Nghiên cứu chiết tách, xác định cấu trúc và hàm lượng của scopolamine từ cây đại cà dược (Brugmansia suaveolens) (LV thạc sĩ)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

HOÀNG PHÚ LÂM

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC
VÀ HÀM LƯỢNG CỦA SCOPOLAMINE
TỪ CÂY ĐẠI CÀ DƯỢC (BRUGMANSIA SUAVEOLENS)

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

THÁI NGUYÊN - 2017


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

HOÀNG PHÚ LÂM

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC
VÀ HÀM LƯỢNG CỦA SCOPOLAMINE
TỪ CÂY ĐẠI CÀ DƯỢC (BRUGMANSIA SUAVEOLENS)
Chuyên ngành: Hóa phân tích
Mã số: 60.44.01.18

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Thị Mai

THÁI NGUYÊN - 2017

LỜI CẢM ƠN
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn TS.
Nguyễn Thị Mai đã giao đề tài và tận tình hướng dẫn em trong suốt thời gian
thực hiện đề tài.
Em xin chân thành cảm ơn các cán bộ phòng Nghiên cứu cấu trúc,Viện
Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ
em rất nhiều trong quá trình thực nghiệm và hoàn thành luận văn.
Tôi xin cảm ơn các thầy cô khoa Hóa Học - Trường Đại Học Khoa Học
Thái Nguyên đã trang bị cho em kiến thức để tiếp cận với các vấn đề nghiên
cứu khoa học và các anh chị, các bạn học viên lớp K9B- lớp Cao học Hóa đã
trao đổi và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình tôi, bạn bè và
đồng nghiệp của tôi - những người đã luôn bên cạnh động viên và giúp đỡ tôi
trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn này.
Thái Nguyên, tháng 5 năm 2017
Tác giả luận văn

Hoàng Phú Lâm

a


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................a
MỤC LỤC ......................................................................................................... b
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ............................................................... d
DANH MỤC BẢNG ..........................................................................................e
DANH MỤC HÌNH ........................................................................................... f
DANH MỤC PHỤ LỤC PHỔ .......................................................................... g

MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
Chương 1: TỔNG QUAN ............................................................................... 3
1.1. Giới thiệu chi Brugmansia ......................................................................... 3
1.2. Nghiên cứu hóa học chi Brugmansia ......................................................... 3
1.3. Giới thiệu cây đại cà dược (Brugmansia suaveolens)................................ 5
1.3.1. Đặc điểm thực vật ................................................................................... 5
1.3.2. Công dụng theo kinh nghiệm dân gian ................................................... 5
1.4. Tổng quan về các phương pháp chiết mẫu thực vật................................... 6
1.4.1. Chọn dung môi chiết ............................................................................... 6
1.4.2. Quá trình chiết ......................................................................................... 8
1.5. Các phương pháp sắc ký trong phân lập các hợp chất hữu cơ ................. 10
1.5.1. Đặc điểm chung của phương pháp sắc ký ............................................. 10
1.5.2. Cơ sở của phương pháp sắc ký ............................................................. 10
1.5.3. Phân loại phương pháp sắc ký .............................................................. 11
1.6. Một số phương pháp hóa lý xác định cấu trúc của các hợp chất
hữu cơ.............................................................................................................. 15
1.6.1. Phổ khối lượng (Mass spectroscopy, MS) ............................................ 15
1.6.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance
Spectroscopy NMR) ........................................................................................ 16
Chương 2: THỰC NGHIỆM........................................................................ 18
2.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................... 18

b


2.2. Các phương pháp nghiên cứu................................................................... 18
2.2.1. Phương pháp xử lý và chiết mẫu ........................................................... 18
2.2.2. Phương pháp phân lập các chất ............................................................. 18
2.2.3. Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được ................ 19
2.3. Thực nghiệm ............................................................................................ 19

2.3.1. Xử lý mẫu dược liệu, chiết tách và phân lập các hợp chất ................... 19
2.3.2. Hằng số vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất .................................... 21
2.3.3. Phương pháp xác định hàm lượng của hợp chất phân lập được .......... 22
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 24
3.1. Xác định cấu trúc các hợp chất bằng các phương pháp phổ .................... 24
3.1.1. Hợp chất BS1 (Scopolamine)................................................................ 24
3.1.2. Xác định cấu trúc hợp chất BS2 ............................................................ 28
3.1.3. Xác định cấu trúc các hợp chất BS3 ..................................................... 34
3.2. Xác định hàm lượng chất BS1 (CBS1) có trong mẫu khô ....................... 38
KẾT LUẬN .................................................................................................... 43
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 44

c


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
CC

Column Chromatography

Sắc ký cột

TLC

Thin Layer Chromatography

Sắc ký lớp mỏng

Me
MS

1

H-NMR

13

C-NMR

Nhóm metyl
Phổ khối lượng

Mass Spectroscopy
Proton Magnenic Rosonance
Spectrocopy

Carbon-13 Nuclear Magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon
Resonance Spectroscopy

13

δ
DEPT

ESI-MS

HMBC

HSQC

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

Chuyể n dich
̣ hóa ho ̣c
Distortionless Enhancement by
Polarisation Transfer
Electronspray Ionization Mas
Spectrum

Phổ DEPT
Phổ khối ion hóa phun mù điện tử

Heteronuclear Multiple Bond Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều
liên kết

