Xây dựng phương pháp xác định hàm lượng cleistantoxin phân lập từ quả cây chà chôi ( cleistanthus tonkinensis) làm nguyên liệu phân lập chất chuẩn

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

KHÚC HOÀNG PHƯƠNG
Mã sinh viên: 1201460

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP
XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG
CLEISTANTOXIN PHÂN LẬP TỪ
QUẢ CỦA CÂY CHÀ CHÔI
(CLEISTANTHUS TONKINENSIS)
LÀM NGUYÊN LIỆU
THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN
KHĨA LUẬN TƠT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. ThS. Nguyễn Lâm Hồng
2. HVCH. Đào Tú Anh
Nơi thực hiện:
1. Bộ mơn Hóa phân tích - Độc chất
2. Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam

HÀ NỘI - 2017


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến ThS. Nguyễn Lâm Hồng Giảng viên Bộ mơn Hóa phân tích - Độc chất và HVCH. Đào Tú Anh, những
người đã trực tiếp hướng dẫn và tạo điều kiện về mọi mặt cho tôi trong suốt q
trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp này.
Tơi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cơ trong Bộ mơn Hóa phân
tích - Độc chất, Trường Đại học Dược Hà Nội đã quan tâm, giúp đỡ tôi trong thời

gian vừa qua.
Xin cảm ơn Ban lãnh đạo, các anh chị trong Phòng Tổng hợp Hữu cơ, Viện Hóa
sinh biển, đặc biệt là TS. Đồn Thị Mai Hương và ThS. Lê Cơng Vinh đã tận tình
chỉ bảo và tạo điều kiện thuận lợi trong thời gian tôi thực hiện khóa luận tại phịng.
Cũng nhân đây, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban giám hiệu, các thầy cô
giáo và cán bộ nhân viên Trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã dạy bảo và
giúp đỡ tôi trong suốt năm năm học tập tại trường.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, những người
đã ln ở bên động viên, cổ vũ và giúp đỡ để tơi có thể hồn thành khóa học này.
Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2017
Sinh viên

Khúc Hoàng Phương


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................................ 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .................................................................................. 3
1.1. Tổng quan về thực vật của cây Chà chôi (Cleistanthus tonkinensis Jabl.
Phyllanthaceae) .......................................................................................... 3
1.1.1. Vị trí phân loại ........................................................................................ 3
1.1.2. Họ Diệp hạ châu (Phyllanthaceae) ........................................................... 3
1.1.3. Chi Cleistanthus ...................................................................................... 4
1.1.4. Loài Cleistanthus tonkinensis .................................................................. 4
1.1.4.1. Đặc điểm thực vật ................................................................................. 5
1.1.4.2. Thành phần hóa học .............................................................................. 5
1.1.4.3. Hoạt tính sinh học ................................................................................. 5
1.2. Hợp chất cleistantoxin................................................................................ 6
1.2.1. Sơ lược về hợp chất cleistantoxin ............................................................ 6
1.2.2. Các nghiên cứu trước đây về hợp chất cleistantoxin ................................ 6

1.3. Chất chuẩn và quy trình thiết lập chất chuẩn .............................................. 7
1.3.1. Khái quát về chất chuẩn........................................................................... 7
1.3.2. Quy trình thiết lập chất chuẩn .................................................................. 8
1.4. Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ................. 9
1.4.1. Khái niệm ................................................................................................ 9
1.4.2. Cấu tạo máy sắc ký lỏng hiệu năng cao ................................................. 10
1.4.3. Một số thông số đặc trưng cho quá trình sắc ký ..................................... 12


CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 15
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị ........................................................................... 15
2.1.1. Nguyên liệu ........................................................................................... 15
2.1.2. Hóa chất, dung mơi, chất chuẩn ............................................................. 15
2.1.3. Dụng cụ, thiết bị .................................................................................... 16
2.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 17
2.2.1. Phân lập và tinh chế cleistantoxin từ quả của cây Chà chôi (Cleistanthus
tonkinensis Jabl. Phyllanthaceae) ........................................................... 17
2.2.2. Xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng chất tinh chế được................................ 17
2.2.3. Xác định tạp chất liên quan của cleistantoxin tinh chế được bằng
HPLC/DAD .......................................................................................... 17
2.2.4. Xác định hàm lượng cleistantoxin tinh chế được bằng HPLC/DAD....... 17
2.3. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 17
2.3.1. Phân lập và tinh chế cleistantoxin từ quả của cây Chà chôi (Cleistanthus
tonkinensis Jabl. Phyllanthaceae) ........................................................... 18
2.3.2. Xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng chất tinh chế được................................ 18
2.3.3. Xác định tạp chất liên quan của cleistantoxin tinh chế được .................. 18
2.3.3.1. Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký ................................................. 18
2.3.3.2. Thẩm định phương pháp phân tích ...................................................... 18
2.3.4. Xác định hàm lượng cleistantoxin tinh chế được ................................... 20
2.3.4.1. Xây dựng phương pháp....................................................................... 20

