Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và đều kiện hô hấp đến khả năng sinh enzym ngoại bào của lactobacillus sporogenes

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

BO CHANDAN
MÃ SINH VIÊN: 1201066

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT
ĐỘ VÀ ĐIỀU KIỆN HÔ HẤP ĐẾN KHẢ
NĂNG SINH ENZYM NGOẠI BÀO CỦA
Lactobacillus sporogenes
KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2017


BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

BO CHANDAN
MÃ SINH VIÊN: 1201066

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT
ĐỘ VÀ ĐIỀU KIỆN HÔ HẤP ĐẾN KHẢ
NĂNG SINH ENZYM NGOẠI BÀO CỦA
Lactobacillus sporogenes
KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:
TS: Đàm Thanh Xuân
Nơi thực hiện:
Bộ môn Công nghiệp Dược

HÀ NỘI- 2017


LỜI CẢM ƠN

Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Đàm Thanh Xuân, người đã
trực tiếp hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi để em có thể hoàn thành khóa luận.
Em xin chân thành cảm ơn Ths Nguyễn Khắc Tiệp đã đóng góp nhiều ý kiến
quý báu và tận tình giúp đỡ em thực hiện đề tài này.
Em xin cảm ơn sự quan tâm, giúp đỡ của các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật
viên Bộ môn Công nghiệp Dược đối với em trong suốt quá trình nghiên cứu và làm
thực nghiệm tại bộ môn.
Em cũng xin cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng đào tạo, các thầy cô giáo trường
Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình học tập
tại trường.
Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn gia đình, thầy cô, bạn bè, những người
luôn động viên, giúp đỡ em trong học tập và trong cuộc sống.
Em xin trân trọng cảm ơn!
Hà Nội, ngày 12 tháng 5 năm 2017
Sinh viên

BO CHANDAN


MỤC LỤC
TRANG
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH VẼ, BIỂU ĐỒ
ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................................... 1
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN .................................................................................... 2
1.1. Tổng quan về probiotic ..................................................................................... 2
1.1.1. Định nghĩa về probiotic ................................................................................... 2
1.1.2. Các chức năng sinh học của probiotic ............................................................. 2
1.2. Tổng quan về Lactobacillus sporogenes............................................................. 4
1.2.1. Lịch sử phát hiện .............................................................................................. 4
1.2.2. Đặc điểm phân loại
 ........................................................................................ 5
1.2.3. Đặc điểm phân bố ............................................................................................ 5
1.2.4. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa ............................................................... 5
1.2.5. Những đặc điểm, chức năng sinh học tương đồng giữa L. sporogenes và các vi
khuẩn Lactobacillus khác .......................................................................................... 9
1.2.6. Các đặc tính giúp L. sporogenes vượt trội hơn các vi khuẩn Lactobacillus khác
trong ứng dụng làm probiotic .................................................................................. 10
1.3. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sự phát triển của vi sinh vật. ....... 12
1.3.1. Ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy đến sự sinh
trưởng của vi sinh vật............................................................................................... 12
1.3.2. Ảnh hưởng của các yếu tố bên ngoài đến sinh trưởng của vi sinh vật........... 12
1.4. Một số chế phẩm chứa vi khuẩn lactobacillus sporogenes trên thị trường. 13
CHƯƠNG II. NGUYÊN LIỆU, HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU ....................................................................................................... 15
2.1. Nguyên liệu, hoá chất, thiết bị ....................................................................... 15


2.1.1. Vi sinh vật sử dụng ........................................................................................ 15
2.1.2. Hoá chất sử dụng ........................................................................................... 15
2.1.3. Môi trường sử dụng ....................................................................................... 15
2.1.4. Dụng cụ .......................................................................................................... 17

2.2. Nội dung nghiên cứu ....................................................................................... 17
2.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện hô hấp đến khả năng sinh enzym ngoại
bào của Lactobacillus sporogenes ở nhiệt độ 37 0C.
 ........................................... 17
2.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện hô hấp đến khả năng sinh enzym ngoại
bào của Lactobacillus sporogenes ở nhiệt độ 50 0C.
 ........................................... 17
2.3. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................... 17
2.3.1. Phương pháp nhân giống Lactobacillus sporogenes ..................................... 17
2.3.2. Phương pháp lên men. ................................................................................... 17
2.3.3. Phương pháp thử hoạt tính enzym của dịch nuôi cấy .................................... 18
CHƯƠNG III. THỰC NGHIỆM – KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU-BÀN LUẬN .. 20
3.1. Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện hô hấp đến khả năng sinh enzym ngoại
bào của Lactobacillus sporogenes ở nhiệt độ 37 0C.
 .......................................... 20
3.1.2. Thử hoạt tính protease trong môi trường nuôi cấy Canh thang khi bổ sung hạt
đậu 2,5% và bổ sung bột đậu 2,5%. ......................................................................... 21
3.1.3. Thử hoạt tính protease trong môi trường nuôi cấy Canh thang khi bổ sung
casein sau 48 giờ. ..................................................................................................... 23
3.1.4. Lựa chọn môi trường nuôi cấy để thử hoạt tính của amylase. ....................... 25
3.1.5. Thử hoạt tính amylase trong môi trường nuôi cấy Canh thang khi bổ sung hạt
đậu 2,5% và bổ sung bột đậu 2,5%. ......................................................................... 26
3.1.6. Thử hoạt tính amylase khi nuôi cấy L. sporogenes trong môi trường Canh thang
bổ sung casein sau 48 giờ. ....................................................................................... 27
3.1.7. Lựa chọn môi trường nuôi cấy để thử hoạt tính của cellulase trong môi trường
hiếu khí và kỵ khí..................................................................................................... 29
3.1.8. Thử hoạt tính cellulase trong môi trường nuôi cấy Canh thang khi bổ sung hạt
đậu 2,5% và bổ sung bột đậu 2,5%. ......................................................................... 30


