Nghiên cứu tách, chiết và xác định hàm lượng một số hợp chất Diterpenoid từ loài kim giao (Nageia Fleuryi (Hick.) De Laubenf)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGUYỄN DUY HẢI

NGHIÊN CỨU TÁCH, CHIẾT VÀ XÁC ĐỊNH HÀM
LƯỢNG MỘT SỐ HỢP CHẤT DITERPENOID TỪ
LOÀI KIM GIAO
(NAGEIA FLEURYI (HICK.) DE LAUBENF)

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

THÁI NGUYÊN - 2017


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGUYỄN DUY HẢI

NGHIÊN CỨU TÁCH, CHIẾT VÀ XÁC ĐỊNH
HÀM LƯỢNG MỘT SỐ HỢP CHẤT DITERPENOID
TỪ LOÀI KIM GIAO

(NAGEIA FLEURYI (HICK.) DE LAUBENF)
Chuyên ngành: Hóa phân tích
Mã số: 60 44 01 18

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS. PHẠM HẢI YẾN

THÁI NGUYÊN - 2017


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và chân thành nhất đến với TS. Phạm Hải Yến.
Cô đã giao đề tài, nhiệt tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất giúp tôi
thực hiện luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn Phòng Nghiên cứu cấu trúc – Viện Hóa sinh biển,
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã hỗ trợ trang thiết bị cho
nghiên cứu này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô trong bộ môn Hóa Phân tích nói riêng
và trong khoa Hóa học nói chung đã dạy dỗ, chỉ bảo và động viên tôi trong thời
gian tôi học tập tại trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại Học Thái Nguyên.
Qua đây, tôi xin cảm ơn gia đình, các bạn học viên và sinh viên của Bộ môn
Hóa phân tích đã luôn động viên, tận tình giúp đỡ tôi trong thời gian học tập và
thực hiện luận văn này.
Thái Nguyên, ngày 18 tháng 05 năm 2017
Học viên

Nguyễn Duy Hải


MỤC LỤC
Mở đầu ........................................................................................................................... 1
Nội dung nghiên cứu ............................................................................................... 2
1.1. Tổng quan về cây Kim Giao ............................................................................ 3
1.1.1. Vài nét về thực vật .......................................................................................... 3
1.1.2. Phân bố và sinh thái ....................................................................................... 4

1.1.3. Ứng dụng ........................................................................................................ 4
1.1.4. Các nghiên cứu về thành phần hoá học và hoạt tính sinh học ................... 4
2.1. Mẫu thực vật ......................................................................................................... 11
2.2. Phương pháp phân lập các hợp chất ................................................................... 11
2.2.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC) ................................................................................ 11
2.2.2. Sắc ký lớp mỏng điều chế............................................................................. 11
2.2.3. Sắc ký cột (CC) ............................................................................................. 11
2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ ................... 11
2.3.1. Phổ hồng ngoại (Infraed Spectroscopy-IR) ................................................ 12
2.3.2. Phổ khối lượng (Mass spectroscopy - MS) ................................................. 12
2.3.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) .......................................................... 13
2.4. Phương pháp định lượng và đánh giá chất sạch bằng LC/MS .......................... 15
2.5. Thực nghiệm ................................................................................................... 17
2.5.1. Phân lập các hợp chất........................................................................................ 17
2.5.2. Hằ ng số vâ ̣t lý và các dữ kiện phổ của các hơ ̣p chấ t đã phân lâ ̣p ................... 18

2.5.3. Định lượng các hợp chất.................................................................................... 19
3.1. Xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất phân lập được...................... 21
3.1.1. Hợp chất D1: ................................................................................................ 21
3.1.2. Hợp chất D2: ................................................................................................ 25
3.1.3. Hợp chất D3: ................................................................................................ 29
3.1.4. Hợp chất D4: ................................................................................................ 32
3.1.5. Hợp chất D5: ................................................................................................ 36
3.2. Xác định hàm lượng các hợp chất phân lập được bằng phương pháp LC/MS 40
3.2.1. Xác định hàm lượng chất D1 (kí hiệu PE1) ............................................... 40
3.2.2. Xác định hàm lượng chất D2 (kí hiệu PE2): .............................................. 42
KẾT LUẬN: ........................................................................................................... 45


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

1

CC

Column Chromatography

Sắc ký cột

TLC

Thin Layer Chromatography

Sắc ký lớp mỏng

MeOH

Methanol

EtOAc

Ethyl acetate

H-NMR

13

C-NMR

DEPT

HMBC

HSQC

NOESY

Proton Magnenic Rosonance
Spectrocopy

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

Carbon-13 Nuclear Magnetic

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

Resonance Spectroscopy

cacbon 13

Distortionless Enhancement
by Polarisation Transfer

Phổ DEPT

Heteronuclear Multiple Bond

Phổ tương tác dị hạt nhân qua

Connectivity

nhiều liên kết

Heteronuclear Single-

Phổ tương tác dị hạt nhân qua

Quantum Connectiv ity

1 liên kết

Nuclear Overhauser Effect

Phổ học hạt nhân Overhauser

Spectroscopy

có hiệu lực


DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 2.1. Sơ đồ chiết các phân đoạn từ lá kim giao .............................................. 17
Sơ đồ 2.2. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn diclometan của lá kim giao .......... 18


