Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và điều kiện hô hấp đến khả năng sinh acid lactic của lactobacillus sporogenes

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ HÀ
Mã sinh viên: 1201150

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT
ĐỘ VÀ ĐIỀU KIỆN HÔ HẤP ĐẾN KHẢ
NĂNG SINH ACID LACTIC CỦA
Lactobacillus sporogenes
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2017


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ HÀ
Mã sinh viên: 1201150

KHẢO SÁT KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG
CỦA NHIỆT ĐỘ VÀ ĐIỀU KIỆN HÔ
HẤP ĐẾN KHẢ NĂNG SINH ACID
LACTIC CỦA
Lactobacillus sporogenes
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
ThS. Kiều Thị Hồng
Nơi thực hiện:
Bộ môn Công nghiệp dược

HÀ NỘI – 2017


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành nhất tới cô giáo ThS. Kiều Thị
Hồng đã hết lòng hướng dẫn, tận tâm chỉ bảo và giúp đỡ tôi hoàn thành khoá luận
này.
Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Đàm Thanh Xuân đã cho tôi những bài học giá trị,
nhiệt tình dạy bảo và giúp đỡ tôi từ những ngày đầu nghiên cứu cho tới nay.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo và các kỹ thuật viên Bộ môn Công
Nghiệp Dược và Viện Công Nghệ Dược Phẩm Quốc Gia đã nhiệt tình chỉ bảo và tạo
điều kiện cho tôi hoàn thành khoá luận này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô giáo
trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong
suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại trường.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân và bạn bè đã động viên,
giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.

Hà Nội, tháng 05 năm 2017
Sinh viên
Nguyễn Thị Hà


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT
DANG MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1

Chương 1.
1.1

TỔNG QUAN .................................................................................... 2

Acid lactic .....................................................................................................2

1.1.1

Định nghĩa .............................................................................................. 2

1.1.2

Đặc điểm ................................................................................................. 2

1.1.3

Công dụng ............................................................................................... 3

1.2

Các phương pháp sản xuất acid lactic: ......................................................5

1.2.1

Phương pháp tổng hợp hóa học.............................................................. 6

1.2.2

Phương pháp vi sinh vật ......................................................................... 6

1.3

Vi khuẩn sinh acid lactic:............................................................................8

1.3.1

Đặc điểm của nhóm vi khuẩn sinh lactic ................................................ 8

1.3.2

Chi Lactobacillus .................................................................................... 9

1.3.3

Loài Lactobacillus sporogenes ............................................................... 9

1.3.4

Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sự phát triển của vi khuẩn sinh

acid lactic : ......................................................................................................... 11
1.4

Các nghiên cứu về Lactobacillus sporogenes và khả năng sinh acid

lactic của vi khuẩn này: .......................................................................................13
Chương 2.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 15

2.1

Đối tượng nghiên cứu: ...............................................................................15

2.1.1

Nguyên vật liệu: .................................................................................... 15

2.1.2

Thiết bị sử dụng .................................................................................... 17

2.2

Nội dung nghiên cứu: ................................................................................17

2.2.1

Lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp cho L. sporogenes để thu

được calci lactat với hiệu suất cao..................................................................... 17
2.2.2

Khảo sát và lựa chọn nhiệt độ và điều kiện hô hấp thích hợp cho L.

sporogenes để thu được calci lactat với hiệu suất cao. ..................................... 18
2.3

Phương pháp nghiên cứu: .........................................................................18

2.3.1

Phương pháp nhân giống và nuôi cấy .................................................. 18

2.3.2

Phương pháp tách chiết calci lactat từ dịch lên men .......................... 18

2.3.3

Phương pháp định tính calci lactat: ..................................................... 19

2.3.4

Phương pháp Schoorl- Regenbogen định lượng đường ....................... 20

2.3.5

Phương pháp tính hiệu suất tiêu thụ đường tạo calci lactat ................ 20

2.3.6

Phương pháp tính toán và xử lý số liệu: ............................................... 21

Chương 3.
3.1

THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................ 22

Lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp cho L. sporognens để thu

được calci lactat với hiệu suất cao: ....................................................................22
3.1.1

Khảo sát và lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp cho L. sporognens

để thu được calci lactat với hiệu suất cao .......................................................... 22
3.1.2
3.2

Định tính sản phẩm calci lactat thu được thu được ............................. 24

Khảo sát và lựa chọn nhiệt độ và điều kiện hô hấp thích hợp cho

Lactobacillus sporogenes để thu được calci lactat với hiệu suất cao. ..............27
3.2.1

Khảo sát các điều kiện hô hấp khi nuôi cấy L. sporogenes tại 37oC để

thu được calci lactat với hiệu suất cao .............................................................. 27


3.2.2

Khảo sát các điều kiện hô hấp khi nuôi cấy L. sporogenes tại 50oC để

thu được calci lactat với hiệu suất cao ............................................................. 30
3.3