3.1.9. Thử hoạt tính cellulase trong khi nuôi cấy L. sporogenes môi trường nuôi cấy
Canh thang bổ sung casein. ...................................................................................... 31
3.2. Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện hô hấp đến khả năng sinh enzym ngoại

bào của Lactobacillus sporogenes ở nhiệt độ 50 0C.
 .......................................... 33
3.2.1. Thử hoạt tính protease trong môi trường nuôi cấy Canh thang khi bổ sung hạt
đậu 2,5%, bột đậu 2,5%, casein 2,5% và casein 5%. ............................................... 33
3.2.2. Thử hoạt tính amylase trong môi trường nuôi cấy Canh thang khi bổ sung hạt
đậu 2,5% và bổ sung bột đậu 2,5% trong trường hợp hiếu khí và kỵ khí. ............... 34
3.2.3. Thử hoạt tính cellulse trong môi trường nuôi cấy Canh thang khi bổ sung hạt
đậu 2,5% và bổ sung bột đậu 2,5% trong trường hợp hiếu khí và kỵ khí. ............... 36
3.3. So sánh khả năng sinh enzym ở 50 0C và 37 0C của enzym trong dịch nuôi
cấy Canh thang ....................................................................................................... 38
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ................................................................................... 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤC LỤC


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Tên đầy đủ

Tên viết tắt
ATCC
CMC
FAO
L. sporogenes
MRS
WHO

Trung tâm giữ giống quốc gia Mỹ (American Type Culture
Collection)
Carboxyl methyl cellulose
Food and Agriculture Organization (Tổ chức Nông lương thế
giới)

Lactobacillus sporogenes
(de Man, Rogosa and Sharpe) Môi trường nuôi cấy vi khuẩn
lactic
World Health Organization (Tổ chức Y tế thế giới)


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng
Bảng 1.1
Bảng 1.2
Bảng 1.3
Bảng 1.4
Bảng 1.5

Tên bảng
So sánh các đặc tính cơ bản của Lactobacillus sporogenes với
các chi Bacillus và Lactobacillus. 

Những tương đồng về đặc điểm sinh trường và sinh hóa của
L. sporogenes và Lactobacillus
Những khác biệt về đặc điểm sinh trưởng và sinh hóa của L.
sporogenes so với Bacillus.
Tác dụng của một vài sản phẩm trao đổi chất của
Lactobacillus.
Bảng liệt kê những ưu điểm của L. sporogenes so với
L.acidophillus.

Bảng 1.6

Các sảm phẩm chứa L. sporogenes.

Bảng 3.1

Hoạt tính protease trong dịch lên men sau 24 giờ, 48 giờ và
72 giờ nuôi cấy L. sporogenes ở 37 0C.
Hoạt tính brotease của L. sporogenes trong dịch nuôi cấy (bổ
sung đậu) ở 37 0C.

Bảng 3.2

Trang
6
7
8
10
11
14
20
22

Bảng 3.3

Thử hoạt tính protease sau khí bổ sung casein ở 37 0C.

23

Bảng 3.4

Hoạt tính amylase trong dịch lên men thu được sau 24 giờ,
48 giờ và 72 giờ nuôi cấy L. sporogenes ở 37 0C.

25

Bảng 3.5

Thử hoạt tính amylase sau khi bổ sung đậu ở 37 0C.

26

Bảng 3.6

Hoạt tính amylase sau khi bổ sung casein vào môi trường
Canh thang với nồng độ khác nhau ở 37 0C.
Hoạt tính cellulase của L.sporogenes khi nuôi cấy trong 3 môi
trường nuôi cấy khác nhau ở 37 0C.

Bảng 3.7

28
29

Bảng 3.8

Hoạt tính cellulase sau khi bổ sung đậu ở 37 0C.

Bảng 3.9
Bảng 3.10

Hoạt tính cellulase sau khi bổ sung casein với nồng độ khác
nhau ở 37 0C
Hoạt tính protease ở 50 0C sau khi bổ sung đậu và casein.

Bảng 3.11

Hoạt tính amylase khi bổ sung đậu và casein ở 50 0C

35

Bảng 3.11

Hoạt tính cellulase khi bổ sung đậu và casein ở 50 0C

37

Bảng 3.13

So sánh khả năng sinh enzym ở 37 0C và 50 0C

38

30
32
33


DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH VẼ, BIỂU ĐỒ
Bảng

Tên hình

Tràng

Hình 1.1

Nhuộm Gram tế bào vi khuẩn Lactobacillus sporogenes

5

Hình 1.2

Giản đồ cấu tạo bào tử.

8

Hình 1.3

Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tốc độ sinh trưởng vi sinh vật

13

Hình 3.1

Hình 3.2

Hình 3.3

Hình 3.4

Hình 3.5

Hình 3.6

Đồ thị so sánh hoạt tính protease trong môi trường nuôi cấy
Canh thang ở 37 0C khi bổ sung bột đậu 2,5% và hạt đậu 2,5%
trong điều kiện kỵ khí và hiếu khí.
Đồ thị so sánh hoạt tính protease trong môi trường nuôi cấy
Canh thang khi bổ sung casein với nồng độ khac nhau trong
điều kiện kỵ khí và hiếu khí ở 37 0C.
Đồ thị so sánh hoạt tính amylase trong môi trường nuôi cấy
Canh thang ở 37 0C khi bổ sung bột đậu 2,5% và hạt đậu 2,5%
trong điều kiện kỵ khí và hiếu khí.
Đồ thị so sánh hoạt tính amylase trong môi trường nuôi cấy
Canh thang ở 37 0C khi bổ sung casein với nồng độ khac nhau
trong điều kiện kỵ khí và hiếu khí.
Đồ thị so sánh hoạt tính cellulase trong môi trường nuôi cấy
Canh thang ở 37 0C khi bổ sung bột đậu 2,5% và hạt đậu 2,5%
trong điều kiện kỵ khí và hiếu khí.
Đồ thị so sánh hoạt tính cellulase trong môi trường nuôi cấy
Canh thang ở 37 0C khi bổ sung casein với nồng độ khac nhau
trong điều kiện kỵ khí và hiếu khí.

