghiệp với sản lƣợng lớn để đáp ứng nhu
cầu thực phẩm cho ngƣời tiêu dùng. Chúng có tốc độ sinh trƣởng nhanh, từ con giống
cỡ 20 -25g/con sau 1 năm nuôi có thể đạt 4 - 5kg/con. Ðây là đối tƣợng có rất nhiều
triển vọng đối với nghề nuôi biển ở nƣớc ta.
Tuy nhiên ở nhiều nơi do phát triển ồ ạt, tự phát, thiếu quy hoạch, ngƣời nuôi
chƣa có hiểu biết cơ bản về kỹ thuật nuôi nhất là chƣa nhận thức đúng mức về nguy cơ ô
nhiễm môi trƣờng và dịch bệnh trong quá trình nuôi nên năng suất thấp, tổn thất là điều

không tránh khỏi, gây khó khăn về đời sống kinh tế cho ngƣời nuôi. Gần đây, nghề nuôi
thâm canh đối tƣợng này gặp trở ngại do số hộ nuôi ngày càng nhiều, môi trƣờng ngày
càng ô nhiễm, đồng thời tác động của biến đổi khí hậu dẫn đến tình hình dịch bệnh diễn
ra càng phức tạp, gây nhiều thiệt hại cho ngƣời nuôi. Tác nhân gây bệnh chủ yếu là ký
sinh trùng, virus và vi khuẩn trong đó chủ yếu là do vi khuẩn với nhiều bệnh gây thiệt
hại nặng nề nhƣ bệnh mù mắt, lở loét, xuất huyết, đốm trắng nội tạng… Trong đó, bệnh
đốm trắng nội tạng do vi khuẩn Photobacterium damselae đƣợc nhiều tác giả mô tả nhƣ
là một tác nhân nguy hiểm, gây tỉ lệ chết khoảng 80% ở cá bớp nuôi (Lopez và cs, 2002;
Liu và cs, 2003; Rajan và cs, 2003; Đỗ Thị Hoà và cs, 2008).
Do đó, đƣợc sự cho phép của Viện Công nghệ sinh học và Môi trƣờng, trƣờng
Đại học Nha Trang; đƣợc sự định hƣớng của TS. Trần Vĩ Hích, tôi đã thực hiện đề tài


2

tốt nghiệp với tiêu đề “Xác định tác nhân vi khuẩn gây bệnh đốm trắng nội tạng ở
cá bớp Rachycentron canadum nuôi tại Khánh Hoà” với nội dung sau:
Nội dung đề tài
1. Phân lập một số chủng vi khuẩn gây bệnh đốm trắng nội tạng trên cá bớp nuôi
tại Khánh Hoà.
2. Xác định các đặc điểm sinh học các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc.
3. Xác định độc lực của các chủng phân lập đƣợc.
4. Xác định khả năng kháng kháng sinh của các chủng phân lập đƣợc.
Mục tiêu của đề tài
 Mục tiêu chung: Phân lập và xác định đƣợc tác nhân vi khuẩn gây bệnh đốm
trắng nội tạng ở cá bớp nuôi tại Khánh Hòa.
 Mục tiêu cụ thể:
 Phân lập đƣợc một số chủng vi khuẩn từ mẫu cá bớp nuôi lồng nghi mắc bệnh
đốm trắng nội tạng ở Khánh Hòa.
 Xác định các đặc tính sinh học của các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc nhƣ: phản

ứng catalase, sinh H2S, sinh hơi, khả năng dung huyết, khả năng di động.
 Xác định khả năng gây bệnh của các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc trên cá bớp.
 Xác định khả năng kháng kháng sinh đối với một số loại kháng sinh cho phép
dùng trong nuôi trồng thuỷ sản của các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc.
Ý nghĩa của đề tài
 Ý nghĩa khoa học: Kết quả của đề tài là cơ sở khoa học cho các nghiên cứu tiếp
theo về dịch tễ học và các phƣơng pháp phòng, trị bệnh gây đốm trắng nội tạng do
vi khuẩn gây ra trên cá bớp.
 Ý nghĩa thực tiễn: Phân lập các chủng vi khuẩn gây bệnh đốm trắng nội tạng trên
cá bớp là cơ sở cho việc nghiên cứu phát triển loại vaccine phòng bệnh ở qui mô
công nghiệp.


3

CHƢƠNG I: TỔNG QUAN
1.1 Một số đặc điểm sinh học của cá bớp

Hình 1.1: Cá bớp trưởng thành
Theo FAO (1974), cá bớp có hệ thống phân loại nhƣ sau:
Ngành: Động vật có xƣơng sống (Chordata)
Lớp: Cá (Pices)
Bộ: Cá vƣợc (Perciformes)
Họ: Cá bớp biển (Rachycentridae)
Giống: Cá bớp (Rachycentron)
Loài: Cá bớp biển (Rachycentron canadum)
Tên thƣờng gọi: cá bớp hay cá giò.
Tên khoa học: Rachycentron canadum.
Tên tiếng Anh : Cobia/ Black king fish.
1.1.1 Đặc điểm hình thái

Cá bớp có thân hình thoi, dài, đầu thuôn, đỉnh đầu tƣơng đối bằng phẳng.
Miệng rộng, hàm dƣới nhô dài hơn hàm trên. Răng nhung mọc thành đai ở cả hai
hàm. Mắt hai bên đầu, hơi lồi, nhỏ, màng mở mắt chạy vòng quanh mắt. Hai bên lƣờn
phía lƣng có hai sọc trắng chạy dọc thân, phần còn lại có màu nâu đậm hoặc đen. Phía
bụng màu sáng bạc, vây lƣng gồm có hai vây: vây trƣớc có 6-9 vây ngắn, nhọn,