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cây kim giao - Nageia fleuryi ................................................................... 3
Hình 3.1. Cấu trúc hợp chất D1 .............................................................................. 21
Hình 3.2. Phổ 1H-NMR của D1 ............................................................................... 22
Hình 3.3. Phổ 13C-NMR của D1.............................................................................. 22

Hình 3.4. Phổ HSQC của D1 .................................................................................. 24
Hình 3.5. Phổ HMBC của D1 ................................................................................. 24
Hình 3.6. Phổ NOESY của D1 ................................................................................ 25
Hình 3.7. Cấu trúc của D2 ...................................................................................... 25
Hình 3.8. Phổ 1H-NMR của D2 ............................................................................... 26
Hình 3.9. Phổ 13C-NMR của D2.............................................................................. 26
Hình 3.10. Phổ HSQC của D2 ................................................................................ 28
Hình 3.11. Phổ HMBC của D2 ............................................................................... 28
Hình 3.12. Cấu trúc hợp chất D3 ............................................................................ 29
Hình 3.13. Phổ 1H-NMR của D3 ............................................................................. 29
Hình 3.14. Phổ 13C-NMR của D3............................................................................ 30
Hình 3.15. Phổ HSQC của D3 ................................................................................ 31
Hình 3.16. Phổ HMBC của D3 ............................................................................... 32
Hình 3.17. Cấu trúc hợp chất D4 ............................................................................ 32
Hình 3.18. Phổ 1H-NMR của D4 ............................................................................. 33
Hình 3.19. Phổ 13C-NMR của D4............................................................................ 33
Hình 3.20. Phổ HSQC của D4 ................................................................................ 35
Hình 3.21. Phổ HMBC của D4 ............................................................................... 35
Hình 3.22. Phổ NOESY của D4 .............................................................................. 36
Hình 3.23. Cấu trúc hợp chất D5 ............................................................................ 36
Hình 3.24. Phổ 1H-NMR của D5 ............................................................................. 37
Hình 3.25. Phổ 13C-NMR của D5............................................................................ 37
Hình 3.26. Phổ HSQC của D5 ................................................................................ 39
Hình 3.27. Phổ HMBC của D5 ............................................................................... 40
Hình 3.28. Diện tích pic chất D1 (PE1) trên mẫu tổng .......................................... 42
Hình 3.29. Diện tích pic chất D2 (PE2) trên mẫu tổng .......................................... 44


DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 3.1.1. Số liệu phổ hợp chất D1 và chất tham khảo ........................................ 23

Bảng 3.1.2. Số liệu phổ hợp chất D2 và chất tham khảo ........................................ 27
Bảng 3.1.3. Số liệu phổ hợp chất D3 và chất tham khảo ........................................ 30
Bảng 3.1.4. Số liệu phổ hợp chất D4 và chất tham khảo ........................................ 34
Bảng 3.1.5. Số liệu phổ hợp chất D5 và chất tham khảo ........................................ 38
Bảng 3.2.1. Kết quả đo phổ LC/MS của mẫu PE1.................................................. 40
Bảng 3.2.2: Kết quả phân tích phương sai ............................................................. 41
Bảng 3.2.3. Kết quả định lượng của mẫu 1............................................................. 42
Bảng 3.2.4. Kết quả đo phổ LCMS của mẫu PE2 .................................................. 42
Bảng 3.2.5. Kết quả phân tích phương sai .............................................................. 43
Bảng 3.2.6. Kết quả định lượng của mẫu D2 .......................................................... 44


DANH MỤC PHỤ LỤC

Phụ lục 1. Phổ 1H-NMR của D1 ........................................................................... 1 - PL
Phụ lục 2. Phổ 13C-NMR của D1 ...................................................................... 1 - PL
Phụ lục 3. Phổ HSQC của D1 .......................................................................... 2 - PL
Phụ lục 4. Phổ HMBC của D1 ......................................................................... 2 - PL
Phụ lục 5. Phổ NOESY của D1 ........................................................................ 3 - PL
Phụ lục 6. Phổ 1H-NMR của D2 ....................................................................... 3 - PL
Phụ lục 7. Phổ 13C-NMR của D2 ...................................................................... 4 - PL
Phụ lục 8. Phổ HSQC của D2 .......................................................................... 4 - PL
Phụ lục 9. Phổ HMBC của D2 ......................................................................... 5 - PL
Phụ lục 10. Phổ 1H-NMR của D3 ..................................................................... 5 - PL
Phụ lục 11. Phổ 13C-NMR của D3 .................................................................... 6 - PL
Phụ lục 12. Phổ HSQC của D3 ........................................................................ 6 - PL
Phụ lục 13. Phổ HMBC của D3 ....................................................................... 7 - PL
Phụ lục 14. Phổ 1H-NMR của D4 ..................................................................... 7 - PL
Phụ lục 15. Phổ 13C-NMR của D4 .................................................................... 8 - PL
Phụ lục 16. Phổ HSQC của D4 ........................................................................ 8 - PL

Phụ lục 17. Phổ HMBC của D4 ....................................................................... 9 - PL
Phụ lục 18. Phổ NOESY của D4 ...................................................................... 9 - PL
Phụ lục 19. Phổ 1H-NMR của D5 ................................................................... 10 - PL
Phụ lục 20. Phổ 13C-NMR của D5 .................................................................. 10 - PL
Phụ lục 21. Phổ HSQC của D5 ...................................................................... 11 - PL
Phụ lục 22. Phổ HMBC của D5 ..................................................................... 11 - PL


