Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời paracetamol và cefein trong viên nén bằng điện di mao quản

BỘ Y TẾ
TRƯ
TRƯỜNG
ĐẠI HỌC DƯỢC
C HÀ N
NỘI
-----  ------

NGUYỄN CẢNH
NH QUANG
MÃ SINH VIÊN: 1201480

XÂY DỰNG
D NG PHƯƠNG PHÁP
ĐỊNH
NH LƯỢNG
LƯ
ĐỒNG
NG TH
THỜI
PARACETAMOL VÀ CAFEIN
TRONG VIÊN NÉN
BẰNG
NG ĐIỆN
ĐI
DI MAO QU
QUẢN
KHÓA LUẬN
LU
TỐT NGHIỆP DƯỢ
ỢC SĨ

HÀ NỘI - 2017


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
-----  ------

NGUYỄN CẢNH QUANG
MÃ SINH VIÊN: 1201480

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP
ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI
PARACETAMOL VÀ CAFEIN
TRONG VIÊN NÉN
BẰNG ĐIỆN DI MAO QUẢN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:
TS. Lê Đình Chi
Nơi thực hiện:
Bộ môn Hóa phân tích và độc chất

HÀ NỘI - 2017


LỜI CẢM ƠN

Tác giả khóa luận muốn dành lời đầu tiênđể bày tỏ lòng cảm ơn chân thành

đếnTS.Lê Đình Chi - Bộ môn Hóa phân tích và Độc chất - Trường Đại học Dược Hà
Nội, người thầy không những đã tận tình chỉ bảo, đưa ra những hướng dẫn chính xác
và kịp thời khi tôi gặp khó khăn, mà còn luôn ân cần động viên, chia sẻ với tôi các
vấn đề trong cuộc sống.
Xin trân trọng gửi lời tri ân đến các thầy cô giáo và các anh chị kỹ thuật viên
của Bộ môn Hóa phân tích và độc chất - Trường Đại học Dược Hà Nội, đã luôn giúp
đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện khóa luận tốt nghiệp.
Tôi xin gửi lời cám ơn sâu sắc đến bố mẹ, người thân và bạn bè đã quan tâm,
động viên khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tình cảm của mọi
người đã đem lại cho tôi niềm an ủi lớn lao và đó cũng chính là động lực tinh thần to
lớn giúp tôi hoàn thành khóa luận này.
Tác giả khóa luận cũng xin bày tỏ lời cảm ơn tới các thành viên trong Hội đồng
đánh giá khóa luận bởi những ý kiến đóng góp của Hội đồng sẽ giúp tôi thấy được
những hạn chế của mình để có thể tiến bộ nhanh hơn trên con đường học tập và
nghiên cứu. Dù người viết đã cố gắng hoàn thành khóa luận của mình với khả năng
có thể, nhưng chắc hẳn không thể tránh khỏi những thiếu sót và bất cập, rất mong
được thầy cô chỉ giáo.

Hà Nội, ngày tháng năm 2017
Sinh viên

Nguyễn Cảnh Quang


MỤC LỤC
Trang

ĐẶT VẤN ĐỀ

1

Chương 1. TỔNG QUAN

2

1.1. Paracetamol

2

1.1.1. Công thức cấu tạo, một số tính chất và tác dụng dược lý

2

1.1.2. Dược động học

4

1.2. Cafein

5

1.2.1. Công thức cấu tạo, một số tính chất và tác dụng dược lý

5

1.2.2. Dược động học

7

1.3. Một số phương pháp phân tích đồng thời paracetamol và cafein

7

1.4. Điện di mao quản (CE: Capillary Electrophoresis)

8

1.4.1. Nguyên tắc

8

1.4.2. Phân loại

14

1.4.3. Ưu nhược điểm

16

Chương 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị

18
18

2.1.1. Hóa chất

18

2.1.2.Thiết bị, dụng cụ

18

2.2.Nội dung nghiên cứu

18

2.3.Phương pháp nghiên cứu

18

2.3.1.Chuẩn bị các dung dịch chuẩn, dung dịch chế phẩm và các dung dịch làm
việc khác

19

2.3.2. Điều kiện điện di

19


2.3.3. Phương pháp xử lý số liệu:
Chương 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1.Khảo sát và lựa chọn các điều kiện điện di