Connectivity

Heteronuclear Single-Quantum Phổ tương tác dị hạt nhân qua 1 liên
kết

Connectivity

Glc

Glucoside

Rh

Rhamnozơ

LC50

Inhibitory concentration 50%

HPLC

High
Performance
Chromatography

Nồng độ ức chế tối thiểu 50%

Liquid Sắc ký lỏng hiệu năng cao

d


DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1. Dữ kiện phổ NMR của hợp chất BS1 và chất tham khảo .............. 26
Bảng 3.2. Dữ kiện phổ NMR của hợp chất BS2 và các chất tham khảo ........ 32
Bảng 3.3. Dữ kiện phổ NMR của hợp chất BS3 và chất tham khảo .............. 37
Bảng 3.4. Cấu trúc của các hợp chất được phân lập từ loài cà độc dược ....... 38
Bảng 3.5. Kết quả đo phổ HPLC của mẫu BS1 .............................................. 40
Bảng 3.6. Kết quả phân tích phương sai ......................................................... 40
Bảng 3.7. Kết quả mẫu nghiên cứu ................................................................. 42

e


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Hình ảnh cây đại cà dược (Brugmansia suaveolens) ........................ 5

Hình 2.1. Sơ đồ phân lập các chất từ loài Brumansia suaveolens .................. 20
Hình 3.1. Phổ MS của hợp chất BS1 .............................................................. 24
Hình 3.2. Phổ 1H -NMR của hợp chất BS1..................................................... 25
Hình 3.3. Phổ 13C -NMR của hợp chất BS1 ................................................... 26
Hình 3.4. Phổ HMBC của hợp chất BS1 ........................................................ 27
Hình 3.5. Một số tương tác chính HMBC của hợp chất BS1 ......................... 27
Hình 3.6. Cấu trúc hóa học của hợp chất BS1 (Scopolamine) ....................... 28
Hình 3.7. Phổ 1H -NMR của hợp chất BS2..................................................... 29
Hình 3.8. Phổ 13C -NMR của hợp chất BS2 ................................................... 30
Hình 3.9. Phổ DEPT của hợp chất BS2 .......................................................... 30
Hình 3.10. Phổ HMBC của hợp chất BS2 ...................................................... 31
Hình 3.11. Một số tương tác chính HMBC của hợp chất BS2 ....................... 31
Hình 3.12. Phổ khối của hợp chất BS2 ........................................................... 33
Hình 3.13. Cấu trúc hóa học của hợp chất BS2 .............................................. 33
Hình 3.14. Phổ 1H -NMR của hợp chất BS3................................................... 34
Hình 3.15. Phổ 13C -NMR của hợp chất BS3 ................................................ 35
Hình 3.16. Phổ DEPT của hợp chất BS3 ........................................................ 35
Hình 3.17. Phổ HMBC của hợp chất BS3 ...................................................... 36
Hình 3.18. Một số tương tác chính HBMC của hợp chất BS3 ....................... 36
Hình 3.19. Cấu trúc hóa học của hợp chất BS3 .............................................. 38
Hình 3.20. Sắc ký đồ của chất BS1 ở nồng độ 0,19 mg/mL ........................... 38
Hình 3.21. Sắc ký đồ của chất BS1 ở nồng độ 0,475 mg/mL ......................... 39
Hình 3.22. Sắc ký đồ của chất BS3 ở nồng độ 0,95 mg/mL ........................... 39
Hình 3.23. Đường chuẩn của hợp chất BS1 .................................................... 41
Hình 3.24. Sắc ký đồ của chất BS1 trong cặn chiết ........................................ 41

f


DANH MỤC PHỤ LỤC PHỔ

Hình 3.1. Phổ MS của hợp chất BS1 ................................................................ 1
Hình 3.2. Phổ 1H -NMR của hợp chất BS1....................................................... 2
Hình 3.3. Phổ 13C -NMR của hợp chất BS1 ..................................................... 3
Hình 3.4. Phổ HMBC của hợp chất BS1 .......................................................... 4
Hình 3.5. Phổ 1H -NMR của hợp chất BS2....................................................... 5
Hình 3.6. Phổ 13C -NMR của hợp chất BS2 ..................................................... 6
Hình 3.7. Phổ DEPT của hợp chất BS2 ............................................................ 7
Hình 3.8. Phổ HMBC của hợp chất BS2 .......................................................... 8
Hình 3.9. Phổ khối của hợp chất BS2 ............................................................... 9
Hình 3.10. Phổ 1H -NMR của hợp chất BS3................................................... 10
Hình 3.11. Phổ 13C -NMR của hợp chất BS3 ................................................ 11
Hình 3.12. Phổ DEPT của hợp chất BS3 ........................................................ 12
Hình 3.13. Phổ HMBC của hợp chất BS3 ...................................................... 13
Hình 3.14. Sắc ký đồ của chất BS1 ở nồng độ 0,19 mg/mL ........................... 14
Hình 3.15. Sắc ký đồ của chất BS1 ở nồng độ 0,475 mg/mL ......................... 15
Hình 3.16. Sắc ký đồ của chất BS1 trong cặn chiết ........................................ 16

g


MỞ ĐẦU
Việt Nam nằm trong khu vực khí hậu nhiệt đới gió mùa, nên thảm thực
vật phát triển rất đa dạng và phong phú; có khoảng 11000 đến 12000 loài thực
vật bậc cao, trong đó, gần 4000 loài được nhân dân ta dùng làm thuốc. Ngoài
sự phong phú về chủng loại, nguồn dược liệu Việt Nam còn có giá trị ở chỗ
chúng được sử dụng rộng rãi trong nhân dân để phòng và chữa nhiều bệnh
khác nhau. Các cây thuốc được sử dụng dưới hình thức một vị hay phối hợp
với nhau tạo nên các bài thuốc dân gian, cổ truyền được tồn tại và lưu truyền
đến ngày nay. Đây là nguồn tài nguyên vô cùng quý giá, từ xa xưa, nó đã
được con người biết đến, khai thác và sử dụng vào phục vụ đời sống, sức