Mở đầu
Hiện nay, các loại thuốc có nguồn gốc từ thiên nhiên đang ngày càng được ưa
chuộng do những đặc tính nổi bật của chúng như: ít độc, ít gây phản ứng phụ, dễ
hấp thu. Từ ngàn xưa ông cha ta đã sử dụng nhiều phương thuốc dân gian từ cây cỏ
để chữa bệnh, bồi bổ cơ thể, hay tạo mùi thơm... Do đó ngày nay các hợp chất có
hoạt tính sinh học trong thực vật và động vật đang nhận được sự quan tâm rất lớn
từ giới khoa học. Trong tương lai, các hợp chất có hoạt tính sinh học sẽ đóng vai
trò rất quan trọng, là các yếu tố khởi đầu cho việc tổng hợp nên các loại dược
phẩm mới có tác dụng tốt hơn.
Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới, có khí hậu nóng, độ ẩm cao, lượng
mưa lớn, là những điều kiện rất thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của các
loài thực vật. Với hệ thực vật phong phú và đa dạng khoảng 12.000 loài thực vật
bậc cao có mạch, trong đó có tới 4.000 loài được nhân dân ta dùng làm thảo dược,
điều này là một tiền đề lớn cho sự phát triển ngành hóa học các hợp chất thiên
nhiên ở nước ta. Việc nghiên cứu, khảo sát về thành phần hoá học và tác dụng
dược lý của các loài cây thuốc có giá trị cao của Việt Nam nhằm đặt cơ sở khoa
học cho việc sử dụng chúng một cách hợp lí và có hiệu quả có ý nghĩa đặc biệt
quan trọng. Kim giao hay còn gọi Kim giao núi đá (danh pháp khoa học Nageia
fleuryi hay Podocarpus fleuryi) là một loài thực vật trong họ Podocarpaceae. Lá
loài này được dân gian dùng sắc uống chữa ho ra máu, sưng cuống phổi và dùng
làm thuốc giải độc…
Ở Việt Nam, chưa thấy có công bố nào về thành phần hóa học của loài này.

Trên thế giới, năm 1990 và 1991 nhóm tác giả Xu Ya-ming và cộng sự đã công bố
cấu trúc của 16 hợp chất được phân lập từ loài Podocarpus fleuryi. Năm 2013, LanChun Zhang và cộng sự đã phân lập được 3 hợp chất diterpenoid mới. Kết quả thử
nghiệm hoạt tính gây độc tế bào trên năm dòng tế bào ung thư HL-60, SMMC-772,
A-549, MCF-7 và SW480 cho thấy hợp chất fleuryinol B và 19-hydroxyferruginol
có hoạt tính ở mức độ trung bình với giá trị IC50 nằm trong khoảng 14-38 µM.
Luận văn này tập trung nghiên cứu phân tích cấu trúc và xác định hàm lượng
một số hợp chất diterpenoid được phân lập từ cây Kim giao (Nageia fleuryi), có ý
HV: Nguyễn Duy Hải

1


nghĩa quan trọng giúp làm sáng tỏ thành phần hóa học và tìm kiếm những hợp chất
có hoạt tính sinh học phục vụ cuộc sống.
Nội dung nghiên cứu
1, Nghiên cứu phân lập một số hợp chất diterpenoid từ loài Kim giao
2, Phân tích cấu trúc và xác định hàm lượng các hợp chất diterpenoid phân lập được

HV: Nguyễn Duy Hải

2


Chương 1
TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về cây Kim Giao
1.1.1. Vài nét về thực vật

Hình 1.1. Cây kim giao - Nageia fleuryi
Chi Kim giao (Nageia) là một chi thực vật nhỏ nằm trong họ Thông tre

(Podocarpaceae). Một vài phân loại khoa học trước đây xếp chi Kim giao vào
chi Thông tre (Podocarpus). Đến năm 1987 thì người ta bắt đầu tách riêng chi Kim
giao (Nageia).
Ở Việt Nam, chi Kim giao được ghi nhận có 3 loài là: Kim giao đế mọng
(Nageia wallichiana hay Podocarpus wallichiana), Kim giao hạt to (Nageia fleuryi
hay Podocarpus fleuryi) và Kim giao hạt nhỏ (Nageia nagi hay Podocarpus nagi).
Cây kim giao hạt to (Nageia fleuryi) là một loài cây thân gỗ nhỡ cao từ 1525m. Thân thường thẳng và tán cây hình tháp. Các cành nhánh của cây thường
mọc ngang và rủ xuống. Vỏ thân cây màu nâu xám và thường bong mảng. Lá cây
thường có hình bầu dục hoặc mũi mác, đầu lá hình nhọn, đuôi lá hình nêm. Lá dài
15-18cm, rộng 4-5cm Hệ gân lá thuộc dạng đa gân, đặc trưng của thực vật chi
Nageia. Bề mặt phiến lá thường trơn bóng như chất liệu da. Lá đính đơn và đối
HV: Nguyễn Duy Hải

