Nghiên cứu thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ bằng enzyme pepsin thô

TÓM TẮT
LỜI NÓI ĐẦU

CAM ĐOAN

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH VẼ

−
−
−
−
−
−
−
−

CP: chế phẩm.
Da: đơn vị khối lượng phân tử.
kDa: kilo Dalton.
OD: Optical density – mật độ quang.
U: Unit – Đơn vị hoạt độ protease.
UV-Vis: Ultraviolet–visible spectroscopy – quang phổ tử ngoại khả kiến.
v/w: volume/weigh – thể tích/khối lượng.
w/v weigh/volume – khối lượng/thể tích.

1


Nghiên cứu thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ bằng enzyme pepsin thô

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Cá ngừ là một trong những loại thủy sản có giá trị kinh tế cao và kim ngạch xuất
khẩu lớn của Việt Nam: theo Tổng cục thủy sản Việt Nam, sản lượng khai thác cá ngừ
5 tháng đầu năm 2016 ước đạt 9,605 tấn [53]. Trong khi đó, theo Hiệp hội chế biến và
xuất khẩu cá ngừ Việt Nam, giá trị xuất khẩu cá ngừ trong tháng 2/2017 đạt hơn 36.6
triệu USD, tăng 53% so với cùng kỳ năm 2016 [51]. Các sản phẩm cá ngừ xuất khẩu
của nước ta bao gồm: đóng hộp, tươi sống, đông lạnh và khô. Phần thịt được sử dụng
trong sản xuất chủ yếu là phần thịt trắng, trong khi đó phần thịt đỏ không được sử
dụng chiếm đến 11% tổng khối lượng của cá [21].
Trong thịt đỏ cá ngừ có chứa 18.28% protein và lượng lớn các acid amin thiết
yếu như: Isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, tryptophan,…[28].
Hiện nay ở các nhà máy sản xuất các sản phẩm từ cá ngừ ở một số tỉnh, thành phố như
Đà Nẵng, Cà Mau vẫn chưa có biện pháp tối ưu để xử lý phần thịt đỏ này, mà chỉ được
sử dụng làm thức ăn chăn nuôi hoặc bán ra các đầu mối bán lẻ tại chợ với giá thành rất
rẻ từ 4.000 - 5.000 đ/kg. Thịt đỏ cá ngừ có màu sắc đặc trưng vì chúng chứa các hợp
chất mang màu mà chủ yếu là myoglobin (Mb) và hemoglobin (Hb). Thịt đỏ này dễ bị
biến đổi thành màu tối do sự oxi hóa nguyên tử sắt (Fe) trong nhóm hem của protein
khi tiếp xúc với oxy để hình thành dạng metMb (Mb-Fe 3+) có màu nâu không mong
muốn [20].
Ở nước ta hiện nay vẫn chưa có nhiều nghiên cứu [6] tập trung vào việc tận dụng
thịt đỏ cá ngừ để sản xuất các sản phẩm có giá trị gia tăng. Đề tài này nghiên cứu một
số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân thịt đỏ cá ngừ bằng chế phẩm enzyme
pepsin thô tách chiết từ nội tạng cá như: tỷ lệ enzyme/nguyên liệu, tỷ lệ nguyên
liệu/nước, thời gian phản ứng, pH và nhiệt độ môi trường phản ứng để có thể tạo ra
được dịch đạm có hàm lượng dinh dưỡng cao và chất lượng đảm bảo với giá thành rẻ.
2. Mục tiêu của đề tài
Mục tiêu của đề tài này là
− Xác định được thành phần của thịt đỏ cá ngừ.

− Tách chiết chế phẩm enzyme pepsin thô từ nội tạng cá ngừ.
− Nghiên cứu những điều kiện tối ưu để thủy phân protein từ thịt đỏ cá ngừ bằng
chế phẩm enzyme pepsin thô được tách chiết từ nội tạng cá ngừ gồm có: tỷ lệ
enzyme/nguyên liệu, tỷ lệ nguyên liệu/nước, thời gian thủy phân và nhiệt độ thủy
phân. Hướng đến sử dụng dịch đạm thủy phân làm thức ăn dinh dưỡng cho con người.
Trang 2


Nghiên cứu thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ bằng enzyme pepsin thô

3. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
3.1. Đối tượng nghiên cứu
− Thịt đỏ cá ngừ - sản phẩm phụ của ngành công nghiệp chế biến cá ngừ, đưcọ
cung cấp bởi Công ty TNHH MTV đồ hộp Hạ Long.
− Nội tạng cá ngừ được thu mua tại chợ.
3.2. Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp vật lý: xác định nhiệt độ bằng nhiệt kế
Phương pháp hóa lý: xác định pH của môi trường và dịch đạm sau thủy phân.
Phương pháp hóa sinh: thực hiện các phản ứng để thủy phân protein thịt đỏ cá
ngừ bằng chế phẩm enzyme pepsin thô ở các điều kiện thay đổi; xác định các thành
phần hóa học của thịt đỏ cá ngừ như protein, độ ẩm, lipid, tro, ni-tơ tổng số, ni-tơ
amin.
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
Ý nghĩa khoa học: ở Việt Nam hiện nay vẫn chưa có nhiều nghiên cứu về thủy
phân thịt đỏ cá ngừ để tạo các sản phẩm có giá trị dinh dưỡng cao cho người sử dụng.
Nghiên cứu này giúp xác định các điều kiện tối ưu để thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ
bằng chế phẩm enzyme pepsin thô tách chiết từ nội tạng cá. Nghiên cứu này sẽ tìm
thêm một hướng đi mới trong việc sản xuất dịch đạm có dinh dưỡng cao, ngoài ra việc
tận dụng nội tạng cá ngừ để đưa vào nghiên cứu cũng góp phần vào việc bảo vệ môi
trường sống.

Ý nghĩa thực tiễn: ở Việt Nam và thế giới hiện có rất ít sản phẩm được sản xuất
từ dịch đạm thủy phân có hàm lượng dinh dưỡng cao và giá thành những sản phẩm
này khá cao. Đề tài này sử dụng nguyên liệu là phụ phẩm và phế phẩm của ngành công
nghiệp thủy sản do đó sẽ là hạ giá thành của sản phẩm. Vì vậy đây là một đề tài có tính
thực tiễn cao, sản phẩm có tính thân thiện với môi trường và an toàn cho người sử
dụng.
5. Kết cấu của đồ án tốt nghiệp
Tóm tắt
Nhiệm vụ đồ án
Lời nói đầu
Cam đoan
Mục lục
Danh mục bảng biểu và hình ảnh
Danh sách các ký hiệu và chữ viết tắt
Chương 1: Tổng quan tài liệu
Chương 2: Vật liệu và phương pháp
Trang 3


Nghiên cứu thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ bằng enzyme pepsin thô

Chương 3: Kết quả và thảo luận
Chương 4: Kết luận và kiến nghị
Tài liệu tham khảo
Phụ lục

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu về thịt đỏ cá ngừ
1.1.1. Đặc điểm của thịt đỏ cá ngừ

Cá ngừ là một loại thủy sản có giá trị dinh dưỡng và kinh tế cao. Trong cá ngừ có
hai loại thịt là thịt trắng và thịt đỏ. Phần thịt đỏ có vị trí nằm sát và dọc theo xương
sống, có màu sậm.
Trong công nghệ chế biến cá, phần thịt đỏ thường là phế phẩm được vứt bỏ do có
mùi tanh và hương vị ít thơm ngon như phần thịt trắng, phần thịt này thường chiếm
đến 11% tổng trọng lượng của thịt cá [21].
Hiện tại, lượng thịt này thường được sử dụng để sản xuất thức ăn chăn nuôi với
giá thành khá rẻ.
1.1.2. Thành phần của thịt đỏ cá ngừ
Trong thịt đỏ cá ngừ có chứa một lượng lớn protein, acid amine tự do,
carbohydrate và một số chất khoáng. Bên cạnh đó, màu sắc của thịt đỏ là do các hợp
chất mang màu mà chủ yếu là myoglobin (Mb) và hemoglobin (Hb), hàm lượng của
chúng trong thịt đỏ cá ngừ cao hơn gấp 5 lần so với thịt trắng [21]. Thịt đỏ dễ bị biến
đổi màu sắc do sự oxi hóa nguyên tử sắt trong nhóm hem của protein khi tiếp xúc với
không khí để hình thành dạng metMb (Mb-Fe3+) có màu nâu [20].
Trong thịt đỏ cá ngừ có một lượng lớn protein, nước và chất béo. Hàm lượng các
chất có trong thịt đỏ cá ngừ được thể hiện ở bảng 1.1.
Bảng 1.1. Hàm lượng các chất và năng lượng trong 100g thịt đỏ cá ngừ [35].
Thành phần
Calorie (kcal/100g)
Độ ẩm (g/100g)
Protein (g/100g)
Chất béo (g/100g)
Carbohydrate (g/100g)