Bàn luận chung: .........................................................................................33

3.3.1

Lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp cho L. sporognens để thu

được calci lactat với hiệu suất cao..................................................................... 33
3.3.2

Khảo sát và lựa chọn nhiệt độ và điều kiện hô hấp thích hợp cho

Lactobacillus sporogenes để thu được calci lactat với hiệu suất cao. ............... 36
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .................................................................................... 39

TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
B. coagulans

Bacillus coagulans

FDA

Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ
(Food and Drug Administration)

Glc

Glucose

L. acidophilus

Lactobacillus acidophilus

L. sporogenes

Lactobacillus sporogenes

MRS

Môi trường quy ước được dùng để nuôi cấy các vi
sinh vật sinh acid lactic (de Man, Rogosa, Sharpe)

Vd

Vừa đủ

VK

Vi khuẩn

𝑥̅

Giá trị trung bình



Độ lệch chuẩn


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. So sánh các đặc tính cơ bản của Lactobacillus sporogenes với các chi
Bacillus và Lactobacillus .........................................................................................11
Bảng 2.1. Các hoá chất sử dụng trong đề tài ............................................................15
Bảng 2.2. Các môi trường sử dụng trong đề tài ........................................................16
Bảng 2.3. Bảng các thiết bị sử dụng..........................................................................17
Bảng 3.1. Lượng glucose mà L. sporogenes tiêu thụ ở hai môi trường nuôi cấy: MRS
và MT. .......................................................................................................................23
Bảng 3.2. Kết quả phân tích phổ hồng ngoại của sản phẩm. ....................................25
Bảng 3.3. Lượng glucose mà L. sporogenes tiêu thụ ở hai điều kiện hô hấp: kị khí và
hiếu khí tại nhiệt độ 37oC. .........................................................................................28
Bảng 3.4 Hiệu suất tạo calci lactat ở hai điều kiện hô hấp: kị khí và hiếu khí tại nhiệt
độ 37oC. .....................................................................................................................29
Bảng 3.5. Lượng glucose mà L. sporogenes tiêu thụ ở hai điều kiện hô hấp: kị khí và
hiếu khí tại 50oC. .......................................................................................................31
Bảng 3.6. Hiệu suất tạo calci lactat ở hai điều kiện hô hấp: kị khí và hiếu khí tại 50oC.
...................................................................................................................................32


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Các phương pháp sản xuất acid lactic .........................................................6
Hình 1.2. Quá trình lên men lactic đồng hình (homolactic) và dị hình (heterolactic).
.....................................................................................................................................8
Hình 1.3. Hình ảnh nhuộm Gram tế bào vi khuẩn Lactobacillus sporogenes ..........10
Hình 3.1. So sánh lượng glucose mà L. sporogenes tiêu thụ ở hai môi trường nuôi
cấy: MRS và MT ở điều kiện kị khí tại 37oC. ...........................................................23
Hình 3.2. Phổ IR của calci lactat ...............................................................................25

Hình 3.3. Tinh thể calci lactat khan dưới kính hiển vi quang học. ...........................26
Hình 3.4. So sánh lượng glucose mà L. sporogenes tiêu thụ ở hai điều kiện hô hấp: kị
khí và hiếu khí tại 37oC. ............................................................................................28
Hình 3.5. So sánh lượng glucose mà L. sporogenes tiêu thụ ở hai điều kiện hô hấp: kị
khí và hiếu khí tại 50oC. ............................................................................................31
Hình 3.6. So sánh hiệu suất tạo calci lactat của L. sporogenes ở hai điều kiện hô hấp:
kị khí và hiếu khí tại 50oC. ........................................................................................32
Hình 3.7. Ảnh SEM của tinh thể calci lactat khan trong nghiên cứu của Sun Hee
Cheong ......................................................................................................................36


ĐẶT VẤN ĐỀ
Các sản phẩm lên men của vi sinh vật đã, đang và ngày càng được ứng dụng phổ
biến trong mọi lĩnh vực của đời sống. Trong số các sản phẩm của công nghệ lên men,
acid lactic và muối lactat là những sản phẩm có lịch sử lâu đời và được ứng dụng rất
rộng rãi [1]. Phương pháp tổng hợp hóa học acid lactic thường tạo ra dạng racemic.
Trong khi đó phương pháp vi sinh có thể tạo ra dạng acid L(+) lactic với hiệu suất
cao và thân thiện với môi trường [23].
Lactobacillus sporogenes là một chủng vi khuẩn sinh acid lactic có nhiều đặc tính
nổi trội: có khả năng phát triển ở các điều kiện nhiệt độ và pH khắc nghiệt mà các
loại vi khuẩn sinh acid lactic phổ biến khác không thể phát triển được, khả năng sản
xuất acid lactic tinh khiết quang học cao cũng như sản xuất sinh khối vi sinh vật
không chỉ từ nguồn carbon là glucose mà còn từ cellulose và xylose (những nguồn
carbon rẻ tiền hơn)… [24], [43].
Trên thế giới, Lactobacillus sporogenes đang ngày càng phổ biến như là dòng vi
khuẩn mới sản sinh acid lactic phù hợp với sản xuất acid lactic công nghiệp [48]. Tuy
nhiên ở Việt Nam, những nghiên cứu về vi khuẩn này chưa nhiều cũng như chưa có
nghiên cứu nào về khả năng sinh acid lactic của nó. Xuất phát từ lý do đó, đề tài
“Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và điều kiện hô hấp đến khả năng sinh acid lactic
của Lactobacillus sporogenes” được tiến hành với những mục tiêu sau:

-

Lựa chọn môi trường thích hợp nuôi cấy Lactobacillus sporogenes để sinh
acid lactic với hiệu suất cao.

-

Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và điều kiện hô hấp đến khả năng sinh acid
lactic của Lactobacillus sporogenes.

1


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1

Acid lactic

1.1.1 Định nghĩa
Acid lactic là hợp chất hữu cơ thu được nhờ các phương pháp khác nhau: phương
pháp tổng hợp hóa học và phương pháp lên men vi sinh vật.
1.1.2 Đặc điểm
 Công thức tổng quát: C3H6O3 [46].
 Tên khoa học: acid 2-hydroxypropanonic.
 Thành phần : C 40,00 %; H 6,71% ; O 53,28%.
 Khối lượng phân tử: 90,08 g/mol.
 Công thức cấu tạo:

 Các dạng của acid lactic:
Acid lactic có một nguyên tử carbon bất đối nên nó có hai đồng phân quang

học: acid L(+)- lactic và acid D(-)- lactic.

Acid D(-) lactic

Acid L(+) lactic

Hai đồng phân quang học này có tính chất lý hóa giống nhau, nhưng khác nhau là
khả năng làm quay mặt phẳng phân cực của ánh sáng. Do đó tính chất sinh học của
chúng hoàn toàn khác nhau. Hai đồng phân quang học này đều có thể được tổng hợp

2


bởi các vi khuẩn sinh acid lactic. Ở người, cả hai dạng đồng phân này đều được hấp
thu qua đường ruột. Đồng phân L(+) được hấp thu hoàn toàn và nhanh chóng chuyển
hoá thành glycogen. Đồng phân D(-) hấp thu và chuyển hoá không hoàn toàn, phần
acid không được chuyển hoá sẽ được thải trừ qua nước tiểu. Sự xuất hiện của acid
lactic không được chuyển hoá có thể gây nên tình trạng nhiễm toan chuyển hoá cho
cơ thể [17], [47]. Các acid lactic có tính quang hoạt khi bị ánh sáng phân cực đi qua,
các dạng phân cực có thể chuyển thành dạng acid racemic dưới tác dụng của ezym
racemase từ một vài loài vi khuẩn lactic. Nếu acid D(-) lactic và acid L(+) lactic có
trong một hỗn hợp theo tỉ lệ 50: 50 người ta gọi là hỗn hợp racemic. Hỗn hợp này kí
hiệu là DL- lactic acid [46].
 Tính chất vật lý của acid lactic:
Ở dạng dung dịch, acid lactic là chất lỏng trong suốt, không màu, không mùi, vị
đặc trưng, tan tốt trong nước, không bay hơi. Ở dạng tinh thể, dễ tan ở áp suất khí
quyển tạo chất lỏng. Khi ở pha lỏng, acid lactic dễ chuyển sang dạng dime mạch
thẳng lactoyl lactat và polymer mạch thẳng cao hơn, khi đó nhóm hydroxyl của phân
tử này liên kết ester với nhóm carbonyl của phân tử khác. Dạng dimer mạch vòng
lactat cũng có thể được hình thành nếu được đun nóng kéo dài [1]. Acid lactic là một

chất có độ hút ẩm cao, là chất lỏng sánh đặc, có sẵn trên thị trường ở những dạng
khác nhau về chất lượng và phụ thuộc vào độ tinh sạch có nhiều tiêu chuẩn khác nhau
như: acid lactic kỹ thuật, thực phẩm, dược phẩm và acid lactic plastic. Ở dạng đồng
phân acid D(-) lactic hoặc acid L(+)- lactic lần lượt có nhiệt độ nóng chảy và nhiệt
độ sôi là 530C và 1220C [6], [46]. Một trong những tiêu chuẩn chất lượng quan trọng
của acid lactic tinh sạch cao là sự bền nhiệt, ví dụ: khi đung nóng dung dịch chứa
80% acid lactic đến 1800C, ta thu được dung dịch không màu [1].
1.1.3 Công dụng:
Acid lactic được sử dụng trong nhiều lĩnh vực.
 Trong y học:
Acid lactic và dẫn chất của nó có nhiều ứng dụng quan trọng. Acid lactic làm hạ
pH đường ruột còn khoảng 5, do đó, sự phát triển của các vi sinh vật gây thối và