2.3.4.2. Thẩm định phương pháp ..................................................................... 21
2.4. Xử lý kết quả ........................................................................................... 23


CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ........................... 24
3.1. Phân lập và tinh chế cleistantoxin từ quả của cây Chà chôi (Cleistanthus
tonkinensis Jabl. Phyllanthaceae) ............................................................. 24
3.2. Xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng chất tinh chế được .................................. 28
3.2.1. Phổ hấp thụ tử ngoại - khả kiến (UV-VIS) ............................................. 28
3.2.2. Phổ hồng ngoại (IR) .............................................................................. 28
3.2.3. Phổ khối lượng (MS) ............................................................................. 29
3.2.4. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) ...................................................... 30
3.3. Xác định tạp chất liên quan của cleistantoxin tinh chế được bằng
HPLC/DAD ............................................................................................. 32
3.3.1. Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký .................................................... 32
3.3.1.1. Khảo sát và lựa chọn pha động ............................................................ 32
3.3.1.2. Chọn bước sóng phát hiện ................................................................... 34
3.3.2. Xây dựng phương pháp .......................................................................... 34
3.3.3. Thẩm định phương pháp ........................................................................ 35
3.3.4. Kết quả xác định tạp chất liên quan của cleistantoxin tinh chế được ...... 37
3.3.5. Khảo sát độ ổn định của dung dịch thử 1500 ppm ................................. 38
3.4. Xác định hàm lượng cleistantoxin tinh chế được bằng HPLC/DAD ......... 40
3.4.1. Xây dựng phương pháp .......................................................................... 40
3.4.2. Thẩm định phương pháp ........................................................................ 41
3.4.3. Kết quả xác định hàm lượng cleistantoxin tinh chế được ....................... 51

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................... 53
TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ACN

Acetonitril

APG

Angiosperm Phylogeny Group

ARS

ASEAN Reference Standards

ASEAN

Association of Southeast Asian Nations

CTF

Phân đoạn

d

Độ chia nhỏ nhất

DAD

Diode Array Detector

EPCRS

European Pharmacopeia Reference Substances

FID

Flame Ionization Detector

HL

Hàm lượng

HPLC

High Performance Liquid Chromatography

ICH

International Conference on Harmonisation of Technical
Requirements for Registration of Pharmaceuticals of
Human Use

ICP

Inductively Coupled Plasma

ICRS

International Chemical Reference Substances

IR

Infrared Radiation

IUPAC

International Union of Pure and Applied Chemistry

LOD

Limit of Detection

LOQ

Limit of Quantitation

m

Khối lượng

MeOH

Methanol


MS

Mass Spectroscopy

N

Số đĩa lý thuyết

NIST

National Institute of Standards and Technology

NMR

Nuclear Magnetic Resonance

N/A

Not Available

RS

Độ phân giải

RSD

Relative Standard Deviation

δ

Độ chuyển dịch hóa học

S

Diện tích

SKĐ

Sắc ký đồ

SKLM

Sắc ký lớp mỏng

S/N

Signal/Noise

TCCS

Tiêu chuẩn cơ sở

TLC

Thin Layer Chromatography

USPRS

United States Pharmacopeia Reference Substances

UV-VIS

Ultraviolet - Visible Spectroscopy

WHO

World Health Organization


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng
3.1

Nội dung
Dữ liệu NMR của chất tinh chế được (1H: 500 MHz, 13C:
125 MHz, CDCl3)

Trang
31

3.2

Kết quả xác định giới hạn tạp chất liên quan

38

3.3

Kết quả khảo sát độ ổn định của dung dịch thử 1500 ppm

39

3.4

Kết quả khảo sát độ phù hợp của hệ thống

44

3.5

Cách pha dung dịch thẩm định khoảng tuyến tính

45

3.6

Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính

45

3.7

Cách pha dung dịch thẩm định độ đúng

47

3.8

Kết quả khảo sát độ đúng

49

3.9

Kết quả khảo sát độ lặp lại

50

3.10

Kết quả khảo sát độ ổn định của dung dịch thử 100 ppm

51


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Nội dung

Hình

Trang

1.1

Tiêu bản cây Cleistanthus tonkinensis

4

1.2

Quả của cây Cleistanthus tonkinensis

4

1.3

Công thức cấu tạo của cleistantoxin

6

1.4

Sơ đồ cấu tạo máy sắc ký lỏng hiệu năng cao

10

2.1

Kết quả giám định định danh loài Cleistanthus tonkinensis

15

2.2

Cách xác định tỷ số tín hiệu trên nhiễu (S/N)