Hàm lượng
120
69.37
18.28
4.631

0.75
Trang 4


Nghiên cứu thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ bằng enzyme pepsin thô

Trong thịt đỏ cá ngừ có một lượng lớn các acid amin thiết yếu cho cơ thể như
acid glutamic, leucine, isoleucine. Ngoài ra trong thịt đỏ có chứa một lượng nhỏ
histidine, trong điều kiện thích hợp chúng sẽ chuyển hóa thành histamine – là một chất
gây nên hiện tượng dị ứng cho cơ thể người sử dụng.
Hàm lượng một số acid amin có trong thịt đỏ cá ngừ được trình bày trong bảng
1.2 sau:
Bảng 1.2. Hàm lượng một số acid amin có trong thịt đỏ cá ngừ [35].
Thành phần
Hàm lượng (g/100g khô)
Acid glutamic
13.35
Leucine
8.57
Isoleucine
5
Valine
4.24
Lysine
4.17
Histidine
2.38
Tryptophan
0.45
Hàm lượng một số chất khoáng có trong thịt đỏ cá ngừ được thể hiện trong bảng

1.3. sau:
Bảng 1.3. Hàm lượng các chất khoáng có trong thịt đỏ cá ngừ [35].
Thành phần
Tro (g/100g khô)
Kali (mg/100g khô)
Canxi (mg/100g khô)
Natri (mg/100g khô)
Sắt (mg/100g khô)

Hàm lượng
1.224
238.4
134.4
53.74
11.05

1.2. Tổng quan về pepsinogen và enzyme pepsin
1.2.1. Pepsinogen
Pepsinogen là một dạng tiền enzyme của enzyme pepsin, chúng được sản xuất
bởi các tế bào gốc của tuyến oxyntic. Pepsinogen thường có trong biểu mô thành dạ
dày và được tiết ra bởi dạ dày, chúng được hoạt hóa thành pepsin khi có dự hiện diện
của HCl [37, trang 6].
1.2.1.1. Cấu trúc và phân loại của
pepsinogen
Pepsinogen của nhiều loài động vật có xương sống như động vật có vú, gia cầm,
động vật lưỡng cư và cá đã được tách chiết và xác định trình tự chuỗi protein và DNA.
Pepsinogen là mỗi chuỗi protein đơn bao gồm khoảng 370 acid amin, có khối
lượng phân tử khoảng 42kDa và trong cấu trúc phân tử có 3 cầu nối disulfua. Điểm pH
Trang 5

Nghiên cứu thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ bằng enzyme pepsin thô

đẳng điện của pepsinogen ở pH 3.7, chúng khá bền ở pH 7 đến 9, tuy nhiên ở pH acid
pepsinogen sẽ chuyển thành pepsin [37, trang 6].
Pepsinogen của các loài động vật có vú được chia thành năm nhóm bao gồm
pepsinogen A (PG-A), pepsinogen B (PG-B), pepsinogen F (PG-F), pepsinogen C
(PG-C, hay progastricsin) và pepsinogen Y (PG-Y hay prochymosin) [30]. Sự phân
loại pepsinogen ở các loài cá rất đa dạng. Một vài nhà khoa học dựa vào hệ thống phân
loại pepsinogen của động vật có vú và phân chia pepsinogen của cá thành 3 loại: PGA, PG-B và PG-C [26, 33], trong khi một số nhà khoa học khác phân thành PG-I, PGII, PG-III, và PG-IV [46, 47].

Hình 1.1.Cấu trúc của phân tử pepsinogen tách chiết từ golden mandarin fish
(Siniperca scherzeri) [23].
Tuy nhiên, pepsinogen cá có những đặc điểm rất riêng biệt so với các
pepsinogen từ động vật có vú như: pepsinogen của các loài cá có điểm đẳng điện pI
cao hơn, pH tối ưu cao hơn, hằng số Michaelis khác nhau, nhiệt độ tối ưu thấp hơn và
độ bền nhiệt thấp hơn [49].
1.2.1.2. Sự chuyển đổi pepsinogen
thành pepsin
Pepsin cùng một số enzyme khác được tổng hợp trong dạ dày thường tồn tại ở
dạng zymogen (tiền enzyme), chúng sẽ được chuyển thành dạng hoạt động nhờ sự có
mặt của các aicd trong dịch vị dạ dày [37, trang 6].
Quá trình hoạt hóa tiền enzyme là một quá trình phức tạp bao gồm các phản ứng
để cắt đứt các liên kết và các thay đổi về cấu trúc của zymogen, dẫn đến kết quả làm
các trung tâm hoạt động của enzyme được bộc lộ ra bên ngoài [40].
Trang 6


Nghiên cứu thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ bằng enzyme pepsin thô

Ở pH 2, phản ứng hoạt hóa pepsinogen xảy ra rất nhanh và không xảy ra hiện
tượng tự thủy phân chính nó [31, trang 6]. Phản ứng hoạt hóa pepsinogen là một phản
ứng tự xúc tác và một trong những sản phẩm của phản ứng này (enzyme pepsin) là
chất xúc tác cho chính phản ứng này. Bằng chứng là khi cho một lượng enzyme pepsin
vào thì tốc độ của phản ứng hoạt hóa tăng lên.
Khoảng 7 đến 9 liên kết peptide bị cắt đứt trong quá trình hoạt hóa pepsinogen,
tuy nhiên cũng có thể chỉ có 1 trong những liên kết bị cắt đứt và 6 đến 8 liên kết còn
lại là những vị trí liên kết yếu không liên quan đến quá trình hoạt hóa pepsinogen [41].
Nhìn chung, trong quá trình hoạt hóa pepsinogen để tạo thành pepsin phải có ít nhất
một liên kết bị cắt đứt và pepsin là chất xúc tác cho quá trình này. Kết quả của quá
trình hoạt hóa pepsinogen là 44 acid amin bị loại bỏ, khối lượng phân tử giảm xuống
từ 42 Kdal còn lại 35.5 Kdal và điểm pH đẳng điện từ 3.7 thay đổi thành dưới 1. Ngoài
ra, pepsinogen của lợn gồm có 363 acid amin, khi chúng được hoạt hóa thành pepsin
thì chuỗi polypeptide chỉ còn lại 321 acid amin. Trong quá trình hoạt hóa đã có 42 acid
amin bị mất đi trong đó có 9 lysine, 2 histidine, 2 arginine [39].
1.2.2. Pepsin
1.2.2.1. Cấu tạo, nguồn gốc và phân
loại pepsin
Pepsin là một enzyme thuộc họ aspatic protease ở trong dạ dày của động vật có
xương sống. Enzyme pepsin thuộc nhóm endopeptidase hoạt động ở điều kiện acid,
chúng giữ một vai trò quan trọng trong quá trình tiêu hóa của động vật có xương sống
[27]. Cấu trúc của chúng gồm một chuỗi polypeptide đơn có chứa 321 acid amin, có
khối lượng phân tử khoảng 35.5 kDa. Pepsin được tìm thấy và phân lập chủ yếu ở dịch
vị dạ dày của một số loài như người, gia súc, cừu, chim và cá. Pepsin ở các loài động
vật có vú thường có ở dạ dày (ở cả niêm mạc và dịch vị), tuy nhiên chúng cũng được
tìm thấy một lượng nhỏ ở máu, cơ và nước tiểu. Đối với cá, enzyme pepsin thường có
ở dạ dày nhưng cũng được phát hiện trong trứng cá hồi hay da cá nóc. Có rất nhiều
loại enzyme pepsin khác nhau trong dạ dày, mỗi loại sẽ có cấu trúc protein và tính chất
khác nhau [49].
Pepsin được tổng hợp và tiết ra ở màng dạ dày dưới dạng tiền hoạt động gọi là