4

không nối màng; 1-3 gai dài và 26-33 tia mềm phía sau. Vây hậu môn dài, có 2-3 gai
và 22-28 tia mềm.
1.1.2 Phân bố
Cá bớp sống ở vùng nƣớc mặn hoặc lợ ven biển, phân bố rộng trên toàn thế
giới (Liao và cs, 2004; Holt và cs, 2007; Nguyen và cs, 2008), có thể tìm thấy ở vùng
thềm lục địa, xung quanh các rạn san hô cho đến vùng biển khơi thuộc khí hậu nhiệt
đới hoặc cận nhiệt đới ở biển Đại Tây Dƣơng, Ấn Độ Dƣơng, Tây - Nam Thái Bình
Dƣơng. Cá thƣờng sống ở tầng giữa hoặc tầng trên của vùng nƣớc nên còn đƣợc gọi
là loài cá nổi.
Vào những tháng mùa thu và mùa đông, chúng di cƣ xuống phía nam và vùng
nƣớc ấm ngoài khơi, có nhiệt độ nƣớc khoảng 20˚C - 30˚C, đến đầu mùa xuân chúng
lại di cƣ ngƣợc lên phía Bắc dọc theo bờ Đại Tây Dƣơng.
1.2.3 Đặc điểm sinh trưởng, sinh dưỡng
Cá bớp là một loài cá dữ, chủ động bắt mồi, vồ mồi và nuốt chửng. Thức ăn của
cá bớp khi trƣởng thành là giáp xác, chân đầu và các loài cá nhỏ nhƣ: cá đối, cá trích,
lƣơn, trong đó ƣu thế nhất là cua. Khi nghiên cứu về thành phần thức ăn trong dạ dày
của cá bớp cho thấy 42% là callinectes, 46% là tôm (Micheal, 2001).
Trong quần thể đàn cá cái thƣờng lớn nhanh hơn cá đực, có thể đạt 5 - 8 kg sau
một năm nuôi (Trần Ngọc Hải, 2012). Cá thành thục sau 2 - 3 tuổi, cỡ 6 - 10 kg, cá cái
thƣờng thành thục muộn hơn cá đực.
Mùa sinh sản từ tháng 4 - 9, cao điểm vào tháng 6 - 7. Vào mùa sinh sản cá tụ

tập thành đàn, màu sắc nổi 2 sọc sáng dọc thân rõ hơn, nơi sinh sản là các vùng cửa
sông, vũng, vịnh ven biển hoặc ngoài khơi. Cá thƣờng đẻ vào lúc hoàng hôn và có thể
đẻ 15 - 20 lần trong mỗi mùa sinh sản. Sức sinh sản cá cái từ vài trăm nghìn đến hàng
triệu trứng mỗi con, trứng cá thuộc dạng trôi nổi và nở tốt ở độ mặn 30 - 32‰.
Trứng cá bớp hình cầu, đƣờng kính trung bình là 1,4 mm, 24 – 36h sau khi thụ
tinh thì nở ở nhiệt độ nƣớc từ 31˚C đến 22˚C. Cá bột mới nở có chiều dài là 2,5 mm,
chƣa có sắc tố. Năm ngày sau khi nở thì mắt và miệng của cá phát triển, lúc này
chúng có thể bắt mồi. Khi đạt 30 ngày tuổi thì hình dáng giống cá trƣởng thành.


5

1.1.4 Môi trường sống
Cá sống đƣợc ở nhiều nơi khác nhau nhƣ đáy bùn, cát, sỏi, rạn san hô hay rừng
ngập mặn. Cá có thể sống trong dải nhiệt độ rộng từ 17 - 32˚C trong đó nhiệt độ tối ƣu
cho sự phát triển của cá là 27˚C (Cheung và cs, 2013), đây cũng là sinh vật phát triển
trong điều kiện muối rộng, sống ở độ mặn 5 – 44.5‰ (Resley và cs, 2006), độ mặn
thích hợp nhất là từ 22-34‰.
Ở điều kiện nhiệt độ thấp, cá bắt mồi kém (Vaught và Nakamura, 1989).
1.2 Tình hình nuôi cá bớp trên thế giới và Việt Nam
1.2.1 Tình hình nuôi cá bớp trên thế giới
Nghiên cứu nuôi trồng thuỷ sản đƣợc báo cáo lần đầu tiên vào năm 1975 với
việc thu thập trứng cá hoang dại ở ngoài khơi bờ biển bắc Carolina. Sau thí nghiệm
131 ngày nuôi với sự phát triển của ấu trùng, kết luận rằng cá bớp có tiềm năng nuôi
trồng thuỷ sản vì tốc độ tăng trƣởng nhanh và tính an toàn của cá. Các nghiên cứu bổ
sung về cá bớp đã đƣợc thực hiện vào cuối những năm 1980. Đến năm 1997, Đài Loan
của Trung Quốc đã sản xuất đƣợc cá giống để nuôi, chủ yếu là các hệ thống lồng gần
bờ. Trƣờng đại học Southern của Mỹ đã đƣa ra báo cáo đầu tiên về đẻ trứng ở cá giống
vào năm 1996. Những năm trở về sau, tình hình nuôi cá bớp phát triển mạnh mẽ.
Hiện nay cá giống đang đƣợc nuôi ở các vƣờn ƣơm và nuôi lồng ngoài khơi ở

nhiều nơi, một số quốc gia nhƣ Cộng hoà Dominican, Mexico, Philippines, Hoa Kỳ và
các quốc gia châu Á.
Theo FAO (2012) thì sản lƣợng nuôi cá bớp năm 2010 trên thế giới khoảng trên
40.000 tấn trong đó Đài Loan và Trung Quốc chiếm 80%. Sau Trung Quốc và Đài
Loan, Việt Nam là nƣớc sản xuất cá lớn thứ ba trên Thế giới.
Theo Sveanevig (2001), Mỹ tiến hành nuôi cá bớp thƣơng phẩm từ năm 2002
và ngày càng phát triển nghề nuôi. Trung Quốc tiến hành nuôi cá bớp từ năm 1992
đến nay, từ năm 1997 kỹ thuật sản xuất giống phát triển với số lƣợng lớn vì vậy cá
bớp nhanh chóng chiếm ƣu thế và trở thành loài nuôi công nghiệp trong hệ thống
lồng xa bờ. Nhật Bản đã nhập con giống từ Trung Quốc và tiến hành nuôi lồng ở khu
vực đảo Okinawa.