20

3.1

Quy trình phân lập và tinh chế cleistantoxin

27

3.2

Phổ hấp thụ UV-VIS của dung dịch 7B (CHCl3)

28

3.3

Phổ IR (KBr) của chất tinh chế được

29

3.4

Phổ khối lượng (ESI-MS) của chất tinh chế được

29

3.5

Phổ 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) của chất tinh chế được

30

3.6

Phổ 13C-NMR (CDCl3, 125MHz) của chất tinh chế được

30

3.7

Công thức cấu tạo của cleistantoxin

32

3.8

3.9

3.10
3.11
3.12
3.13

Sắc ký đồ dung dịch cleistantoxin 1500 ppm với pha động 1
(hỗn hợp nước và acetonitril tỷ lệ 45:55)
Sắc ký đồ dung dịch cleistantoxin 1500 ppm với pha động 2
(hỗn hợp đệm phosphat pH = 2,5 và nước tỷ lệ 45:55)
Sắc ký đồ dung dịch cleistantoxin 1500 ppm với pha động 3
(hỗn hợp đệm phosphat pH = 6,8 và nước tỷ lệ 45:55)
Phổ hấp thụ UV-VIS của cleistantoxin
Sắc ký đồ khảo sát độ đặc hiệu của phương pháp xác định
tạp chất liên quan
Sắc ký đồ dung dịch cleistantoxin 0,5 μg/ml

33

33

33
34

36
37


3.14

3.15
3.16
3.17

3.18

Sắc ký đồ khảo sát độ đặc hiệu của phương pháp xác định
hàm lượng cleistantoxin tinh chế được
Kết quả xác định độ tinh khiết của pic cleistantoxin trong
dung dịch thử
Phổ 3D của dung dịch thử
Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng
độ
Sắc ký đồ dung dịch chuẩn và dung dịch thử định lượng
cleistantoxin

42

42
43
46

52

ĐẶT VẤN ĐỀ
Theo Tổ chức Y tế Thể giới (WHO), ung thư là nguyên nhân dẫn đến tử vong
đứng thứ hai trên toàn cầu với 8,8 triệu người chết trong năm 2015 [15]. Nhiều liệu
trình điều trị đã được áp dụng như: hóa trị, xạ trị, can thiệp xâm lấn... tuy nhiên kết
quả thu được vẫn chưa như mong đợi. Điều đó càng thúc đẩy các nhà khoa học tìm
tịi nghiên cứu ra các phương pháp, các loại thuốc mới để chống lại căn bệnh này.
Tại Việt Nam, một hướng nghiên cứu đang rất được quan tâm đó là phát triển
các thuốc điều trị ung thư có nguồn gốc từ dược liệu. Năm 2009, dự án "Phịng thí
nghiệm hợp tác Pháp - Việt, nghiên cứu hóa thực vật của hệ thực vật Việt Nam" đã
được khởi động, dịch chiết ethyl acetat của hơn 2500 loài thực vật ở Việt Nam đã
được đem thử sàng lọc hoạt tính kháng tế bào ung thư trên dịng ung thư biểu mơ
KB. Một trong những kết quả nổi bật nhất đó là dịch chiết từ quả của cây Chà chôi
(Cleistanthus tonkinensis) đã cho phần trăm ức chế dịng tế bào ung thư biểu mơ
KB đạt từ 88,40 - 95,17%. Từ dịch chiết này, nhóm nghiên cứu đã phân lập, tinh
chế và xác định cấu trúc được 9 hợp chất tinh khiết nhóm aryltetralin lignan, trong
đó cleistantoxin có hoạt tính ức chế mạnh nhất trên các dòng tế bào ung thư thử
nghiệm (KB, MCF7, MCF7R, HT29) với giá trị IC50 trong khoảng 14 - 36 nM
(tương đương với khoảng 0,006 - 0,014 μg/ml). Từ kết quả khả quan trên, hợp chất
cleistantoxin tiếp tục được tiến hành thử mơ hình Docking phân tử đánh giá khả
năng ức chế enzym topoisomerase I và enzym caspase. Theo dự đốn của mơ hình,
hoạt chất này có tác dụng kháng tế bào ung thư, kháng khuẩn và kháng virus. Bên
cạnh đó, các hợp chất glycosid của cleistantoxin phân lập được từ quả của cây Chà
chơi có cấu trúc hóa học gần như tương tự etoposid và teniposid là hai dẫn chất của
podophyllotoxin đang được sử dụng làm thuốc điều trị ung thư phổi. Dựa trên các
kết quả này, nhóm tác giả quyết định nghiên cứu phân đoạn giàu cleistantoxin và
các aryltetralin lignan được chiết xuất từ quả của cây Chà chôi để phát triển thành
nguyên liệu làm thuốc điều trị ung thư.