19
20
20

3.1.1. Khảo sát dung dịch điện ly nền

22

3.1.2. Khảo sát và lựa chọn nồng độ đệm phosphat

24

3.1.3. Khảo sát và lựa chọn pH đệm

25

3.1.4. Khảo sát và lựa chọn bước sóng phát hiện

26

3.1.4. Tổng kết điều kiện tối ưu

28

3.1.5. Vị trí của các chất trên điện di đồ

29

3.2. Thẩm định phương pháp phân tích

29

3.2.1. Độ đặc hiệu

29

3.2.2. Độ phù hợp hệ thống

31

3.2.3. Khoảng nồng độ tuyến tính

32

3.2.4. Độ lặp lại

34

3.2.5.Độ chính xác trung gian

35

3.2.6. Độ đúng

36

3.3. Ứng dụng
Chương 4:KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT

41
46

4.1. Kết luận

46

4.2. Kiến nghị

47

TÀI LIỆU THAM KHẢO


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Viết tắt
HPLC

MEEKC

MEKC

Viết đầy đủ
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid
Chromatography)
Sắc ký điện động vi nhũ tương (Microemulsion electrokinetic
chromatography)
Sắc

ký

điện

động

micell

(Micellar

electrokinetic

chromatography)

CEC

Sắc ký điện di mao quản (Capillary electrochromatography)

CSE

Điện di rây mao quản (Capillary sieving electrophoresis)

CGE

Điện di gel mao quản (Capillary gel electrophoresis)

IEF

Điện di hội tụ đẳng điện (Isoelectric focusing)

ITP

Điện di đẳng tốc (Isotachophoresis)

CE

Điện di mao quản (Capillary electrophoresis)

CZE

Điện di mao quản vùng (Capillary zone electrophoresis)

EOF

Dòng điện thẩm (Electroosmotic flow)

UV-VIS

Bước sóng tử ngoại –khả kiến

pK

Hằng số phân ly

C

Nồng độ

t

Thời gian

S

Diện tích

SD

Độ lệch chuẩn

RSD

Độ lệch chuẩn tương đối


DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang

Bảng 1.1. Một số phương pháp phân tích đồng thời cafein và paracetamol

7

Bảng 1.2. Các chất thường dùng làm pha động trong CE và giá trị pK của chúng 11
Bảng 3.1. Độ phù hợp hệ thống của paracetamol và cafein

32

Bảng 3.2. Quan hệ tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của paracetamol

33

Bảng 3.3. Quan hệ tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của cafein