6

Đài Loan bắt đầu nuôi cá bớp vào đầu những năm 1990 (Yeh, 2000; Liao và cs,
2004) và đƣợc xem là nƣớc dẫn đầu trong sản xuất giống nhân tạo và nuôi cá bớp.
Nuôi cá thịt năm 1998 đã sản xuất đƣợc 2.673 tấn, tăng gấp hai mƣơi lần so với năm
1990 là 103 tấn. Sản lƣợng năm 2003 đạt 2.500 tấn.
1.2.2 Tình hình nuôi cá bớp ở Việt Nam
Việt Nam nằm trong khu vực phân bố tự nhiên của cá bớp, đồng thời do tốc độ
tăng trƣởng nhanh và giá thành khá cao, nên cá bớp hiện đƣợc nuôi nhiều ở các vùng
biển của nƣớc ta nhƣ Quảng Ninh, Hải Phòng, Nghệ An, Hà Tĩnh, Huế, Phú Yên,
Khánh Hoà, Vũng Tàu, Kiên Giang với hình thức nuôi chủ yếu là nuôi lồng trên biển.
Nghề nuôi cá biển ở Việt Nam khởi đầu từ rất sớm tuy nhiên cho đến năm 1990
phƣơng pháp nuôi mới đƣợc cải thiện và cho sản lƣợng hàng năm khoản 3.000 tấn,
trong đó có sự đóng góp không nhỏ của nghề nuôi cá bớp lồng trên biển.
Năm 2005, diện tích mặt nƣớc nuôi trồng thuỷ sản nƣớc mặn lợ là 661 nghìn
ha. Sản lƣợng cá biển nuôi ở nƣớc ta năm 2001 đạt 2.150 tấn, năm 2005 đạt 5.010 tấn,
đến năm 2007 tăng lên 15.000 tấn. Đối với khu vực đồng bằng sông Cửu Long đặt biệt

là tỉnh Kiên Giang cũng xuất hiện hình thức nuôi cá biển trong lồng nhƣ cá mú, cá
bớp, số lƣợng lồng nuôi cũng gia tăng từ 131 lồng đạt sản lƣợng 90 tấn năm 2007 lên
gần 900 lồng, đạt sản lƣợng hơn 500 tấn 2010 (Cao Lệ Quyên, 2011).
Khánh Hoà là một tỉnh ven biển, cùng với sự phát triển của nghề nuôi cá bớp
thƣơng phẩm, các cơ sở ƣơm nuôi cá bớp giống cũng phát triển mạnh theo kiểu tự
phát, tập trung chủ yếu ở các địa phƣơng: thị xã Ninh Hòa, thành phố Nha Trang,
huyện Vạn Ninh và thành phố Cam Ranh.
1.3 Tình hình phát triển bệnh trên cá bớp
Mặc dù cá bớp là loài cá khá khỏe mạnh nhƣng cũng nhạy cảm với các tác nhân
gây bệnh nhƣ vi khuẩn, virus, và ký sinh trùng (Kaiser và Holt, 2005).
Các bệnh do virus gây ra nhƣ Lymphocystis do Iridovirus , bệnh hoại tử thần
kinh - VNN (Viral Nervous Necrosis) tác nhân gây bệnh là Beta - nodavirus, những
bệnh do virus gây ra hiện nay chƣa có phƣơng pháp điều trị đặc hiệu, và có rất ít các
nghiên cứu về các loại bệnh này.


7

Một số loài ký sinh trùng thƣờng gặp gây bệnh trên cá bớp nhƣ Trichodina spp.
gây bệnh đốm trắng trên da cá nƣớc mặn; Brooklynella hostilis gây bệnh
Brooklynellosis ở cá bớp với các dấu hiệu đặc trƣng là cơ thể nhạt màu, bỏ ăn, tiết
nhiều chất nhờn, hôn mê; sán lá đơn chủ Dionchus rachycentris, những ký sinh trùng
này làm cá giảm hoạt động, gây thiếu oxy, mặc khác chúng còn là tác nhân mở đƣờng
tạo điều kiện cho những tác nhân khác nhƣ nấm, vi khuẩn, virus xâm nhiễm vào cơ thể
cá qua các vết lỡ loét trên da (La Quốc Triệu, 2013).
Nhƣng đƣợc quan tâm nhiều nhất vẫn là bệnh do vi khuẩn gây ra.
Các nghiên cứu về bệnh do vi khuẩn trên cá bớp bao gồm Mycobacteriosis,
Vibriosis, Photobacteriosis và Streptoccosis, đƣợc gây ra bởi các tác nhân gây bệnh
bao gồm: Mycobacterium marinum, Vibrio anguillarum, Vibrio ordalii, Pasteurella
piscida và Streptococcus spp. (Liao và cs, 2004; Lowery và Smith, 2006)