1

Nhằm xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho phân đoạn có tác dụng hóa trị liệu ung thư
này, các chất chuẩn rất cần được thiết lập để tiến hành định tính và định lượng các
chất đã phân lập trên. Chính vì vậy, chúng tơi tiến hành đề tài: "Xây dựng phương
pháp xác định hàm lượng cleistantoxin phân lập từ quả của cây Chà chôi
(Cleistanthus tonkinensis) làm nguyên liệu thiết lập chất chuẩn" với mục tiêu:
-

Phân lập, tinh chế và nhận dạng cleistantoxin từ quả của cây Chà chôi
(Cleistanthus tonkinensis Jabl.).

-

Xác định giới hạn tạp chất liên quan của cleistantoxin tinh chế được bằng
HPLC/DAD.

-

Xác định hàm lượng cleistantoxin tinh chế được bằng HPLC/DAD.

2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về thực vật của cây Chà chơi (Cleistanthus tonkinensis Jabl.
Phyllanthaceae)
1.1.1. Vị trí phân loại
Theo APG [5], họ Diệp hạ châu (Phyllanthaceae) được phân loại như sau:
Thực vật có hoa (Angiosperms)

Thực vật hai lá mầm thật sự (Eudicots)
Nhánh Hoa hồng (Rosids)
Bộ Sơ-ri (Malpighiales)
Họ Diệp hạ châu (Phyllanthaceae)
1.1.2. Họ Diệp hạ châu (Phyllanthaceae)
Họ Diệp hạ châu (danh pháp khoa học: Phyllanthaceae) là một họ thực vật có
hoa, trước đây được coi là phân họ Phyllanthoideae của họ Thầu dầu
(Euphorbiaceae) [10]. Phân họ Phyllanthoideae được tách ra từ họ Thầu dầu vào
năm 2006 dựa trên kết quả phân tích gen các lồi thuộc phân họ này [10], [11], [12].
Họ Diệp hạ châu bao gồm khoảng 2000 loài, được chia thành 8 tông, 54 - 60 chi
(tùy thuộc theo phân loại của từng tác giả), có đặc điểm thực vật là cây thân gỗ, cây
bụi hoặc cây thân thảo. Chúng phân bố chủ yếu ở khu vực khí hậu nhiệt đới, ngoại
trừ một vài loài ở khu vực ơn đới Nam bán cầu cùng số ít lồi sống xa về phía bắc
đến miền trung khu vực ơn đới Bắc bán cầu [10], [12]. Chi Phyllanthus, một trong
những chi lớn nhất của thực vật có hoa, với 1269 lồi, chiếm hơn một nửa số loài
trong họ [11].
1.1.3. Chi Cleistanthus
Cleistanthus (do chữ Latin cleisto, bắt nguồn từ chữ Hy Lạp kleistos: đóng,
khơng mở và anthos: hoa kết hợp thành) được dịch sang Tiếng Việt là cách hoa
hoặc cọc rào. Là cây gỗ nhỏ hay nhỡ, lá mọc so le xếp hai dãy, nguyên. Cụm hoa ở
3


nách lá, thành xim đơn hoặc bông, nhiều hoa hoặc ít hoa; lá bắc thường ngắn hơn
hoa; hoa không cuống hoặc có cuống, cùng gốc hoặc khác gốc; đài hợp ở gốc. Hoa
đực có 4-6 lá đài, thường là 5, xếp van. Cánh hoa 5 nhỏ, thường nguyên. Đĩa mật
phẳng hay lồi. Bầu khơng lơng hoặc có lơng nhung. Quả nang có 3 mảnh vỏ trịn ở
lưng; hạt hình trứng - 3 góc [4].
Chi Cleistanthus gồm khoảng 140 lồi mọc tự nhiên từ châu Phi, Ấn Độ đến
Australia. Ở nước ta, theo sách "Cây cỏ Việt Nam" của tác giả Phạm Hồng Hộ [3],

chi Cleistanthus có 14 lồi, phân bố khắp cả nước, từ Hà Giang tới Phú Quốc.
1.1.4. Loài Cleistanthus tonkinensis

Hình 1.1: Tiêu bản cây Cleistanthus tonkinensis

Quả xanh

Quả chín

Hình 1.2: Quả của cây Cleistanthus tonkinensis

4


1.1.4.1. Đặc điểm thực vật
Lồi Cleistanthus tonkinensis có tên Tiếng Việt là Chà chôi, thuộc họ Diệp hạ
châu (Phyllanthaceae), được miêu tả như sau:
-

Cây gỗ nhỏ cao 1 - 3 m; nhánh láng, đen.