3


E.coli (thích nghi ở pH 6- 7 bị ức chế), làm giảm sự hình thành carcinogen ở ruột già,
phục hồi sự cân bằng và củng cố hệ vi sinh vật đường ruột đã có [27]. Purasorb là
một hợp chất cao phân tử được sản xuất từ acid lactic, nó được sử dụng trong phẫu
thuật chỉnh hình như là đinh ghim, gắn phần xương lại với nhau, khi xương định hình,
purasorb sẽ tự tiêu huỷ [7]. Người ta thường bổ sung calci lactat vào thành phần sữa
bột dinh dưỡng, bánh ngọt, bánh nướng để tăng lượng calci của cơ thể [7]. Ester
lactate được sử dụng rộng rãi vì đặc tính hút ẩm và nhũ tương hóa của nó. Trong
ngành công nghiệp dược phẩm, nó được sử dụng như một chất bổ sung trong quá
trình tổng hợp các loại thuốc ngoài da và chống loãng xương [39].
 Trong bảo quản và chế biến thực phẩm:
Một lượng lớn acid lactic được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm với vai trò:
là gia vị đối với các loại đồ uống nhẹ, dịch quả, mứt siro, dùng để acid hoá rượu vang
và hoa quả nghèo acid, sản xuất bột chua trong sản xuất bánh mì, trong quá trình muối
chua rau, quả, trong sản xuất các loại sữa chua đều có sử dụng quá trình lên men

lactic… [7], [16], [28].
Acid lactic được ưa thích trong công nghiệp thực phẩm bởi vì nó có nhiều đặc tính
có lợi như: vị chua dễ chịu, có đặc tính bảo quản và về mặt sinh lý học, acid lactic có
những ưu điểm sau [18]:
 Tăng cường khả năng tiêu hoá protein sữa thông qua sự đông vón.
 Tăng cường hoạt tính Ca, P, Fe.
 Tăng cử động đẩy nhanh thức ăn xuống dạ dày.
 Là nguồn năng lượng cho quá trình hô hấp.
 Trong mỹ phẩm:
Các loại lactat kim loại (như natri lactat) được sử dụng trong thành phần một số
sản phẩm chăm sóc da có tác dụng chống lại các vi sinh vật trên bề mặt da, làm dịu
da, làm ẩm và làm sáng da [7], [42].
 Ứng dụng khác:

4


Bên cạnh sử dụng acid lactic như một chất phụ gia trong dược phẩm, thực phẩm,
mỹ phẩm và hoá công nghiệp, việc sử dụng acid lactic để sản xuất chất dẻo sinh học
sẽ ngày càng tăng và vượt xa các ứng dụng khác [39].
1.2 Các phương pháp sản xuất acid lactic:
Acid lactic có thể được sản xuất bằng cả phương pháp tổng hợp hóa học hoặc
phương pháp vi sinh vật, nhưng phương pháp vi sinh vật đang được quan tâm nhiều
hơn trong giai đoạn gần đây vì vấn đề môi trường và hạn chế của việc sử dụng nguyên
liệu hoá thạch không tái chế được [50]. Vào đầu những năm 1960, một phương pháp
tổng hợp hóa học acid lactic đã được phát triển do nhu cầu cao trong công nghiệp làm
bánh. Acid lactic có hai đồng phân quan học là acid D(-) lactic và acid L(+)- lactic.
Acid lactic được phân loại là an toàn cho việc sử dụng làm phụ gia thực phẩm bởi
FDA, tuy nhiên acid D(-)- lactic có thể gây hại đến sự trao đổi chất của con người và
là nguyên nhân dẫn đến nhiễm toan chuyển hóa, quá trình mất calci. Mặc dù DLlactic acid luôn được sản xuất bởi phương pháp hóa học từ nguồn nguyên liệu hóa

dầu, một đồng phân quang học tinh khiết acid D(-)- lactic hoặc acid L(+)- lactic có
thể thu được bằng phương pháp lên men vi sinh vật sử dụng các nguồn tài nguyên tái
tạo bằng cách nuôi cấy vi sinh vật. Độ tinh khiết quang học của acid lactic là cực kỳ
quan trọng đối với tính chất của poly lactic acid (PLA) nhằm phù hợp với nhu cầu
thương mại. Do đó, công nghệ sản xuất sinh học của acid lactic đã nhận được sự quan
tâm lớn vì nó thay thế cho ngành công nghiệp hóa dầu: gây ra tình trạng ô nhiễm môi
trường với nguồn cung hạn chế của các tài nguyên hóa dầu [10].