3


xứng nhau qua cành. Nón đực thường đính thành chùm 3-4, nón cái thường mọc
đơn lẻ ở nách lá. Quả hình trụ đường kính từ 1,5 - 2,5 cm.
Cây ra nón vào tháng 5; nón chín vào tháng 11-12.
1.1.2. Phân bố và sinh thái
Kim giao được tìm thấy ở miền nam Trung Quốc (Quảng Đông, Quảng
Tây, Vân Nam), Lào, Campuchia, Việt Nam (hầu hết các tỉnh miền núi có địa chất
đá vôi).
Loài ưa phát triển trên đất đá vôi có độ dày tầng đất lớn, thoát nước tốt. Ngoại
trừ trường hợp đặc biệt về quần hợp đơn loài ở Vườn quốc gia Cát Bà của Việt
Nam thì Kim giao là loài thường phân bố hỗn giao với các loài Sến, Táu và Dẻ ở
các khu rừng mưa nhiệt đới và á nhiệt đới thường xanh, có độ cao từ 200 - 1000m.
Ở Việt Nam, chi này phân bố khá rộng, từ Cao Bằng, Phú Thọ, Hải Phòng,
Ninh Bình đến Quảng Nam, Ninh Thuận, Lâm Đồng.
1.1.3. Ứng dụng

Lá Kim giao được dân gian dùng sắc uống chữa ho ra máu, sưng cuống phổi
và dùng làm thuốc giải độc…
Gỗ của Kim giao có màu trắng sáng rất đẹp và bền thường được dùng đóng
đồ nội thất. Người Á Đông có cả những kinh nghiệm truyền thống về việc dùng gỗ
Kim giao để thử độc thực phẩm.
Tán và lá cây đẹp nên cây cũng được dùng nhiều cho kiến trúc cảnh quan,
trồng ven đường, các công trình tôn giáo như đình chùa, nhà thờ, các công trình
mang lối kiến trúc cổ Đông Á.
1.1.4. Các nghiên cứu về thành phần hoá học và hoạt tính sinh học
Các nhà khoa học trên thế giới đã chỉ ra thành phần hóa học chính của các
loài thuộc chi Nageia gồm các hợp chất diterpenoid, flavonoid, biflavonoid,
phenolic, lignan, và steroid ...Nghiên cứu về thành phần hóa học một số loài thuộc
chi Nageia đã bắt đầu vào giữa những năm 60 của thế kỉ 20. Năm 1968, Yuji
Hayashi và cộng sự đã công bố phân lập được ba hợp chất norditerpenoid
dilactone: nagilactone A (1), B (2), C (3) và một hợp chất bisnorditerpenoid
dilactone: nagilactone D (4) từ lá và hạt loài P. nagi [2]. Năm 1977, Yuji Hayashi
HV: Nguyễn Duy Hải

4


tiếp tục nghiên cứu hạt và vỏ rễ loài P. nagi và công bố 3 hợp chất diterpeniod
dilactone mới: 15-hydroxy-nagilactone D (5), 3β-hydroxy-nagilactone A (6),
1β,2β-dihydroxy-nagilactone D (7) cùng với 6 hợp chất đã biết: 3β,17-diacetylnagilactone D (8), 1β,3β,7β-triacetyl-nagilactone A (9), 1β,2β,3β-triacetylnagilactone D (10), nagilactone A (1), B (2) và D (4) [3]. Từ hạt loài P. nagi, hai
hợp chất 15-methoxycarbonyl-nagilactone

D (11)

và 1-deoxy-2α-hydroxy-

nagilactone A (12) được Yuji Hayashi và cộng sự phân lập [4]. Tiếp tục các
nghiên cứu về thành phần hóa học của vỏ rễ loài P. nagi nhóm tác giả trên thông
báo cấu trúc ba hợp chất mới diterpenoid dilactone dạng 7,8-epoxy-enolide: 16hydroxy-podolide (13), 2,3-dihydro-16-hydroxy-podolide (14) và 2β,3β-epoxypodolide (15) [5]. Cũng từ vỏ rễ loài P. nagi, Bai-Ping Ying và cộng sự đã phân
lập được ba hợp chất norditerpene dilactone: 2,3-dehydro-16-hydroxynagilactone F
(16), nagilactone I (17) và 16-hydroxynagilactone E (18) [6]. Năm 1990 và 1991
nhóm tác giả Xu Ya-ming, Fang Sheng-ding và He Qi-min đã công bố cấu trúc của
16 hợp chất được phân lập từ loài P. fleuryi: palmitic acid (19), sugiol (20), βsitosterol (21), nagilactone A (1), nagilactone B (2), isoginkgetin (22), β-sitosteryl
stearate (23), 3β,5α-dihydroxy-6-stigmastanone (24), 5α-hydroxy-6-stigmastanone3β-palmitate (25), daucosterol (26), syringin (27) và 5 hợp chất robustaflavone
(28-32) [7]. Năm 1991, Isao Kubo và cộng sự đã phân lập được hợp chất 2αhydroxynagilactone F (33) từ vỏ rễ loài P. nagi và kết quả thử nghiệm hoạt tính
kháng nấm cho thấy hợp chất này có hoạt tính đối với chủng nấm S. cerevisiae
(MIC 800 µg/ml) [8]. Từ lá loài P. nagi, bảy hợp chất được phân lập: 3-deoxy-2αhydroxy-nagilactone E (34), 3-epi-nagilactone C (35), 15-methoxy-nagilactone D
(15), sugiol (20), nagilactone A (1), nagilactone C (3), vomifoliol (36) [9] và từ
vỏ rễ loài này, sáu hợp chất: nagilactone J (37), nagilactone C (3), nagilactone D
(4), nagilactone I (17), 16-hydroxynagilactone E (18) và vomifoliol (36) đã được
phân lập [10].