33

Bảng 3.4. Kết quả đánh giá độ lặp lại trên mẫu paracetamol

34

Bảng 3.5. Kết quả đánh giá độ lặp lại trên mẫu cafein

35

Bảng 3.6. Kết quả đánh giá độ lặp lại khác ngày trên mẫu paracetamol

35

Bảng 3.7. Kết quả đánh giá độ lặp lại khác ngày trên mẫu cafein

36

Bảng 3.8. Kết quả đánh giá độ thu hồi tại 80% của cafein

38

Bảng 3.9. Kết quả đánh giá độ thu hồi tại 80% của paracetamol

38

Bảng 3.10. Kết quả đánh giá độ thu hồi tại 100% của cafein

39

Bảng 3.11. Kết quả đánh giá độ thu hồi tại 100% của paracetamol

39

Bảng 3.12. Kết quả đánh giá độ thu hồi tại 120% của cafein

40

Bảng 3.13. Kết quả đánh giá độ thu hồi tại 120% của paracetamol

40

Bảng 3.14. Kết quả định lượng cafein trong hapacol extra

41

Bảng 3.15. Kết quả định lượng paracetamol trong hapacol extra

42

Bảng 3.16. Kết quả định lượng cafein trong panadol extra

43

Bảng 3.17. Kết quả định lượng paracetamol trong panadol extra

43

Bảng 3.18. Tổng hợp hàm lượng của các chất trong chế phẩm

44

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Trang

Hình 1.1. Cấu trúc phân tử paracetamol

2

Hình 1.2. Cấu trúc phân tử cafein

5

Hình 1.3. Sơ đồ phân tích hệ điện di mao quản

9

Hình 1.4. Mặt cắt ngang của mao quản

10

Hình 1.5. Lớp điện tích kép trên bề mặt mao quản

11

Hình 1.6. Ảnh hưởng dòng EOF đến tốc độ của các ion trong quá trình điện di

11

Hình 1.7. Các kĩ thuật bơm mẫu trong phương pháp điện di mao quản

14

Hình 2.1. Máy điện di mao quản P/ACE MDQ plus của hãng Sciex

17

Hình 3.1. Điện di đồ khi sử dụng các dung dịch đệm khác nhau

23

Hình 3.2. Sắc ký điện di tại nồng độ đệm 25mM; 30 mM; 35mM; 40mM

25

Hình 3.3. Điện di đồ với dung dịch đệm phosphat 25mM ở các pH khác nhau

26

Hình 3.4. Phổ hấp phụ của cafein và paracetamol

27

Hình 3.5. Điện di đồ ở điều kiện đã được xác định

29

Hình 3.6. Điện di đồ paracetamol chuẩn và cafein chuẩn

29

Hình 3.7. Điện di đồ của các chất

30

Hình 3.8. Điện di đồ các mẫu

31

Hình 3.9. Đường hồi quy tuyến tính paracetamol

33

Hình 3.10. Đường hồi quy tuyến tính cafein

34

Hình 3.11. Điện di đồ định lượng chế phẩm hapacol extra

43

Hình 3.12.Điện di đồ định lượng chế phẩm panadol extra

44


ĐẶT VẤN ĐỀ

Paracetamol là một hoạt chất hạ nhiệt giảm đau đã được sử dụng phổ biến từ
lâu trong nhiều dạng bào chế khác nhau, cả đơn độc và kết hợp với các hoạt chất
khác.Trong số đó có các dạng bào chế sử dụng kết hợp giữa paracetamol và cafein

(Panadol Extra (GSK), Hapacol Extra (DHG), Pancelxim Extra (CTCPDP Đông
Nam)…) nhằm tăng cường tác dụng giảm đau.
Cho tới nay, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) vẫn là kỹ thuật được dùng
phổ biến nhất để phân tích Paracetamol và Cafein: Paracetamol và Cafein đã được
định lượng đồng thời bằng cột C18 [7]. Bên cạnh HPLC, Paracetamol và Cafein đã
được định lượng đồng thời bằng kỹ thuật sắc ký mixen điện động (micellar kinetic
chromatography – MEKC) [11]. Trong nghiên cứu này, nhóm nghiên cứu hướng tới
xây dựng một phương pháp CZE đơn giản cho phép định lượng đồng thời cả
Paracetamol, Cafein trong chế phẩm dạng viên nén hoặc nang cứng, cho phép thay
thế các phương pháp phân tích khác nhau cần thiết trước đây bằng một phương
pháp duy nhất tiện lợi hơn cho áp dụng trên thực tế.Vì vậy chúng tôi quyết định
chọn đề tài là “Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời Paracetamol và Cafein
trong viên nén bằng điện di mao quản” với hai mục tiêu:
1. Xây dựng được phương pháp định lượng đồng thời Paracetamol và Cafein
bằng điện di mao quản.
2. Ứng dụng phương pháp này để định lượng hai thành phần trên trong chế
phẩm đang lưu hành trên thị trường.

1


Chương 1:TỔNG QUAN
1.1. Paracetamol:
1.1.1. Công thức cấu tạo, một số tính chất và tác dụng dược lý:
1.1.1.1. Danh pháp và công thức cấu tạo:
- Tên khoa học: N-(4-hydroxyphenyl) acetamid hay phydroxyacetanilid hay
4-hydroxyacetanilid.
- Tên khác: Acetaminophen.
- Biệt dược: Panadol, pradol, pandol…
- Công thức phân tử:

Hình 1.1. Cấu trúc phân tử paracetamol

C8H9NO2
Khối lượng mol: 151,2g/mol.

2


1.1.1.2. Tính chất:
Bột kết tinh màu trắng, không mùi, vị đắng nhẹ, nóng chảy ở khoảng 170oC.
Chế phẩm hơi tan trong nước, tan nhiều trong nước sôi, rất khó tan trong cloroform,
ether, tan trong ethanol và các dung dịch kiềm [2, 5].
Hóa tính do nhóm OH phenolic, nhóm chức acetamid và nhân thơm quyết
định[2, 5].
1.1.1.3. Cơ chế tác dụng và tác dụng dược lý:
- Cơ chế tác dụng:
Cơ chế gây sốt: các yếu tố gây sốt ngoại lai (Vi khuẩn, độc tố…), gây sốt cho
cơ thể kích thích bạch cầu sản xuất và giải phóng các chất gây sốt nội sinh. Các chất
này sẽ hoạt hóa enzym prostagladin synthetase làm tăng tổng hợp PGE1 và PGE2 từ
acid arachidonic ở vùng dưới đồi gây mất cân bằng cơ chế điều nhiệt của cơ thể gây
sốt [3, 4].
Cơ chế hạ sốt: các thuốc hạ sốt ức chế enzym prostagladin synthetase làm
giảm tổng hợp PGE1 và PGE2do đó làm giảm quá trình sinh nhiệt, tăng cường quá
trình thải nhiệt, tái lập sự cân bằng cho trung tâm điều nhiệt của cơ thể [3, 4].
Paracetamol là thuốc giảm đau không nằm trong nhóm opioid, nó có tác
dụng giảm đau, hạ sốt, nhưng không có tác dụng chống viêm. Paracetamol, với liều
điều trị, có tác dụng hạ sốt trong cơ thể do bất kỳ nguyên nhân nào nhưng gây hạ
thân nhiệt ở người bình thường [3, 4].
-Tác dụng dược lý:
Paracetamol (N-acetyl-p-aminophenol hoặc Acetaminophen) là chất chuyển

hóa có hoạt tính của phenacetin, là thuốc giảm đau, hạ sốt hữu hiệu có thể thay thế
aspirin.Paracetamol không có hiệu quả điều trị viêm. Với liều ngang nhau tính theo
gam, paracetamol có tác dụng giảm đau và hạ sốt tương tự aspirin [4].

