Xây dựng phương pháp định lượng saponin toàn phần trong rễ cây ngưu tất bằng phương pháp HPLC

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHẠM NGỌC ÁNH
Mã sinh viên: 1201038

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP
ĐỊNH LƯỢNG SAPONIN TOÀN PHẦN
TRONG RỄ CÂY NGƯU TẤT BẰNG
PHƯƠNG PHÁP HPLC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2017


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHẠM NGỌC ÁNH
Mã sinh viên: 1201038

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP
ĐỊNH LƯỢNG SAPONIN TOÀN PHẦN
TRONG RỄ NGƯU TẤT BẰNG
PHƯƠNG PHÁP HPLC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. TS. Trần Nguyên Hà
2. TS. Nguyễn Tuấn Hiệp
Nơi thực hiện:
1. Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất

2. Khoa CNCX – Viện Dược Liệu

HÀ NỘI - 2017


LỜI CẢM ƠN
Để có thể hoàn thành khóa luận này, ngoài sự cố gắng và nỗ lực của bản
thân, em còn may mắn nhận được sự hướng dẫn, giúp đỡ của mọi người xung
quanh. Em xin phép được bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến những người đã
dạy dỗ, hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian qua.
Trước tiên, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến thầy Ts. Nguyễn
Tuấn Hiệp, người đã dành nhiều thời gian và tâm huyết hướng dẫn, dạy bảo
em trong suốt quá trình nghiên cứu. Em xin chân thành cảm ơn cô Ts. Trần
Nguyên Hà, người đã tạo điều kiện, và giúp đỡ em hoàn thành khóa luận này.
Em xin gửi lời cảm ơn đến các anh chị khoa Công Nghệ Chiết Xuất,
Viện Dược Liệu, đặc biệt là chị Đỗ Thị Thùy Linh, người đã luôn theo sát giúp
đỡ em. Chân thành cảm ơn ban giám đốc Viện Dược Liệu đã cho em cơ hội
thực tập tại viện.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu trường Đại học Dược Hà
Nội, các thầy cô Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất đã luôn giúp đỡ, tạo điều
kiện cho em trong quá trình thực hiện đề tài.
Cuối cùng, cảm ơn gia đình, bạn bè, anh chị những người luôn động
viên, khích lệ, trợ giúp cho em về mọi mặt để em có được kết quả ngày hôm
nay.

Hà Nội, ngày tháng năm 2017
Sinh viên
Phạm Ngọc Ánh

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT .................................
DANH MỤC CÁC BẢNG ................................................................................
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ..........................................................
ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ........................................................................... 3
1.1. Tổng quan về loài Achyranthes bidentata .............................................. 3
1.1.1. Vị trí phân loại và đặc điểm thực vật loài Achyranthes bidentata..... 3
1.1.2. Bộ phận sử dụng .................................................................................. 4
1.1.3. Thành phần hóa học ............................................................................ 4
1.1.4. Tác dụng dược lý .................................................................................. 7
1.2. Tổng quan về hợp chất Saponin ............................................................ 9
1.2.1. Cấu trúc hóa học và phân loại ........................................................... 9
1.2.2. Tính chất hóa lý của saponin .............................................................. 11
1.2.1.1. Tính chất vật lý ................................................................................... 11
1.2.1.2. Tính chất hóa học ............................................................................... 11
1.3. Một số phương pháp định tính, định lượng saponin ......................... 11
1.3.1. Các phương pháp định tính............................................................... 12
1.3.1.1. Phản ứng tạo bọt ................................................................................ 12
1.3.1.2. Phản ứng màu .................................................................................... 12
1.3.1.3. Sắc kí lớp mỏng ................................................................................. 12
1.3.2. Các phương pháp định lượng.............................................................. 12
1.3.2.1. Phương pháp khối lượng .................................................................... 12
1.3.2.2. Phương pháp đo quang ....................................................................... 13
1.4. Tổng quan về phương pháp HPLC ...................................................... 13
1.4.1. Nguyên tắc hoạt động ....................................................................... 13