khỏe của mình. Có được đặc tính dược liệu quý giá là do cây thuốc có các hợp
chất thiên nhiên mang hoạt tính sinh học. Các hợp chất thiên nhiên thường ít
độc hơn so với hợp chất tổng hợp, được dùng làm chất kích thích, điều hòa
sinh trưởng, làm nguyên liệu cho các ngành công nghiệp v.v...; đặc biệt,
chúng được dùng làm nguyên liệu cho ngành công nghiệp mỹ phẩm, thực
phẩm và làm thuốc phòng, chữa bệnh cho con người.
Ngày nay, do biến đổi khí hậu, loài người đang phải đối mặt với hàng
loạt dịch, bệnh nguy hiểm và nan y. Mặt khác, mặc dù khoa học - công nghệ
phát triển mạnh mẽ và đạt được nhiều tiến bộ vượt bậc, mang tính đột phá,
đời sống của con người đã được cải thiện rõ rệt, nhưng do sự biến đổi của môi
trường, do áp lực của công việc, do thức ăn chúng ta sử dụng hàng ngày chưa
bảo đảm an toàn thực phẩm, cùng với sự biến thể của các loại vi khuẩn, vi rút
gây bệnh v.v… đã và đang đe dọa cuộc sống của chúng ta không ngừng.
Chính vì vậy, việc nghiên cứu tìm ra những loại thuốc tăng cường sức đề
kháng, phòng, chống và chữa bệnh là một vấn đề đã và đang được sự quan
tâm của các nhà khoa học cũng như của toàn xã hội.
Chi Brugmansia là chi trong họ Cà (Solananceae), là một chi khá lớn,
được phân bố ở nhiều quốc gia và có mặt ở hầu hết các tỉnh, thành trong cả

1


nước. Các bộ phận lá, rễ, vỏ thân, cành, quả của các loài trong chi Brugmansia là
các vị thuốc quí trong dân gian.
Cây đại cà dược (Brugmansia suaveolens) được trồng làm cảnh và sử
dụng làm dược liệu. Tuy nhiên, do có nhiều các hợp chất dạng tropane
alkaloid nên cây có độc tính hoặc gây dị ứng khi tiếp xúc hoặc sử dụng với
liều lượng cao.
Vì vậy chúng tôi lựa chọn loài Brugmansia suaveolens họ cà
(Solananceae) làm đối tượng nghiên cứu cho đề tài: “Nghiên cứu chiết tách,

xác định cấu trúc và hàm lượng của scopolamine từ cây đại cà dược
(Brugmansia suaveolens)”
Nhiệm vụ của đề tài là:
1. Xử lý mẫu và tạo dịch chiết.
2. Nghiên cứu phân lập thành phần hóa hoc.
3. Xác định cấu trúc hóa học của các chất phân lập được.
4. Định lượng scopolamine bằng HPLC.

2


Chương 1

TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu chi Brugmansia
Chi Brugmansia là chi trong họ Cà (Solananceae). Chi Brugmansia trên
thế giới có tám loài là B. arborea , B. aurea , B. candida , B. dolichocarpa, B.
insignis, B. sanguinea, B. versicolorand và B. vulcanicola. Ở Viê ̣t Nam, chi
này chỉ có một loài là B. suaveolens [1, 2].
1.2. Nghiên cứu hóa học chi Brugmansia
Tinh dầu lá và hoa loài B. candida được các tác giả Geoffrey C. Kite và
Christine Leon nghiên cứu. Kết quả cho thấy, các hợp chất benzaldehyde,
methyl

benzoate, phenylethyl alcohol, benzyl acetate, methyl salicylate,

benzyl benzoate, benzyl salicylate, α-thujene, α-pinene, β-pinene, limonene,
1,8-cineole, trans-ocimene, trans-sabinene hydrate, terpinolene, α-terpineol,
β-elemene, β-cedrene, [z]-α-trans-bergamotene, α-farnesene, trans-nerolidol,
cis,trans-farnesol, trans,trans-farnesol, trans,cis-farnesol, indole được tìm thấy

trong tinh dầu hoa; các hợp chất ethyl benzoate, methyl salicylate, α-pinene,
trans-ocimene, perillene, α-elemene, [z]-α-trans-bergamotene, α-santalene, βcaryophyllene, [z]-α-cis-bergamotene, α-guaiene, cis,β-farnesol, γ-gurjunene,
β-selinene, β-bisabolene, β-sesquiphellandrene, trans-nerolidol, dendrolasin
và santalol acetat được tìm thấy trong tinh dầu lá [3].
Từ tinh dầu hoa loài B. suaveolens các hợp chất heptanal, octanal, 1,8cineole, (E)-β-ocimene, γ-terpinene, linalool,
terpinen-4-ol,

nonanal, phenethyl alcohol,

2-isobutyl-3-methoxypyrazine, α-terpineol,

theaspirane A,

theaspirane B, megastigmatrienone I, (E)-nerolidol, megastigmatrienone II,
megastigmatrienone III, megastigmatrienone IV, pentacosane, heptacosane,
nonacosane và hentriacontane đã được tác giả Samuel J. Anthony và cộng sự
thông báo [4].