3


Paracetamol làm giảm thân nhiệt của người bệnh sốt, nhưng hiếm khi làm
giảm thân nhiệt ở người bình thường. Thuốc tác dụng lên vùng dưới đồi gây hạ
nhiệt, tỏa nhiệt tăng do giãn tĩnh mạch và tăng lưu lượng máu ngoại biên [4]..
Với liều điều trị, paracetamol ít tác động đến hệ tim mạch và hô hấp, không
làm thay đổi cân bằng acid-base, không gây kích ứng, xước hoặc chảy máu dạ dày
như dùng salicylat. Nguyên nhân do paracetamol không tác dụng trên
cyclooxygenase toàn thân, chỉ tác động đến cyclooxygenase/prostagladin của hệ
thần kinh trung ương. Paracetamol không tác dụng trên tiểu cầu hoặc thời gian chảy
máu [4].
Khi dùng quá liều paracetamol, một chất chuyển hóa là N-bezoquinonimin
gây độc nặng cho gan.Liều bình thường, paracetamol dung nạp tốt, không có nhiều
tác dụng phụ của aspirin.Tuy vậy, quá liều cấp tính (trên 10g) làm thương tổn gan
gây chết người. Những vụ ngộ độc và tự vẫn bằng paracetamol đã tăng lên một cách
đáng lo ngại trong những năm gần đây [4].
1.1.2. Dược động học:
- Hấp thu: Paracetamol được hấp thu nhanh chóng và hầu như hoàn toàn qua
đường tiêu hóa. Thức ăn có thể làm viên nén giải phóng kéo dài paracetamol chậm
được hấp thu một phần và thức ăn giàu cacbonhydrat làm giảm tỷ lệ hấp thu của
paracetamol. Nồng độ đỉnh trong huyết tương đạt trong vòng 30 đến 60 phút sau khi
uống với liều điều trị[3, 4].
- Phân bố: Paracetamol phân bố nhanh và đồng đều trong phần lớn các mô
của cơ thể.Khoảng 25% paracetamol trong máu kết hợp với protein huyết tương [3,
4].

- Chuyển hóa: Paracetamol chuyển hóa tại cytocrom P450 ở gan tạo nên chất
trung gian là Nacetylbenzoquinonimin, chất này tiếp tục liên hợp với nhóm sulfuryl
của glutathion để tạo ra chất không có hoạt tính[3, 4].

4


- Thải trừ: Thuốc
Thu thải trừ qua nước tiểu chủ yếu ở dạng
ng đđã chuyển hóa, độ
thanh thảii là 19,3 lít/giờ.
lít/gi Thời gian bán thải khoảng 2,5 giờ.. Khi dùng paracetamol
ở liềuu cao (trên 10 g/ngày), sẽ
s tạo ra nhiều N-acetylbenzoquino
acetylbenzoquinonimin làm cạn kiệt
glutathion gan.Khi đó N-acetylbenzoquinonimin
N
sẽ phản ứng
ng vvới nhóm sulfydrid
của protein gan gây tổổn thương gan, hoại tử gan, có thể gây tử vong nếu không cấp
cứu kịp thời[3, 4].
1.2. Cafein:
1.2.1. Công thức cấu
u tạo,
t
một số tính chất và tác dụng dượcc lý:
1.2.1.1. Danh pháp và công thức
th cấu tạo:
- Tên khác: trimethylxanthine, coffeine, theine, mateine, guaranine,
methyltheobromine hay 1,3,7-trimethylxanthine.

1,3,7
- Biệt dược:Cafein
Cafein citrat.
- Tên khoa học:: 1,3,7-trimethyl-3,7-dihydro-1H-purin-2,6
2,6-dion.
- Công thứcc phân tử:
t
Hình 1.2. Cấu trúc phân tử Cafein