Các bệnh Vibriosis có thể bắt gặp ở cá bớp ở tất cả các giai đoạn trong vòng
đời, một số dấu hiệu bệnh nhƣ màu sắc cơ thể tối, lờ đờ, bỏ ăn, mất thăng bằng, mang
nhợt nhạt, vây mòn cụt và các vết thƣơng tổn trên da; gan, thận có thể có màu nhọt
nhạt, lách xuất hiện các đốm trắng, tuy nhiên cá bệnh có thể có hoặc không xuất hiện
các triệu chứng, nên rất khó trong phát hiện bệnh. Nhiều loài vibrio khác nhau đã đƣợc
phân lập từ cá hấp hối bao gồm V. alginolyticus, V. harveyi, V. parahaemolyticus và V.
vulnificus (Rajan và cs, 2001; Lopez và cs, 2002; Liu và cs, 2004).
Bệnh Mycobacteriois đƣợc gây ra vởi vi khuẩn Mycobacterium là vi khuẩn hiếu
khí, hình que, sinh trƣởng chậm trong môi trƣờng nuôi cấy, 2-3 tuần vi khuẩn mới sinh
trƣởng và phát triển, ở nhiệt độ 25˚C, khuẩn lạc sinh trƣởng trong tối không sinh sắc tố
nhƣng sinh trƣởng trong ánh sáng thì sinh sắc tố màu vàng chanh đến vàng cam (Bùi
Quang Tề, 2008). Bệnh tác động chủ yếu đến cá giống (15-20 cm), cá mắc phải có một
số biểu hiện nhƣ cá lờ đờ, xuất hiện vết loét trên da, giảm sắc tố (Leano và cs, 2008).
Bệnh do Streptococcus do tác nhân chính là Streptococcus iniae. Streptoccocus
là vi khuẩn gram dƣơng, hình cầu hoặc hình ovan, đƣờng kính nhỏ hơn 2 μm, không di
động, thƣờng dính với nhau thành chuổi. Trong trƣờng hợp cấp tính, cá có thể sắp chết
hoặc chết với dấu hiệu bên ngoài và bên trong nội tạng. Trƣờng hợp cá nhiễm nhẹ có
thể bơi nhấp nhô gần mặt nƣớc, mắt có thể bị mù, xuất huyết ở da, vây, mắt bị lồi và


8

xuất huyết bên trong mắt, mang bị xung huyết (Leano et al, 2008), cá bị bệnh còn có
thể bị mù mắt và chán ăn (Liao và cs, 2004).
1.4 Bệnh đốm trắng nội tạng trên động vật thuỷ sản.
1.4.1 Dấu hiệu bệnh lý
Bệnh xuất hiện ở Đài Loan vào tháng 7 năm 2000 với các dấu hiệu lâm sàng
của bệnh bao gồm cá biếng ăn, chậm lớn, lở loét trên da, xuất hiện các nốt trắng trên
gan, thận, tỳ tạng với kích thƣớc 0,5 - 2 mm (hình 1.2), gây chết rải rác trên cá. Bệnh
này thƣờng gặp ở cá giống khi nhiệt độ nƣớc giảm (Liu và cs, 2003). Cá bệnh có thể

chết sau 5 - 10 ngày với tỷ lệ chết cao từ 80 - 100% gây thiệt hại kinh tế ở các nƣớc
nhƣ: Nhật, Mỹ, Pháp, Tây Ban Nha, Hy Lạp, Thổ Nhƣ Kỳ.
Ở Việt Nam, bệnh phân bố ở hầu hết các vùng nuôi trên cả nƣớc. Theo Đỗ Thị
Hoà và cs (2008), bệnh đốm trắng nội tạng đã xuất hiện trên cá bớp kích cỡ 0,5 - 1
kg/con đƣợc nuôi lồng tại Đầm Môn, Vạn Ninh, Khánh Hoà. Bệnh xuất hiện vào mùa
mƣa, mùa có nhiệt độ thấp trong năm. Cá bệnh có các dấu hiệu tƣơng tự mô tả của Liu
và cs (2003).

Hình 1.2: Biểu hiện bệnh lý của cá bị đốm trắng nội tạng (a) Cá bớp bị nhiễm
Photobacterium damselae subsp. piscicida xuất hiện những nốt màu trắng trong gan
(A) và thận (B) (Nguồn: Moraes và cs 2009).
1.4.2 Một số loại bệnh có xuất hiện đốm trắng trên nội tạng
Theo Từ Thanh Dung (2004), bệnh mủ ở thận và gan của cá tra nuôi tại đồng
bằng sông Cửu Long (ĐBSCL), Việt nam do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri, là một
vi khuẩn Gram (-) gây ra. Trong khi đó, Lý Thị Thanh Loan và cs (2007) tiếp tục đƣa
ra công bố về tác nhân gây bệnh mủ ở gan, thận trên cá Tra ở ĐBSCL là do một vi


9

khuẩn Gram (+), kỵ khí, có sinh bào tử đƣợc cho rằng vi khuẩn này thuộc giống
Clostridium sp.
Một nghiên cứu khác của Wang và cs (2007), một loại bệnh đã xảy ra ở cá lóc
nuôi trong ao tại Trung Quốc, với triệu chứng điển hình là có nhiều hạt u mà trắng
trong các cơ quan nội tạng của cá nhƣ gan, lách, thận do Norcadia seriolae gây ra, đây
là một loài vi khuẩn Gram (+) có dạng sợi, nhỏ dài, phân nhánh. Cũng loài vi khuẩn
này, Dƣơng Văn Quý Bình (2010) đã nghiên cứu bệnh trên cá chim vây vàng tại Vũng
Ngán, Nha Trang. Dấu hiệu bệnh lý bên ngoài của cá nhƣ xuất hiện các nốt phòng rộp
trên da, lở loét, mang bị hoại tử, xuất hiện các khối u dọc xƣơng sống, các đốm trắng
dạng hạt bên trong lách, gan, thận và xoang bụng của cá.