pepsinogen (PG). Khi HCl được tiết vào dịch dạ dày (lúc này pH=1.5-2.0), 44 acid
amin phân giải theo cơ thế tự xúc tác để kích hoạt thành pepsin.
Cấu trúc pepsin từ các loài động vật có vú đã được miêu tả chi tiết, pepsin từ cá
vẫn chưa được nghiên cứu sâu rộng. Nghiên cứu đầu tiên là sự phát hiện cấu trúc
không gian vùng trung tâm hoạt động và thành phần amino acid của pepsin từ cá thu
Trang 7


Nghiên cứu thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ bằng enzyme pepsin thô

gần giống với pepsin từ lợn (57,7% chuỗi đồng nhất). Pepsin của cá thu là một chuỗi
đơn protein (một monome) của hai vùng xoắn cuộn tương đồng phân chia bởi một nếp
gấp sâu [31].
Vùng xúc tác của pepsin được hình thành tại vùng tiếp xúc của hai vùng và có
chứa hai gốc aspartic acid là Asp 32 và Asp 215 ở mỗi vùng. Trong hoạt động xúc tác
của pepsin, phân tử nước có nhiệm vụ hoạt hóa hay kìm hãm hoạt động nhóm carboxyl
của Asp 215 và Asp 32 một cách độc lập để bẽ gãy hay giữ nguyên liên kết peptide
trong phân tử protein [49].

Hình 1.2. Cấu trúc của pepsin tách chiết từ Atlantic cod (Gadus morhua) [31].
Danh pháp và phân loại pepsin dựa trên đặc điểm riêng biệt của enzyme như
hoạt độ, độ bền, động học, thành phần của mỗi loại enzyme bao gồm cả vùng xúc tác
chứa gốc aspartate, sự thoái hóa protein và cấu trúc bậc 3. Phân loại của enzyme
pepsin cũng từ phân loại của pepsinogen tương ứng của nó.
1.2.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến
hoạt độ của enzyme pepsin
Hoạt độ của pepsin được đo bởi khả năng phân giải protein chịu ảnh hưởng của
pH, nhiệt độ và các chất ức chế.
a) pH
Cả pH tối ưu (giá trị pH cho hoạt động xúc tác hiệu quả nhất) và pH ổn định (giá

trị pH giữ độ bền của enzyme) đều có ảnh hưởng lớn đến hoạt động của pepsin cá. Khi
pH xa dần giá trị tối ưu thì độ hoạt độ của pepsin sẽ giảm dần. El-Beltagy và cộng sự
(2004) đã nghiên cứu pepsin I và II từ loài cá rô phi thấy rằng cả hai loại đều có pH tối
ưu là 2.5 và chứng minh rằng càng xa pH tối ưu thì hoạt lực pepsin càng giảm [24].

Trang 8


Nghiên cứu thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ bằng enzyme pepsin thô

Nhìn chung, nếu trong cá có hơn một loại pepsin, pH tối ưu của chúng sẽ gần
giống nhau. Tuy nhiên, điều này không áp dụng cho một số loài cá như cá trứng Bắc
cực. Như vậy, pepsin chủ yếu bền ở điều kiện pH thấp. Pepsin là một loài protease ưa
acid và độ bền giảm như protein bị biến tính ở pH trên 6.0 [43].
Theo Sitthipong Nalinanon (2010) [38], pH tối ưu của enzyme pepsin từ nội tạng
cá ngừ vây dài (Thunnus alalunga) là 2 cá ngừ vằn (Katsuwonus pelamis) là 2.5, đối
với pepsin của 2 loài cá này, pH tối ưu của chúng nằm trong khoảng 2 đến 2.5.
b) Nhiệt độ
Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn lên hoạt động của pepsin của cá. Cũng như pH,
nhiệt độ tối ưu và khoảng ổn định nhiệt cũng rất quan trọng. Nhiệt độ tối ưu của
enzyme của cá nằm trong khoảng 30oC đến 55oC. Khi nhiệt độ xa giá trị tối ưu, hoạt độ
của enzyme sẽ giảm. Nhiệt độ tối ưu của pepsin cá phụ thuộc chủ yếu vào loài cá (cá
sống ở vùng nước nóng hay nước lạnh). Các loài cá ở vùng nước lạnh có nhiệt độ tối
ưu thấp hơn những loài sống ở vùng nước nóng. Hoạt độ của pepsin I và II từ vùng
nước mặn nóng tối ưu lần lượt ở nhiệt độ 40 oC và 55oC, trong khi ở vùng nước lạnh thì
nhiệt độ tối ưu của hai loại pepsin này lần lượt là 38oC và 43oC [49].
Nhiệt độ cao ảnh hưởng đến độ bền của enzyme pepsin tùy thuộc vào loài cá.
Tuy nhiên, pepsin từ loài nước lạnh dễ bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ cao hơn. Nhiệt độ
cao làm biến tính pepsin và phá hủy cấu trúc của nó.
Theo Sitthipong Nalinanon (2010) [38] nhiệt độ tối ưu của enzyme pepsin từ nội

tạng cá ngừ vây dài (Thunnus alalunga) là 50oC.
c) Các chất ức chế
Pepstatin A (một chất kìm hãm hoạt động aspartic proteinase) có thể cạnh tranh
với cơ chất của pepsin và ngăn cản sự gắn enzyme vào cơ chất, vì vậy làm ức chế hoạt
động xúc tác của enzyme [22, trang 40].
Không phải tất cả các chất ức chế protease đều có ảnh hưởng ức chế lên pepsin.
Một số chất tiêu biểu như phenyl methyl sulfonyl fluoride (PMSF), là một chất ức chế
serine protease; ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA), là một chất ức chế
metalloenzyme nhưng không có bất cứ tác dụng kìm hãm nào đối với enzyme pepsin
[19].
Tuy nhiên, một số chất hóa học có khả năng ức chế hoạt động của enzyme
pepsin. Các chất có khả năng ức chế hoạt động của pepsin như : Sodium dodecyl
sulfate (SDS) ở 0.05-0.1% (w/v) và cysteine ở nồng độ 5-50 mM [37] có tác dụng kìm
hãm lên pepsin từ loài cá thu ngừ (Thunnus alalunga) cá ngừ vằn (Katsuwonus
Trang 9


Nghiên cứu thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ bằng enzyme pepsin thô

pelamis) và cá ngừ bò (Thunnus tonggol). Các hợp chất như methanol, ethanol,
amylalcol ức chế hoạt động pepsin ở nồng độ thấp, mức độ ức chế của các loại hợp
chất alcohol tăng theo kích thước phân tử của chúng [45].
Adenosine tri phosphate (ATP), molybdate, NaCl, MgCl 2, và CaCl2 không có
ảnh hưởng nào lên hoạt động xúc tác của pepsin từ cá thu ngừ, cá ngừ đuôi dài, cá bơn
và cá đuôi chuột [36].
1.2.3. Ứng dụng trong công nghiệp của enzyme pepsin
− Chiết xuất Collagen.
− Nghiên cứu y học: Pepsin được sử dụng trong việc điều trị các vấn đề về tiêu
hóa, khử trùng răng và chữa các bệnh như bệnh khó tiêu, đau dạ dày, nôn mửa dai
dằng, bệnh tiêu chảy ở trẻ con, và cả một số bệnh ung thư.