1.4.2. Cấu tạo HPLC ..................................................................................... 14
1.4.3. Ứng dụng của phương pháp HPLC trong định lượng saponin ...... 15

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......... 18
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị ........................................................................ 18
2.1.1. Nguyên liệu......................................................................................... 18
2.1.2. Chất chuẩn, hóa chất ......................................................................... 18
2.1.3. Dụng cụ, thiết bị ................................................................................. 19
2.2. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................... 19
2.2.1. Xây dựng phương pháp phân tích .................................................... 19
2.2.2. Xử lí số liệu......................................................................................... 21
2.3. Thẩm định phương pháp ....................................................................... 21
2.3.1. Tính thích hợp của hệ thống ............................................................. 21
2.3.2. Tính chọn lọc...................................................................................... 21
2.3.3. Đường chuẩn...................................................................................... 22
2.3.4. Giới hạn phát hiện (LOD) và Giới hạn định lượng (LOQ) ............. 22
2.3.5. Độ lặp lại ............................................................................................ 23
2.3.6. Độ đúng .............................................................................................. 23
2.4. Phân tích mẫu thực ................................................................................ 24
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN ....................... 25
3.1. Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng ................................. 25
3.1.1. Qui trình chiết xuất saponin trong rễ ngưu tất .................................. 25
3.1.2. Khảo sát và tìm điều kiện sắc kí .......................................................... 31
3.2. Thẩm định phương pháp phân tích...................................................... 35
3.2.1. Tính thích hợp của hệ thống ............................................................... 35
3.2.2. Tính chọn lọc ........................................................................................ 36
3.2.3. Đường chuẩn ........................................................................................ 37
3.2.4. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) ................ 39


3.2.5. Độ lặp lại............................................................................................... 39
3.2.6. Độ đúng................................................................................................. 40
3.3. Ứng dụng phương pháp trong định lượng saponin tổng trong một số

mẫu rễ ngưu tất ............................................................................................. 42
3.4. Bàn luận .................................................................................................. 44
3.4.1. Tính cấp thiết của việc tiêu chuẩn hóa dược liệu ngưu tất ở Việt
Nam 44
3.4.2. Qui trình chiết xuất saponin trong rễ ngưu tất .................................. 44
3.4.3. Phương pháp định lượng và thẩm định phương pháp ...................... 45
3.4.4. Hàm lượng saponin ở một số mẫu thực.............................................. 46
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .......................................................................... 47
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................
PHỤ LỤC ...........................................................................................................


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Tên viết tắt

Nội dung đầy đủ

AO

Acid Oleanolic

AOAC

Hiệp hội các nhà hóa học phân tích (Association of official
analytical chemists)

ACN

Acetonitrile

BuOH

Butanol

DAD

Detector mảng điốt (Diode array detector)

ELSD

Detector tán xạ bay hơi (Evaporative light scattering detector)

ESI

Ion hóa tia điện (Electrospray Ionization)

EtOH

Ethanol

FLD

Detector huỳnh quang (Fluorescence Detector)

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid
chromatography)

HPLC –

MS/MS

Sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ (High performance
liquid chromatography – Mass spectrometry)

Kl/tt

Khối lượng/thể tích

MeOH

Methanol

IR

Hồng ngoại (Infrared)

RSD

Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation)

RRLC

Sắc kí lỏng phân giải nhanh (rapid-resolution liquid
chromatography)

TLC

Sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography)

TOF

Đầu dò khố i phổ thời gian bay (Time-of-Flight)

UV

Tử ngoại (Ultraviolet)

λem

Bước sóng phát xạ (emission)

λex

Bước sóng kích thích (exitation)