23

24

27

29

31

32

Hình 3.7

Đồ thị so sánh hoạt tính protease trong dịch nuôi cấy ở 50 0C.

34

Hình 3.8

Đồ thị so sánh hoạt tính amylase trong dịch nuôi cấy ở 50 0C.

36

Hình 3.9

Đồ thị so sánh hoạt tính cellulase trong dịch nuôi cấy ở 50 0C.

37

sinh enzym ngoại bào của L.
Hình 3.10 Đồ thị so sánh 0khả năng
0
sporogenes ở 37 và 50 C.

38


ĐẶT VẤN ĐỀ
Probiotic được biết đến là các lợi khuẩn có nhiều giá trị thiết thực đối với sức

khỏe con người như: chống nhiễm trùng đường tiêu hóa, cải thiện khả năng dung nạp
lactose, tăng cường miễn dịch, giảm cholesterol.... Probiotic đã được sử dụng từ rất
lâu trước đây, trong vài thập kỷ trở lại đây, số lượng nghiên cứu về probiotic cũng
như số chế phẩm probiotic có mặt trên thị trường xuất hiện ngày càng nhiều.
Trong số các probiotic được sử dụng, không thể không kể đến Lactobacillus
sporogenes, đây là một chủng vi khuẩn có rất nhiều đặc tính nổi trội: có khả năng
sinh bào tử giúp chống chịu tốt với các điều kiện bất lợi của môi trường, làm tăng tỉ
lệ sống sót và tăng hiệu quả điều trị; có khả năng lên men đồng hình tạo acid L (+)
lactic mà cơ thể có thể chuyển hóa hoàn toàn được....
Tại Việt Nam, vi khuẩn Lactobacillus sporogenes đã bắt đầu được nghiên cứu
trong những năm gần đây, tuy nhiên, số lượng nghiên cứu chưa nhiều và tập trung
chủ yếu vào nhóm ngành thực phẩm và thú y. Với mong muốn góp phần nhỏ vào
nghiên cứu L. sporogenes ở Việt Nam, đề tài “Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và
điều kiện hô hấp đến khả năng sinh enzym ngoại bào của Lactobacillus
sporogenes” được thực hiện với các mục tiêu:
1. Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện hô hấp đến khả năng sinh enzym ngoại bào
của Lactobacillus sporogenes ở nhiệt độ 37 0C.

2. Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện hô hấp đến khả năng sinh enzym ngoại bào
của Lactobacillus sporogenes ở nhiệt độ 50 0C.


1


CHƯƠNG I. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về probiotic
1.1.1. Định nghĩa về probiotic
Thuật ngữ probiotic có nguồn gốc từ Hy Lạp. Theo nghĩa gốc, “biotic” hay
“biosis” từ chữ “life” là đời sống, và “pro” là thân thiện, nên probiotic có thể hiểu
theo nghĩa là cái gì đó thân thiện với đời sống con người. Hiểu sát nghĩa hơn, đó là
chất bổ sung dinh dưỡng chứa những vi khuẩn hay vi sinh vật có ích [19], [26].

Hàng nghìn năm trước, con người đã biết sử dụng các thực phẩm có vi sinh
vật sống có lợi như sữa lên men, đậu tương lên men... nhằm tăng cường sức khỏe,
nhưng mãi đến năm 1907, khái niệm probiotic mới được nêu ra lần đầu tiên bởi nhà
khoa học Eli Metchnikoff trong cuốn sách “Kéo dài sự sống” của ông. Ông đã nói:
“Sự phụ thuộc của hệ vi sinh vật trong ruột vào thực phẩm làm cho đường ruột có
khả năng chấp nhận ở mức nào đó sự thay đổi các hệ vi khuẩn trong cơ thể và thay
thế vi khuẩn có hại bằng vi khuẩn có lợi” [15], [28].
Năm 2002, Tổ chức Nông lương thế giới (FAO) và Tổ chức Y tế thế giới
(WHO) đã đưa ra định nghĩa về probiotic như sau: “Probiotic là những vi sinh vật
sống mà khi đưa vào cơ thể với một lượng đủ lớn sẽ đem lại tác động có lợi cho sức
khỏe vật chủ”. Nhưng không phải tất cả những vi sinh vật sống nào cũng là probiotic,
theo đánh giá của tổ chức FAO và WHO, vi khuẩn được sử dụng trong các chế phẩm
probiotic dạng thực phẩm phải đáp ứng được các điều kiện: có nguồn gốc rõ ràng,
phải đặc hiệu dòng, phải đạt hàm lượng không dưới 109 lợi khuẩn cho một liều sử
dụng, có khả năng sống trong suốt chiều dài hệ tiêu hóa và phát triển được trong ruột,
cuối cùng là phải được chứng minh khoa học về tính hiệu quả trong quá trình sử dụng
[14].
1.1.2. Các chức năng sinh học của probiotic
1.1.2.1. Tăng khả năng tiêu hóa nhờ hệ thống enzym
Vi sinh vật đường ruột có lợi của động vật nuôi có một vai trò quan trọng trong
sự tiêu hóa và hấp thu thức ăn của vật chủ. Chúng tham gia vào quá trình tiêu hóa các
chất dinh dưỡng trong khẩu phần như: carbonhydrate, protein, lipid...thành những