− Sản xuất phô mai.
− Sản xuất cá hộp.
− Xử lý và chế biến cá. [49]
1.3. Tổng quan về protein và quá trình thủy phân protein
1.3.1. Protein
Protein là cá polymer phân tử lớn được tạo thành từ các monomer mà chủ yếu là
các L-acid amin kết hợp với nhau qua liên kết peptide [7, trang 10].
1.3.2. Quá trình thủy phân protein
Quá trình thủy phân protein là quá trình cắt mạch các phân tử peptid ở các liên
kết peptid tạo ra các phân tử có kích thước nhỏ hơn như: peptone, polypeptide, peptide
và acid amin [7, trang18]. Trong quá trình thủy phân protein, các liên kết peptid bị cắt
đứt theo các trình tự để tạo thành các phân tử có kích thước khác nhau:
Protein
Polypeptide
Peptide
Acid amin
Sản phẩm của quá trình thủy phân protein là các polypeptide, peptide, acid amin
và một lượng nhỏ amoniac. Hầu hết các acid amin sản phẩm tạo thành chủ yếu là các
L-α amino acid [7, trang 13].
1.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân protein bằng enzyme
1.3.3.1. Ảnh hưởng của nồng độ cơ
chất và nồng độ enzyme đến phản ứng
thủy phân protein bằng enzyme
Ở giai đoạn đầu của phản ứng, nếu nồng độ enzyme thấp thì tốc độ phản ứng
enzyme phụ thuộc tuyến tính với nồng độ cơ chất [2, trang 41]. Khi tăng lượng cơ chất
Trang 10


Nghiên cứu thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ bằng enzyme pepsin thô

thì tốc độ phản ứng ban đầu sẽ tăng. Khi toàn bộ enzyme kết hợp với cơ chất để tạo
nên phức hợp phản ứng enzyme-cơ chất, nếu ta tiếp tục cho cơ chất vào thì tốc độ
phản ứng sẽ không đổi, khi đó tốc độ phản ứng đạt trạng thái tối đa.
Trong điều kiện dư thừa cơ chất, tốc độ phản ứng enzyme sẽ phụ thuộc vào nồng
độ enzyme. Khi nồng độ enzyme tăng sẽ làm tăng tốc độ phản ứng. Trong trường hợp
nồng độ enzyme quá lớn, tốc độ phản ứng sẽ tăng chậm và sau một khoảng thời gian
ngắn, tốc độ phản ứng sẽ không đổi theo thời gian.
1.3.3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến phản ứng enzyme. Khi nhiệt độ tăng tốc độ
phản ứng sẽ tăng theo, tuy nhiên tốc độ phản ứng chỉ tăng đến một giới hạn nhiệt độ
nhất định. Vượt quá nhiệt độ đó, tốc độ phản ứng enzyme sẽ giảm dần và dẫn đến triệt
tiêu.
Nhiệt độ tương ứng với tốc độ phản ứng enzyme cao nhất được gọi là nhiệt độ tối
ưu. Phần lớn enzyme hoạt động mạnh ở nhiệt độ 40 – 50 oC, một số enzyme khác hoạt
động mạnh ở 60oC và một số khác ở 70 oC. Với mỗi enzyme khác nhau thì có nhiệt độ
hoạt động tối ưu khác nhau. Nếu đưa nhiệt độ lên cao hơn nhiệt độ tối ưu, hoạt tính
của enzyme sẽ giảm và không có khả năng phục hồi lại được. Ngược lại, ở nhiệt độ
0oC enzyme bị ức chế hoạt động rất mạnh nhưng khi đưa nhiệt độ từ từ lên nhiệt độ tối
ưu, hoạt tính enzyme sẽ tăng dần lên đến mức tối đa [2, trang 45].
1.3.3.3. Ảnh hưởng của pH
Chỉ số pH có ảnh hưởng rất lớn đến vận tốc phản ứng enzyme. Mỗi enzyme chỉ
hoạt động tốt ở một pH xác định gọi là pH hoạt động tối thích của enzyme. pH môi
trường ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, enzyme và đặc biệt là độ bền của
enzyme [2, trang 44].
Nhiều enzyme hoạt động rất mạnh ở pH trung tính, tuy nhiên cũng có nhiều
enzyme hoạt động mạnh ở pH acid yếu. Tuy nhiên có một số loại enzyme có thể hoạt
động mạnh ở cả pH kiềm và acid.
1.3.3.4. Ảnh hưởng của thời gian
phản ứng
Thời gian phản ứng có ảnh hưởng lớn đến hiệu suất của quá trình thủy phân và

tính chất của dịch thủy phân. Thời gian phản ứng ngắn sẽ làm giảm hiệu suất của quá
trình do enzyme chưa thủy phân hết cơ chất có trong môi trường. Khi thời gian phản
ứng tăng sẽ làm tăng hiệu suất thủy phân protein những kéo theo đó là sự phát triển
Trang 11


Nghiên cứu thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ bằng enzyme pepsin thô

của các vi sinh vật tạo ra các sản phẩm như H 2S, NH3,… làm giảm chất lượng của dịch
thủy phân.
1.3.3.5. Ảnh hưởng của các chất
kìm hãm
Hoạt độ của enzyme có thể bị thay đổi bởi một số chất hóa học khác nhau. Các
chất hóa học này có trong các phản ứng enzyme nhưng không bị chuyển hóa bởi các
enzyme đó [2, trang 46].
Các chất gây kìm hãm hoạt động của enzyme bao gồm các ion, các phân tử vô
cơ, hữu cơ và cả các phân tử protein. Cơ chế kìm hãm của các chất có thể là thuận
nghịch hoặc không thuận nghịch.
1.3.3.6. Ảnh hưởng của các chất
hoạt hóa
Các chất có khả năng làm tăng hoạt tính của enzyme được gọi là các chất hoạt
hóa. Các chất này có bản chất khác nhau, chúng có thể là các anion, các ion kim loại
hoặc là các chất hữu cơ có cấu trúc phức tạp. Các chất hoạt hóa này chỉ có khả năng
hoạt hóa ở một nồng độ nhất định, vượt quá nồng độ này chúng sẽ làm ức chế hoạt
động của enzyme [2, trang 51].
1.4. Tình hình nghiên cứu về thủy phân protein từ cá
1.4.1. Nghiên cứu trong nước
Một số nghiên cứu liên quan tới vấn đề đặt ra của luận văn được thực hiện ở điều
kiện trong nước như sau:
Theo Nguyễn Trọng Cẩn thì có thể sản xuất dịch đạm thủy phân từ nguyên liệu

cá bằng cách sử dụng Aspergillus Orizae hoặc vi khuẩn. Khi sử dụng mốc Aspergillus
Orizae để thủy phân thịt cá thì trong mốc này có chứa hệ enzyme protease như
innulase, imetase, asparaginase, glutaminase, proteolytic. Những enzyme này có tác
dụng thủy phân trong điều kiện thích hợp là nhiệt độ 37-41 oC, pH = 6-8, tỉ lệ nấm mốc
thường sử dụng là 3-4% so với nguyên liệu. Thời gian thủy phân tùy thuộc vào mức độ
hoạt động của nấm mốc và yêu cầu hàm lượng đạm của sản phẩm. Đối với sản xuất
nước mắm, thời gian thủy phân từ 10-15 ngày thì thu được chượp chín. Lượng muối
bổ sung vào quá trình thủy phân thường từ 4-6% để tránh thối rữa. Nếu bổ sung một
lượng muối cao hơn thì protease của mốc bị ức chế, không hoạt động. Sản xuất dịch
đạm thủy phân từ nấm mốc có thể có những nhược điểm như: Dịch đạm không có
hương thơm, dễ bị đắng, có thể là do xác vi sinh vật còn tồn tại, hoặc do các loại muối
Trang 12