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng

Nội dung

Trang

1.1

Cấu trúc một số hợp chất saponin triterpenoid trong rễ ngưu
tất

5

1.2

Cấu trúc một số hợp chất phytoecdysone trong rễ ngưu tất

6

1.3

Các nghiên cứu sử dụng phương pháp HPLC trong định
lượng saponin

15

2.1

Các mẫu Ngưu tất dùng trong nghiên cứu

18

2.2

Qui trình chiết và thủy phân saponin trong các nghiên cứu

19

3.1

Kết quả thẩm định tính thích hợp của hệ thống

36

3.2

Thời gian lưu mẫu thử và mẫu chuẩn

37

3.3

Sự phụ thuốc của diện tích pic theo nồng độ AO

38

3.4

Bảng kết quả đo độ lặp lại

40

3.5

Kết quả thẩm định độ đúng

41

3.6

Hàm lượng saponin toàn phần trong một số dược liệu ngưu
tất

43


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình

Nội dung

Trang

1.1

Ngưu tất- Achyranthes Bidentata

3

1.2

Rễ ngưu tất- Radix achyranthes bidentata

4

1.3

Cấu trúc polysaccharid trong rễ ngưu tất

6

1.4

Phân loại saponin

9

1.5

Khung oleanan và cấu trúc acid oleanolic

10

1.6

Cấu trúc khung cơ bản của một số nhóm saponin

11

1.7

Sơ đồ khối của một máy sắc kí lỏng hiệu năng cao

14

3.1

Kết quả khảo sát nồng độ cồn

24

3.2

Kết quả khảo sát acid sử dụng thủy phân saponin toàn phần

27

3.3

Kết quả khảo sát nồng độ acid sử dụng thủy phân saponin toàn
phần

28

3.4

Kết quả khảo sát nhiệt độ sử dụng thủy phân saponin toàn phần

28

3.5

Kết quả khảo sát thời gian thủy phân saponin toàn phần

29

3.6

Kết quả khảo sát tỷ lệ acid sử dụng thủy phân saponin toàn phần

30

3.7

Qui trình định lượng saponin tổng trong rễ ngưu tất

31

3.8

Khảo sát bước sóng phát hiện tối ưu của AO

32

3.9

Sắc kí đồ (a) mẫu chuẩn acid oleanolic và (b) mẫu thử với hệ pha
động MeOH: TFA (0,1 %) (75: 25)

33

3.10

Kết quả khảo sát tỷ lệ dung môi ACN: H2O (đệm acid formic 0,1
%): (a) 70: 30; (b) 80: 20; (c) 90: 10; (d) 80: 20 (mẫu thử)

34

3.11

Sắc ký đồ mẫu trắng

36

3.12

Hình ảnh chồng phổ mẫu AO chuẩn( đường màu đen) và mẫu
AO thử ( đường màu đỏ)

37

3.13

Sắc kí đồ của dãy dung dịch chuẩn nồng độ 12,5 - 400 µg/ml

38

3.14

Sự phụ thuốc của diện tích pic theo nồng độ AO

39


ĐẶT VẤN ĐỀ
Rễ cây ngưu tất (Radix Achyranthis Bidentatae) là một thảo dược quý, từ
lâu đã được ông cha ta sử dụng như một vị thuốc hành huyết, tán ứ, tiêu ung lợi
thấp, bổ can, ích thân, cường gân tráng cốt [5]. Ngày nay, ngoài việc sử dụng
rễ ngưu tất trong các thang thuốc sắc, ngày càng có nhiều chế phẩm đông dược
được sản xuất từ vị thuốc này như: sản phẩm hỗ trợ điều trị cholesterol máu
cao: Cholestin, an mạch Ích Nhân, Hạ hồi đơn,... điều trị phong tê thấp: Bà
Giằng, viêm khớp Tâm Bình,... hoạt huyết dưỡng não: hoạt huyết Minh Não