2


chất dễ hấp thu hơn nhờ hệ thống enzym của chúng như: amylase, protease,
cellulase... Nhóm này gồm những vi khuẩn: Bacillus subtilis, Ruminococcus,
Cellulomonas, Saccaromyces cerevisiae, Aspergillus oryzae, Lactobacillus,...
Theo một số nghiên cứu của Nahashon, việc bổ sung Lactobacillus vào trong khẩu

phần bắp, lúa mạch, đậu nành đã kích thích thèm ăn và tăng tích lũy mỡ, N, Ca, P,
Cu và Mn cho gà đẻ.
Ngoài ra, việc bổ dung chế phẩm Saccharomyces boulardii vào khẩu phần gà
thịt làm giảm hệ số chuyển đổi thức ăn trên 1 kg tăng trọng, ảnh hưởng phần nào lên
sức đề kháng, làm giảm tỉ lệ chết, tăng hiệu quả sản xuất.
1.1.2.2. Tổng hợp vitamin K và nhóm B

Hệ vi sinh vật có khả năng tổng hợp vitamin nhóm B như B1, B2, B6, B12 và
vitamin K ở manh tràng và đại tràng.
1.1.2.3. Trung hòa độc tố và phân hủy một số độc chất

Theo Rami và Khetarpaul (1998), probiotic có khả năng sản xuất các chất có
tác dụng trung hòa độc tố gây tiêu chảy của vi khuẩn E. coli, có thể làm giảm hoạt
tính urease trong ruột non, ngăn chặn sự tổng hợp các amin độc, làm giảm nồng độ
NH3 trong phân gia súc, gia cầm [22]. Một vài vi sinh vật có khả năng khử độc và
phân hủy một số chất có độc tính, tạo thành những dẫn xuất không độc. Nhiều nghiên
cứu cho thấy tế bào nấm men có tính khử các chất độc được sinh ra trong quá trình
tiêu hóa như: indol, skatol, phenol,... Tác dụng trung hòa và khử độc của probiotic
không những giúp cho ống tiêu hóa hoạt động tốt hơn mà còn có ý nghĩa về mặt môi
trường.
1.2.2.4. Giúp ổn định hệ vi sinh vật đường ruột

Động vật khỏe mạnh, có hệ tiêu hóa hoạt động tốt là cơ sở cho sự chuyển hóa
tốt thức ăn phục vụ cho nhu cầu cơ thể. Đặc tính quan trọng nhất của một đường tiêu
hóa khỏe mạnh là sự cân bằng của hệ vi sinh vật đường ruột. Việc bổ sung probiotic
giúp duy trì hệ vi sinh vật đường ruột thông qua hoạt động cạnh tranh và đối kháng.
Hoạt động cạnh tranh thể hiện ở các vị trí bám dính trên nhung mao ruột, các
chất dinh dưỡng và khối lượng các sản phẩm trao đổi chất của vi sinh vật. Nhiều
3


nghiên cứu chứng minh probiotic ức chế sự bám dính của vi sinh vật gây bệnh như
E. coli, Salmonella typhimurium [13], [17], [24]. Việc ức chế khả năng bám dính của

vi sinh vật gây bệnh giúp ngăn ngừa sự phát triển và gây bệnh của chúng.
Nhóm vi khuẩn lactic là những vi sinh vật tiêu biểu cho hoạt động đối kháng
của của probiotic. Chúng chống lại các vi sinh vật gây bệnh nhờ vào các sản phẩm
do chúng tạo ra như: bacteriocin, acid hữu cơ, hydroperoxydase, lactocidin...
Lactocidin có phổ kháng khuẩn rất rộng. Các acid acetic và lactic làm giảm pH đường
ruột khiến môi trường đường ruột trở nên bất lợi cho sự tồn tại của vi sinh vật gây
bệnh Gr (-). Một số bacteriocin thường gặp như: mycobacillin, subtilin (do Bacillus
subtilis sinh ra), nizin (do Lactococcus lactis sinh ra), penicillin (do nấm penicillium
sinh ra), L. acidophillus tạo ra lactacin B có tác dụng ức chế các loài Lactobacillus
khác và acidocin ức chế vi sinh vật gây bệnh.
1.1.2.5. Kích thích hệ thống miễn dịch

Yếu tố được xác định có vai trò kích thích hệ thống miễn dịch là thành phần
của vách tế bào vi khuẩn: peptidoglycan. Sự phân hủy peptidoglycan tạo thành chất
muramyl peptid có tác dụng kích hoạt đại thực bào. Saarela và ctv (2000) cho rằng
khả năng bám vào niêm mạc ruột của probiotic tạo sự tương tác giúp probiotic tiếp
xúc với hệ thống lympho đường ruột và hệ thống miễn dịch, nhờ đó thúc đẩy hiệu
quả miễn dịch và tạo nên sự ổn định hàng rào bảo vệ ruột [25].
1.2. Tổng quan về Lactobacillus sporogenes
1.2.1. Lịch sử phát hiện
L. sporogenes lần đầu tiên được phân lập vào năm 1933 bởi L.M. HorowitzWlassowa và N.W. Nowotelnow. Vào thời gian đó, vi khuẩn được phân loại và mô
tả như sau: tế bào hình que, Gram (+), tạo bào tử, sản xuất acid lactic, hiếu khí hay kị
khí tùy ý, phản ứng catalase (+) (Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology,
1974). Vi khuẩn còn có tên là Bacillus coagulans.
Do vi khuẩn này có các đặc điểm của cả hai chi Lactobacillus và Bacillus, nên
vị trí phân loại của nó giữa hai họ Lactobacillaceae và Bacillaceae vẫn còn gây nhiều
tranh cãi. Vi khuẩn này được biết đến với cả hai tên gọi trên, nhưng tên gọi
4