-

Phiến lá tròn dài, to 7 - 13 x 2 - 5 cm, chót có mũi nhọn, đáy tròn, mỏng,
cứng, láng, gân phụ 7 - 8 cặp; cuống 1 cm, lá bẹ 2 - 3 mm.

-

Chùm hoa cao 1 - 1,5 cm; hoa nhỏ, không cọng; cánh hoa 5, to 1 mm, tiểu
nhụy 5, nhụy cái lép; hoa cái không cọng, cánh hoa 2 mm, đĩa mật quanh

nỗn sào có ít lơng.

-

Nang (quả) xoan, cao 1,3 cm, nở làm 3 mảnh; hột hoe, cao 7 mm.

Cây phân bố ở khu vực rừng trên đá vôi từ Cao Bằng, Lạng Sơn đến Nghệ An,
Hà Tĩnh [3].
1.1.4.2. Thành phần hóa học
Đến nay, đã có 9 hợp chất tinh khiết nhóm aryltetralin lignan được phân lập từ
quả của cây Chà chơi trong đó có hợp chất cleistantoxin.
1.1.4.3. Hoạt tính sinh học
Từ năm 2009, Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt
Nam phối hợp với Viện Hóa học các hợp chất tự nhiên (Cộng hịa Pháp) đã thu hái,
định danh khoa học và thử sàng lọc hoạt tính sinh học dịch chiết ethyl acetat của
hơn 2500 lồi thực vật Việt Nam trong đó có cây Chà chơi về hoạt tính kháng tế
bào ung thư trên dịng ung thư biểu mô KB. Kết quả cho thấy dịch chiết từ
Cleistanthus tonkinensis thể hiện khả năng ức chế mạnh sự phát triển của tế bào ung
thư, cụ thể, nó cho phần trăm ức chế dòng tế bào ung thư biểu mô KB lên tới 88,40
- 95,17%. Đây là tiền đề cho các nghiên cứu phân lập và tinh chế các hợp chất từ
cây Chà chôi, hướng tới mục tiêu phát triển một thuốc có nguồn gốc từ dược liệu để
điều trị ung thư.

5


1.2. Hợp chất cleistantoxin
1.2.1. Sơ lược về hợp chất cleistantoxin
Danh

pháp

IUPAC:

7-hydroxy-6-metoxy-4,5:3’,4’-bis(metylendioxy)-2.7’

xyclolignan-9,9’-olit
Công thức phân tử: C21H18O8
Khối lượng phân tử: 398,0 Da
Công thức cấu tạo:

Hình 1.3: Cơng thức cấu tạo của cleistantoxin
Tính chất: Tinh thể rắn, màu trắng. Tan tốt trong dicloromethan, aceton và
acetonitril, kém tan trong methanol. Nhiệt độ nóng chảy: 195 - 196ºC (aceton).
Độ quay cực [α]30D -148,0 (c 0,5; CHCl3) [13].
1.2.2. Các nghiên cứu trước đây về hợp chất cleistantoxin
Năm 2012, trong khuôn khổ Dự án hợp tác Pháp - Việt về sàng lọc hoạt tính
sinh học của thảm thực vật Việt Nam, hợp chất cleistantoxin đã lần đầu tiên được
phân lập từ quả của cây Cách hoa Đông Dương (Cleistanthus indochinensis Merr.
ex Croiz) bởi Trịnh Thị Thanh Vân và các cộng sự. Chất này sau đó đã được thử
hoạt tính sinh học gây độc trên tế bào ung thư. Kết quả cho thấy hợp chất
cleistantoxin cho hoạt tính ức chế rất mạnh trên các dòng tế bào thử nghiệm (KB,
MCF7, MCF7R, HT29) với giá trị IC50 trong khoảng 14 - 36 nM (tương đương với
khoảng 0,006 - 0,014 μg/ml) [4],[13].