3


Từ cặn nước của hoa loài B. suaveolens được Alexander Garcia
Parker và cộng sự nghiên cứu tác dụng giảm đau trên chuột. Nghiên cứu
này đã được tiến hành để kiểm tra khả năng giảm đau của nó bằng cách sử
dụng acetic axit gây đau bụng và đĩa nóng gây bỏng chân. Cặn nước từ
hoa loài B. suaveolens dùng với mức liều 100 và 300 mg/kg thể trọng
lượng ức chế đáng kể cảm giác đau do axit gây ra. Tăng nhiệt độ tấm đĩa
kim loại, các tác giả nhận thấy ở cả mức hai liều 100 và 300 mg/kg đều có
khả năng làm giảm cảm giác đau [5].
Một số alkaloid tropane như hyoscine (scopolamine) (1) [6], atropine

(2) và scopolamine (1) [7] cũng đã được thông báo có mặt trong loài B.
arborea. Cặn metanol của loài này có tác dụng chống viêm, giảm đau, làm
lành vết thương, thông mũi, chống co thắt và đặc biệt là có tác dụng trong
điều trị bệnh thấp khớp [8]. Cặn metanol và nước của B. arborea có tác dụng
ức chế tái hấp thụ serotonin (5-HT1A, 5-HT2A, 5-HT2C, D1, D2, 𝛼1 và 𝛼2) hoạt tính chống trầm cảm [9].

B. candida chứa các alkaloid tropane trong số đó có hyoscyamine (3) và
scopolamine (1) là chất có hoạt tính kháng cholinergic đã được sử dụng rộng rãi
làm thuốc giảm đau, an thần, chống co thắt và giãn đồng tử [10, 11, 12].

4


1.3. Giới thiệu cây đại cà dược (Brugmansia suaveolens)
1.3.1. Đặc điểm thực vật
Tên khoa học: Brugmansia suaveolens
Tên tiếng Việt: đại cà dược, cà độc dược cảnh
Chi: Brugmansia suaveolens)
Họ: Cà (Solananceae)
Mô tả :
Cây nhỡ khỏe, cao 4-5m, hóa gỗ, có
vỏ xám, cành lá thường thòng uống.
Lá mọc so le, phiến có dạng như lá
thuốc lá, to, dài 15-20 cm, tới 30 cm,
rộng 20 cm, có lông ở mặt dưới, gốc
có khi không cân; đầu nhọn; cuống
dài 2-3 cm. Hoa mọc thòng xuống, to,
Hình 1.1. Hình ảnh cây đại cà dược

đơn độc hay xếp từng đôi, màu trắng,

(Brugmansia suaveolens)

tràng hình hoa loa kèn.

1.3.2. Công dụng theo kinh nghiệm dân gian
Trong y học cổ truyền Trung Hoa, nó là một trong 50 vị thuốc cơ bản,
với tên gọi dương kim hoa.
Theo Đông y, hoa cà độc dược có vị cay, tính ôn, có độc, có tác dụng
ngừa suyễn, giảm ho, chống đau, chống co giật, phong thấp đau nhức. Lá là vị
thuốc ngừa cơn hen, giảm đau bao tử, chống say tàu xe. Ngoài ra còn điều trị
phong tê thấp, đau dây thần kinh toạ, đau răng... Người ta thường dùng lá cuộn
thành điếu hay thái nhỏ vấn thành điếu thuốc để hút (chữa ho, hen suyễn), dùng
lá hơ nóng đắp điều trị đau nhức, tê thấp, hoặc phơi khô tán bột mịn.

5


Vì cây có độc tính cao nên chỉ dùng theo sự hướng dẫn của thầy thuốc.
Khi bị ngộ độc, có hiện tượng giãn đồng tử, mờ mắt, tim đập nhanh, giãn phế
quản, môi miệng khô, khô cổ đến mức không nuốt và không nói được. Chất
độc tác động vào hệ thần kinh trung ương, có thể gây tử vong do hôn mê.
Trong dân gian có rất nhiều bài thuốc dùng cây đại cà dược, tuy nhiên
thành phần hóa học và giải thích những tác dụng trong dân gian chưa được
các nhà khoa học trong nước nghiên cứu.
1.4. Tổng quan về các phương pháp chiết mẫu thực vật
Sau khi tiến hành thu hái và làm khô mẫu, tuỳ thuộc vào đối tượng chất
có trong mẫu khác nhau (chất phân cực, chất không phân cực, chất có độ phân
cực trung bình,…) mà ta chọn dung môi và hệ dung môi khác nhau.
1.4.1. Chọn dung môi chiết

Thường thì các chất chuyển hóa thứ cấp trong cây có độ phân cực khác
nhau. Tuy nhiên những thành phần tan trong nước ít khi được quan tâm. Dung
môi dùng trong quá trình chiết cần phải được lựa chọn rất cẩn thận.
Điều kiện của dung môi là phải hòa tan được những chất chuyển hoá
thứ cấp đang nghiên cứu, dễ dàng được loại bỏ, có tính trơ (không phản ứng
với chất nghiên cứu), không dễ bốc cháy, không độc.
Nếu dung môi có lẫn các tạp chất thì có thể ảnh hưởng đến hiệu quả và
chất lượng của quá trình chiết. Vì vậy những dung môi này nên được chưng cất
để thu được dạng sạch trước khi sử dụng. Thường có một số chất dẻo lẫn trong
dung môi như các diankyl phtalat, tri-n-butyl-axetylcitrar và tributylphosphat.
Những chất này có thể lẫn với dung môi trong quá trình sản xuất hoặc trong
khâu bảo quản như trong các thùng chứa hoặc các nút đậy bằng nhựa.
Methanol và chlorofrom thường chứa dioctylphtalat [di-(2-etylhexyl)phtalat hoặc bis-2-etylhexyl-phtalat]. Chất này sẽ làm sai lệch kết quả phân
lập trong các quá trình nghiên cứu hoá thực vật, thể hiện hoạt tính trong thử

