Sắc kí lỏng hiệu nâng cao (HPLC)

Sắc kí lỏng hiệu nâng cao (HPLC)

GVHD: Th.S Lưu Huỳnh Vạn Long
Sinh viên thực hiện: Nguyễn Ngọc Phương Uyên
Nguyễn Hoàng Yến
Lê Huỳnh Phương Thảo
Lê Phạm Huynh
Nguyễn Thanh Thiện
Vũ Thị Lan Anh


Sắc kí lỏng hiệu nâng cao (HPLC)

10/6/17

2

Sắc kí lỏng hiệu nâng cao (HPLC)


Sắc kí lỏng hiệu nâng cao (HPLC)

1. Các bộ phận của máy HPLC

2. Các loại pha tĩnh để nhồi cột sắc ký HPLC

3. Các loại đầu dò trong HPLC

4. Điều chế các hợp chất cần phân tích

10/6/17

3

Sắc kí lỏng hiệu nâng cao (HPLC)


1. Các bộ phận của máy HPLC

Bình chứa dung môi giải ly
cột

Đầu dò
Máy bơm

Máy HPLC

Bộ phận chích mẫu vào
máy

10/6/17

Cột sắc ký (và cột bảo
vệ)

4

Sắc kí lỏng hiệu nâng cao (HPLC)


Sắc kí lỏng hiệu nâng cao (HPLC)

1: Bình chứa pha động.

5: Cộ sắc ký (pha tĩnh)

2: Bộ phận khử khí

6: Đầu dò 

3: Bơm cao áp

7: Hệ thống máy tính có phần mềm ghi nhận tín hiệu, xử lý dữ liệu và điều khiển hệ thống.

4: Bộ phận tiêm mẫu

8: In dữ liệu. 

10/6/17

5

Sắc kí lỏng hiệu nâng cao (HPLC)


1. Các bộ phận của máy HPLC

10/6/17

6

Sắc kí lỏng hiệu nâng cao (HPLC)


1. Các bộ phận của máy HPLC
1. Bình chứa dung môi giải ly cột

-

Làm bằng chất liệu trơ, thường là thủy tinh.

-

Cấu tạo:

+

Nắp bảo vệ  tránh bụi rơi vào bình.

+

Ống dẫn dung môi từ bình vào ống sắc ký, có gắn nút lọc bằng kim loại  lọc dung môi và giữ ống luôn ở dưới
mặt thoáng của chất lỏng.

-

Cần phải loại bỏ phần không khí đã hòa tan vào dung môi trước
khi lắp bình dung môi vào vị trí  khử bọt khí.

10/6/17

7

Sắc kí lỏng hiệu nâng cao (HPLC)


1. Các bộ phận của máy HPLC

2. Máy bơm

-

10/6/17

Là loại máy bơm đặc biệt có:

+

Áp suất: 7.000 psi (48,3 Mpa).

+

Vận tốc bơm: 0,5 - 4,0 ml/phút.

-

Dùng để bơm dung môi (pha động) đi xuyên ngang qua một pha tĩnh (được nhồi chặt bởi những hạt rất mịn).

-

Bơm được cấu tạo bằng lọa chất liệu chịu được dung môi hữu cơ và các dung dịch đệm.

8

Sắc kí lỏng hiệu nâng cao (HPLC)


1. Các bộ phận của máy HPLC

3. Cột sắc ký (và cột bảo vệ)

-

Làm bằng thép không gỉ:

+

Chiều dài: 10 – 25 cm.

+

Đường kính trong: 2,1 – 4,6 mm.

-

Tiêu chuẩn hạt nhồi cột: đường kính ≤ 5µm.

-

Trước khi pha động vào cột phân tích cần phải cho qua cột bảo vệ  lọc bỏ những chất tạp bẩn còn sót lại.

10/6/17

9

Sắc kí lỏng hiệu nâng cao (HPLC)


1. Các bộ phận của máy HPLC

4. Bộ phận chích mẫu vào máy

-

Ống chứa mẫu là van có 2 cổng  định hướng dòng chảy của pha động.