Nghiên cứu thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ bằng enzyme pepsin thô

canxi, ma-giê có trong muối ăn; dịch đạm dễ bị chua, có nhiều nguyên nhân: có thể do
lượng tinh bột mà mốc sử dụng không hết trong quá trình chế biến lên men lactic, có
thể do các acid bay hơi hình thành khi cá bị ươn [5].
Trong công trình “Ảnh hưởng các điều kiện chiết khác nhau đến hiệu suất thu
hồi protein từ cơ thị đỏ cá ngừ” (2012) của Phạm Thị Hiền đã đưa ra được ảnh hưởng
của pH, nhiệt độ, thời gian chiết, tỷ lệ dung môi và nguyên liệu lên hiệu quả tách chiết
protein từ thịt đỏ cá ngừ. Hiệu suất thu hồi protein cao nhất tại pH = 13, thời gian chiết
1h, nhiệt độ dung môi chiết 30oC, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi chiết = 1/10 [6].
Cũng trong năm 2012 công trình “Sản xuất sản phẩm thủy phân protein từ đầu
cá ngừ vây vàng bằng protease thương mại” của Nguyễn Thị Mỹ Hương đưa ra sản
phẩm thủy phân protein từ đầu cá ngừ vây vàng bằng enzyme Protamex 0.5% ở nhiệt
độ 45oC và pH tự nhiên trong thời gian 6 giờ với tỉ lệ nước/nguyên liệu là 1:1. Kết quả
nghiên cứu đã chỉ ra độ thủy phân và tỉ lệ thu hồi nitơ trong sản phẩm thủy phân tăng
lên cùng với sự tăng thời gian thủy phân. Sau 6 giờ thủy phân, độ thủy phân đã đạt

được 30.1% và tỉ lệ thu hồi nitơ là 85.1%. Sản phẩm thủy phân protein từ đầu cá ngừ
vây vàng có hàm lượng protein 88.2%, lipit 1.4% và tro 8.3%. Sản phẩm thủy phân
protein này có hàm lượng acid amin không thay thế cao [4].
Năm 2014, Trần Thanh Trúc và cộng sự đã thực hiện công trình “Nghiên cứu khả
năng thủy phân dịch protein của thịt đầu tôm sú bằng enzyme protease nội tại”. Thông
qua nội dung nghiên cứu, xác định các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tự thủy phân
protein như thời gian thủy phân thích hợp, ảnh hưởng của pH đến môi trường thủy
phân. Đặc biệt, điều kiện tiền xử lý nhiệt nhằm kích hoạt hệ enzyme protease nội bào.
Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng, thời gian thủy phân protein tốt nhất, dịch thủy phân
không có mùi lạ là 8 giờ, đồng thời, quá trình thủy phân protein đạt tốt nhất khi điều
chỉnh pH môi trường là 9, kết hợp với thông số tối ưu của điều kiện tiền xử lý nhiệt
nguyên liệu là 50.73oC và thời gian là 4.43 phút [13].
Cũng trong năm 2014, Nguyễn Thị Mỹ Hương trong nghiên cứu “Thành phần
dinh dưỡng của các sản phẩm thủy phân từ đầu và xương cá chẽm (Lates calcarifer)
bằng enzyme Flavourzyme” đã tiến hành thủy phân đầu và xương cá chẽm (Lates
calcarifer) bằng enzyme Flavourzyme với tỉ lệ enzyme 0.5% so với nguyên liệu, tỉ lệ
nước : nguyên liệu là 1:1, quá trình thủy phân được thực hiện ở nhiệt độ 50°C, pH tự
nhiên (6.5) trong thời gian 6 giờ. Kết quả nghiên cứu cho thấy bột thủy phân protein
có hàm lượng protein cao (81.5%), hàm lượng lipit thấp (1.80%) và hàm lượng tro
7.4%. Bột protein không tan có hàm lượng protein 67.3%, hàm lượng lipit 16.5% và
hàm lượng tro 6.9%. Bột thủy phân protein và bột protein không tan có giá trị dinh
Trang 13


Nghiên cứu thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ bằng enzyme pepsin thô

dưỡng cao với các acid amin không thay thế. Dầu cá từ đầu và xương cá chẽm giàu
axit béo omega 3 (26.18%), đặc biệt là axit docosahexaenoic (DHA) và axit
eicosapentaenoic (EPA) [3].
Năm 2015, công trình “Nghiên cứu ứng dụng enzyme protamex để thủy phân cá

trích (Sardinella Gibbosa) thu dịch đạm” của Trần Thị Bích Thủy đưa ra điều kiện
thủy phân thích hợp để thu dịch đạm giàu acid amine từ protein của cá trích bằng
enzyme Protamex ở pH tự nhiên với tỷ lệ nước/nguyên liệu là 1/1. Kết quả nghiên cứu
cho thấy điều kiện thủy phân thích hợp là: nhiệt độ 50 oC, tỷ lệ enzyme - cơ chất 0.5%
(w/v), thời gian 6 giờ. Độ thủy phân, hiệu suất thu hồi nitơ, hàm lượng nitơ ammonia
và hàm lượng nitơ acid amine trong dịch thủy phân thu được lần lượt đạt là 70.73%,
63.04%, 1.57 g/l và 12.88 g/l [14].
Hiện nay, các công trình nghiên cứu về thịt đỏ cá ngừ vẫn còn ít, chưa toàn diện.
Nghiên cứu quá trình thủy phân thịt đỏ cá ngừ bằng enzyme pepsin thô vẫn chưa có.
1.4.2. Nghiên cứu nước ngoài
Để đáp ứng được nhu cầu ngày càng cao của con người về “thực phẩm phân tử”,
nhiều nước trên thế giới đã nghiên cứu ứng dụng công nghệ enzyme thủy phân protein,
dựa trên tính năng của các protease, để sản xuất ra một loại thực phẩm giàu dinh
dưỡng và dễ hấp thụ, đó là dịch protein thủy phân.
Ling Lin Liu và cộng sự (1981) đã sản xuất dịch đạm thủy phân từ cá bằng
enzyme pepsin, nhưng các tác giả lại không sử dụng chế phẩm enzyme có sẵn trên thị
trường mà chỉ chiết lấy dịch thô enzyme từ dạ dày lợn để giảm chi phí sản xuất. Tuy
nhiên, chất lượng sản phẩm chưa cao vì enzyme có chứa nhiều tạp chất [33].
Ở Anh, Imm J.Y. và Lee C.M. (1999) đã nghiên cứu sản xuất bột gia vị thủy sản
từ lươn đỏ Urophycis chuss bằng enzyme Flavourzyme and Savorase ở điều kiện pH
tự nhiên của cá (6.8) và tỷ lệ nước/cá là 2/5, tác giả còn bổ sung thêm 1.5% NaCl và
0.4% Sodium Tripolyphosphate (STPP) để cải thiện chất lượng của gia vị bằng cách
loại bỏ vị đắng và mùi tanh đặc trưng của cá. Kết quả nghiên cứu cho thấy với thời
gian thủy phân 6 giờ cho hiệu suất thủy phân cao nhất, quá trình thủy phân đã làm tăng
hàm lượng của hầu hết các acid amin tự do, dịch thủy phân cho hàm lượng cao các
acid amin tạo vị umami và vị ngọt cao hơn so với nước dùng khi nấu nguyên liệu [29].
Ở Pháp, Guerard F. (2002) đã ứng dụng công nghệ enzyme trong sản xuất dịch
đạm thủy phân từ phế thải của nhà máy sản xuất cá hộp. Theo tác giả, dịch thủy phân
protein cá (FPH) đang ngày càng thu hút sự quan tâm vì khả năng ứng dụng của chúng
như một nguồn peptid có hoạt tính sinh học hoặc như nguồn cơ chất nitơ để chuẩn bị

môi trường lên men vi sinh vật. Các phế thải của nhà máy chế biến cá hộp được thủy
Trang 14