5


Hình 1.1. Các phương pháp sản xuất acid lactic [50].
1.2.1 Phương pháp tổng hợp hóa học:
Phương pháp hóa học cho hỗn hợp racemic: Từ acetaldehyd, chuyển thành dạng
lactonitrile, loại tạp và trở lại acid lactic.
 Cộng hợp hydrogen cyanide:
CH3CHO
Acetaldehyd

+

HCN

CH3CHOHCN

Hydrogen cyanide

Lactonitrite

 Thủy phân lactonitril bằng acid sulfuric:

2CH3CHOHCN + 4H2O + H2SO4

2CH3CHOHCOOH + (NH4)2SO4

Lactonitril

Acid lactic

Tuy nhiên, phương pháp này cũng có một số nhược điểm như thường tạo ra dạng
racemic DL- acid lactic và acid D(-)- lactic. Đây là các dạng gây hại với sức khoẻ con
người nên ít dùng [25], [49].
1.2.2 Phương pháp vi sinh vật:
Cơ sở của phương pháp vi sinh vật là tiến hành lên men trong điều kiện kị khí
hoặc vi hiếu khí với các chủng vi sinh vật sinh acid lactic. Acid lactic được tạo thành
6


từ sự chuyển hóa mono hoặc disaccharide bước đầu đi theo con đường EmbdenMayerhoff- Parnas (hình 1.2). Sau đó, ở điều kiện kị khí, acid pyruvic sinh ra sẽ được
khử hóa thành acid lactic dưới tác dụng của enzym lactat dehyrogenase. Lactat
dehydrogenase (LDH) của các vi khuẩn lactic đóng vai trò quan trọng trong việc tạo
thành acid L(+)- hay D(-)- lactic do khả năng lập thể hóa của sản phẩm (do gen ldhD
hay ldhL quy định), tùy theo chủng vi khuẩn lactic có loại gen nào thì sẽ cho sản
phẩm tương ứng. Gen mã hóa enzym L(+)- lactat hydrogeunase được nghiên cứu trên
Lactobacilus plantarum. Gen mã hóa D(-)- lactat hydrogenase được nghiên cứu trên
Lactobacillus Johnsonii. Cả hai dạng lên men tạo acid lactic từ hydratcarbon là đồng
hình hay dị hình. Lên men lactic đồng hình khi lượng acid lactic chiếm đại đa số do
vi khuẩn lactic loại này có enzym aldolase nhưng không có enzym phosphoketolase.
Lên men dị hình khi lượng acid lactic chiếm tỷ lệ thấp, đi kèm với hỗn hợp các chất
khác như acid acetic, acid formic hoặc CO2, do vi khuẩn lactic không có enzym
aldolase nhưng có enzym phosphoketolase (hình 1.2) [10].

7


Hình 1.2. Quá trình lên men lactic đồng hình (homolactic) và dị hình
(heterolactic).
1.3 Vi khuẩn sinh acid lactic:
1.3.1 Đặc điểm của nhóm vi khuẩn sinh lactic:
Vi khuẩn sinh acid lactic là một nhóm VK thu nhận năng lượng nhờ phân giải
hydrat carbon và sinh acid lactic. Chúng được xếp chung vào họ Lactobacteriaceae.
Mặc dù nhóm VK này không đồng nhất về mặt hình thái (gồm cả dạng que ngắn, que
dài và cả vi khuẩn hình cầu), song về mặt sinh lý chúng lại tương đối đồng nhất với

8


các đặc điểm sau: đều là VK Gr dương, chịu được acid, không tạo bào tử, hầu hết
không di động và là vi sinh vật kị khí hoặc vi hiếu khí [3], [10], [34].
Những VK sinh lactic được sử dụng nhiều trong các ngành công nghiệp thuộc về
các chi như Lactobacillus, Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus. Trong đó
Lactobacillus chiếm vị trí quan trọng nhất [4], [51]
1.3.2 Chi Lactobacillus
Là chi lớn nhất trong các VK sinh acid lactic với nhiều chủng đã được nghiên cứu
và ứng dụng trong sản xuất. Chi Lactobacillus được phát hiện với hơn 125 loài, dưạ
vào sự chuyển hóa glucid trong tế bào và sản phẩm tạo ra trong quá trình lên men,
chia thành 3 nhóm chính [3]:
 Nhóm 1: VK lên men đồng hình, sản phẩm cuối cùng của quá trình lên men
chủ yếu là acid lactic (90-98%), các sản phẩm khác chỉ tồn tại ở dạng nhỏ. Đại
diện: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus
delbrueckii...