6


nghiệm sinh học và có thể làm bẩn dịch chiết của cây. Chlrofrom, metylen
clorit và methanol là những dung môi thường được lựa chọn trong quá trình
chiết sơ bộ một phần của cây như: lá, thân, rễ, củ, quả, hoa…
Những tạp chất của chlorofrom như CH2Cl2, CH2ClBr có thể phản ứng
với một vài hợp chất như các ancaloit tạo muối bậc 4 và những sản phẩm
khác. Tương tự như vậy, sự có mặt của lượng nhỏ axit clohiđric (HCl) cũng
có thể gây ra sự phân huỷ, sự khử nước hay sự đồng phân hoá với các hợp
chất khác. Chlorofrom có thể gây tổn thương cho gan và thận nên khi làm
việc với chất này cần được thao tác khéo léo, cẩn thận ở nơi thoáng mát và
phải đeo mặt nạ phòng độc. Metylen clorit ít độc hơn và dễ bay hơi hơn
chlorofrom.
Methanol và ethanol 80% là những dung môi phân cực hơn các

hiđrocacbon thế clo. Người ta cho rằng các dung môi thuộc nhóm rượu sẽ
thấm tốt hơn lên màng tế bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu
được lượng lớn các thành phần trong tế bào. Trái lại, khả năng phân cực của
chlorofrom thấp hơn, nó có thể rửa giải các chất nằm ngoài tế bào. Các ancol
hoà tan phần lớn các chất chuyển hoá phân cực cùng với các hợp chất phân
cực trung bình và thấp. Vì vậy, khi chiết bằng ancol thì các chất này cũng bị
hoà tan đồng thời. Thông thường dung môi cồn trong nước có những đặc tính
tốt nhất cho quá trình chiết sơ bộ.
Tuy nhiên cũng có một vài sản phẩm mới được tạo thành khi dùng
methanol trong suốt quá trình chiết. Ví dụ trechlonolide A thu được từ
trechlonaetes aciniata được chuyển thành trechlonolide B bằng quá trình phân
huỷ 1-hydroxytropacocain cũng xảy ra khi erythroxylum novogranatense
được chiết trong methanol nóng.

7


Người ta thường ít sử dụng nước để thu được dịch chiết thô từ cây mà
thay vào đó là dùng dung dịch nước của methanol.
Dietyl ete hiếm khi được dùng cho các quá trình chiết thực vật vì nó rất
dễ bay hơi, bốc cháy và rất độc, đồng thời nó có xu hướng tạo thành peroxit
dễ nổ. Peroxit của dietyl ete dễ gây phản ứng oxi hoá với các hợp chất không
có khả năng tạo cholesterol như các carotenoid. Tiếp đến là axeton cũng có
thể tạo thành axetonit nếu 1,2-cis-diol có mặt trong môi trường axit. Quá trình
chiết dưới điều kiện axit hoặc bazơ thường được dùng với quá trình phân tách
đặc trưng, cũng có khi xử lí các dịch chiết bằng axit-bazơ có thể tạo thành
những sản phẩm mong muốn.
Sự hiểu biết về những đặc tính của những chất chuyển hoá thứ cấp
trong cây được chiết sẽ rất quan trọng để từ đó lựa chọn dung môi thích hợp
cho quá trình chiết, tránh được sự phân huỷ chất bởi dung môi và quá trình

tạo thành chất không mong muốn.
Sau khi chiết, dung môi được cất ra bằng máy cất quay ở nhiệt độ
không quá 30-400C, với một vài hoá chất chịu nhiệt có thể thực hiện ở nhiệt
độ cao hơn.
1.4.2. Quá trình chiết
Hầu hết quá trình chiết đơn giản được phân loại như sau:
- Chiết ngâm.
- Chiết sử dụng một loại thiết bị là bình chiết Xoclet.
- Chiết sắc với dung môi nước.
- Chiết lôi cuốn theo hơi nước.
Chiết ngâm là một trong những phương pháp được sử dụng rộng rãi
nhất trong quá trình chiết thực vật bởi nó không đòi hỏi nhiều công sức và
thời gian. Thiết bị sử dụng là một bình thuỷ tinh với một cái khóa ở dưới đáy
để điều chỉnh tốc độ chảy thích hợp cho quá trình tách rửa dung môi. Dung
8


môi có thể nóng hoặc lạnh nhưng nóng sẽ đạt hiệu quả chiết cao hơn. Trước
đây, máy chiết ngâm đòi hỏi phải làm bằng kim loại nhưng hiện nay có thể
dùng bình thuỷ tinh.
Thông thường quá trình chiết ngâm không được sử dụng như phương
pháp chiết liên tục bởi mẫu được ngâm với dung môi trong máy chiết khoảng
24 giờ rồi chất chiết mới được lấy ra. Thông thường quá trình chiết một mẫu
chỉ thực hiện qua 3 lần dung môi vì khi đó cặn chiết sẽ không còn chứa những
chất giá trị nữa. Sự kết thúc quá trình chiết được xác định bằng một vài cách
khác nhau.
Ví dụ:
- Khi chiết các ancaloid, ta có thể kiểm tra sự xuất hiện của hợp chất
này bằng sự tạo thành kết tủa với những tác nhân đặc trưng như tác nhân
Đragendroff và tác nhân Maye.