Lactobacillus sporogenes vẫn được sử dụng nhiều hơn trong các chế phẩm thương

mại xuất hiện trên thị trường. Do nguồn gốc của giống vi sinh vật trong khóa luận,
tên gọi Lactobacillus sporogenes sẽ được sử dụng.
Tuy nhiên, những nghiên cứu gần đây, đặc biệt là nghiên cứu dựa trên sự tương
đồng về DNA đã khẳng định L. sporogenes gần gũi với Lactobacillus hơn Bacillus.
Năm 1967, L. sporogenes được xếp lại vào giống Lactobacillus.
1.2.2. Đặc điểm phân loại

Vi khuẩn L. sporogenes có đặc điểm phân loại như sau:
Họ: Lactobacillaceae

Giống: Lactobacillus

Tộc: Lactobacilleae

Loài: Lactobacillus sporogenes

1.2.3. Đặc điểm phân bố
Chúng phân bố tương đối rộng rãi trong tự nhiên, đặc biệt trong các sản phẩm
sữa.
1.2.4. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa
1.2.4.1. Hình thái tế bào sinh dưỡng
• Đặc điểm hình thái:
- Lactobacillus sporogenes được mô tả là trực khuẩn Gram dương, hình 
que, kích
thước 0,5 – 0,7µm × 1,6 – 7,1 µm, có khả năng di động, có khả 
năng sinh bào tử
[12], [18].
- Tế bào Lactobacillus sporogenes có xu hướng mọc đơn hoặc hiếm khi ở 
dạng
chuỗi ngắn [12], [18].

Hình 1.1: Nhuộm Gram tế bào vi khuẩn Lactobacillus sporogenes

5

• Điều kiện nuôi cấy: 

L. sporogenes là vi khuẩn kỵ khí tùy nghi, sinh trưởng tối ưu ở nhiệt độ từ 35 –
o
50 C, pH khoảng 5,5 – 6,5 [12], [18]. Về dinh dưỡng, vi khuẩn này có khả năng sử
dụng nhiều nguồn carbon khác nhau: glucose, lactose, maltose, dextrose, fructose,
galactose.... 

• Đặc điểm sinh lý, sinh hóa:
L. sporogenes cho phản ứng catalase dương tính [12], [18]. L. sporogenes có khả
năng tổng hợp acid L (+) lactic, không tổng hợp 
đồng phân D (-).
Hai đồng phân
quang học của acid lactic là acid D (-) lactic và acid L (+) lactic 
có thể được tổng
hợp bởi các vi khuẩn sinh acid lactic, từ lâu đã được sử dụng trong dược phẩm và các
ngành công nghiệp khác. Ở người, cả hai dạng đồng phân này đều được hấp thu qua
đường ruột. Đồng phân L (+) được hấp thu hoàn toàn và nhanh chóng chuyển hóa
thành glycogen. Đồng phân D (-) không được hấp thu hoàn toàn, phần acid không
được chuyển hóa sẽ được thải trừ qua nước tiểu. Sự xuất hiện của acid lactic không
được chuyển hóa có thể gây nên tình trạng nhiễm toan chuyển hóa cho cơ thể [11],
[29]. Lactobacillus sporogenes có các đặc tính chung của cả hai chi Lactobacillus và
Bacillus, bảng dưới đây so sánh các đặc tính cơ bản của Lactobacillus sporogenes
với hai chi này. 

Bảng 1.1 So sánh các đặc tính cơ bản của Lactobacillus sporogenes với các chi
Bacillus và Lactobacillus. [18]
Đặc tính
L. sporogenes
Lactobacilus
Bacilus
Catalase

+

-

+

Oxidase

-

-

+

Nitrate

-

-

+

Sinh bao tử

+

-

+

Khả năng di động

+

+/-

+

Sinh acid lactic

+

-

-

Acid mesodiaminopimelic

+

+/-

+

6


Các đặc điểm sinh trưởng phát triển và sinh hóa
Tương tự như hình thái, những điểm tương đồng Lactobacillus và khác biệt Bacillus
về mặt sinh trưởng phát triển và sinh hóa của L. sporogenes được trình bày ở Bảng
1.2 và 1.3.

Bảng 1.2 Những tương đồng về đặc điểm sinh trưởng và sinh hóa của L.
sporogenes và Lactobacillus [29].
Điểm tương đồng

Chi tiết
-Khó nuôi cấy, cần những chất hữu cơ phức tạp để phát

Môi trường nuôi

triển như: carbonhydrate (để lên men), pepton, cao thịt,

cấy

dịch chiết nấm men.

Môi trường thích hợp là : MRS và Canh thang

PH tối ưu

5,5-6,5

Nhiệt độ tối ưu

35- 50 0C
-Không thủy phân tinh bột, casein.
-Không hóa lỏng gelatin

Một só ứng sinh
hoá

-Indole (-)


-Không sinh gas hay H2S

-Không có menaquinones

-Sản xuất acid khi lên men các loại đường: lactose,
arabinose, xylose, glucose, galactose, mannose, fructose,

Khả năng lên men

maltose, sucrose và trehalose.

-Sản xuất acid lactic khi lên men: glucose, fructose,
sucrose, trehalose và lactose.

Một số đăc điểm

-Gram (+)

-Hiếu khí hay kị khí tùy ý .