 Nhóm 2: Nhóm VK lên men dị hình không bắt buộc, sản phẩm của quá trình
lên men có thể là acid lactic, acid acetic, acid formic, ethanol tùy loại đường
trong môi trường. Đại diện: Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei,
Lactobacillus leichmeii,...
 Nhóm 3: Nhóm VK lên men dị hình bắt buộc, sản phẩm cuối cùng là acid
lactic, acid acetic, carbonic, ethanol. Đại diện: Lactobacillus brevis,
Lactobacillus fermentum, Lactobacillus buchmeri,...
1.3.3 Loài Lactobacillus sporogenes:
Lactobacillus sprogenes được biết đến lần đầu tiên dưới tên gọi Bacillus coagulans
do một đợt bùng phát của một sản phẩm đặc biệt từ sữa bị đông vón hàng loạt [26].
Năm 1932, VK này lại được Horowitz và Wlasowa phân lập và đặt tên là
Lactobacillus sporogenes [37]. Đến năm 1957, VK này được phân loại theo Bergey’s
Manual of Determinative Bacteriology dựa trên các đặc tính sinh hoá và danh pháp
chính xác hiện tại là Bacillus coagulans [20]. Do VK này có đặc điểm của cả hai chi
Lactobacillus và Bacillus, nên vị trí phân loại của nó giữa hai họ Lactobacillaceae và

9


Bacillaceae vẫn còn nhiều tranh cãi [22]. Ngày nay, VK này được biết đên với cả hai
tên gọi, nhưng tên gọi Lactobacillus sporogenes vẫn được sử dụng nhiều hơn trong
các chế phẩm thương mại xuất hiện trên thị trường. Do nguồn gốc của giống vi sinh
vật trong khoá luận, tên gọi Lactobacillus sporogenes sẽ được sử dụng.
L. sporogenes tồn tại trong tự nhiên ở hai dạng: tế bào sinh dưỡng và bào tử. Trong
phạm vi đề tài, dạng tế bào sinh dưỡng của L. sporogenes là dạng được nghiên cứu
và bàn luận.
 Đặc điểm hình thái:
L. sprorogenes là trực khuẩn Gram dương, hình que, có khả năng di động, có khả
năng sinh bào tử [22], [31].
Tế bào L. sporogenes có xu hướng mọc đơn hoặc hiếm khi ở dạng chuỗi ngắn [22],

[26].

Hình 1.3. Hình ảnh nhuộm Gram tế bào vi khuẩn Lactobacillus sporogenes
 Điều kiện nuôi cấy:
L. sporogenes là VK kỵ khí tuỳ nghi [44], có phát triển trong một phạm vi rộng
của nhiệt độ (30- 57o) và pH (4- 10,5) [21], phát triển tối ưu ở nhiệt độ từ 30- 50oC
và pH khoảng 5,5- 6,5 [15], [40].
Về dinh dưỡng, VK này có khả năng sử dụng nhiều nguồn carbon khác nhau như:
glucose, lactose, maltose, dextrose, fructose, galactose…[26], [43].
 Đặc điểm sinh lý, sinh hoá:
L. sporogenes cho phản ứng catalase dương tính [22], [26], có khả năng tổng hợp
acid L(+) lactic, không tổng hợp đồng phân D(-) [30], [43].

10


L. sporogenes có đặc tính chung của cả hai chi Lactobacillus và Bacillus.
Bảng 1.1. So sánh các đặc tính cơ bản của Lactobacillus sporogenes với các chi
Bacillus và Lactobacillus [22].
Đặc tính

L. sporogenes

Lactobacillus

Bacillus

Catalase

+

-

+

Oxidase

-

-

+

Nitrate

-

-

+

Sinh bào tử

+

-

+

Khả năng di động

+

+/-

+

Sinh acid lactic

+

+

-

Acid meso- diaminopimelic

+

+/-

+

1.3.4 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sự phát triển của vi khuẩn sinh acid
lactic : [3], [4], [51]
Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, vi sinh vật sử dụng dinh dưỡng từ môi
trường để tổng hợp các cơ chất cần thiết và chịu tác động từ các yếu tố bên ngoài.
Muốn nghiên cứu và ứng dụng vi sinh vật vào sản xuất cần hiểu được ảnh hưởng của
thành phần dinh dưỡng cũng như các yếu tố khác lên sự sinh trưởng và phát triển của
chúng. Trong phạm vi đề tài, ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng của môi trường

nuôi cấy khác nhau, nhiệt độ nuôi cấy và nồng độ oxy là những yếu tố được bàn luận.
 Thành phần dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy:
Vi sinh vật chủ yếu thu nhận chất dinh dưỡng từ môi trường bên ngoài để sử dụng
làm nguyên liệu cung cấp cho quá trình sinh trưởng tổng hợp tạo ra các thành phần
của tế bào hoặc cung cấp cho quá trình trao đổi năng lượng. Căn cứ vào chức năng
sinh lý khác nhau trong tế bào mà người ta thường chia các chất dinh dưỡng thành 5
nhóm lớn:
 Nguồn carbon: Nguồn carbon quan trọng nhất cho vi khuẩn sinh acid lactic
là monosaccharide và disaccharide. Các nguồn carbon này được dùng để
11