Nghiên cứu thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ bằng enzyme pepsin thô

phân với enzyme protease thương mại “Umamizyme”. Quá trình thủy phân enzyme
được tiến hành trong bình lên men 1 lít, ở pH 7 nhiệt độ 45°C. Các yếu tố ảnh hưởng
đến quá trình thủy phân được nghiên cứu (tỷ lệ enzyme/cơ chất protein thay đổi trong
khoảng từ 0.1 đến 1.5% (w/w), mức độ thủy phân protein, hàm lượng nitơ giải phóng
ra, trọng lượng phân tử của peptid. Kết quả thu được khi tỷ lệ enzyme/cơ chất là 1,5%,
sau 4 giờ thủy phân thì mức độ thủy phân lên đến 22.5%. Tác giả cũng đã xác định
được đường thẳng tuyến tính giữa mức độ thủy phân và hàm lượng nitơ thu hồi. Nhân
tố giới hạn quá trình thủy phân được rút ra từ kết quả thí nghiệm là nhiệt độ 45°C và
pH 7. Các kết quả thí nghiệm cũng cho thấy khi thủy phân phế thải của quá trình chế
biến cá ngừ, enzyme “Umamizyme” có hiệu quả thủy phân tương đương với enzyme
Alcalase® 2, 4L. Tuy nhiên, tính ổn định của enzyme Umamizyme thấp hơn enzyme
Alcalase® 2,4L [28].
Sofiane Ghorbel và cộng sự (2005) tạo môi trường cung cấp nitơ cho quá trình
nuôi Rhizopus oryzae đã sử dụng dịch thủy phân từ cá mòi bằng cách cho thủy phân
nguyên liệu cá mòi bằng enzyme Alcalase với tỷ lệ nguyên liệu/nước = 8% (w/v) ở pH
8.0 và 60oC, thời gian phản ứng thủy phân là 3 giờ. Kết quả chỉ ra rằng nguồn nitơ từ
cá tạo điều kiện cho R.oryzae phát triển tốt và tạo ra sản phẩm lipase tốt hơn so với
peptone, từ đó chỉ ra rằng dịch thủy phân từ cá có thể ứng dụng trong quá trình công
nghiệp lên men [42].
Anusha G.P. và cộng sự (2007) cũng đã tiến hành nghiên cứu thu nhận dịch thủy
phân từ cá Hake Thái Bình Dương. Các điều kiện thủy phân khác nhau đã được thực
hiện bao gồm tự thủy phân (1 giờ ở 52oC và pH 5.5), hoặc bằng bổ sung các enzyme
thương mại như Validase ® BNP hay Flavourzyme 500® L. Dịch thủy phân thu được
từ loài cá này được chứng minh là có hoạt tính chống ôxy hóa [17].

Ở Malaysia, S.Y.Yu và L.K.Tan (1990) đã sử dụng enzyme alkalase 0.61 để sản
xuất dịch đạm thủy phân từ cá rô phi Oreochromis mossambicus. Điều kiện thủy phân
cho hiệu suất cao là ở nhiệt độ 50 oC, pH là 8.0, với tỷ lệ một phần nước và một phần
thịt cá; tỷ lệ enzyme và cơ chất là 1:50. Sau khi đã trung hòa, dịch thuỷ phân được thu
hồi và làm nguyên liệu sản xuất bánh quy “Keropok” [48].
Năm 2010, Mahmoudreza Ovissipour và cộng sự, đã tạo dịch thủy phân từ nội
tạng cá ngừ vây vàng (Thunnus albacares). Điều kiện thủy phân (hoạt độ của enzyme,
nhiệt độ, và thời gian) được tối ưu hóa bằng cách sử dụng phương pháp phản ứng bề
mặt. Điều kiện tối ưu để đạt mức độ thủy phân cao nhất ở nhiệt độ 60.4 oC, thời gian
90.25 phút và hoạt độ của protease (Alcalase 2,2L) là 70,22 AU/kg protein. Dịch thủy

Trang 15


Nghiên cứu thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ bằng enzyme pepsin thô

phân được sấy khô và xác định được tỷ lệ protein tương đối cao (72.34%) và lipid thấp
(1.43%) với tỷ lệ hiệu quả trong phân giải protein từ nội tạng cá ngừ là 2.85-5.35 [34].
Trong báo cáo năm 2012 của Faouzi Ben Rebah và Nabil Miled đã chỉ ra rằng
ngành công nghiệp thủy sản tạo ra một lượng lớn sản phẩm phụ, tạo một vấn đề lớn
cho môi trường và sức khỏe của con người. Để tránh lãng phí các sản phẩm phụ này,
các phương pháp khác nhau đã được sử dụng bao hồm: ủ chua, lên men, thủy phân và
sản xuất dầu cá. Kết quả cho thấy các sản phẩm loại bỏ trong quá trình sản xuất chế
biến thủy sản là một nguồn cung cấp dinh dưỡng tuyệt vời cho sự sinh trưởng và phát
triển của vi sinh vật trong quá trình sản xuất enzyme, mà có thể thay thế những môi
trường có chi phí cao do phải cung cấp các yếu tố tăng trưởng trong môi trường. Các
phụ phẩm (đầu, nội tạng, nước thải,…) đã được sử dụng và thử nghiệm làm môi
trường phát triển cho các vi sinh vật sản xuất enzyme như protease, lipase, chitinolytic
và enzyme ligninolytic đã bước đầu cho thấy có nhiều lợi thế trong quá trình sản xuất
enzyme như năng suất cao, kỹ thuật đơn giản, giảm nhu cầu năng lượng và chi phí sản

xuất [25].
Từ các kết quả nghiên cứu ở trên cho thấy, công nghệ enzyme có thể xúc tác cho
quá trình chuyển hóa các nguyên liệu giá trị thấp (cá tạp kém giá trị, phế phụ phẩm
tôm, cá, ...) thành một loại thực phẩm chức năng có giá trị cao gấp nhiều lần. Ứng
dụng enzyme để thủy phân protein sẽ triệt để hơn, thu được dịch đạm thuỷ phân có
chất lượng cao do tạo ra được nhiều các peptit và acid amin có thành phần, tỷ lệ cân
đối để bổ sung vào các thực phẩm khác cho người. Dịch đạm thuỷ phân được xem là
nguyên liệu đầu vào cho phát triển và sản xuất một số sản phẩm giá trị gia tăng như
bột dinh dưỡng, bột gia vị, tạo nước sốt, súp đặc trưng cho các sản phẩm từ thủy sản.

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1. Nguyên liệu và thiết bị sử dụng
2.1.1. Nguyên liệu
Thịt đỏ cá ngừ được Công ty TNHH MTV đồ hộp Hạ Long – Đà Nẵng cung cấp:
mẫu thịt đỏ được lấy từ dây chuyền sản xuất cá hộp “cá ngừ dầm dầu”, sau công đoạn
hấp loại bỏ nước tự do ở nhiệt độ 60 – 80oC.

Trang 16


Nghiên cứu thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ bằng enzyme pepsin thô

Hình 2.3. Mẫu thịt đỏ cá ngừ được cung cấp bởi Công ty TNHH MTV đồ hộp Hạ
Long – Đà Nẵng trước và sau khi rã đông.
Quy cách lấy mẫu và bảo quản mẫu: mẫu thịt đỏ được bảo quản trong túi nilon
đặt trong thùng xốp được chuyển về phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học của
Trường Đại học Bách Khoa – Đại học Đà Nẵng. Tại đây, mẫu thịt đỏ được phân chia
vào các túi PE với khối lượng 100g. Các mẫu này có thể trực tiếp đem đi làm thí
nghiệm hoặc bảo quản trong tủ lạnh -20 oC, những lần thí nghiệm tiếp theo mẫu sẽ

được rã đông ở nhiệt độ phòng tới nhiệt độ khối thịt từ 0 – 1 oC rồi mang đi xử lý và
khảo sát.
Vật liệu để tách chiết chế phẩm enzyme pepsin thô: nội tạng cá ngừ được thu
mua tại chợ Hòa Khánh thuộc phường Hòa Khánh Bắc, quận Liên Chiểu, thành phố
Đà Nẵng sau được rửa qua với dung dịch nước muối 1 – 1.5% và sau đó bảo quản
trong tủ lạnh -20oC. Khi tiến hành nghiên cứu và khảo sát, mẫu mẫu sẽ được rã đông ở
nhiệt độ phòng tới nhiệt độ khối thịt từ 0 – 1oC.