HV: Nguyễn Duy Hải

5


Một nghiên cứu khác của Isao Kubo về tác dụng kháng khuẩn, sáu hợp chất
diterpenoid: totarol (38), totaradiol (39), 19-hydroxytotarol (40), totaral (41),
HV: Nguyễn Duy Hải

6


4β-carboxy-19-nortotarol (42), sugiol (20) đã được phân lập và thử tác dụng kháng
khuẩn trên 12 chủng, kết quả cho thấy hợp chất totarol thể hiện hoạt tính kháng

khuẩn mạnh đối với các vi khuẩn Gram (+), đặc biệt là vi khuẩn
Propionibacterium acnes. Đồng thời, totarol, cũng thể hiện hoạt tính mạnh đới 4
chủng vi khuẩn Gram (+) khác là: Streptococcus mutans, Bacillus subtilis,
Brevibacterium ammoniagenes và Staphylocorrur aureus (đây là những chủng vi
khuẩn kháng penicillin). Hoạt kháng khuẩn của totarol được thể hiện mạnh hơn khi
nó kết hợp với một số hợp chất khác. Đáng chú ý, hoạt tính của totarol đối với
chủng vi khuẩn Sta. aureus tăng lên gấp tám lần khi kết hợp với axit anacardic.
Tác động hiệp đồng của axit anacardic và totarol làm cho nồng độ tối thiểu diệt
khuẩn (MBC) của totarol được giảm xuống trong khoảng từ 1,56-0,2 µg/ml [11].
Năm 1993, Isao Kubo tiếp tục nghiên cứu tác dụng kháng nấm của ba hợp chất:
2α-hydroxynagilactone F (43), nagilactone E (44) và nagilactone C (3) trên ba
chủng nấm: Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae và Pityrosporum ovale.
Kết quả cho thấy, nagilactone E thể hiện hoạt tính trung bình trên chủng Pit. ovale
và yếu trên 2 chủng còn lại. Tuy nhiên, khi kết hợp với các hợp chất
phenylpropanoid như anethole và isosafrole thì tác dụng kháng nấm tăng lên đáng
kể [12]. Một nghiên cứu khác của nhóm tác giả trên đã tiếp tục công bố cấu
trúc của ba hợp chất khung norditerpene dilactone: 1-deoxynagilactone A (45),
1-deoxy-2,3-dehydronagilactone A (46) và 2,3-dehydronagilactone A (47). Từ
hạt loài P. nagi, Li-Jang Xuan và cộng sự đã phân lập được năm hợp chất diterpene
dilactone glycoside, nagilactoside C-E (48-50) [13] và nagilactoside F và G (5152) [14]. Từ vỏ rễ loài P. nagi lần đầu tiên hai hợp chất cyclopeptide được phân
lập, và được đạt tên là nagitide A và B (53-54) [15]. Một axit béo không bão hòa
phân lập từ hạt P. nagi, sciadionic axit (SCA; 5, 11, 14-20:3) đã được Szu-Jung
Chen thử nghiệm tác dụng kháng viêm kết quả cho thấy SCA làm giảm quá trình
sản sinh PGE2 (29%), nitric oxide (NO) (31%), interleukin-6 (IL-6) (34%) và khối
u hoại tử một (TNF-α) (14%). Tác dụng ức chế các chất trung gian gây viêm là do
SCA làm giảm biểu hiện của cảm ứng của enzym tổng hợp NO (iNOS) và
cyclooxygenase-2 (COX-2) và ức chế yếu tố nhân kappa B (NF-B) của quá trình
HV: Nguyễn Duy Hải

7

chuyển vị và phosphoryl hóa protein mitogen-activated protein kinase (MAPK)
[16]. Năm 2013, từ cành và lá loài P. fleuryi, Lan-Chun Zhang đã phân lập được ba
hợp chất abietane diterpenoid mới: fleuryinol A-C (55-57), cùng với 14 hợp chất
đã biết: 19-hydroxyferruginol (58), lambertic acid (59),

inumakiol

D (60),

totaradiol (39), 19-hydroxytotarol (40), 3-acetoxy-methyl-5-[(E)-3-acetoxypropen1-yl)]-2-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-7-methoxy-2,3-dihydrobenzofuran

(61),

divanillyltetrahydrofuran (62), (+)-pinoresinol (63), ligballinol (64), sitostane3β,5α,6β-triol (65), ergosta-7,22-dien-3β,5α,6β-triol (66), stigmast-4-ene-3β,6βdiol (67), stigmast-5-ene-3β,7β-diol (68) và ergosterol peroxide (69). Tám hợp
chất (55-62) được đáng giá hoạt tính gây độc tế bào trên năm dòng tế bào: HL-60,
SMMC-772, A-549, MCF-7 và SW480 kết quả cho thấy hợp chất fleuryinol B
(56) và 19-hydroxyferruginol (58) có hoạt tính trung bình đối với dòng tế bào
SMMC-7721 và A-549 với giá trị IC50 lần lượt là 38 và 14 µM [17]. Một nghiên
cứu được công bố vào tháng 01 năm 2016 của các nhà khoa học Trung Quốc về
loài P. wallichiana cho thấy đã phân lập được bốn hợp chất: sugiol (20), vanillic
axit (70), p-hydroxybenzoic axit (71) và 7-ketositosterol (72). Cấu trúc của chúng
được xác đinh bằng các phương pháp phổ NMR và đây là nghiên cứu hóa học đầu
tiên về loài này [18].