cung cấp năng lượng, xây dựng câu trúc tế bào và sinh ra các acid hữu cơ
như acid malic, acid pyruvic,...
 Nguồn nitơ: Nitơ ở dạng acid amin hoặc peptid là nguồn dinh dưỡng rất
quan trọng cho quá trình phát triển của VK sinh acid lactic.
 Các muối vô cơ: Để đảm bảo cho quá trình sinh trưởng và phát triển, VK
sinh acid lactic cần rất nhiều các hợp chất vô cơ. Đối với Lactobacillus thì
Mg2+, Mn2+, Fe2+ có tác động tích cực lên sự phát triển và sinh ra acid
lactic. Ngoài ra, Mg2+ còn là chất hoạt động trong quá trình lên men lactic
bằng cách giúp VK sử dụng tốt hơn các loại đường
 Các chất sinh trưởng: Đối với VK sinh acid lactic, các chất sinh trưởng
(các gốc kiềm purin, pirimidin và các dẫn xuất của chúng, các acid béo,
các thành phần của màng tế bào và các vitamin thông thường, ... ) có vai
trò quan trọng trong việc gia tăng sinh khối và sinh acid lactic.
 Nhiệt độ:
Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng và phát triển của VK sinh acid
lactic. Khoảng nhiệt độ phát triển của VK sinh acid lactic khá rộng. Một số loài có
thể phát triển ở 55°C, một số khác có thể phát triển ở 5°C. Nói chung đa số chúng có
thể phát triển trong khoảng nhiệt độ từ 15°C - 40°C. Nhiệt độ ảnh hưởng nhiều nhất

đến các phản ứng enzym. Trong một khoảng nhiệt độ nào đó thì tốc độ phản ứng
enzym tăng khi nhiệt độ tăng, nếu tiếp tục tăng nhiệt độ thì sẽ xảy ra sự biến tính
protein. Các loài có nhiệt độ phát triển tối ưu trong khoảng 40°C - 45°C được gọi là
VK ưa nhiệt (thermophile). Các loài có nhiệt độ phát triển tối ưu trong khoảng 20°C
- 40°C được gọi là loại ưa ấm (mesophile).
 Oxy:
Đa số VK sinh acid lactic là loài hô hấp tùy tiện, tuy nhiên, chúng vẫn có khả năng
oxy hóa rất nhiều chất nhờ sử dụng oxy phân tử. Người ta đã chứng minh được rằng
hệ enzym peroxydase có trong VK sinh acid lactic có thể thực hiện các chức năng
thay cho hệ enzym dehyrogenase, khi đó oxy được sử dụng như là chất nhận hydro.

12


Quá trình oxy hóa ở VK sinh acid lactic thường kèm theo việc tạo thành H2O2.
Phương trình tóm tắt:
Peroxydase
NAD+ + H2O + ½O2

+

NADH + H + H2O2

1.4 Các nghiên cứu về Lactobacillus sporogenes và khả năng sinh acid lactic
của vi khuẩn này:
 Ở Việt Nam:
Các nghiên cứu về L. sporogenes còn khá ít hoặc chưa được công bố nhiều.
Tại Đại học Dược Hà Nội có một số nghiên cứu về L. sporogenes: tác giả Tô Ngọc
Sắc với luận văn nghiên cứu về nuôi cấy L. spororgenes để tạo nguyên liệu probiotic
[9], tác giả Dương Thị Huyền Trang với khóa luận về khảo sát ảnh hưởng của nhiệt

độ và điều kiện hô hấp đến lượng sinh khối của L. sporogenes [12]… nhưng chưa có
nghiên cứu nào đánh giá về khả năng sinh acid L(+) lactic của VK này.
Ngoài ra, tại trường Đại học Nông lâm Thành phố Hồ Chí Minh, tác giả Trần Hạnh
Triết với nghiên cứu đặc điểm sinh trưởng và phát triển của VK L. sporogenes đã tìm
hiểu về đặc điểm hình thái vi/ đại thể và sinh hoá của VK, đồng thời khảo sát những
đặc tính khác [15].
 Trên thế giới:
Từ khi được phân lập lần đầu vào năm 1933 đến nay, L. sporogenes đã trải qua rất
nhiều nghiên cứu. Các chủng giống khác nhau của vi khuẩn này đã và đang được
nghiên cứu và ứng dụng rất nhiều trong các chế phẩm probiotics. Nghiên cứu của tác
giả J.R. Endres và cộng sự đã chứng minh được rằng một số chủng L. sporogenes có
thể sống sót trong điều kiện khắc nghiệt về nhiệt độ và pH ở dạ dày và acid mật mà
các loại probiotic thông dụng khác dễ bị tổn thương [24]. Những tác dụng có lợi của
nó cũng đã được đánh giá và khẳng định qua rất nhiều nghiên cứu: nó sản sinh ra acid
lactic tạo môi trường pH acid cho đường ruột và sản sinh coagulins từ đó có khả năng
ngăn ngừa được sự phát triển của các VK có hại, gây thối rữa [30]. Ngoài ra L.
sporogenes cũng có khả năng sản sinh các men tiêu hóa như amylase và protease, có