Hình 2.4. Mẫu nội tạng cá ngừ thu mua từ chợ Hòa Khánh, Tp. Đà Nẵng.
Trang 17


Nghiên cứu thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ bằng enzyme pepsin thô

2.1.2. Thiết bị
Trong nghiên cứu này tôi sử dụng các thiết bị có trong phòng thí nghệm Công
nghệ sinh học của trường Đại học Bách khoa – Đại học Đà Nẵng:
− Cân kỹ thuật OHAUS – Mỹ.
− Cân phân tích SHIMADZU AUY 220 – Nhật Bản.
− Máy đo pH TOLEDO MP220 – Thụy Sĩ.
− Máy xay sinh tố PANASONIC MX-SM 1031 – Malaysia.
− Máy lắc khô STUART SI500 – Anh.
− Máy ly tâm ROTANTA 460R – Đức.
− Tủ lạnh ALASSKA – Việt Nam.
− Tủ lạnh âm SANYO – Nhật Bản.
− Bếp điện.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Các phương pháp phân tích
2.2.1.1. Xác định hàm lượng ni-tơ
tổng số và protein thô thịt đỏ cá ngừ

Hàm lượng protein thô trong mẫu được xác đinh bằng phương pháp xác định
hàm lượng ni-tơ tổng số - phương pháp Kjeldahl.
Tất cả các dạng ni-tơ có trong cơ thể và các mô là ni-tơ tổng số. Ni-tơ trong các
acid amin của phân tử protein được gọi là ni-tơ protein, ni-tơ không có trong protein
như các muối amoni, của muối vô cơ, acid nitric, các amino acid tự do, các peptide,
urê và các dẫn xuất của urê, các alkaloid, các purin và pyrimidin… là các ni-tơ phi
protein.
Nguyên tắc của phương pháp Kjeldahl: Vô cơ hóa mẫu bằng acid sulfuric đậm
đặc, ni-tơ có trong mẫu sẽ chuyển thành amon sulfat. Dùng kiềm đặc đẩy amoniac ra
khỏi amon sulfat trong máy cất đạm tạo thành amon hydroxyt, sau đó định lượng bằng
acid. Hàm lượng ni-tơ trung bình trong phân tử protein của sản phẩm thủy sản là 16%
vì vậy hàm lượng protein thô trong mẫu thử bằng hàm lượng ni-tơ tổng số nhân với hệ
số 6.25. Quy trình được tiến hành theo TCVN 3705 – 1990 ở mục 2.1 phụ lục 2.
2.2.1.2. Xác định hàm lượng chất
béo thịt đỏ cá ngừ
Hàm lượng chất béo được xác định dựa theo phương pháp chiết Soxhlet theo
TCVN 3703:2009 ở mục 2.2 phụ lục 2.

Trang 18


Nghiên cứu thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ bằng enzyme pepsin thô

Nguyên tắc của phương pháp: Mẫu được xử lý bằng natri sulfat hoặc canxi sulfat,
chất béo giải phóng được trích ly bằng ete etylic. Dung môi được làm bay hơi và
lượng chất béo được xác định bằng cách cân.
2.2.1.3. Xác định hàm lượng tro
tổng số thịt đỏ cá ngừ
Nguyên tắc của phương pháp: Tro hóa hoàn toàn mẫu trong lò nung ở nhiệt độ từ
500 đến 550oC trong lò nung để chuyển hóa hoàn toàn chất hữu cơ thành tro có màu

xám trắng. Hàm lượng tro được xác định từ khối lượng tro còn lại sau khi tro hóa.
Quy trình được tiến hành theo TCVN 5105 – 2009 ở mục 2.3 phụ lục 2.
2.2.1.4. Xác định hàm lượng ẩm thịt
đỏ cá ngừ
Nguyên tắc của phương pháp: Dùng nhiệt để loại bỏ nước khỏi mẫu thử. Hiệu số
khối lượng của mẫu thử trước và sau khi sấy khô là lượng nước có trong mẫu thử.
Quy trình được tiến hành theo TCVN 3700 – 1990 ở mục 2.4 phụ lục 2.
2.2.1.5. Xác định hàm lượng ni-tơ
amin thịt đỏ cá ngừ và dịch đạm
Nguyên tắc của phương pháp: Cho amin tác dụng với formoldehyt tạo thành
nhóm –N=CH2 ( metylic) làm cho tính bazơ yếu đi và thể hiện tính acid. Do đó chuẩn
bằng chất chuẩn kiềm và chất chỉ thị acid-bazơ để kết thúc phản ứng.
Quy trình tiến hành theo TCVN 3707 – 1990 ở mục 2.5 phụ lục 2.
2.2.2. Xác định mức độ thủy phân protein trong dịch đạm
Mức độ thủy phân (H) của protein trong dịch đạm thu được sau quá trình thủy
phân dưới tác dụng của enzyme pepsin được tính theo công thức (1) sau:
H=

N AA − N AA0
N OA − N AA0

× 100%

(1) [50]
Trong đó:
NAA – Hàm lượng ni-tơ amin sau khi thủy phân, xác định bằng phương pháp
chuẩn độ formol.
NAA0 – Hàm lượng ni-tơ amin trong nguyên liệu ban đầu, xác định bằng phương
pháp chuẩn độ formol.
NOA – Hàm lượng ni-tơ tổng số trong nguyên liệu, được xác định bằng phương

pháp Kjeldahl.
Trang 19


Nghiên cứu thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ bằng enzyme pepsin thô

2.2.3. Thực nghiệm thu nhận CP enzyme pepsin thô từ nội tạng cá ngừ và xác định
hoạt độ của enzyme pepsin
2.2.3.1. Quy trình tách chiết enzyme
Nguyên liệu tươi

Xử lý
(nước muối 1-1.5%)

Thu enzyme thô

Bảo quản -20oC
Ly tâm 5000v/p, 15 phút, 4oC

Rã đông (0-1oC)
Thủy phân 45oC/40 phút
Nghiền

Phối trộn với nước theo tỉ lệ 1:1

Điều chỉnh pH đến 2-2.5

Hình 2.3. Sơ đồ quy trình tách chiết CP enzyme pepsin thô từ nội tạng cá ngừ [1].

Thuyết minh quy trình:

Nội tạng cá ngừ sau khi thu mua hoặc tách từ cá nếu trực tiếp sử dụng sẽ được
đưa đến công đoạn nghiền, còn nếu chưa được sử dụng sẽ được xử lý sơ bộ bằng cách
rửa với nước muối nồng độ 1-1.5% để loại bỏ các chất bẩn và bảo quản ở nhiệt độ
-20oC. Khi tiến hành nghiên cứu, nguyên liệu sẽ được rã đông ở nhiệt độ 0-1 oC sau đó
được nghiền nhỏ trong máy nghiền đến kích thước khoảng 1mm. Nguyên liệu sau khi
nghiền sẽ được trộn với nước cất theo tỉ lệ 1:1 và điều chỉnh pH đến 2-2.5. Tiếp đó sẽ
Trang 20