-

Khi máy đang hoạt động đều, pha động lỏng đi xuyên ngang qua cột sắc ký nhờ một máy bơm tạo áp suất cao.

10/6/17

10

Sắc kí lỏng hiệu nâng cao (HPLC)


1. Các bộ phận của máy HPLC

10/6/17

11

Sắc kí lỏng hiệu nâng cao (HPLC)


1. Các bộ phận của máy HPLC
5. Đầu dò

-

Dùng để theo dõi dòng chảy của dung môi giải ly  khi nào các hợp chất đi ra khỏi cột.

-

Một số tiêu chuẩn lý tưởng của đầu dò HPLC:

10/6/17

+

Độ bền cao, không làm hư hại mẫu phân tích.

+

Độ nhạy cao, cho kết quả có tính lặp lại.

+

Cho đáp ứng tương đồng với những chất phân tích có cấu trúc hóa học tương đồng.

+

Không thay đổi khi có sự thay đổi nhiệt độ, áp suất.

+

Thời gian đáp ứng ngắn, độc lập với vận tốc dòng chảy của dung môi giải ly.

12

Sắc kí lỏng hiệu nâng cao (HPLC)


1. Các bộ phận của máy HPLC

10/6/17

13

Sắc kí lỏng hiệu nâng cao (HPLC)


1. Các bộ phận của máy HPLC

10/6/17

14

Sắc kí lỏng hiệu nâng cao (HPLC)

2. Các loại pha tĩnh để nhồi cột sắc ký HPLC

Có nhiều loại pha tĩnh để nhồi cột HPLC: pha thường, pha tạo nối, pha đảo, trao đổi ion, sắc ký gel,…

Loại cột

Tính chất của hợp chất có thể phân tích

Trọng lượng phân tử nhỏ(<2.000). Không có mang điện tích. Có
Cột pha thường, pha đảo, pha tạo nối

tính phân cực hoặc không. Có thể hòa tan trong dung môi hữu cơ
hoặc nước.

Trọng lượng phân tử nhỏ(<2.000). Phân tử mang điện tích. Hòa tan

Cột trao đổi ion

trong nước.

Trọng lượng phân tử nhỏ hoặc lớn. Không mang điện tích. Có thể
Cột sắc ký gel

10/6/17

hòa tan trong dung môi hữu cơ hoặc nước.

15

Sắc kí lỏng hiệu nâng cao (HPLC)


2. Các loại pha tĩnh để nhồi cột sắc ký HPLC

1.Pha thường:



HPLC pha thường được xem là kỹ thuật sắc ký hấp thu, sử dụng một pha động không phân cực,
kết hợp pha tĩnh phân cực.



Cơ chế tách chất dựa vào phân bố các nguyên tử chất tan giữa dung dịch và sự hấp thụ lên bề mặt
pha tĩnh.



10/6/17

Nguyên liệu dùng cho sắc ký rắn-lỏng là silica gel,alumin và graphit…

16

Sắc kí lỏng hiệu nâng cao (HPLC)


2. Các loại pha tĩnh để nhồi cột sắc ký HPLC



Cơ chế hấp thu là tương tác giữa nhóm silanol của silica gel với nhóm chức phân cực của phân tử chất tan.



Sắc ký lỏng-lỏng bao gồm pha động lỏng và pha tĩnh lỏng.



Sắc ký lỏng-lỏng có thể phân loại thành :
sắc ký lỏng-lỏng pha thường và sắc ký lỏng-lỏng pha đảo.



Điểm bất tiện của sắc ký lỏng-lỏng là dung môi giải ly phải bão hòa với pha tĩnh, không thể áp dụng kỹ thuật
giải ly với dung môi có độ phân cực tăng dần.

10/6/17

17

Sắc kí lỏng hiệu nâng cao (HPLC)


2. Các loại pha tĩnh để nhồi cột sắc ký HPLC
2.Pha tạo nối :
Ưu điểm :



Phân tử phân cực,không phân cực, loại ion, khả năng ion hóa…đều có thể tách chỉ bởi một cột sắc ký và với pha động phù
hợp.



Chế tạo nhiều loại pha tĩnh với độ phân cực khác nhau.