HV: Nguyễn Duy Hải

8

HV: Nguyễn Duy Hải

9


Từ kết quả tổng quan các nghiên cứu trên, có thể nhận thấy các nghiên cứu
chủ yếu của các nhà khoa học Nhật Bản và Trung Quốc. Thành phần hóa học của
các loài thuộc chi Nageia khá đa dạng, đồng thời các nghiên cứu về hoạt tính sinh
học đã phát hiện được nhiều hợp chất có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm, chống
oxi hóa và diệt tế bào ung thư.

HV: Nguyễn Duy Hải

10


Chương 2
THỰC NGHIỆM
2.1. Mẫu thực vật
Mẫu cành và lá cây Kim giao (Nageia fleuryi (Hick.) de Laubenf) thu tại Hải
Phòng vào tháng 6/2016. Tên khoa học được TS. Bùi Văn Thanh, Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam giám định. Mẫu tiêu bản được lưu giữ tại Viện
Hoá sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.2. Phương pháp phân lập các hợp chất
2.2.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC)
Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60
F254 (Merck 1,05715), RP18 F254s (Merck). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai
bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H 2SO4 10% được
phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng từ từ đến khi hiện màu.

2.2.2. Sắc ký lớp mỏng điều chế
Sắc ký lớp mỏng điều chế thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn Silica gel 60G
F254 (Merck, ký hiệu 105875), phát hiện vệt chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước
sóng 254 nm và 365 nm, hoặc cắt rìa bản mỏng để phun thuốc thử là dung dịch
H2SO4 10%, hơ nóng để phát hiện vệt chất, ghép lại bản mỏng như cũ để xác định
vùng chất, sau đó cạo lớp Silica gel có chất, giải hấp phụ và tinh chế lại bằng cách
kết tinh trong dung môi thích hợp.
2.2.3. Sắc ký cột (CC)
Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là Silica gel pha thường và pha
đảo. Silica gel pha thường có cỡ hạt là 0,040-0,063 mm (240- 430 mesh). Silica gel
pha đảo ODS hoặc YMC (30-50 m, Fujisilica Chemical Ltd.). Nhựa trao đổi ion
Diaion HP-20 (Misubishi Chemical Indutries Co., Ltd.).
2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ
Cấu trúc hóa học của hợp chất hữu cơ thường được xác định nhờ vào ứng
dụng của các phương pháp phổ kết hợp. Tùy thuộc vào cấu trúc hóa học của từng
chất mà sử dụng các phương pháp phổ cho phù hợp. Cấu trúc càng phức tạp thì yêu
cầu phối hợp các phương pháp phổ càng cao. Trong một số trường hợp, để xác
HV: Nguyễn Duy Hải

11


định cấu trúc hóa học của hợp chất người ta phải dựa vào các phương pháp phổ
khác như chuyển hóa hóa học, kết hợp với phương pháp sắc kí so sánh…
2.3.1. Phổ hồng ngoại (Infraed Spectroscopy-IR)
Phổ hồng ngoại được xây dựng dựa vào sự khác nhau về dao động của các liên
kết trong phân tử hợp chất dưới sự kích thích của tia hồng ngoại. Mỗi kiểu liên kết
được đặc trưng bởi một vùng bước sóng khác nhau. Do đó dựa vào phổ hồng ngoại
có thể xác định các nhóm đặc trưng trong hợp chất, ví dụ như dao động hóa trị của
nhóm OH tự do trong các nhóm hyđroxyl là 3300-3450 cm-1, của nhóm cacbonyl

C=O là khoảng 1700-1750 cm-1, của nhóm NH là khoảng 3100-3500 cm-1.v.v…
2.3.2. Phổ khối lượng (Mass spectroscopy - MS)
Nguyên tắc của phương pháp phổ này là dựa vào sự phân mảnh ion của phân
tử chất dưới sự bắn phá của chùm ion bên ngoài. Phổ MS còn cho các pic ion mảnh
khác mà dựa vào đó mà người ta có thể xác định được cơ chế phân mảnh, và dựng
lại được cấu trúc các hợp chất. Hiện nay có rất nhiều phương pháp phổ khối lượng,
những phương pháp chủ yếu được nêu ra dưới đây:
+ Phổ EI-MS (Electron Impact Ionization Mass Spectroscopy) dựa vào sự
phân mảnh ion dưới tác dụng của chùm ion bắn phá năng lượng khác nhau, phổ biến là
70 eV.
+ Phổ ESI-MS (Electron Spray Ionization Mass Spectroscopy) gọi là phổ
phun mù điện tử. Phổ này được thực hiện với năng lượng bắn phá thấp hơn nhiều
so với phổ EI-MS, do đó phổ thu được chủ yếu là các pic ion phân tử và các pic
đặc trưng cho sự phá vỡ các liên kết có mức năng lượng thấp dễ bị phá vỡ.
+ Phổ FAB (Fast Atom Bombing Mass Spectroscopy) là phổ bắn phá
nguyên tử nhanh. Với sự bắn phá nguyên tử nhanh ở mức năng lượng thấp, do đó
phổ thu được cũng dễ thu được pic ion phân tử.
+ Phổ khối lượng phân giải cao (High Resolution Mass Spectroscopy), cho
phép xác định pic ion phân tử hoặc ion mảnh với sự chính xác cao.
Ngoài ra, hiện nay người ta còn sử dụng kết hợp các phương pháp sắc kí kết
hợp với phổ khác như: GC-MS (sắc kí khí - khối phổ), LC - MS (sắc kí lỏng - khối