Khang, hoạt huyết thông mạch PH,…. Các nghiên cứu trong và ngoài nước đã
cho thấy các tác dụng kể trên là nhờ vào các hoạt chất có trong rễ cây như:
saponin triterpen, phytoecdysone, polysaccharid, đặc biệt là saponin [3], [38].
Hiện nay, ở nước ta việc đánh giá hàm lượng saponin trong ngưu tất
còn chưa được tiêu chuẩn hóa. Đã có những qui trình định tính thành phần
saponin trong rễ ngưu tất, tuy nhiên chuyên luận “ngưu tất” trong dược điển
Việt Nam IV chưa có qui trình chuẩn để xác định hàm lượng saponin trong
dược liệu này. Vì vậy việc tiêu chuẩn hóa chất lượng saponin trong rễ cây ngưu
tất là rất cần thiết.
Các nghiên cứu trước đây cho thấy các saponin trong rễ cây ngưu tất khi
thủy phân cho thành phần chính là acid oleanolic (AO). Năm 2009, Viện kiểm
nghiệm thuốc Trung Ương thực hiện đề tài “Nghiên cứu phát triển bộ dữ liệu
chuẩn của một số dược liệu thường dùng phục vụ công tác kiểm tra giám sát
chất lượng dược liệu và thuốc đông dược”, trong đó đã tiến hành xây dựng “dấu
vân tay” của một số dược liệu bằng phương pháp TLC và HPLC, đối với dược
liệu ngưu tất chất đối chiếu là acid oleanolic [1]. Vì vậy chúng tôi lựa chọn acid
oleanolic làm chất chuẩn, và thực hiện đề tài: “Xây dựng phương pháp định
lượng saponin toàn phần trong rễ cây ngưu tất bằng phương pháp HPLC” với
2 mục tiêu chính như sau:
1


 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng saponin tổng trong rễ
cây ngưu tất bằng phương pháp HPLC.
 Ứng dụng xác định hàm lượng saponin trong một số mẫu rễ ngưu tất
trên thị trường.

2

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1.

Tổng quan về loài Achyranthes bidentata

1.1.1. Vị trí phân loại và đặc điểm thực vật loài Achyranthes bidentata
Vị trí của loài Achyranthes bidentata trong
hệ thống phân loại học thực vật [13] :
Ngành : Ngọc lan Magnoliophyta
Lớp : Hai lá mầm Dicotyledoneae
Phân lớp : Cẩm chướng Caryophyllidae
Bộ : Cẩm chướng Caryophyllales
Ho ̣ : Rau dền (Amaranthaceae) Juss, 1789
Chi : Achyranthes
Loài : Achyranthes bidentata
Cây thảo, sống nhiều năm, cao đến 2 m. Hình 1.1: Ngưu tấtAchyranthes Bidentata [10]
Thân mềm, có 4 cạnh, phình lên ở những đốt,
màu lục hoặc nâu tía, cành thường mọc lên thẳng đứng. Lá đối, hình bầu dục
hoặc mác, dài 5- 10 cm, rộng 1- 4 cm, gốc thuôn hẹp, đầu nhọn, 2 mặt nhẵn,
mép nguyên hoặc uốn lượn, gân lá mặt trên màu nâu tía, cuống dài 1- 1,5cm
[5], [6], [10].
Hoa lưỡng tính, hoa mọc ở ngọn thân hay kẽ lá đầu cành thành bông,
cánh nhọn, tiền diệp thành gai móc, cọng dài 4- 5 mm, lá đài 5 xanh, nhị 5, chỉ
nhị dính với nhau và dính với cả nhị lép, nhị lép có răng rất nhỏ tiểu nhụy 7,
bao phấn hình mắt chim, bầu hình trứng. Bế quả rụng với lá đài, lá hoa và tiền
diệp. Quả hình bầu dục, 1 hạt [5], [6], [10]. Ngưu tất là cây ưa sáng và ưa ẩm,
cây ra hoa quả nhiều hàng năm, tái sinh tự nhiên chủ yếu từ hạt.
Phân bố: Cây được trồng nhiều ở Lai Châu, Hưng Yên, Tây Nguyên,
Thái Nguyên, Vĩnh Phúc, Hà Nội, Sa Pa [5].