Bệnh vi khuẩn trên thận (Bacterial kidney disease) do vi khuẩn
Corynebacterium gây ra với các triệu chứng trên cá nhƣ cá bị bệnh có dấu hiệu bỏ ăn,
bơi lên gần mặt nƣớc. Trên cơ thể có màu đen. Xuất hiện những tổn thƣơng màu hơi
trắng trên thận. Thận và gan của cá bị xuất huyết mạnh (chảy máu), đƣợc phát hiện ở
con sông Scottish bởi Dee và Spey (1933).
Bệnh Photobacter gây đốm trắng trên gan, lách, gây bệnh vào các mùa có nhiệt
độ ấm trong năm, khi nhiệt độ xuống thấp, cá trong tình trạng ủ bệnh. Đƣợc mô tả ở
nhiều đối tƣợng thuỷ sản khác nhau nhƣ cá Mú, cá Tráp, cá Chim vây vàng, cá
bớp…Đặc biệt, loài này có khả năng gây nhiễm trùng trên ngƣời (Liu, 2003).
1.4.3 Bệnh đốm trắng nội tạng trên cá bớp
Tác nhân gây bệnh đƣợc nhắc đến chủ yếu là Photobacterium damselae, đây là
một vi khuẩn đƣợc biết đến với khả năng gây chết rất cao (Kubota và cs, 1972; Nahano
và cs, 2009; Đỗ Thị Hoà và cs, 2008). Tuỳ vào nguồn phân lập và độ tuổi cũng nhƣ kích
cỡ của cá, có thể dẫn đến sự khác biệt về độc lực của vi khuẩn phân lập đƣợc.
Trƣớc đây Photobacterium damselae subsp. piscicida (P. piscicida) là tác nhân
gây bệnh trên cá nuôi tại Nhật Bản và các nƣớc Châu Âu (Magarinos, 1996; Austin và
cs, 1993; Plumb và Hanson, 2007). Cũng từng có tên trong báo cáo gây bệnh ở cá
nƣớc ngọt tại Đài Loan.Và gần đây đƣợc báo cáo từ nuôi cá bớp (Lopez và cs, 2002;
Leano và cs, 2008) mô tả P. piscisida là tác nhân gây bệnh tụ huyết trùng trên cá bớp,


10

thƣờng gây thƣơng tổn cá bớp giai đoạn giống ở nhiệt độ dƣới 28oC, làm xuất hiện
những đốm trắng đặc trƣng trên thận và tỳ tạng (Nguyễn Thu Dung, 2016).
1.5 Tổng quan về vi khuẩn Photobacterium damselae
1.5.1 Phân loại khoa học
Ngành: Proteobacteria
Lớp: Gammaproteobacteria
Bộ: Vibrionales

Họ: Vibrionaceae
Chi: Photobacterium
Loài: Photobacterium damselae

1.5.2 Đặc điểm hình thái

Hình 1.3: Hình thái vi khuẩn Photobacterium damselae dưới kính hiển vi điện tử.
Nguồn: Trương Thu Hương, (2015).
P. damselae là trực khuẩn, bắt màu hồng Gram âm, bắt màu sẫm ở 2 đầu, ở
phần thân nhạt màu hơn. Khuẩn lạc phát triển trên môi trƣờng Tryptic soya agar (TSA)
có dạng tròn, viền trơn bóng, lồi, khoảng 1-2mm, màu trắng đục hoặc hơi hồng. Phát
triển đƣợc trên môi trƣờng Thiosulphate citrate bile salt sucrose agar (TCBS) với


11

khuẩn lạc màu xanh. Khuẩn lạc trên môi trƣờng thạch máu có màu xám, đục, đƣờng
kính khoảng 1mm, viền trơn, gây dung huyết dạng  và quan sát rõ ràng sau 48h ở
nhiệt độ 28˚C (Fouz và cs, 1997; Hawke, 1987).
Đây là vi khuẩn hiếu khí, kỵ khí tuỳ ý, không có khả năng phát quang và không
sinh bào tử. Dƣơng tính với các phản ứng oxidase, catalase, methyl red, khử nitrate,
sinh acid từ glucose. Âm tính với các phản ứng indol, citrate, phân giải gelatin, không
sinh H2S (phản ứng KIA), không sử dụng sucrose (Trƣơng Thu Hƣơng, 2015).
1.5.3 Đặc điểm gây bệnh của vi khuẩn Photobacterium damselae
Photobacterium damselae sp. là một mầm bệnh của nhiều loài động vật biển
nhƣ cá, giáp xác, nhuyễn thể và cá voi. P. damselae tồn tại trong môi trƣờng nƣớc
mặn, chúng đƣợc tìm thấy quanh năm, tuy nhiên vào mùa đông thì số lƣợng vi khuẩn
rất ít. Chúng còn đƣợc phân lập từ lớp dịch nhầy, dịch bẩn tích tụ trong lồng nuôi hoặc
từ mẫu nƣớc nuôi cá bị bệnh. Cá sống sót sau dịch bệnh có thể trở thành nguồn mang
mầm bệnh sau này (Botella, 2002). Cá có thể đƣợc lây nhiễm bằng cách tiêm, ngâm,

cho ăn, nuôi chung cá khỏe với cá bệnh.
P. damselae đƣợc mô tả là tác nhân gây bệnh trên rất nhiều đối tƣợng thuộc cá
biển nuôi lồng tại nhiều quốc gia trên thế giới, các loài cá có tầm quan trọng về kinh tế
trong nuôi trồng thủy sản nhƣ cá mú, cá bớp, cá tráp, cá vƣợc… đã chịu rất nhiều thiệt
hại do chúng gây ra ( Agarinos và cs, 1997), và đây đƣợc coi là tác nhân gây bệnh mới
nổi trong nuôi trồng thủy sản biển (Labella và cs, 2011).
Dấu hiệu điển hình của cá nhiễm P. damselae là xuất hiện vùng xuất huyết và
tổn thƣơng loét trên bề mặt cơ thể. Cá bệnh hầu hết có các triệu chứng chung và khá
điển hình trên nhiều loài: xuất hiện vết loét trên da, kém ăn hoặc bỏ ăn, da sẫm màu,
giải phẫu bên trong thấy thận sƣng, xuất hiện các đốm trắng dạng hạt trong mô gan,
thận, tụy, mang và nội tạng xuất huyết (Robohm, 1983), hoại tử trong nội tạng, hoại tử
tập trung ở lách và thận, gây nhiễm trùng và hoại tử rộng rãi.
Không những thế, chúng còn có thể gây bệnh trên ngƣời nhƣ nhiễm trùng dẫn
đến hoại tử và có thể tử vong.