5


C8H10N4O2
Khối lượng mol: 194,2 g/mol.
1.2.1.2. Tính chất:
Tinh thể trắng, mịn, hay bột kết tinh trắng. Vụn nát ngoài không khí khô, đun
nóng ở 100 oC cafein sẽ mất nước và thăng hoa ở khoảng 200 oC.Dung dịch cafein
có phản ứng trung tính với giấy quỳ. Dễ tan trong nước sôi, cloroform, hơi tan trong
nước, khó tan trong ethanol và ether, tan trong các dung dịch acid và trong các dung
dịch đậm đặc của benzoat hay salicylat kiềm[2, 5].
1.2.1.3. Cơ chế tác dụng và tác dụng dược lý:
- Trên thần kinh trung ương:Cafein kích thích ưu tiên trên vỏ não làm giảm
các cảm giác mệt mỏi, buồn ngủ, làm tăng hưng phấn vỏ não, tăng cảm nhận giác
quan, do đó tăng khả năng làm việc và làm việc minh mẫn hơn. Tuy nhiên, nếu sử
dụng cafein liên tục và kéo dài thì sau giai đoạn hưng phấn là ức chế. Với liều sử
dụng cao, cafein tác dụng trên toàn bộ hệ thần kinh trung ương gây co giật [3, 4].
- Trên hệ tuần hoàn:Cafein kích thích làm tim đập nhanh, mạnh, tăng lưu
lượng tim và lưu lượng mạch vành. Ở liều điều trị thuốc ít ảnh hưởng đến huyết áp
[3, 4].
- Trên hệ hô hấp: Kích thích trung tâm hô hấp, làm giãn phế quản và giãn

mạch phổi. Tác dụng này càng rõ khi trung tâm hô hấp bị ức chế[3, 4].

6


- Trên hệ tiêu hóa: Gây táo bón, tăng tiết dịch vị, có thể gây loét dạ dày, tá
tràng. Trên cơ trơn: thuốc có tác dụng làm giãn cơ trơn mạch máu, mạch vành, cơ
trơn phế quản và cơ trơn tiêu hóa[3, 4].
- Trên thận: Thuốc làm giãn mạch thận, tăng sức lọc cầu thận, giảm tái hấp
thu Na+ nên có tác dụng lợi tiểu, tuy nhiên tác dụng lợi tiểu kém. Nguyên nhân là do
cafein ngăn cản phân hủy AMPv do ức chế cạnh tranh với phosphodiesterase. Nồng
độ AMPv tăng thúc đẩy các phản ứng làm tăng canxi nội bào, tăng hoạt động của cơ
tim, tăng chuyển hóa, tăng phân hủy lipid, tăng glucose trong máu[3, 4].
1.2.2. Dược động học:
- Hấp thu:Thuốc hấp thu nhanh qua đường uống và đường tiêm. Thuốc đạt
nồng độ tối đa trong huyết tương sau khi uống khoảng một giờ[3, 4].
- Phân bố: Thuốc phân bố rộng rãi trong cơ thể, qua nhau thai và sữa mẹ, thể
tích phân bố 0,4 – 0,6 l/kg [3, 4].
- Chuyển hóa: Thuốc chuyển hóa ở gan bằng phản ứng dimethyl và oxy hóa
[3, 4].
- Thải trừ: Thuốc thải trừ qua nước tiểu chủ yếu ở dạng đã chuyển hóa. Thời
gian bán thải khoảng 3 – 7 giờ, kéo dài ở trẻ sơ sinh và trẻ đẻnon[3, 4].
1.3.Một số phương pháp phân tích Paracetamol và Cafein:
Bảng 1.1. Một số phương pháp phân tích cafein và paracetamol
Tài liệu
STT

tham

Đối tượng

Điều kiện

phân tích

khảo

Đối tượng mẫu

HPLC
1

[1], [7], [8]

(Cột tách: RP – 18,5µm,
220 x 4,6 mm .
Pha động : 100% CH3OH
Tốc độ pha động: 1,2
ml/phút.
Detectơ UV-VIS: λ = 270

7

Paracetamol
và cafein

Chế phẩm ba thành phần
gồm paracetamol, cafein
và phenobarbital

nm.
Nhiệt độ cột: 250 C.
Thể tích vòng mẫu : 20µl)

2

[7]

Paracetamol

Chế phẩm hai thành

và cafein

phần

Paracetamol

Chế phẩm hai thành

và cafein

phần

Biến đổi

Paracetamol

Chế phẩm hai thành

đạo hàm

và cafein

phần

Thêm chuẩn điểm H
Quang phổ hấp thụ
phân tử UV-VIS
(Khoảng bước sóng thích
hợp để quét phổ từ 200-

3

[7], [16]

300 nm, Paracetamol
λmax = 244 nm, Cafein
λmax = 272 nm trong
môi trường axit HCl
0,1M)

4

[9]

5

[9]

6

[9]

7

[11]

Biến đổi wavelet phổ Paracetamol

Chế phẩm hai thành

tỷ đối

và cafein

phần

Phân tích

Paracetamol

Chế phẩm hai thành

đa biến

và cafein

phần

Paracetamol

Chế phẩm hai thành

và cafein

phần

Điện di mao quản

1.4. Điện di mao quản (CE: Capillary Electrophoresis):
Điện di mao quản (CE – capillary electrophoresis) là một kỹ thuật tách các
chất trong dung dịch lỏng dựa trên sự di chuyển khác nhau của các phân tử chất
(mang điện tích) trong cột mao quản dưới ảnh hưởng của điện trường tạo bởi điện
áp cao thế (15 – 30 kV) đặt vào hai đầu mao quản [10].