- Các flavonoid thường là những hợp chất màu. Vì vậy, khi dịch
chiết chảy ra mà không có màu sẽ đánh dấu sự rửa hết những chất này
trong cặn chiết.
- Khi chiết các chất béo thì nồng độ trong các phần của dịch chiết ra
và sự xuất hiện của cặn chiết tiếp theo sau đó sẽ biểu thị sự kết thúc quá
trình chiết.
- Các lacton của sesquitecpen và các glicozid trợ tim, phản ứng Kedde
có thể dùng để biểu thị sự xuất hiện của chúng hoặc khi cho phản ứng với
aniline axetat sẽ cho biết sự xuất hiện của các hydrat cacbon và từ đó có thể
biết được khi nào quá trình chiết kết thúc.
Như vậy, tuỳ thuộc vào mục đích cần thiết lấy chất gì để lựa chọn dung
môi cho thích hợp và thực hiện quy trình chiết hợp lí nhằm đạt hiệu quả cao.
Ngoài ra, có thể dựa vào mối quan hệ của dung môi và chất tan của các lớp
chất mà ta có thể tách thô một số lớp chất ngay trong quá trình chiết.

9


1.5. Các phương pháp sắc ký trong phân lập các hợp chất hữu cơ
Phương pháp sắc ký (Chromatography) là một phương pháp phổ biến
và hữu hiệu nhất hiện nay, phương pháp này được sử dụng rộng rãi trong việc
phân lập các hợp chất hữu cơ nói chung và các hợp chất thiên nhiên nói riêng.
1.5.1. Đặc điểm chung của phương pháp sắc ký
Sắc ký là phương pháp tách, phân tích, phân li các chất dựa vào sự khác
nhau về bản chất hấp phụ và sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha:
pha động và pha tĩnh.
Sắc ký gồm có pha động và pha tĩnh. Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu
tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tương ứng với tính chất
của chúng (tính bị hấp phụ, tính tan,…).
Phương pháp sắc ký dựa trên sự khác biệt về tốc độ di chuyển của các

chất trong pha động khi tiếp xúc mật thiết với một pha tĩnh. Nguyên nhân của
sự khác nhau đó là do khả năng bị hấp phụ và phản hấp phụ của các chất khác
nhau hoặc do khả năng trao đổi khác nhau của các chất ở pha động với các
chất ở pha tĩnh.
Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh.
Trong quá trình pha động chuyển động dọc theo hệ sắc ký hết lớp pha tĩnh
này đến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quá trình hấp phụ và phản hấp phụ.
Kết quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn qua
hệ thống sắc ký so với các chất tương tác yếu hơn với pha này. Nhờ đặc điểm
này mà người ta có thể tách các chất qua quá trình sắc ký.
1.5.2. Cơ sở của phương pháp sắc ký
Phương pháp sắc ký dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa
pha động và pha tĩnh. Ở điều kiện nhiệt độ không đổi, định luật mô tả sự phụ
thuộc của lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh với nộng độ của dung dịch (hoặc
với chất khí là áp suất riêng phần) gọi là định luật hấp phụ đơn phân tử đẳng
nhiệt Langmuir:

10


n=
n

: Lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh lúc đạt cân bằng.

n  : Lượng cực đại của chất có thể bị hấp phụ lên một chất hấp phụ

nào đó.
b

: Hằng số.

C

: Nồng độ của chất bị hấp phụ.

1.5.3. Phân loại phương pháp sắc ký
Trong phương pháp sắc ký:
- Pha động là các chất ở trạng thái khí hay lỏng.
- Pha tĩnh có thể là các chất ở trạng thái lỏng hoặc rắn.
 Theo bản chất của hai pha sử dụng
- Pha tĩnh: Có thể là chất rắn hoặc chất lỏng
+ Pha tĩnh là chất rắn: Thường là alumin hoặc silicagel đã được xử lý,
nó có thể nạp nén vào trong một cột
+ Pha tĩnh là chất lỏng: Có thể là một chất lỏng được tẩm lên bề mặt
một chất mang
- Pha động: Có thể là chất lỏng hoặc chất khí.
+ Pha động là chất khí: Thí dụ trong kỹ thuật sắc ký khí. Trong truờng
hợp này chất khí được gọi là khí mang hay khí vectơ.
+ Pha động là chất lỏng: Thí dụ trong kỹ thuật sắc ký giấy, sắc ký lớp
mỏng, sắc ký cột.
 Phân loại sắc ký theo bản chất của hiện tựợng xảy ra trong quá trình
phân tách chất.
- Sắc ký phân chia (partition chromatography)
+ Pha động là chất lỏng hoặc chất khí (trong sắc ký khí)
+ Pha tĩnh là chất lỏng, lớp chất lỏng với chiều dày rất mỏng, chất lỏng
này đuợc nối hóa học lên bề mặt của những hạt rắn, nhuyễn và mịn.