3


1.1.2. Bộ phận dùng
Bộ phận dùng: Rễ - Radix Achyranthis
Bidentatae
Đặc điểm: Rễ hình trụ, dài 20- 30 cm,
đường kính 0,5- 1,0 cm. Đầu trên mang vết tích
của gốc thân, đầu dưới thuôn nhỏ. Mặt ngoài
màu vàng nâu, có nhiều nếp nhăn dọc nhỏ và vết
tích của rễ con [3].
Hình 1.2: Rễ ngưu tất- Radix
Achyranthis bidentatae
1.1.3. Thành phần hóa học
Có rất nhiều công trình nghiên cứu về thành phần hóa học của ngưu tất.
Trong đó một số thành phần chính trong rễ ngưu tất như: saponin triterpenoid,
phytoecdysone, polysaccharide,…[6], [10], [23].
a. Saponin triterpenoid
Thành phần saponin trong rễ ngưu tất chủ yếu là lớp saponin triterpenoid
mà phần sapogenin có khung oleanan. Hợp chất đầu tiên acid oleanolic (1) được
Tang & Eisenbrand mô tả đầu tiên năm 1992. Từ đó đến nay, bằng việc sử dụng
kĩ thuật phân tích hiện đại như LC-MS, HPLC…đã có tổng cộng trên 20 hợp
chất saponin trong rễ cây ngưu tất được phát hiện [27]. Trong đó có một số
saponin triterpenoid điển hình như: oleanolic acid-28-O-β-D-glucopyranoside
(2), chikusetsusaponin V (3), 3-O-β-D-glucopyranosyl-oleanolic acid-28-O-βD-glucopyranoside (4) [31], bidentatoside I (5) [34], bidentatoside II (6),
chikusetsusaponin V methyl ester (7) [33].

4

Bảng 1.1: Cấu trúc một số hợp chất saponin triterpenoid trong rễ ngưu
tất

STT

Tên chất

2

Oleanolic acid-28-O-β-Dglucopyranoside
Chikusetsusaponin V

3

R1

R2

H

Glc

Glc

4

3-O-β-D-glucopyranosyl-

5

oleanolic acid-28-O-β-Dglucopyranoside
Bidentatoside I

Glc

Glc

6

Bidentatoside II

7

Chikusetsusaponin V

Glc

Glc

methyl ester

b. Phytoecdysone
5


Nhóm hợp chất tiếp theo mang cấu trúc khung steroid có hàm lượng nhỏ
hơn trong rễ ngưu tất, gọi chung là các phytoecdysone. Trong đó ecdysterone
và inokosterone được Takemoto và cộng sự phát hiện đầu tiên năm 1967 [40].
Hàm lượng ecdysterone và inokosterone trong ngưu tất khi chiết với MeOH
cho khoảng 0,069% và 0,037% [36]. Có tổng cộng trên 10 hợp chất mang cấu

trúc này được phát hiện cho tới nay [25], [26], [41], [48], [52].
Bảng 1.2: Cấu trúc một số hợp chất phytoecdysone trong rễ ngưu tất

STT
8

9

10

Tên chất

R1

R2

R3

H

OH

H

OH

H

OH

Ecdysterone

25-R inokosterone

25-S inokosterone

c. Polysaccharid

Hình 1.3: Cấu trúc polysaccharid trong rễ ngưu tất: n = 1,2,3,…20; R: H
hoặc gốc alkyl, alkenyl, alkinyl có từ 1 -4 nguyên tử C, các gốc R có thể
giống hoặc khác nhau [24].