8


1.4.1. Nguyên tắc:
Điện di mao quản là một kỹ thuật tách các chất dựa trên sự di chuyển khác
nhau của các phân tử chất (chủ yếu là các ion mang điện tích) trong dung dịch chất
điện ly có chất đệm pH và trong tác dụng của điện trường nhất định do thế (V) đặt
vào hai đầu mao quản sinh ra[10]. Cấu tạo của hệ điện di được cho trong hình 1.3
Hình 1.3. Sơ đồ phân tích hệ điện di mao quản

1.4.1.1. Độ điện di, tốc độ điện di và thời gian điện di:
Trong điện di, tốc độ di chuyển của các hạt tích điện (v) tỉ lệ thuận với cường
độ điện trường (E):

v = μ. E
Trong đó:

v: tốc độ di chuyển của ion
μ: là độ diện di
E: là điện trường ngoài

Trong điều kiện tốc độ của dòng ổn định, lực tác động lên các tiểu phân tích
điện từ phía điện trường ngoài và lực ma sát sẽ cân bằng:
q.E= fe.v
Trong đó: q: là điện tích hạt nhân
fe: là lực ma sát, fe = 6.π.η.r (η: là độ nhớt của dung dịch, r là bán kính ion)

9


Từ các công thức trên có thể suy ra công thức tính độ linh động của ion như
sau:
μ = v/E = q/(6.π.η.r)
Như vậy độ linh động điện di tỉ lệ thuận với điện tích của ion chất phân tích
và tỷ lệ nghịch với độ nhớt η của dung dịch pha động điện di và độ lớn (bán kính
hydrat r) của ion chất phân tích [10].
1.4.1.2. Mao quản:
Mao quản là một bộ phận quan trọng trong phương pháp điện di mao quản.
Đây chính là một trong các yếu tố quyết định sự điện di hỗn hợp của các chất mẫu.
Mao quản được chế tạo chủ yếu là silica được gọi là mao quản silica. Trong một số
trường hợp cũng có thể dùng mao quản teflon, khi mao quản silica không phù hợp,
ví dụ mẫu có ion F- và tách ở pH thấp.
Hình 1.4. Mặt cắt ngang của mao quản

 Lớp điện kép trên thành mao quản và dòng điện di thẩm thấu
Trong quá trình điện di, lớp điện kép và thế của chúng (thế Zêta) xuất hiện ở
sát thành mao quản, nó phụ thuộc vào lực ion của dung dịch pha động điện di.

10


Hình 1.5. Lớp điện tích kép trên bề mặt mao quản

Dòng EOF di chuyển từ cực dương sang cực âm, dưới tác dụng của điện
trường, các cation di chuyển cùng chiều với dòng EOF do đó di chuyển nhanh hơn,
ngược lại các anion di chuyển ngược chiều với dòng EOF do đó di chuyển chậm
hơn còn các phần tử trung hòa không chịu tác động của điện trường nên di chuyển
cùng tốc độ với dòng EOF [10].
Hình 1.6. Ảnh hưởng của dòng EOF đến tốc độ của các ion trong quá trình điện di

Do vậy, để có được hiệu quả tách cao cần thiết phải tìm được điều kiện tối
ưu và/hoặc sử dụng các biện pháp kiểm tra và khống chế (như thêm các chất hoạt
hóa, thay đổi bề mặt mao quản,…) sao cho dòng EOF có cường độ phù hợp với chất
phân tích trong điều kiện nghiên cứu cụ thể [10].
1.4.1.3. Dung dịch đệm pH và pha động trong phương pháp điện di mao quản:
Dung dịch đệm quyết định độ linh động điện di của các chất phân tích. Do
yếu tố pH, loại dung dịch đệm mà trong đó, các ion và phân tử axit hay bazơ trong
thành phần của dung dịch đệm góp phần tạo nên lực ion của chúng. Hơn nữa, chúng
cũng ảnh hưởng đến độ tan, tốc độ phản ứng của các chất.