7


Bảng 1.3 Những khác biệt về đặc điểm sinh trưởng và sinh hóa của L. sporogenes
so với Bacillus [29]
Điểm khác biệt

Chi tiết

Môi trường nuôi

Dễ nuôi cấy hơn Lactobacillus

cấy

Một số phản ứng

Lactobacillus cho phản ứng oxidase (-) và nitrate (-) trong

sinh hoá

khi Bacillus luôn cho hai phản ứng này (+)

Khả năng lên men

Bacillus không lên men được lactose

đường
1.2.4.2. Bào tử
Hình thái
Lớp vỏ bào tử có cấu tạo là một phức hệ peptidoglycan - acid dipicolinic calcium. Bào tử hình ellip, nằm ở một đầu của tế bào sinh dưỡng, có kích thước 0,9
- 1,2x1,0 - 1,7 µm. Cấu tạo chi tiết của bào tử L. sporogenes được mô tả theo Hình
1.2.

Hình 1.2: Giản đồ cấu tạo bào tử.
Gồm: lớp ngoại bào tử (exosporium), màng ngoài (outer coat), màng trong (inner
coat), lớp vỏ dưới màng trong (cortex), màng vỏ của vách tế bào mầm (cortical
membrane of the germ cell wall), tế bào chất sát nhập vào tế bào mẹ (incorporated
mother cell cytoplasm), nguyên sinh chất (core/protoplast), vật chất nhân (nuclear
material).
Khi gặp phải điều kiện bất lợi như nhiệt độ, pH, môi trường dinh dưỡng không phù
hợp,... L. sporogenes từ dạng tế bào sinh dưỡng tạo thành bào tử [9], [24].
8

1.2.5. Những đặc điểm, chức năng sinh học tương đồng giữa L. sporogenes và
các vi khuẩn Lactobacillus khác
Vi khuẩn L. sporogenes là một loài thuộc giống Lactobacillus nên mang nhiều
đặc tính và chức năng sinh học của Lactobacillus. Những đặc tính và chức năng này
đều có ý nghĩa trong ứng dụng sản xuất probiotic.
1.2.5.1. Những đặc điểm trao đổi chất

Quá trình trao đổi chất của Lactobacillus có vai trò rất quan trọng trong khả
năng chữa bệnh của Lactobacilus. Các nghiên cứu nuôi cấy Lactobacillus trong môi
trường sữa đã thể hiện rõ ràng những hoạt tính đáng chú ý sau:
Phân giải protein
Lactobacillus sản sinh enzym proteinase phân giải protein thành các
polypeptide mạch ngắn. Hoạt tính này của vi khuẩn giúp cho protein được cơ thể vật
chủ tiêu hóa dễ dàng. Vì vậy, các chế phẩm từ hoạt động lên men của Lactobacillus
được đánh giá là nguồn dinh dưỡng có giá trị cao cho các đối tượng: trẻ sơ sinh, người
đang dưỡng bệnh, người già hay gia súc non.
Phân giải lipid
Nhờ có enzym lipase, Lactobacillus có khả năng phân cắt chất béo ở dạng
triglyceride thành các acid béo và glycerol. Điều này cũng có ý nghĩa về mặt dinh
dưỡng đối với người và vật nuôi.
Có những nghiên cứu lâm sàng và tiền lâm sàng (preclinical) cho rằng Lactobacillus
phân giải được cholesterol trong lipid huyết thanh (serum lipids) [20] và muối mật.
Cả hai khả năng này đều có ý nghĩa về mặt lâm sàng.
Phân giải đường lactose
Lactobacillus

mang

enzym

beta-galactosidase,

glycolase

và

lactic

dehydrogenase (LDH) có tác dụng chuyển hoá đường lactose thành acid lactic. Đây
là một acid hữu cơ có những đặc tính sinh học đặc biệt [10].
Sản xuất bacteriocin và các cơ chất kháng khuẩn
Bacteriocin là protein hay hợp chất protein do vi khuẩn sản xuất có hoạt tính
diệt khuẩn trực tiếp. Cơ chất này giúp vi khuẩn Lactobacillus thể hiện hoạt tính ức
9


chế đối với các vi sinh vật gây thối trong hệ tiêu hóa.
Bảng 1.4 Tác dụng của một vài sản phẩm trao đổi chất của Lactobacillus
[25].
Sản phẩm trao đổi chất

Tác dụng
Ức chế sự khử nhóm carboxyl.

1. Carbon dioxid

Làm giảm tính thấm của màng tế bào.
Tương tác với các protein gắn kết

2. Diacetyl

arginine

3. Hydrogen peroxide/

Oxi hóa những protein cơ bản

Lactoperoxidase

1.2.6. Các đặc tính giúp L. sporogenes vượt trội hơn các vi khuẩn Lactobacillus
khác trong ứng dụng làm probiotic
Ngoài những chức năng sinh học kể trên, L. sporogenes còn vượt trội hơn các
vi khuẩn khác làm probiotic nhờ đáp ứng những yêu cầu của một loại probiotic lý
tưởng như:
. Có nguồn gốc tự nhiên và thích hợp với cơ thể người và vật nuôi
. Không mang độc tính hay bất kỳ một tác dụng phụ nào cho người và vật nuôi
. Có khả năng gắn vào tế bào biểu mô ruột và cố định trên trên đường tiêu hóa để
ngăn ngừa và chống mầm bệnh xâm nhập.
. Kháng được acid và mật, vẫn sống sau khi di chuyển từ dạ dày xuống ruột non
. Lên men và tạo ra L (+) acid lactic, được chuyển hóa hoàn toàn trong quá trình trao
đổi chất nên không gây tình trạng nhiễm acid như D (-) acid lactic.
. Tỉ lệ sống cao sau khi trải qua quy trình sản xuất (thu hoạch, sấy khô...)
. Tính ổn định cao ở nhiệt độ phòng khi trộn hay không trộn với những thành phần
khác
. Có tác dụng cải thiện sức khỏe vật chủ
Ngoài ra, L. sporogenes còn là loài Bacillus
duy nhất dùng làm probiotic mang chứng nhận an toàn cho sức khỏe GRAS
(Generally Recognise As Safe) do FDA (Food & Drug Administration) cấp. Vì những
lý do kể trên giúp L. sporogenes ngày càng được ưa chuộng hơn Lactobacillus quen
10