6


Từ kết quả khả quan trên, hợp chất cleistantoxin tiếp tục được tiến hành thử mơ
hình Docking phân tử đánh giá khả năng ức chế enzym topoisomerase I và enzym

caspase. Theo dự đốn của mơ hình, hoạt chất này có tác dụng kháng tế bào ung
thư, kháng khuẩn và kháng virus. Bên cạnh đó các hợp chất glycosid của
cleistantoxin phân lập được từ quả của cây Chà chơi có cấu trúc hóa học gần như
tương tự etoposid và teniposid là hai dẫn chất của podophyllotoxin đang được sử
dụng làm thuốc điều trị ung thư phổi. Những nghiên cứu trên đã mở ra triển vọng
sản xuất thuốc có nguồn gốc từ dược liệu để điều trị ung thư, điều này chính là động
lực thúc đẩy chúng tôi tiến hành đề tài.
1.3. Chất chuẩn và quy trình thiết lập chất chuẩn
1.3.1. Khái quát về chất chuẩn
 Khái niệm:
Theo Dược điển Việt Nam IV [2], chất chuẩn (chất đối chiếu) là chất đồng nhất
đã được xác định là đúng để dùng trong các phép thử đã được quy định về hóa học,
vật lý và sinh học. Trong các phép thử đó, các tính chất của chất đối chiếu được so
sánh với các tính chất của chất cần thử. Chất đối chiếu phải có độ tinh khiết phù
hợp với mục đích sử dụng.
 Phân loại chất chuẩn: [14]
- Chuẩn gốc: Chất chuẩn được xác định hoặc thừa nhận rộng rãi là có chất
lượng đo lường cao nhất và giá trị của nó được chấp nhận mà không quy
chiếu về các chất chuẩn khác của cùng đại lượng, trong tình huống cụ thể.
Một số chất chuẩn được coi là chuẩn gốc như chuẩn Quốc tế (ICRS), chuẩn
Dược điển Mỹ (USPRS), chuẩn Dược điển châu Âu (EPCRS), chất chuẩn do
Viện Tiêu chuẩn và Công nghệ Quốc gia Mỹ (NIST) thiết lập. Ngoài ra, đối
với các hoạt chất mới, chất chuẩn gốc theo TCCS của nhà phát minh cũng
được xếp vào nhóm này.

7


- Chuẩn thứ cấp: Chất chuẩn có giá trị được xác định bằng cách so sánh với
chuẩn gốc của cùng một đại lượng. Ví dụ như chuẩn ASEAN (ARS), chuẩn

Dược điển Việt Nam, chuẩn làm việc...
1.3.2. Quy trình thiết lập chất chuẩn
Theo hướng dẫn của WHO và ASEAN, quy trình thiết lập chất chuẩn gồm các
bước cơ bản sau:
-

Lựa chọn ngun liệu

-

Xây dựng quy trình

-

Đánh giá ngun liệu

-

Đóng lọ/ống

-

Kiểm tra độ đồng nhất của q trình đóng gói

-

Đánh giá liên phịng

-

Tập hợp và xử lý số liệu, hồn thành hồ sơ

-

Phê duyệt kết quả

-

Đóng gói, bảo quản, phân phối

-

Kiểm tra định kỳ [7], [14].

Thiết lập chất chuẩn là một quá trình được quy định nghiêm ngặt với các bước
cơ bản đã được liệt kê như trên. Tuy nhiên, trong phạm vi của khóa luận này chúng
tơi chỉ đề cập chi tiết những nội dung liên quan trực tiếp tới đề tài:
 Lựa chọn nguyên liệu:
Nguồn nguyên liệu với chất lượng tốt có thể được lựa chọn từ một lơ chất có
nguồn gốc từ q trình sản xuất thơng thường, nếu độ tinh khiết đạt tiêu chuẩn. Các
yêu cầu về độ tinh khiết đối với một chất đối chiếu hóa học phụ thuộc vào mục đích
sử dụng của nó. Chất chuẩn sử dụng trong phép thử định lượng bắt buộc phải có độ
tinh khiết cao; đối với chất chuẩn gốc, hàm lượng cần đạt trên 99,5% (tính trên

8


nguyên liệu khan hoặc không chứa các chất dễ bay hơi). Trong khi đó, chất chuẩn
sử dụng cho phép thử định tính khơng địi hỏi độ tinh khiết q cao do sự hiện diện
của tạp chất ở một hàm lượng nhỏ không ảnh hưởng đáng kể đến kết quả của phép

thử. Đối với tạp chuẩn, nguồn nguyên liệu có thể lấy từ các nhà cung ứng thương
mại, nếu độ tinh khiết đạt trên 95% (hoặc 90% nếu sử dụng cho TLC) [14].
 Xác định tạp chất trong nguyên liệu:
Các phương pháp phân tích cơ bản nhằm xác định tạp chất trong nguyên liệu
thiết lập chất chuẩn gồm:
-

Tạp hữu cơ: sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với dectector UV

-

Tạp kim loại: ICP với detector khối phổ hoặc phổ phát xạ ngun tử

-

Tạp khơng cháy: phương pháp tro hóa mẫu

-

Tồn dư dung mơi: sắc ký khí phát hiện bằng ngọn lửa ion hóa (FID)

-

Hàm lượng nước: chuẩn độ Karl Fisher [6].