13


tác dụng tăng cường miễn dịch, phòng chống lây nhiễm virus [19], phòng ngừa và
phối hợp điều trị rối loạn tiêu hóa cấp và mãn tính ở trẻ em [38].
L. sporogenes không chỉ được nghiên cứu và ứng dụng trong các chế phẩm
probiotic, nó cũng đang nhận được sự quan tâm ngày càng tăng như là dòng vi khuẩn
sinh acid lactic mới tạo ra acid lactic phù hợp cho sản xuất công nghiệp acid lactic:
chỉ tạo dạng acid L(+) lactic và nồng độ acid lactic sản xuất được cuối cùng là cao
[48]. Cũng theo nghiên cứu của Rhee Mun Su và cộng sự, L. sporogenes là một loại
VK phổ biến trong đất, khả năng phát triển ở 50-55oC, pH 5,0 và sản xuất acid lactic
cũng như sinh khối vi sinh vật không chỉ từ đường glucose mà còn từ cellulose và

xylose khiến nó trở thành một vi sinh vật hấp dẫn để sản xuất acid lactic tinh khiết ở
quy mô công nghiệp [43].

14


CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Đối tượng nghiên cứu:
2.1.1 Nguyên vật liệu:
 Chủng giống Lactobacillus sporogenes do Bộ môn Công Nghiệp Dược trường
Đại học Dược Hà Nội cung cấp.
 Nguyên liệu sử dụng trong đề tài:
Bảng 2.1. Các hoá chất sử dụng trong đề tài:
Tên hóa chất

Nguồn gốc

Tên hóa chất

Nguồn gốc

Glucose

Trung Quốc

NaOH

Trung Quốc

Sữa bột

Việt Nam

NaK(C4H4O6)

Trung Quốc

Cao nấm men

Merck- Đức

H2SO4 98%

Trung Quốc

(NH4)2SO4

Trung Quốc

Na2S2O3

Trung Quốc

KH2PO4

Trung Quốc

Cao thịt

Merck- Đức

MnSO4.H2O

Trung Quốc

Pepton

Merck- Đức

FeSO4.7H2SO4

Trung Quốc

HCl

Trung Quốc

MgSO4.7H2O

Trung Quốc

CuSO4

Trung Quốc

CaCO3

Trung Quốc

KI

Trung Quốc

Nước cất

Việt Nam

Ca(OH)2

Trung Quốc

15


 Môi trường sử dụng trong đề tài:
Bảng 2.2. Các môi trường sử dụng trong đề tài:
Môi trường MRS lỏng
(nhân giống và nuôi cấy)
Khối lượng
Thành phần
(g/ 100 ml)
Glucose
2,0

Glucose

7,0

Pepton

1,0

Sữa bột

2,6

Cao thịt

0,5

Cao nấm men

1,3

Cao nấm men

0,4

(NH4)2SO4

0,2

(NH4)2SO4

0,2

KH2PO4

0,25

KH2PO4

0,25

MgSO4.7H2O

0,001

MnSO4.H2O

0,001

MnSO4.H2O

0,03

MgSO4.7H2O

0,03

FeSO4.7H2SO4

0,001

CaCO3

5

Nước máy

vd

Nước máy

Vd

Môi trường MT
Khối lượng
(g/ 100 ml)

Thành phần

 Các dung dịch sử dụng được pha theo hướng dẫn của DĐVN IV [2]:
 Dung dịch Fehling A: Cân chính xác 34,66 g CuSO4.5H2O hoà tan trong
nước đã acid hoá bằng 2- 3 giọt H2SO4 loãng. Thêm nước vừa đủ 500 ml.
 Dung dịch Fehling B: Cân 173 g muối kép Natri Kali tactrat NaK(C4H4O6)
và 50 g NaOH, hoà tan trong 300 ml H2O, để nguội, thêm H2O vừa đủ 500
ml.
 Dung dịch H2SO4 25 %: Cho từ từ 143 ml acid sulfuric 98 % vào 500 ml
nước, lắc liên tục. Làm nguội, thêm nước vừa đủ 1000 ml.
 Dung dịch Na2S2O3 0.1 N: Cân chính xác 25,0 g Na2S2O3 và 0,2 g Na2CO3,
hoà tan trong nước không chứa CO2 vừa đủ 1000 ml.
 Dung dịch HCl 3 N: Pha loãng 25,5 ml acid clohydric với nước cất vừa
đủ 100 ml.

16