11

- Sắc ký hấp thụ (Adsorption chromatography)
+ Pha động là chất lỏng hoặc chất khí.
+ Pha tĩnh là chất rắn: đó là những hạt rắn nhuyễn mịn, có tính trơ,
được nhồi trong một cái ống. Bản thân hạt rắn là pha tĩnh, pha tĩnh thường sử
dụng là những hạt silica gel hoặc alumin.
- Sắc ký trao đổi ion (Ion exchange chromatography)
+ Pha động chỉ có thể là chất lỏng
+ Pha tĩnh là chất rắn, là những hạt hình cầu rất nhỏ, có cấu tạo hóa học
là polymer nên gọi là hạt nhựa. Bề mặt của hạt mang các nhóm chức hóa học
ở dạng ion. Có hai loại hạt nhựa: nhựa trao đổi anion và nhựa trao đổi cation.
- Sắc ký lọc gel (size exclusion chromatography, gel filtration
chromatography)
+ Pha động chỉ có thể là chất lỏng.
+ Pha tĩnh là chất rắn, đó là những hạt hình cầu bằng polymer, trên bề
mặt có nhiều lỗ rỗng.
- Sắc ký ái lực (arrinicy chromatography)
+ Sắc ký ái lực dựa vào tính bám dính của một protein, các hạt trong
cột có nhóm hóa học kết dính bằng liên kết cộng hóa trị. Một protein có ái lực
với nhóm hóa học này sẽ gắn vào các hạt và di chuyển sẽ bị cản trở.
+ Đây là một phương pháp rất hiệu quả và được ứng dụng rộng rãi
trong việc tinh sạch protein.
- Sắc ký lỏng cao áp
+ Kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp là một dạng mở rộng của kỹ thuật sắc ký cột
có khả năng phân tách protein được cải thiện đáng kể. Bản thân vật liệu tạo cột
vốn đã có sự phân chia rõ ràng và như thế sẽ có nhiều vị trí tuơng tác dẫn đến khả
năng phân tách được tăng lên đáng kể. Bởi vì cột được làm từ vật liệu mịn hơn
nên phải có một áp lực tác động lên cột để có được một tốc độ chảy thích hợp.

12

 Phân loại sắc ký theo cấu hình (chromatography configuration)
- Sắc ký giấy và sắc ký lớp mỏng (paper thin - layer chromatography).
Trong sắc ký giấy:
+ Pha tĩnh: một tờ giấy bằng cellulos
+ Pha động: là chất lỏng
Trong sắc ký lớp mỏng:
+ Chất hấp phụ thông dụng trong sắc ký lớp mỏng là silica gel, là loại
pha tĩnh với tính chất rất phân cực
+ Pha động: luôn luôn là chất lỏng
- Sắc ký cột hở cổ điển (classical open column chromatography)
+ Sắc ký cột hở cổ điển là tên gọi để chỉ loại sắc ký sử dụng một ống
hình trụ, được đặt dựng đứng, với đầu trên hở và đầu dưới có gắn một khóa.
+ Pha tĩnh rắn được nhồi vào ống hình trụ. Mẫu cần tách được đặt lên
trên bề mặt của pha tĩnh
+ Pha động là dung môi được liên tục rót vào đầu cột
 Dựa vào trạng thái tập hợp của pha động, người ta chia sắc ký thành
hai nhóm lớn: sắc ký lỏng và sắc ký khí.
 Dựa vào cách tiến hành sắc ký, người ta chia sắc ký thành các nhóm
nhỏ: sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng.
1.5.3.1. Sắc ký cột (CC)
Đây là phương pháp sắc ký phổ biến nhất, đơn giản nhất, chất hấp phụ
là pha tĩnh gồm các loại silicagel (có kích thước hạt khác nhau) pha thường và
pha đảo YMC, ODS, Dianion. Chất hấp phụ được nhồi vào cột (cột có thể
bằng thuỷ tinh hoặc kim loại, phổ biến nhất là cột thuỷ tinh). Độ mịn của chất
hấp phụ rất quan trọng, nó phản ánh số đĩa lí thuyết hay khả năng tách của
chất hấp phụ. Kích thước của chất hấp phụ càng nhỏ thì số đĩa lí thuyết càng
lớn, khả năng tách càng cao, và ngược lại. Tuy nhiên, nếu chất hấp phụ có

13


kích thước hạt càng nhỏ thì tốc độ chảy càng giảm, có thể gây ra hiện tượng
tắc cột (dung môi không chảy được). Khi đó người ta phải sử dụng áp suất,
với áp suất trung bình (MPC) hoặc áp suất cao (HPLC).
Trong sắc ký cột, tỉ lệ đường kính (D) so với chiều cao cột (L) rất quan
trọng, nó thể hiện khả năng tách của cột. Tỉ lệ L/D phụ thuộc vào yêu cầu
tách, tức là phụ thuộc vào hỗn hợp chất cụ thể.
Trong sắc ký, tỉ lệ giữa quãng đường đi của chất cần tách so với quãng
đường đi của dung môi gọi là Rf , với mỗi một chất sẽ có một Rf khác nhau.
Nhờ vào sự khác nhau về Rf này mà ta có thể tách từng chất ra khỏi hỗn hợp.
Tỉ lệ chất so với tỉ lệ chất hấp phụ cũng rất quan trọng. Tuỳ theo yêu
cầu tách mà ta có tỉ lệ khác nhau: Tách thô thì tỉ lệ này thấp (1/5-1/10), tách
tinh thì tỉ lệ này cao hơn và tuỳ vào hệ số tách (tức phụ thuộc vào sự khác
nhau Rf của các chất), mà hệ số này trong khoảng 1/20-1/30.
Trong sắc ký cột, việc đưa chất lên cột hết sức quan trọng. Tuỳ thuộc
vào lượng chất và dạng chất mà người ta có thể đưa chất lên cột bằng các
phương pháp khác nhau. Nếu lượng chất nhiều và chạy thô thì phổ biến là tẩm
chất vào silica gel rồi làm khô, tơi hoàn toàn, đưa lên cột. Nếu tách tinh thì
đưa trực tiếp chất lên cột bằng cách hoà tan chất bằng dung môi chạy cột với
lượng tối thiểu.
Có hai cách đưa chất hấp phụ lên cột:
- Cách 1: Nhồi cột khô.
Theo cách này, chất hấp phụ được đưa trực tiếp vào cột khi còn khô,
sau đó dùng que mềm để gõ nhẹ lên thành cột để chất hấp phụ sắp xếp chặt
trong cột. Sau đó dùng dung môi chạy cột để chạy cột đến khi cột trong suốt.
- Cách 2: Nhồi cột ướt.
Chất hấp phụ được hoà tan trong dung môi chạy cột trước với lượng
dung môi tối thiểu, sau đó đưa dần lên cột đến khi đủ lượng cần thiết.