HV: Nguyễn Duy Hải

12


phổ). Các phương pháp kết hợp này còn đặc biệt hữu hiệu khi phân tích thành phần
của hỗn hợp chất đặc biệt là đối với phân tích thuốc trong ngành dược.v.v…
2.3.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một trong những phương pháp phổ hiện đại và
hữu hiệu nhất hiện nay. Với việc sử dụng kết hợp các kĩ thuật phổ NMR một chiều
và hai chiều, các nhà nghiên cứu có thể xác định cấu trúc của hợp chất, kể cả cấu
trúc lập thể của phân tử.
Nguyên lý chung của các phương pháp phổ NMR (phổ proton và cacbon) là
sự cộng hưởng khác nhau của các hạt nhân từ 1H và

C) dưới tác dụng của từ

13

trường ngoài. Sự cộng hưởng khác nhau nay được biểu diễn bằng độ dịch chuyển
hóa học (chemical shift). Ngoài ra đặc trưng của nhân tử còn được xác định dựa
vào tương tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau (spin coupling).
2.3.3.1. Phổ 1H - NMR
Trong phổ 1H - NMR độ dịch chuyển hóa học (δ) của các proton được xác
định trong thang ppm từ 0- 14ppm, tùy thuộc vào mức độ lai hóa của nguyên tử
cũng như đặc trưng của độ dịch chuyển hóa học và tương tác spin mà ta xác định
được cấu trúc hóa học của các hợp chất.
2.3.3.2. Phổ 13C - NMR
Phổ này cho tín hiệu phổ vạch cacbon. Mỗi nguyên tử cacbon sẽ cộng hưởng
ở một trường khác nhau và cho tín hiệu phổ khác nhau. Thang đo phổ 13C - NMR
là ppm, với dải thang độ rộng 0- 230ppm.
2.3.3.3. Phổ DEPT (Distortionless Enhancement By Polarisation Transfer)
Phổ này cho ta tín hiệu phân loại các loại cacbon khác nhau. Trên phổ DEPT
cacbon bậc 4 không có tín hiệu, tín hiệu CH và CH3 nằm về một phía và của CH2
nằm về một phía trên phổ DEPT 1350. Trên phổ DEPT 900 chỉ xuất hiện tín hiệu
phổ của các CH.
2.3.3.4. Phổ 2D - NMR
Đây là kĩ thuật phổ 2 chiều cho phép xác định tương tác của các hạt nhân từ

của phân tử trong không gian hai chiều. Một số kĩ thuật chủ yếu thường được sử
dụng như sau:
HV: Nguyễn Duy Hải

13


- Phổ HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence)
Các tương tác trực tiếp H-C được xác định nhờ vào các tương tác trên phổ
này. Trên phổ một là trục phổ 1H-NMR, còn trục kia là 13C-NMR. Các tương tác
HSQC nằm trên đỉnh các ô vuông trên phổ.
- Phổ COSY (Correlation Spectroscopy)
Phổ này biểu diễn các tương tác xa của H-H, chủ yếu là các proton đính với
cacbon liền kề nhau. Nhờ phổ này mà các phân tử được ghép nối với nhau.
- Phổ HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Correlation)
Đây là phổ biểu diễn tương tác xa trong không gian phân tử. Nhờ vào các
tương tác trên phổ này mà từng phần của phân tử cũng như toàn bộ phân tử được
xác định về cấu trúc.
- Phổ NOESY (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy)
Phổ này biểu diễn các tương tác xa trong không gian của các proton không
kể đến các liên kết mà chỉ tính đến khoảng cách nhất định trong không gian. Dựa
vào kết quả phổ này có thể xác định cấu trúc không gian của phân tử.
Người ta còn sử dụng hiệu ứng NOE bằng kĩ thuật phổ NOE differences để
xác định cấu trúc không gian của phân tử bằng việc đưa vào một xung đúng bằng
từ trường cộng hưởng của một proton xác định thì các proton có cùng phía vế
không gian cũng như gần nhau về không gian sẽ cộng hưởng mạnh hơn và cho tín
hiệu cộng hưởng với cường độ mạnh hơn.
Ngoài ra còn sử dụng phổ X-RAY (nhiễu xạ Rơngen) để xác định cấu trúc
không gian của toàn phân tử của hợp chất kết tinh ở dạng đơn tinh thể. Nhưng
phạm vi sử dụng của nó hạn chế vì yêu cầu tiên quyết của phương pháp này là cần

phải có đơn tinh thể. Đây là một điều kiện không phổ biến đối với các hợp chất
hữu cơ.
Như trên đã đề cập, ngoài việc sử dụng các loại phổ người ta còn sử dụng kết
hợp với các phương pháp chuyển hóa hóa học cũng như các phương pháp phân
tích so sánh kết hợp khác. Đặc biệt với phân tử nhiều mạch chính dài, tín hiệu phổ
NMR bị chồng lấp nhiều, khó xác định được chính xác chiều dài các mạch. Đối
với phân tử có các đơn vị đường thì việc xác định chính xác các loại đường cũng
HV: Nguyễn Duy Hải