thuộc khác. Điển hình nhất trong số này là L. acidophillus. Đây là loài vi khuẩn rất
thông dụng và phổ biến có mặt trong sữa chua, các loại thực phẩm lên men khác và
thuốc trị rối loạn tiêu hóa,...và được con người tin dùng từ rất lâu.
Những đặc điểm vượt trội của L. sporogenes so với L. acidophilus được thể hiện qua
Bảng 1.5.
Bảng 1.5 Bảng liệt kê những ưu điểm của L. sporogenes so với L. acidophillus
Lactobacillus sporogenes

Lactobacillus acidophilus

Khi gặp điều kiện bất lợi, tế bào sinh

Vi khuẩn không tạo bào tử.

dưỡng tạo thành bào tử chống chịu tốt

Tế bào sinh dưỡng rất nhạy cảm với nhiệt

với những điều kiện bất lợi: nhiệt độ, pH

độ.

thấp trong đường tiêu hóa, dịch mật, sấy
khô, đông lạnh, bức xạ, hóa chất diệt
khuẩn và kháng sinh.
Bào tử vẫn sống sau khi đã xử lý

Yêu cầu phải có vitamin cho sự sinh

o

100 C/20 phút trong môi trường đệm

trưởng.

phosphat
Không yêu cầu phải có vitamin để sinh

Yêu cầu phải có vitamin cho sự sinh

trưởng và phát triển.

trưởng.

Lên men đồng hình tạo ra L (+) acid

Sản xuất D (-) acid lactic có thể gây

lactic dễ dàng chuyển hóa trong cơ thể

chứng nhiễm acid vào quá trình trao đổi

[16].

chất (tài liệu 159, International Dairy
Federeration, 1983)

Khả năng tái sinh tốt và tính ổn định của

Khả năng tái sinh và tính ổn định của tế

bào tử nên vẫn đạt được hiệu quả chữa trị bào kém nên phải uống một lượng lớn.
dù chỉ dùng một liều nhỏ.
Có hạn dùng đến 3 năm khi bảo quản ở
nhiệt độ phòng

o
Bảo quản ở nhiệt độ 4-10 C để giữ hoạt
tính tế bào

Tuy nhiên, L. sporogenes có một nhược điểm duy nhất đó là thời gian tồn tại

11


trong ống tiêu hóa chỉ trong 6 – 7 ngày. Cuối cùng, bào tử theo phân thải ra ngoài.
Hiện nay, cơ chế và nguyên nhân của vấn đề này còn đang được nghiên cứu.
1.3. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sự phát triển của vi sinh vật.
Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, vi sinh vật sử dụng dinh dưỡng từ
môi trường để tổng hợp nên các cơ chất cần thiết và chịu tác động từ các yếu tố bên
ngoài. Muốn nghiên cứu và ứng dụng vi sinh vật vào sản xuất cần hiểu được ảnh
hưởng của thành phần dinh dưỡng cũng như các yếu tố khác lên sự sinh trưởng và
phát triển của chúng.

1.3.1. Ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy đến sự
sinh trưởng của vi sinh vật.
Vi sinh vật chủ yếu thu nhận được chất dinh dưỡng từ môi trường bên ngoài
để sử dụng làm nguyên liệu cung cấp cho quá trình sinh tổng hợp tạo ra các thành
phần của tế bào hoặc cung cấp cho quá trình trao đổi năng lượng. Căn cứ vào chức
năng sinh lý khác nhau trong tế bào mà người ta thường chia các chất dinh dưỡng
thành 5 nhóm lớn: nguồn cacbon, nguồn nitơ, nguồn muối vô cơ, các nhân tố sinh
trưởng và nước. Nhu cầu dinh dưỡng khác nhau ở từng vi sinh vật, ở từng giai đoạn

phát triển của vi sinh vật [2].
1.3.2. Ảnh hưởng của các yếu tố bên ngoài đến sinh trưởng của vi sinh vật.
Các yếu tố bên ngoài tác động lên tế bào rất đa dạng, được chia làm ba nhóm:
yếu tố lý học (nhiệt độ, áp suất...), yếu tố hóa học (pH môi trường, nồng độ oxy môi
trường...) và yếu tố sinh học (chất kháng sinh) [2].
Trong phạm vi đề tài, hai yếu tố bên ngoài ảnh hưởng đến sự phát triển của vi sinh
vật được đề cập đến là nhiệt độ nuôi cấy và nồng độ oxy môi trường.

1.3.2.1. Nhiệt độ môi trường.
Vi sinh vật thường là các sinh vật đơn bào cho nên chúng rất mẫn cảm với sự
biến hóa của nhiệt độ và thường bị biến hóa cùng với sự biến hóa về nhiệt độ của môi
trường nuôi cấy. Trong phạm vi nhiệt độ thấp, khi nhiệt độ tăng lên sẽ làm tăng tốc
độ sinh trưởng của vi sinh vật. Lúc nhiệt độ tăng lên đến một mức độ nhất định thì
nhiệt độ càng tăng tốc độ sinh trưởng càng giảm. Khi nhiệt độ tăng quá cao vi sinh
12


vật sẽ chết do gây ra sự biến tính của enzym, của các thể vận chuyển và các protein
khác. Tại điều kiện nhiệt độ rất thấp, màng sinh chất bị kết đông lại, enzym cũng
ngừng hoạt động, vi sinh vật chậm phát triển hoặc chết.