11


Bảng 1.2. Các chất thường dùng làm pha động trong CE và pK của chúng[7]

Tên chất

Giá trị pK

Tên chất

Giá trị pK

Format

3,75

Tricin

8,05

Acetat

4,76

N,N-bis(2-hidroxyetyl)glycin

8,25

Bicin

Citrat

3,12; 4,76;

Tri(hidroxymetyl)metylamin

6,40

8,30

Tris

Acid 3-

6,13

{[tri(hidroxymetyl)methyl]amin}

Acid 2-(N-morpholino)etansulfonic

8,40

propansulfonic

MES

TAPS

ACES

6,75

Acid 3-(N-morpholino)propansulfonic

6,79

Borat

Acid 2-(cyclohexylamino)
ethanesunlfomic

MOPS

9,14

9,55

CHES

Acid 2{[tri(hidroxymetyl)metyl]amino}

7,16

Phosphat

etansulfonic

TES

12

2,14; 7,10;
13,30

Acid 3-(N-morpholino)propansulfonic

7,20

Histidine

7,51

Lysine

7,9

Arginine

1,78; 5,97;
8,97

MOPS

Acid 4-2-hidroxyetyl-1piperazineetansulfonic

2,20; 8,90;
10,28

HEPES
HEPPSO

2,18; 9,09;

1.4.1.4. Nguồn điện thế cao
Quá trình điện di trong mao quản chỉ xảy ra khi có nguồn điện một chiều
nhất định đặt vào hai đầu mao quản. Điện thế này tạo ra lực điện trường E và dòng
điện I trong mao quản, nó điều khiển và duy trì sự điện di của các chất[10].
Trong điện di mao quản, điện thế V một chiều thường được dùng để đặt vào
hai đầu mao quản là từ 15 - 40 kV/m, hay là từ 150 - 550 V/cm mao quản. Tuy
nhiên, thế V được dùng phải làm sao không cho dòng điện I quá lớn trong mao
quản, dòng điện I này chỉ nên nằm trong vùng từ 10 - 75 µA. Việc chọn điện thế V
là bao nhiêu tùy thuộc vào bản chất của chất phân tích, chất nền của mẫu, giá trị pH
của pha động điện di,… [10, 17].
1.4.1.5. Kỹ thuật bơm mẫu trong phương pháp điện di mao quản:
Trong điện di mao quản có ba phương pháp thường dùng nạp mẫu phân tích
vào trong mao quản, bao gồm:


Phương pháp thủy động lực học dùng áp suất



Phương pháp thủy động lực học theo kiểu xiphông



Phương pháp điện động học

13


Hình 1.7. Các kĩ thuật bơm mẫu trong phương pháp điện di mao quản

-

Kỹ thuật bơm mẫu kiểu thuỷ động học kiểu xiphông
Trong kỹ thuật này, mẫu được bơm vào mao quản nhờ áp lực. Khi đó, lượng

mẫu bơm vào trong mao quản phụ thuộc vào áp lực sử dụng (áp suất, lực hút chân
không hoặc chiều cao bơm mẫu) và thời gian bơm mẫu. Trong đó bơm mẫu theo
nguyên lý xiphông: mẫu được dẫn vào mao quản nhờ chênh lệch độ cao giữa vị trí
đặt lọ mẫu và vị trí đặt lọ đựng dung dịch đệm. Đây là giải pháp bơm mẫu đơn giản
nhất, và được sử dụng cho các hệ điện di maoquản xách tay vận hành thủ công [10].
-

Kỹ thuật bơm mẫu kiểu điện động học
Kỹ thuật này sử dụng lực điện khi áp thế cao (5 - 10 kV trong vài giây) để

bơm mẫu vào mao quản.Phương pháp bơm mẫu này cho kết quả các pic phân tách
có độ sắc nét cao.Tuy nhiên phương pháp này có nhược điểm rất lớn là diện tích pic
(dùng để định lượng) có độ lặp lại thấp với các nền mẫu khác nhau, do đó thường
chỉ dùng để định tính [10].
1.4.2. Phân loại:
Trong điện di mao quản, các kỹ thuật điện di sau được sử dụng:

14


- Điện di vùng (zone electrophoresis) là kỹ thuật đợn giản và được áp dụng rộng
rãi nhất hiện nay trong cả điện di trên mặt phẳng vào mao quản. Trên mao quản, kỹ
thuật này được gọi là điện di mao quản vùng (capillary zone electrophoresis, CZE).
Việc thêm vào dung dịch đệm một số chất sẽ cho các kỹ thuật điện di mới như
MECK, CIEF, CSE[10, 17].