Nghiên cứu thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ bằng enzyme pepsin thô

tiến hành quá trình thủy phân các protein có trong nguyên liệu để loại bỏ chúng ra khỏi
hỗn hợp với enzyme pepsin ở 45 oC trong 40 phút. Khi quá trình thủy phân kết thúc,
hỗn hợp sau thủy phân sẽ được ly tâm ở tốc độ 5000v/p, trong 15 phút ở 4 oC và thu lấy
phần dịch enzyme thô. Dịch enzyme thu được gọi là chế phẩm enzyme pepsin thô.
2.2.3.2. Xác định hoạt độ pepsin
theo phương pháp Anson cải tiến [15, 52]
Nguyên tắc của phương pháp: Sử dụng casein làm cơ chất, dưới tác dụng của
enzyme protease ngoại bào trong thịt đỏ để thủy phân casein thành các đoạn peptid
ngắn và các acid amin trong đó có tyrosine. Xác định lượng tyrosine tạo thành bởi
thuốc thử Folin-Ciocalteu, phản ứng của tyrosine làm thuốc thử Folin-Ciocalteu
chuyển thành màu xanh và hấp thu quang mạnh nhất ở bước sóng 660nm. Dựa vào đồ
thị chuẩn để tính lượng tyrosin tương
ứngcávới
Thịt đỏ
ngừlượng sản phẩm thủy phân dưới tác
dụng của enzyme.
Quy trình tiến hành theo mục 2.6 phụ lục 2.
Nghiền nhỏ
2.2.4. Thực nghiệm nghiên cứu quá trình thủy phân thịt đỏ cá ngừ sử dụng CP

enzyme pepsin thô
2.2.4.1.
Điều chỉnh các thông
số: Bố trí thí nghiệm để xác
pH = 2 –định
2.5 tỷ lệ enzyme/ thịt đỏ cá ngừ thích
Nhiệt độ: 50 hợp
± 0.5oC
cho quá trình thủy phân
Tỷ lệ nguyên liệu/nước: 1/3
Mô tả thí nghiệm:
Thời gian: 2 giờ
Cho vào 7 bình tam giác mỗi bình 20g thịt đỏ cá ngừ đã được nghiền nhỏ bằng
máy xay sau đó bổ sung nước cất theo tỷ lệ 1/3 vào các bình. Điều chỉnh pH nguyên
liệu trong các bình về 2-2.5. Bổ sung enzyme pepsin đã được tách chiết trước đó vào 7
bình theo các tỷ lệ 0%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% so với nguyên liệu (v/w).
40%
45%
0%
25%
35%
20 %
30%
Quá trình thủy phân được tiến hành ở nhiệt độ 50 oC, trong 2 giờ. Sau quá trình thủy
phân, bất hoạt enzyme ở nhiệt độ 85-90oC trong 15 phút sau đó ly tâm thu lấy phần
dịch rồi đem đi cân và phân tích để xác định mức độ thủy phân. Từ đó đánh giá và
chọn tỷ lệ enzyme/nguyên liệu tối ưu để tiến hành các thí nghiệm tối ưu hóa các thông
số khác.
Phân tích hàm lượng ni-tơ amin và xác định mức độ thủy phân

Chọn tỷ lệ thích hợp
Trang 21

Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm để xác định tỷ lệ enzyme/thịt đỏ thích hợp cho quá trình thủy phân.


Nghiên cứu thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ bằng enzyme pepsin thô

Thịt đỏ cá ngừ

Nghiền nhỏ

Điều chỉnh các thông số:
pH = 2 – 2.5
Nhiệt độ: 50 ± 0.5oC
Tỷ lệ nguyên liệu/nước: 1/3 (w/v)
Tỷ lệ enzyme/nguyên liệu (v/w): 30%

1 giờ

2 giờ

3 giờ

4 giờ

5 giờ

2.2.4.2. Bố trí thí nghiệm để xác
định thời gian thích hợp cho quá trình

Phân tích hàm lượng ni-tơ amin và xác định mức độ thủy phân
thủy phân

Chọn thời gian tối ưu
Trang 22

Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm để xác định thời gian thích hợp cho quá trình thủy phân.


Nghiên cứu thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ bằng enzyme pepsin thô

Mô tả thí nghiệm:
Cho vào 5 bình tam giác mỗi bình 20g thịt đỏ cá ngừ đã được nghiền nhỏ bằng
máy xay sau đó bổ sung nước cất theo tỷ lệ 1 nguyên liệu 3 nước (w/v) vào các bình.
Điều chỉnh pH nguyên liệu trong các bình về 2-2.5. Bổ sung enzyme pepsin đã được
tách chiết trước đó vào 5 bình theo tỷ lệ 30% so với nguyên liệu (v/w). Quá trình thủy
phân được tiến hành ở nhiệt độ 50 oC, trong các khoảng thời gian 1, 2, 3, 4 và 5 giờ.
Sau quá trình thủy phân, bất hoạt enzyme ở nhiệt độ 85-90 oC trong 15 phút sau đó ly
tâm thu lấy phần dịch rồi đem đi cân và phân tích để xác định mức độ thủy phân. Từ

Trang 23


Nghiên cứu thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ bằng enzyme pepsin thô

đó đánh giá và chọn tỷ lệ enzyme/nguyên liệu tối ưu để tiến hành các thí nghiệm tối ưu
hóa các thông số khác.
2.2.4.3. Bố trí thí nghiệm để xác
định tỷ lệ nước và nguyên liệu thích hợp
Thịt đỏ cá ngừ

cho quá trình thủy phân
Nghiền nhỏ
Điều chỉnh các thông số:
pH = 2 – 2.5
Nhiệt độ: 50 ± 0.5oC
Thời gian: 2 giờ
Tỷ lệ enzyme/nguyên liệu (v/w): 30%

1/1

1/2

1/3

1/4

1/5

1/6

1/7

Phân tích hàm lượng ni-tơ amin và xác định mức độ thủy phân

Chọn tỷ lệ thích hợp
Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm để xác định tỷ lệ nước và nguyên liệu thích hợp cho quá trình thủy phân.

Mô tả thí nghiệm:
Cho vào 7 bình tam giác mỗi bình 20g thịt đỏ cá ngừ đã được nghiền nhỏ bằng
máy xay sau đó bổ sung nước cất theo các tỷ lệ nguyên liêu/nước 1/1, 1/2, 1/3, 1/4,

1/5, 1/6, 1/7 (w/v) rồi điều chỉnh pH của nguyên liệu về 2-2.5. Bổ sung enzyme pepsin
đã được tách chiết trước đó theo tỷ lệ 1% so với dịch thủy phân. Quá trình thủy phân
được tiến hành ở nhiệt độ 50oC. Theo nguyên tắc kế thừa thì các thí nghiệm sau phải
kế thừa kết quả của các thí nghiệm trước, tuy nhiên do điều kiện của phòng thí nghiệm
Trang 24


Nghiên cứu thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ bằng enzyme pepsin thô

nên các thí nghiệm sau chỉ tiến hành trong 2 giờ. Sau quá trình thủy phân, ta bất hoạt
enzyme ở 85-90oC trong 15 phút sau đó ly tâm thu lấy phần dịch rồi đem đi cân và
phân tích để mức độ thủy phân. Từ đó đánh giá và chọn tỷ lệ nguyên liệu/nước tối ưu
để tiến hành các thí nghiệm tối ưu hóa các thông số khác.
2.2.4.4. Bố trí thí nghiệm để xác
định
Thịt đỏ cá
ngừnhiệt độ thích hợp cho quá trình
thủy phân
Nghiền nhỏ
Điều chỉnh các thông số:
pH = 2 – 2.5
Tỷ lệ nguyên liệu/nước: 1/3 (w/v)
Thời gian: 2 giờ
Tỷ lệ enzyme/nguyên liệu (v/w): 30%

30oC

35oC

40oC

45oC

50oC

Phân tích hàm lượng ni-tơ amin và xác định mức độ thủy phân

Chọn nhiệt độ tối ưu
Hình 2.7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm để xác định nhiệt độ thích hợp cho quá trình thủy phân.

Mô tả thí nghiệm:
Cho vào 5 bình tam giác mỗi bình 20g thịt đỏ cá ngừ đã được nghiền nhỏ bằng
máy xay sau đó bổ sung nước cất theo tỷ lệ nguyên liệu/nước = 1/3 (w/v) vào các bình.
Điều chỉnh pH nguyên liệu trong các bình về 2-2.5. Bổ sung enzyme pepsin đã được
tách chiết trước đó vào 5 bình theo tỷ lệ 30% so với nguyên liệu (v/w). Quá trình thủy
Trang 25