Xác định tạp chất hữu cơ là khía cạnh thách thức nhất trong việc xây dựng một
phương pháp phân tích phù hợp do có rất nhiều con đường dẫn đến các tạp này như:
quá trình tổng hợp, tinh chế và bảo quản. Lượng tạp chất hữu cơ có thể xác định
bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector UV bằng phương pháp
chuẩn hóa diện tích. Tuy nhiên phương pháp này không phải lúc nào cũng thực hiện

được do đáp ứng của mỗi tạp chất với detector là khác nhau. Có thể phải thiết lập hệ
số hiệu chỉnh về đáp ứng của từng tạp với detector hoặc trong trường hợp chất
chuẩn cần thiết lập là hoạt chất mới, chúng ta phải chấp nhận việc tối đa hóa tạp [9].
1.4. Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
1.4.1. Khái niệm
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid chromatography - HPLC)
là một kỹ thuật tách trong đó các chất phân tích được hịa tan trong pha động là chất
lỏng và di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh. Tốc độ di chuyển khác nhau liên

9


quan đến hệ số phân bố của chúng giữa hai pha tức là liên quan đến ái lực tương đối
của các chất này với pha tĩnh và pha động. Thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột vì
vậy phụ thuộc vào các yếu tố đó [1].
Sắc ký lỏng hiệu năng cao được thực hiện chủ yếu dựa trên các cơ chế: phân bố,
hấp phụ, trao đổi ion, loại trừ theo kích thước hoặc tương tác hóa học lập thể [2].
Trong đó, sắc ký lỏng phân bố là kỹ thuật được sử dụng phổ biến nhất hiện nay [1].
1.4.2. Cấu tạo máy sắc ký lỏng hiệu năng cao
Do bản chất hóa học của các chất phân tích rất khác nhau nên có nhiều kỹ thuật
sắc ký lỏng. Tuy nhiên, nguyên tắc cấu tạo của một máy sắc ký lỏng đều giống
nhau, với những bộ phận cơ bản:
-

Hệ thống cấp pha động

-

Hệ thống bơm

-

Bộ phận tiêm mẫu

-

Cột và pha tĩnh

-

Detector

-

Bộ phận thu nhận và xử lý dữ liệu [1]

Hình 1.4: Sơ đồ cấu tạo máy sắc ký lỏng hiệu năng cao

10


 Hệ thống cấp pha động:
Pha động trong HPLC thường là hỗn hợp của hai hay nhiều dung mơi hịa tan
vào nhau để có khả năng tách với độ phân giải phù hợp. Trước khi sử dụng, cần lọc
(qua màng lọc 0,45 μm) và đuổi khí hịa tan trong pha động (siêu âm, sực khí trơ
như heli...) [1]. Các máy HPLC hiện nay đều được trang bị đầu lọc cho dung mơi
pha động cũng như bộ phận loại bọt khí (degasser).
 Hệ thống bơm:
Hệ thống bơm trong HPLC giữ cho pha động chảy với một lưu lượng khơng đổi,
duy trì áp suất trong khoảng 0 - 400 bar. Hệ thống điều khiển bằng bộ vi xử lý có

khả năng cung cấp pha động hoặc hằng định (rửa giải đẳng dòng) hoặc thay đổi tỷ
lệ thành phần (rửa giải gradient) [2].
 Bộ phận tiêm mẫu:
Dung dịch mẫu thử được đưa vào dòng pha động hoặc vào đầu cột nhờ một bộ
phận tiêm mẫu có thể hoạt động dưới áp suất cao. Thiết bị này sử dụng một vịng
chứa mẫu thử có thể tích cố định hoặc thay đổi, vận hành bằng tay hoặc tiêm tự
động. Đối với hệ thống tiêm mẫu tự động, sai số vào khoảng 0,5% trong khi nếu
tiêm bằng tay, độ lặp lại thấp cũng như sai số lớn hơn nhiều [1], [2].
 Cột và pha tĩnh: [1]
Cột sắc ký lỏng hiệu năng cao thường được chế tạo bằng thép khơng gỉ, thủy
tinh hoặc chất dẻo có chiều dài 10 - 30 cm, đường kính trong 4 - 10 mm, thường
gồm các bộ phận:
-

Cột nhồi: thường có hạt cỡ 5 hoặc 10 μm. Số đĩa lý thuyết dao động 40000 60000 đĩa/m. Chất nhồi cột cho HPLC thường được chế tạo bằng silica (silic
dioxyd) bằng cách làm kết tụ các hạt silica để tạo ra các hạt có kích thước
lớn hơn và đường kính đều nhau. Các hạt silica gel hình thành thường được
bao một lớp mỏng hữu cơ liên kết với bề mặt.