Hình 1.3: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tốc độ sinh trưởng vi sinh vật
1.3.2.2. Nồng độ oxy
Oxy có vai trò vô cùng quan trọng đối với hoạt động sống của vi sinh vật. Tùy
thuộc nhu cầu sử dụng oxy mà người ta chia vi sinh vật ra thành các nhóm sau:
• Vi khuẩn hiếu khí bắt buộc.

• Vi khuẩn hiếu khí không bắt buộc (hay kỵ khí tùy nghi).

• Vi khuẩn vi hiếu khí.

• Vi khuẩn kỵ khí chịu dưỡng.

• Vi khuẩn kỵ khí bắt buộc.
Theo các khảo sát trước đây, Lactobacillus sporogenes thuộc nhóm vi khuẩn

hiếu khí không bắt buộc (hay kỵ khí tùy nghi) [21].
1.4. Một số chế phẩm chứa vi khuẩn lactobacillus sporogenes trên thị trường.
Hiện nay trên thị trường trong và ngoài nước có nhiều chế phẩm chứa
Lactobacillus sporogenes ở dạng tế bào sinh dưỡng hoặc dạng bào tử, dùng đơn lẻ
hoặc phối hợp với các vi khuẩn probiotics khác trong cùng một chế phẩm. Một số
sản phẩm chứa Lactobacillus sporogenes được liệt kê trong bảng sau:

13


Bảng 1.6 Các sản phẩm chứa L. sporogenes.
STT

Tên thương
mại

Thành phần

Dạng bào
chế

Nhà sản xuất

1

Estromineral

L. sporogenes

Viên nén

Rattapharm/ Madaus
(Italia)

Biobaby

L. sporogenes,
B. subtilis,
C.butyricum

Cốm pha
hỗn dịch
uống

Ildong phâmceutical
Co., Ltd. (Hàn quốc)

Biolac

L. sporogenes,
L.acidophilus,
L. kefir

Viên nang

CT TNHHMTV Vacxin
và sinh phẩm nha trang

L. sporogenes,
B. subtilis

Viên nén

Ildong phẩmceutical
Co., Ltd. (Hàn Quốc)

L. sporogenes,
B. clausii

Thuốc bột

CTTNHH Dược Phẩm
Mê linh

2

3

4
5

Biotis Q.
tablets
Insotac

14


CHƯƠNG II. NGUYÊN LIỆU, HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU

2.1. Nguyên liệu, hoá chất, thiết bị
2.1.1. Vi sinh vật sử dụng
• Vi sinh vật sử dụng: Lactobacillus sporogenes. ATCC
2.1.2. Hoá chất sử dụng
Tên hoá chất

Nguồn gốc

Tên hoá chất

Nguồn gốc

Cao thịt

Đức

MnSO4.4H2O

Việt Nam

NaCl

Trung quốc

Triamoni citrat

Việt Nam

Thạch bột

Việt Nam

Natri acetat

Việt Nam

Casein

Trung Quốc

Amoni sulfat

Trung Quốc

Xanh methylen

Trung Quốc

Glucose

Viết nam

K2HPO4

Viết Nam

Cao nấm men

Merk-Đức

MgSO4.7H2O

Việt Nam

Ethanol 96

Trung Quốc

MnSO4.4H2O

Việt Nam

Pepton

Merk-Đức

2.1.3. Môi trường sử dụng
a) Môi trường nhân giống
• Peptone: 2 g

• NaCl: 1 g

• Cao thịt: 1 g

• Nước: vừa đủ 100 m

b) Môi trường Canh thang
(MT1)

• NaCl: 1 g

• Peptone: 2 g

• Nước vừa đủ: 100 ml

• Cao thịt: 1 g

15


c) Môi trường MRS (MT2)
• Glucose

2g

• Triamoni citrate

0,2g

• Pepton

1g

• K2HPO4

0,2g

• Cao thịt

1g

• MgSO4.7H2O

0,02g

• Cao nấm men

0,5g

• MnSO4.4H2O

0,005g

• Natri acetat

0,5g

• Nước máy vừa đủ 100 mL

d) Môi trường glucose – cao nấm
men (MT3)
• Glucose

5,0 g

• KH2PO4

0,2 g

• Cao nấm men

0,5 g

• MgSO4. 7H2O

0,1 g

• Amoni sulfat 0,3 g

• Nước máy vừa đủ 100 mL

e) Môi trường Thạch – Casein
• Thạch: 2 g

• Nước: 100 ml

• Casein: 1 g
f) Môi trường Thạch – Tinh bột
• Thạch: 2 g

• Nước: 100 ml

• Tinh bột: 1 g
g) Môi trường thạch – CMC
• Thạch: 2 g

• Nước: 100 ml

• CMC: 1 g
2.1.4. Thiết bị

Thiết bị
Tủ cấy
Tủ ấm
Máy ly tâm

Nguồn gốc
Bioair (Italy)
Memmert (Đức)
Rotofix(Đức)

Cân phân tích
Cân kĩ thuật
Tủ lạnh
Nồi hấp

Máy lắc

Bioshaker(Đức)

Lò vi sóng

16

Presica(Đức)
Presca(Đức)
Toshiba(Nhật)
ALP(Nhật)
Daewoo(Hàn
Quốc)