14


như cấu hình đường thông thường phải sử dụng phương pháp thủy phân rồi xác
định bằng phương pháp so sánh LC-MS hoặc GC-MS với các đường chuẩn dự
kiến.
2.4. Phương pháp định lượng và đánh giá chất sạch bằng LC/MS/MS
Phương pháp này có ưu điểm là nhận diện rất rõ ràng cả về định tính và định
lượng, đồng thời các phương pháp này rất nhạy và thích hợp cho việc đánh giá độ
sạch của hợp chất.
- Thiết lập thông số cho sắc lý lỏng


Các lựa chọn cho hệ dung môi:

Các hệ dung môi: acetonitrile/nước (25:75, v/v)


Các lựa chọn cột sắc ký:

Cột Sunfire -C18 RP (4,6 x 150 mm), 5µm



Bước sóng được lự chọn: 225 nm



Lự chọn các thông số khác: Nhiệt độ 25oC; Tốc độ dòng: 1 ml/phút; Lượng

mẫu bơm 5µl; Thời gian chạy 35 phút.
- Thiết lập chương trình chạy
Chạy gradien: hệ thống sắc ký phân tích được thử nghiệm ban đầu với hệ
dung môi hữu cơ, tỷ lệ dung môi được lựa chọn qua các bước tối ưu hóa.
- Thiết lập các điều kiện thí nghiệm cho hệ thống sắc ký lỏng


Bước đầu thiết lập các thông số:
- Cột sắc ký được lựa chọn Sunfire -C18 RP (4.6 x 150 mm), 5µm.
-

Hệ dung môi hữu cơ ban đầu là nước và ACN, thành phần của pha động

bao gồm kênh A : H2O (0,1% axit focmic), kênh B : Acetonitrile .
- Tốc độ dòng 1 ml/phút, chạy gradient
Thời gian (phút)
Kênh A (%)
Kênh B (%)
0–2
80
20
2 – 20

0
100
20 - 30
0
100
30 - 35
80
20
- Detector PDA : bước sóng 225 nm. Thể tích mẫu bơm vào máy 5µl
Thông số của detector MS:
HV: Nguyễn Duy Hải

15


- Sử dụng nguồn ion hóa ESI: thông số nhiệt độ khí nito của nguồn 280 0C, áp
suất khí 30psi, lưu lượng khí 8lit/phút, điện áp của nguồn 4,5Kv, Mod đo negative
với các ion định lượng được phân mảnh với năng lượng va chạm (CID) của khí
heli trong Trap là 0,7 -1,0 Ampl.
- Chuẩn bị mẫu phân tích:
 Cân chính xác mẫu khô (3 lần)
 Chiết siêu âm (3 lần, mỗi lần 30 phút)
 Cô quay thu được cao chiết tổng, cân khối lượng
 Pha cao chiết tổng trong metanol
- Xây dựng đường chuẩn:
Về nguyên tắc phân tích, khi đã định tính được pic nào trên sắc ký đồ tương
ứng với chất nào và đã có sắc ký đồ của các mẫu chuẩn với những nồng độ khác
nhau thì ta có thể tính ra nồng độ của chất phân tích bằng phương pháp đường
chuẩn, cách thức làm như sau:
 Vẽ đồ thị của diện tích pic theo nồng độ, từ đó dùng chương trình bình

phương tối thiểu để tìm ra đường hồi quy tuyến tính.
 Từ phương trình đường hồi quy dạng A = a + bC trong đó A là diện tích pic;
C là nồng độ của chất phân tích; a, b là hệ số hồi quy. Căn cứ vào sắc ký đồ
của mẫu, ta có được A của chất cần phân tích, dựa vào phương trình này ta
sẽ suy ra nồng độ của chất cần phân tích trên đường chuẩn.
 Từ nồng độ này, căn cứ vào khối lượng hay thể tích mẫu (dịch chiết) cũng
như các thể tích pha loãng thì sẽ suy ra hàm lượng của chất cần phân tích
trong mẫu.
 Trên cơ sở đó, từ chất chuẩn ban đầu với nồng độ tương ứng được pha để
tạo dung dịch gốc stock (A1). Từ dung dịch gốc này tiến hành pha một dãy
các nồng độ khác nhau (B1  B4) để tiến hành xây dựng đường chuẩn.
 Các nồng độ chất chuẩn đã được đo lặp lại 3 lần
 Kết quả phân tích mẫu chất chuẩn ở các nồng độ khác nhau thu được sẽ tiến
hành xây dựng đường chuẩn.

HV: Nguyễn Duy Hải

16