11


-

Cột bảo vệ: thường được đặt trước cột sắc ký để loại các chất có mặt trong
pha động và mẫu phân tích làm giảm tuổi thọ của cột sắc ký. Cột bảo vệ
ngắn hơn cột sắc ký, được nhồi hạt cùng loại nhưng kích thước lớn hơn.

-

Điều nhiệt cột: Các máy HPLC hiện đại thường được trang bị thêm hệ thống
điều nhiệt cột có thể đến 150ºC với độ chính xác đến

0,1ºC.

 Detector:
Detector là bộ phận phát hiện chất phân tích. Tùy theo tính chất của chất phân
tích mà sử dụng loại detector thích hợp. Hiện có nhiều detector, nhưng thường sử
dụng 6 loại detector thuộc 2 nhóm quang học và điện hóa: detector hấp thụ UVVIS, detector huỳnh quang, detector chỉ số khúc xạ, detector tán xạ bay hơi,
detector đo dòng và detector độ dẫn [1].
 Bộ phận thu nhận và xử lý dữ liệu:
Bộ phận thu nhận và xử lý dữ liệu hiện nay thường là các máy vi tính với nhiệm
vụ ghi nhận, xử lý và lưu trữ thông tin.
1.4.3. Một số thông số đặc trưng cho quá trình sắc ký
 Thời gian lưu (tR):
Trong sắc ký rửa giải, sự lưu giữ của một chất được thể hiện dưới dạng thời gian
lưu tR. Thời gian lưu được xác định trực tiếp trên sắc ký đồ, là khoảng cách trên
đường nền từ điểm tiêm mẫu đến đường thẳng đứng kẻ từ đỉnh pic của chất [2].
Thời gian lưu càng lớn, chất phân tích càng bị lưu giữ mạnh, thời gian phân tích kéo
dài. Ngược lại, nếu thời gian lưu quá nhỏ thì khả năng tách kém.
 Hệ số dung lượng (k'):
Hệ số dung lượng k' (còn được gọi là hệ số phân bố khối lượng) là một thông số
quan trọng mô tả tốc độ di chuyển của chất phân tích qua cột và được tính theo cơng
thức sau:
k' = KC x

12


Trong đó:

VS và VM lần lượt là thể tích pha tĩnh và pha động
KC là hệ số phân bố cân bằng giữa hai pha, còn gọi là hằng số phân bố [2].
Để tối ưu hóa q trình tách, ta lựa chọn điều kiện sắc ký sao cho k' dao động từ
1 đến 5 [1].
 Hệ số đối xứng (AS): [2]
Hệ số đối xứng (AS) (hay hệ số kéo đuôi) của một pic được tính theo cơng thức:
AS =
Trong đó:
W0,05 là chiều rộng của pic ở 1/20 chiều cao của pic
d là khoảng cách từ đường thẳng đứng đi qua đỉnh pic đến cạnh phía trước của
pic ở 1/20 chiều cao của pic.
 Hiệu năng của cột và số đĩa lý thuyết biểu kiến: [2]
Hiệu năng của cột (hay hiệu lực biểu kiến của cột) được biểu thị dưới dạng số
đĩa lý thuyết biểu kiến (N), có thể tính theo cơng thức dưới đây:
N = 5,54(

)

Trong đó:
tR là thời gian lưu
Wh là chiều rộng của pic ở nửa chiều cao pic, tính theo cùng đơn vị đo tR
 Độ phân giải: [2]
Độ phân giải (RS) giữa hai pic của hai chất được tính theo cơng thức:
RS =

13


Trong đó:
tR1 và tR2 là thời gian lưu tương ứng với hai chất cạnh nhau

Wh1 và Wh2 là chiều rộng của hai pic ở nửa chiều cao của pic tương ứng
Độ phân giải lớn hơn 1,5 biểu thị hai pic được tách đến đường nền. Cơng thức
trên có thể khơng đúng khi các pic không được tách trên đường nền.

14


CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị
2.1.1. Nguyên liệu
-

Cao cồn khô chiết từ quả của cây Chà chôi (Cleistanthus tonkinensis Jabl.
Phyllanthaceae) được thu hái ngày 06/06/2016 tại La Bằng, Đại Từ, Thái
Nguyên.

-

Mẫu thực vật được định danh bởi Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật,
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Hình 2.1: Kết quả giám định định danh
lồi Cleistanthus tonkinensis
2.1.2. Hóa chất, dung mơi, chất chuẩn
-

Chất chuẩn gốc cleistantoxin (Lot: 7B001) thiết lập tại Viện Kiểm nghiệm
thuốc Trung ương, được xác định tối đa phần trăm tạp theo TCCS của nhà
sản xuất (hàm lượng cleistantoxin là 99,03%).

15