12

Các bệnh nhiễm trùng đã đƣợc báo cáo gây bệnh trên ngƣời hầu hết là do những
vết thƣơng ngoài da khi tiếp xúc với nguồn nƣớc biển hoặc dụng cụ trong quá trình xử
lý đối tƣợng mang mầm bệnh và một số xảy ra sau khi ăn hải sản (Yamane và cs,
2004; Kim và cs, 2009; Morris và cs, 1982; Alvarez, 2006).
Có một số trƣờng hợp tử vong đƣợc báo cáo vào năm 1984, trong đó, một bệnh
nhân đã bị thƣơng trong khi xử lý cá da trơn, vết thƣơng xảy ra trên tay và hiện tƣợng
phù nề đã diễn ra lan rộng đến cẳng tay trong vòng chƣa đầy 24h. Thông qua các dữ liệu
và quan sát cho thấy rằng, sự lây nhiễm từ cá bệnh đem lại nguy cơ lây nhiễm rất cao và
gây tác hại nghiêm trọng đối với sức khỏe con ngƣời (Clarridge và cs, 1985).
Hiện nay trên Thế giới đã xuất hiện rất nhiều trƣờng hợp bệnh nhân bị nhiễm P.
damselae với tỉ lệ tử vong cao (Trƣơng Thu Hƣơng, 2015).
Độc lực của vi khuẩn chủ yếu nằm trong các sản phẩm ngoại bào bao gồm các

protease, hemolysins (Norqvist và cs, 1990; Toranzo và Barja, 1993). Những chất này
có thể gây phá huỷ mô tế bào và gây xuất huyết, đóng một vai trò quan trọng trong sự
xâm nhập của các vi khuẩn gây bệnh trong cơ thể cá (Finkelstein và cs, 1992; Silva và
cs, 2003). Một số protease trong sản phẩm ngoại bào của vi khuẩn cũng đƣợc coi là yếu
tố độc lực ở nhiều vi khuẩn gây bệnh (Ishihara và cs, 2002; Miyoshi và cs, 2002; Farto
và cs, 2006). Protease hạn chế sự hoạt động của enzyme đã đƣợc phát hiện ở P.
damselae

bao

gồm

cả

photphatase,

esterase,

amylase

và

glycosidase.

1.5.4. Khả năng kháng kháng sinh của chủng Photobacterium damselae
Theo nghiên cứu của Pasqualina Lagana và cs (2011), thử nghiệm tính mẩn cảm
với kháng sinh của các chủng P. damselae phân lập ở một số trang trại nuôi trồng thủy sản
ở Ý cho thấy các chủng P. damselae phân lập có khả năng kháng với một số loại kháng
sinh bao gồm: ampicillin, carbenicillin, kanamycin, cefalothin; trong khi đó lại mẩn cảm
với các loại kháng sinh gồm: chloramphenicol, nitrofurantoin và tobramycin.

Một số tác giả nhƣ Toranzo và cs (1991), Bakopoulos và cs (1995) và Sano
(1998) đã đề cập một kháng sinh đƣợc sử dụng rộng rãi nhất điều trị tụ huyết trùng
bao gồm Amoxicillin, Chloramphenicol, Erythromycin, Florfenicol, Flumequine,
axit

oxolinic,

oxytetracycline,

tetracycline (Labella và cs, 2011)

nitrofurazone,

trimethoprim

sulfadiazine

và


13

Tuy nhiên, Thyssen và Ollevier (2001) cho hay các chủng P. damselae phân lập
tại các khu vực địa lý khác nhau sẽ có tính nhạy cảm đối với kháng sinh khác nhau.
Nhƣng nhìn chung, phần lớn các chủng (93%) kháng với Erythromycin và một tỉ lệ
thấp (dƣới 10%) kháng với Amoxicillin, Ampicillin, Florfenicol và Trimethoprimsulfamethoxazole. Trong khi đó các chủng vi khuẩn lại rất nhạy cảm với Kanamycin,
Florfenicol và trimethoprim-sulfamethoxazole (Thyssen và cs, 2011).
Việc nghiên cứu khả năng kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn gây bệnh
chính là cơ sở quan trọng để đƣa ra các giải pháp trong phòng và điều trị bệnh trên cá
nuôi. Hiện nay, ở nƣớc ta còn rất ít các công trình nghiên cứu về khả năng kháng

kháng sinh của các chủng P. damselae phân lập đƣợc.


14

CHƢƠNG II: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian nghiên cứu: Từ 18/02/2017 đến 03/06/2017
Địa điểm nghiên cứu:
 Thu mẫu cá bớp tại các địa điểm nuôi ở Khánh Hoà
 Phân tích mẫu cá bệnh, phân lập và định danh vi khuẩn, thí nghiệm cảm nhiễm
và phân tích mô bệnh học đƣợc tiến hành tại phòng thí nghiệm thuộc trung tâm
Nghiên cứu giống và dịch bệnh thuỷ sản, trƣờng Đại học Nha Trang.
Đối tƣợng và vật liệu nghiên cứu
Đối tƣợng nghiên cứu: Bệnh đốm trắng nội tạng do nhiễm khuẩn gây ra trên cá bớp.
Động vật thí nghiệm: Cá bớp kích thƣớc 3-4cm đƣợc nuôi thuần 3 tuần tại trại giống
ở trung tâm Nghiên cứu giống và dịch bệnh thuỷ sản, trƣờng Đại học Nha Trang trƣớc
khi tiến hành các thí nghiệm cảm nhiễm trên cá.
Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu

Hình 2.1: Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu


15

2.1 Phân lập vi khuẩn
2.1.1 Phương pháp thu và xử lý mẫu
Cá bớp đƣợc lấy mẫu trực tiếp từ các lồng nuôi tại Khánh Hòa, đƣợc vận
chuyển về Trung tâm Nghiên cứu giống và dịch bệnh Thuỷ sản để tiến hành phân tích,

trong quá trình vận chuyển mẫu đƣợc sục khí đảm bảo mẫu cá còn sống. Mẫu cá sau
khi đƣợc đƣa về đƣợc giữ trong các bể sục khí và phân tích trong 24h. Các dấu hiệu
của mẫu cá bệnh đều đƣợc ghi chép lại
2.1.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn
Mẫu cá bớp đƣợc quan sát và ghi lại các dấu hiệu bên ngoài.
Tiến hành mổ phần khoang bụng của cá, dùng bông tẩm cồn 700 lau bề mặt nội
tạng cá, chủ yếu trên gan, thận và lách.
Sau đó, dùng que cấy tiệt trùng lấy mẫu tại các cơ quan nội tạng cần cấy đem
cấy lên môi trƣờng TSA (+ 2% NaCl) và môi trƣờng TCBS.
Ủ đĩa trong tủ ấm ở nhiệt độ 28˚C sau 24h thì ghi nhận màu sắc, hình dạng
khuẩn lạc. Chọn những khuẩn lạc đặc trƣng và tiến hành tách để có khuẩn lạc thuần.
2.1.3 Phương pháp giữ chủng giống các vi khuẩn phân lập được
Dụng cụ và hoá chất
 Dụng cụ: Micropipette 1ml, đầu type 1ml, ống eppendorf, paraffin, Máy vortex,
box cấy
 Hoá chất: Glycerol lỏng 40%
Quy trình thực hiện
 Chủng vi sinh vật thuần sau khi đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng TSB trong
khoảng thời gian từ 16-18h sẽ đƣợc đem đi bảo quản trong Glycerol lỏng ở 80˚C.
 Dùng micropipette 1000 hút 600l Glycerol cho vào các ống eppendorf đã
đƣợc tiệt trùng sau đó cho vào mỗi ống 600l dịch chứa vi khuẩn.
 Các ống eppendorf đƣợc quấn paraffin ở phần nắp để đảm bảo không bị nhiễm
khuẩn trong suốt quá trình bảo quản rồi đem đi trộn đều bằng máy vortex, sau
đó đem bảo quản ở tủ -80˚C.


16

Các ống giống sau khi đƣợc giữ đƣợc lấy ra hoạt hoá lại và kiểm tra tính thuần
của vi khuẩn.

2.2 Xác định các đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn
2.2.1 Xác định đặc điểm hình thái của vi khuẩn
Dụng cụ và hoá chất
 Dụng cụ: Que cấy ria, đèn cồn, lame kính, lamen, kính hiển vi, dầu soi kính.
 Hoá chất: Cồn70˚, nƣớc muối sinh lý, nƣớc cất, bộ thuốc nhuộm Gram
Quy trình thực hiện
Quan sát hình dạng và màu sắc và kích thƣớc khuẩn lạc bằng mắt trên đĩa
khuẩn lạc trên môi trƣờng nuôi cấy: khuẩn lạc tròn, trơn, lồi, có màu trắng đục, kích
thƣớc khoảng 1-2mm.
Sau đó tiến hành nhuộm Gram để quan sát các đặc điểm hình thái của vi khuẩn.
Đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp của Christian Gram (1884):
 Nhỏ một giọt nƣớc muối sinh lý vô trùng lên lame kính
 Dùng que cấy lấy một ít vi khuẩn trải đều trên giọt nƣớc muối, cố định trên
ngọn lửa đèn cồn bằng cách hơ lƣớt qua đến khi mẫu khô lại.
Tiến hành nhuộm Gram:
 Nhỏ dung dịch Crystal violet lên lame kính, chờ 1-2 phút rồi rửa bằng nƣớc cất.
 Nhỏ tiếp dung dịch lugol lên lam kính khoảng 1 phút, tiếp tục rửa bằng nƣớc
cất.
 Tẩy màu bằng dung dịch cồn acetol, nhỏ từ từ dung dịch cồn acetol lên lame
kính cho đến khi giọt nƣớc chảy xuống không còn màu tím, rồi rửa lại lame
kính bằng nƣớc cất.
 Nhỏ lên dung dịch Fushin để khoảng 2 phút rồi rửa lại bằng nƣớc cất.
Để cho lame kính khô rồi quan sát hình dạng, kích thƣớc và Gram của vi khuẩn
dƣới vật kính 100X có giọt dầu.
Đối với tiêu bản phết mẫu mô, sau khi dùng bông tẩm cồn 70˚ khử trùng bề mặt
nội tạng của cá, dùng kéo đã đƣợc tiệt trùng cắt một mẫu mô nhỏ đặt lên lame kính,


17

lấy que cấy phết mẫu mô dàn trải trên lame, có thể bổ sung một ít nƣớc muối sinh lý.
Để mẫu khô tự nhiên, sau đó tiến hành nhuộm nhƣ nhuộm Gram.
2.2.2 Xác định các đặc tính sinh hoá của vi khuẩn
Dụng cụ và hoá chất
 Dụng cụ: Que cấy, pipette Pasteur
 Hoá chất: Bộ kit API 20E, bộ thuốc thử, môi trƣờng OF, paraffin lỏng, môi
trƣờng MacConkey, que thử phản ứng Oxidase.
Quy trình thực hiện
Kiểm tra các khuẩn lạc có cùng nằm trên đƣờng cấy và đã đồng nhất về hình
dạng, màu sắc và kích thƣớc khuẩn lạc, lấy một ít khuẩn lạc đem kiểm tra tính đồng
nhất về kích thƣớc, hình dạng, đặc điểm Gram. Nếu đã đồng nhất thì tiến hành tiếp các
phản ứng sinh hoá, nếu chƣa thì tiếp tục nuôi cấy để có khuẩn lạc thuần.
2.2.2.1 Tiến hành kiểm tra bằng bộ kit API 20E
Quy trình:
 Cho khoảng 5ml nƣớc cất vào khuôn nhựa để giữ ẩm trong quá trình ủ rồi đặt
bộ kít vào khuôn.
 Lấy dịch nuôi cấy vi khuẩn đem ly tâm, thu cặn hoặc lấy khuẩn lạc trên đĩa
thạch nuôi cấy đem pha với nƣớc cất hoặc nƣớc muối vô trùng. So màu độ đục
của ống vi khuẩn tƣơng đƣơng với nồng độ McFarland bậc 4 (mật độ khoảng
108 CFU/ml).
 Sử dụng pipette Pasteur vô trùng, hút dịch vi khuẩn cho vào tất cả các ống.
 Đối với các ống CIT, VP, GEL thì cho dịch vi khuẩn đầy giếng,
 Các ống ADH, LDC, ODC, H 2 S và URE thì phủ đầy giếng bằng paraffin
lỏng.
 Đậy nắp khuông rồi đem ủ ở 28˚C trong khoảng 18-24h.
Nếu sau 24h, có dƣới 3 phản ứng dƣơng tính thì tiếp tục ủ thêm 18-24h nữa. Nếu
có trên 3 phản ứng dƣơng tính thì tiến hành đọc kết quả và thực hiện các phản ứng bổ
sung.
Đọc kết quả theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất.