14


Khi chuẩn bị cột phải lưu ý không được để bọt khí bên trong (nếu có
bọt khí gây nên hiện tượng chạy rối trong cột, giảm hiệu quả tách) và cột
không được nứt, gãy, dò.
Tốc độ chảy của dung môi cũng ảnh hưởng đến hiệu quả tách. Nếu tốc
độ dòng chảy quá lớn sẽ làm giảm hiệu quả tách. Còn nếu tốc độ dòng chảy
quá thấp thì sẽ kéo dài thời gian tách và ảnh hưởng đến tiến độ công việc.
1.5.3.2. Sắc ký lớp mỏng (TLC).
Sắc ký lớp mỏng (TLC) thường được sử dụng để kiểm tra và định
hướng cho sắc ký cột. TLC được tiến hành trên bản mỏng tráng sẵn silica gel
trên đế nhôm hay đế thuỷ tinh. Ngoài ra, TLC còn dùng để điều chế thu chất
trực tiếp. Bằng việc sử dụng bản TLC điều chế (bản được tráng sẵn silica gel
dày hơn), có thể đưa lượng chất nhiều hơn lên bản và sau khi chạy sắc ký,
người ta có thể cạo riêng phần silicagel có chứa chất cần tách rồi giải hấp phụ
bằng dung môi thích hợp để thu được từng chất riêng biệt. Có thể phát hiện
chất trên bản mỏng bằng đèn tử ngoại, bằng chất hiện màu đặc trưng cho từng
lớp chất hoặc sử dụng dung dịch H2SO4 10%.
1.6. Một số phương pháp hóa lý xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ
Cấu trúc hoá học các hợp chất hữu cơ được xác định nhờ vào phương
pháp phổ kết hợp. Tuỳ thuộc vào cấu trúc hoá học của từng chất mà người
ta sử dụng phương pháp phổ cụ thể. Cấu trúc càng phức tạp thì yêu cầu
phối hợp các phương pháp phổ càng cao. Trong một số trường hợp, để xác
định chính xác cấu trúc hoá học của các hợp chất, người ta phải dựa vào
các phương pháp bổ sung khác như chuyển hoá hoá học, các phương pháp
sắc ký so sánh,…
1.6.1. Phổ khối lượng (Mass spectroscopy, MS)
Nguyên tắc của phương pháp phổ này là dựa vào sự phân mảnh ion của

phân tử chất dưới sự bắn phá của chùm ion bên ngoài. Phổ MS còn cho các

15


pic ion mảnh khác mà dựa vào đó người ta có thể xác định được cơ chế phân
mảnh và dựng lại được cấu trúc hoá học của các hợp chất. Hiện nay có rất
nhiều loại phổ khối lượng, như những phương pháp chủ yếu sau:
- Phổ EI-MS (Electron Impact Mass Spectroscopy) dựa vào sự phân
mảnh ion dưới tác dụng của chùm ion bắn phá năng lượng khác nhau, phổ
biến là 70eV.
- Phổ ESI-MS (Electron Sprayt Ionization Mass Spectroscopy) gọi là
phổ phun mù điện tử. Phổ này được thực hiện với năng lượng bắn phá thấp
hơn nhiều so với phổ EI-MS, do đó phổ thu được chủ yếu là pic ion phân tử
và các pic đặc trưng cho sự phá vỡ các liên kết có mức năng lượng thấp, dễ bị
phá vỡ.
1.6.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy
NMR)
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một phương pháp phổ hiện đại và hữu
hiệu nhất hiện nay. Với việc sử dụng kết hợp các kỹ thuật phổ NMR một
chiều và hai chiều, các nhà nghiên cứu có thể xác định chính xác cấu trúc của
hợp chất, kể cả cấu trúc lập thể của phân tử.
Nguyên lý chung của các phương pháp phổ NMR (phổ proton và
cacbon) là sự cộng hưởng khác nhau của các hạt nhân từ ( 1H và 13C) dưới tác
dụng của từ trường ngoài. Sự cộng hưởng khác nhau này được biểu diễn bằng
độ dịch chuyển hoá học (chemical shift). Ngoài ra, đặc trưng của phân tử còn
được xác định dựa vào tương tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau (spin
coupling).
1.6.3.1. Phổ 1H-NMR
Trong phổ 1H-NMR, độ dịch chuyển hoá học (δ) của các proton được

xác định trong thang ppm từ 0-14ppm, tuỳ thuộc vào mức độ lai hoá của
nguyên tử cũng như đặc trưng riêng của từng phần. Dựa vào những đặc trưng
của độ dịch chuyển hoá học và tương tác spin mà ta có thể xác định được cấu
trúc hoá học của hợp chất.

16