Lựa chọn nhiều loại dung môi giải ly.



Dung môi giải ly là nước kết hợp với dung môi hữu cơ.



Áp dụng kỹ thuật giải ly với dung môi có độ phân cực tăng dần mà không làm hư hại pha tĩnh.



Hệ thống đạt sự cân bằng nhanh và không để lại các hệ quả xấu.

10/6/17

18

Sắc kí lỏng hiệu nâng cao (HPLC)

2. Các loại pha tĩnh để nhồi cột sắc ký HPLC

Nhược điểm :



Dung môi chỉ ở khoảng pH 2,5-8,5



Không thể sử dụng các dung môi có tính oxi hóa.

*Các loại pha tạo nối :

 Các nhóm alkyl như octadecyl(C18H37),….
 Các nhóm phân cực như amino,cyano propyl,eter,diol.
 Các nhóm trao đổi ion như acid sulfonic,amino,ammonium tứ cấp.

10/6/17

19

Sắc kí lỏng hiệu nâng cao (HPLC)


2. Các loại pha tĩnh để nhồi cột sắc ký HPLC

2.1.Nguyên liệu tổng hợp pha nối:

-

Giao đoạn thông dụng nhất là sử dụng clorur tionyl để biến nhóm silanol thành clorosilan.

-

Tiếp đó, cho nhóm clorosilan + amin để tạo alkyl aminosilan

-

Nguyên liệu được tạo thành bằng cách cho nhóm silanol bề

mặt tác dụng với organo-clorosilan giúp

nối pha tĩnh vào chất mang, ngang qua nối siloxan(Si-O-Si).

10/6/17

20

Sắc kí lỏng hiệu nâng cao (HPLC)


2. Các loại pha tĩnh để nhồi cột sắc ký HPLC

10/6/17

21

Sắc kí lỏng hiệu nâng cao (HPLC)

2. Các loại pha tĩnh để nhồi cột sắc ký HPLC

 Silan chỉ nối duy nhất một nhóm clor,phản ứng sẽ tạo ra một pha tĩnh mang những nhóm
dimetylsilan một cách đồng đều và pha tĩnh như thế sẽ bị che phủ bởi 8-12% carbon.

 Sử dụng diclorosilan hoặc triclorosilan, nghĩa là Si nối với hai hoặc ba nhóm clor, sẽ có
phản ứng tạo nối ngang tạo nên một pha tĩnh có mức độ tạo nối không thể xác định được.

10/6/17

22

Sắc kí lỏng hiệu nâng cao (HPLC)


2. Các loại pha tĩnh để nhồi cột sắc ký HPLC

Hình 5

10/6/17

23

Sắc kí lỏng hiệu nâng cao (HPLC)


2. Các loại pha tĩnh để nhồi cột sắc ký HPLC

2.2. Cơ chế bắt giữ chất của pha tạo nối:

 Cơ chế bắt giữ chất của pha tạo nối rất phức tạp,cơ chế khác nhau và chưa được hiểu rõ.
 Các nhóm silanol còn sót lại trên bề mặt của hạt silica có thể gây hiệu ứng hấp thu, khiến cho có hiện
tượng tín hiệu mũi trên sắc ký đồ kéo đuôi,tạo vệt dài.

10/6/17

24

Sắc kí lỏng hiệu nâng cao (HPLC)


2. Các loại pha tĩnh để nhồi cột sắc ký HPLC

 Việc lựa chọn dây alkyl dài hoặc ngắn : một nguyên tắc tổng quát là các hợp chất tan có tính phân cực được tách tốt
hơn nhờ vào pha tĩnh có dây alkyl ngắn và chất tan có tính kém phân cực được tách tốt hơn nhờ vào pha tĩnh có dây
alkyl dài.

 Pha tĩnh nitril thường để tách các porphyrin. Các pha tĩnh aminoalkyl thường được sử dụng để tách các loại đường và
peptid, không nên sử dụng pha này để tách các hợp chất carbonyl vì hợp chất này sẽ tạo thành base Schiff với pha
tĩnh.

10/6/17

25

Sắc kí lỏng hiệu nâng cao (HPLC)