18

2.2.2.2 Các phản ứng bổ sung
Một số phản ứng đặc trƣng của vi khuẩn (Trần Linh Thƣớc, 2007).
 Phản ứng Oxidase
Dùng que cấy vô trùng lấy một khuẩn lạc đặt lên đầu que thử oxidase chờ
khoảng 30s rồi quan sát và ghi lại sự thay đổi màu sắc đầu que thử. Nếu đầu thử
chuyển sang màu xanh thì phản ứng là (+), là (-) nếu không có sự thay đổi màu sắc đầu
que thử.
 Phản ứng OF (xác định khả năng lên men và oxi-hoá đƣờng glucose)
Dùng que cấy vô trùng lấy một ít khuẩn lạc cấy thẳng vào 2 ống nghiệm chứa
môi trƣờng OF sau đó phủ paraffin lỏng vô trùng lên một ống để kiểm tra khả năng lên
men đƣờng glucose ( kị khí) của vi khuẩn, ống còn lại là để kiểm tra khả năng oxi-hoá
glucose (hiếu khí). Đậy nút bông không thấm và giấy bạc lên trên 2 ống nghiệm rồi
đem ủ ở 28˚C trong 24-48h sau đó lấy ra kiểm tra sự thay đổi màu sắc ống môi trƣờng.
Nếu môi trƣờng đổi từ màu xanh sang màu vàng là phản ứng (+), Nếu môi trƣờng
không đổi màu là phản ứng (-).
 Khả năng phát triển trên môi trường MacConkey agar + 2% NaCl
Dùng que cấy lấy khuẩn lạc cấy ria trên đĩa môi trƣờng, sau đó đem ủ ở 28˚C
sau 24h quan sát màu sắc khuẩn lạc mọc lên.
2.2.3 Xác định thành phần protein màng của các chủng vi khuẩn
Điện di SDS-Page sử dụng phƣơng pháp Sonication để phá vỡ màng tế bào vi khuẩn
Dụng cụ và hoá chất
 Dụng cụ: Ống eppendorf, ống Fancol, micropipette 1ml, 10l, 200l và đầu
type tƣơng ứng, máy ly tâm lạnh, bộ điện di, máy sonicator, bể ủ nhiệt, máy đo
UV-VIS,
 Hoá chất: Bộ hoá chất điện di, dung dịch sonication, nƣớc muối sinh lý 0,85%
NaCl, dung dịch nhuộm và rửa gel.
Quy trình thức hiện

19

2.2.3.1 Tách chiết protein màng của vi khuẩn
 Dịch nuôi cấy vi khuẩn trên môi trƣờng TSB + 2% NaCl sau 24h ở 28˚C đƣợc
đem đi ly tâm khoảng 12000 vòng/ 10 phút để thu cặn chứa các tế bào vi khuẩn.
 Rửa cặn bằng nƣớc muối sinh lý 3 lần, sau đó hoà tan cặn bằng 200l dung
dịch nƣớc muối sinh lý 0,85%, đem dịch hoà tan đƣợc tiến hành sonication với
12 chu kỳ, mỗi chu kỳ 30s trong điều kiện 4˚C.
 Sau khi sonication xong, đem dịch đi ly tâm 12000 vòng/10 phút ở 4˚C để thu
dịch.
 Dịch thu đƣợc đem ly tâm một lần nữa với 14000 vòng/ 2h ở 4˚C, thu cặn cho
vào các ống ependorf .
 Cặn thu đƣợc đem hoà tan với 200l nƣớc muối sinh lý để chuẩn bị cho quá
trình điện di.
Mẫu đƣợc xử lý hoàn toàn trong điều kiện lạnh để đảm bảo không phá vỡ cấu
trúc của protein do biến tính.
2.2.3.2 Quy trình điện di
Đổ gel, chuẩn bị buồng điện di
 Chuẩn bị các dụng cụ, khuôn gel, pha dung dịch Resolving gel 15% và Stacking
gel 5% (canh thời gian pha các dung dịch thích hợp để tránh bị đông).
 Tải dung dịch Resolving gel 15% vào khuôn khoảng 4-5ml, tải lên một lớp
nƣớc cất 2X để tránh gel bị khô và bị oxi hoá. Chờ khoảng 45 phút cho gel
đông lại.
 Đổ lớp nƣớc cất ra, tiếp tục tải dung dịch Stacking gel 5% đến đầy khuôn gel,
cắm lƣợc vào để tạo các giếng, để khoảng 30 phút.
 Sau khi gel đông hoàn toàn, rút lƣợc ra, lắp khuôn gel vào bể điện di. Đổ dung
dịch Tank bufrer lên ngập khuôn gel và trong bể điện di đến vạch mức thích
hợp.

Xử lý mẫu
 Dịch protein sau khi tách chiết đƣợc đem đi xác định giá trị OD ở bƣớc sóng
595nm để xác định hàm lƣợng protein có trong mẫu sau khi tách chiết.