- Sắc ký điện động micell (micellar electrokinetic chromatography, MEKC) là
một phương pháp điện di trong đó mẫu thử được tách ra bởi sự phân bố khác nhau
của chúng trong các micell (được xem như là một pha tĩnh giả) và dung dịch đệm
(pha động). Trong MEKC, các chất hoạt động bề mặt được thêm vào dung dịch đệm
ở nồng độ lớn hơn nồng độ micell tới hạn.Trong phần lớn trường hợp, MEKC được
tiến hành trong môi trường kiềm.Natri dodecyl sulfat (SDS) là chất hoạt động bề
mặt thường sử dụng nhất[10, 17].
- Sắc ký điện động vi nhũ tương (microemulsion electrokinetic chromatography,
MEEKC) có thể xem như một kỹ thuật mở rộng của MEKC. MEEKC sử dụng các
vi nhũ tương (thường là dầu/nước) làm pha tĩnh giả. MEEKC linh động và hiệu quả
hơn MEKC, có thể dùng cho cả chất phân ly và trung tính hay trong phân tích
quang hoạt. MEEKC được dùng nhiều trong phân tích dược phẩm[10, 17].
- Sắc ký điện di mao quản (capillary electrochromatography, CEC): là một kỹ
thuật mới được phát triển gần đây sử dụng dòng điện thẩm để đưa dung môi rửa giải
đi qua pha tĩnh của cột nhồi HPLC có dung môi. CEC sử dụng thiết bị điện di thông
thường nhưng có thêm ưu điểm là việc ghép nối với detector khối phổ dễ dàng hơn
so với điện di mao quản thông thường. Các chất trung tính cũng có thể phân tách
với hiệu quả rất cao trong kỹ thuật này [10, 17].
- Điện di rây mao quản (capillary sieving electrophoresis, CSE): Trong điện di
rây mao quản, dung dịch đệm được thêm vào những chất có tác dụng cản trở vật lý
sự di chuyển của các phân tử như polyethylen oxyd hay dextran. Các phân tử lớn
như protein sẽ di chuyển chậm hơn do ma sát hay cản trở bởi các chất này. Mức độ
bị cản trở phụ thuộc vào khối lượng hay bán kính thủy động của phân tử. Nếu thêm
vào môi trường điện di các chất có cấu trúc mạng 3 chiều tương tự như sắc ký lọc

15


gel ta có Điện di gel mao quản (capillary gel electrophoresis, CGE). Tuy nhiên,
trong điện di mao quản, CSE cho kết quả lặp lại và tin cậy hơn, dễ thay thế sau khi

điện di nên được sử dụng rộng rãi hơn trong phân tích protein [10, 17].
Ngoài các kỹ thuật trên, một số kỹ thuật điện di mao quản khác cũng được sử
dụng. Ví dụ như: Điện di hội tụ đẳng điện (isoelectric focusing, IEF), Điện di đẳng
tốc (isotachophoresis, ITP)...[17].
1.4.3. Ưu nhược điểm:
- Điện di mao quản có hiệu lực phân tách rất cao. Một trong những yếu tố
quan trọng là các chất được di chuyển đồng đều trong mao quản tạo nên
các băng dịch chuyển chứ không phải các vùng dịch chuyển dạng parabol như trong
sắc ký lỏng cao áp. Điều này hạn chế sự dãn rộng các băng phân tách, tạo nên các
đỉnh hẹp trên điện di đồ làm cho dung lượng pic của điện di cao hơn, đồng nghĩa
với độ phân giải cao hơn.Khi chọn được các điều kiện điện di thích hợp, độ phân
giải của phương pháp có thể đạt được rất cao. Số đĩa lý thuyết trong một hệ điện di
mao quản có thể đạt tới hàng trăm ngàn (thường là 100.000 - 250.000 đĩa lý thuyết),
thậm chí hàng triệu (có thể tới 30.000.000 đĩa lý thuyết trong CGE các
oligonucleotid). Do các đỉnh của các chất tách ra hẹp hơn nên chúng có cường độ
lớn hơn, góp phần làm tăng độ nhạy của phương pháp. Phương pháp điện di nguyên
thủy (điện di vùng) vốn chỉ áp dụng cho các chất ion hóa.Vì thế, trong một hỗn hợp
phức tạp gồm cả các chất điện ly và trung tính, chỉ có các chất điện ly di chuyển
làm cho điện di đồ trở nên đơn giản hơn, thích hợp hơn với việc định lượng. Thiết
bị điện di mao quản tương đối đơn giản, việc sử dụng cũng ít tốn kém về vật tư tiêu
hao hơn các phương pháp sắc ký khác [10].
- Điện di mao quản cũng có những nhược điểm so với các phương pháp sắc
ký khác. Điện di mao quản chủ yếu được dùng cho các chất có thể điện ly. Mặc dù
các kỹ thuật điện di có thể phân tách được các phân tử không ion hóa nhưng việc
phát triển phương pháp và áp dụng chúng trong phân tích các hợp chất tự nhiên còn
tương đối hạn chế. So với sắc ký lỏng, việc chọn các điều kiện phân tích (dung dịch

16

đệm, điện thế) cũng hạn chế và ít linh động hơn so với lựa chọn dung môi và pha
tĩnh sắc ký [10, 17].

17