6


Sáng chế [WO/2001/037844] công bố năm 2001 đã xác định cấu trúc hóa
học của polysaccharid trong rễ ngưu tất (Hình 1.5) [23], cấu trúc này cũng được
Chen XM và cộng sự vào năm 2005 xác định là một fructan mạch ngắn [18].
Hàm lượng của polysaccharid trong rễ ngưu tất trong nghiên cứu của Jiang Yan
năm 2015 khoảng 11,7 % [21].
1.1.4. Tác dụng dược lý
a. Theo y học cổ truyền
Ngưu tất có vị đắng chua, tính bình, không độc, tác dụng vào 2 kinh can
và thận. Dạng sống có tác dụng hành huyết, tán ứ, tiêu ung lợi thấp. Dạng chín
có tác dụng bổ can, ích thân, cường gân tráng cốt [5]. Ngưu tất dạng sống chữa
cổ họng sưng đau, mụn nhọt, đái rát buốt, đái ra máu hoặc sỏi, bế kinh, bụng
dưới kết hòn cục, đẻ khó hoặc khi đẻ rau thai không ra, sau khi đẻ ứ huyết gây
đau bụng, chấn thương, ứ máu bầm, đầu gối nhức mỏi. Ngưu tất sao ẩm chữa
can thận hư, ù tai, đau lưng, mỏi gối, tay chân co quắp [5].
b. Theo y học hiện đại

Theo các nghiên cứu trên thế giới, rễ cây ngưu tất có một số tác dụng
dược lý chính như sau:
 Giảm đau, kháng khuẩn, chống viêm: Saponin trong dịch chiết của ngưu
tất và các sản phẩm chế biến của ngưu tất có tác dụng làm giảm đau, chống
viêm tai giữa trên chuột được gây viêm bởi tinh dầu Croton, tác dụng chống
viêm này tăng lên khi ngưu tất được chế biến với rượu vang [30], tác dụng giảm
đau chống viêm cũng được chứng minh trong thử nghiệm của GAO Chang Kun
và cộng sự [20].
 Điều hòa miễn dịch: Qinghua Chen và cộng sự thử nghiệm trên lợn con
cai sữa cho thấy bổ sung chế độ ăn với polysaccharide có trong ngưu tất giúp
chúng tăng cường đáp ứng miễn dịch tế bào và miễn dịch dịch thể [16]. Tác
dụng này cũng được chứng minh trong thử nghiệm của Lu T và cộng sự, cho
7


thấy polysaccharide trong ngưu tất ở nồng độ cao có hiệu quả tăng cường đáng
kể hiệu giá kháng thể, thúc đẩy sự phát triển của các tế bào lympho T ngoại vi
và tăng cường khả năng miễn dịch của vaccine ND-IB trên gà [39].
Polysaccharid trong rễ ngưu tất còn có tác dụng ức chế sự phát triển và di căn
của tế bào ung thư, bảo vệ, phục hồi chức năng gan trên chuột nhắt [23].
 Trợ lực tử cung: Dịch chiết ngưu tất có tác dụng tăng cường hoạt động
các cơ trơn tử cung trên chuột đã được chứng minh trong thử nghiệm của YJ
Yuan và cộng sự [46].
 Chống loãng xương: Thử nghiệm trên chuột đã chứng minh dịch chiết rễ
ngưu tất giúp cải thiện mật độ xương, giúp điều trị loãng xương, và có thể là
một loại thuốc thay thế tiềm năng cho điều trị loãng xương sau mãn kinh [15],
[49].
 Hạ đường huyết: Theo nghiên cứu của Shengxia Xue và cộng sự năm
2008, cho kết quả các hợp chất polysaccharide biến đổi từ ngưu tất có tác dụng
làm giảm đáng kể mức đường huyết và malondialdehyde ở chuột bị tiểu đường

[43].
 Tác dụng trên hệ thần kinh: Ying Yuan và cộng sự đã chứng minh các
polypeptide chiết được từ ngưu tất có tác dụng thúc đẩy tái tạo mô và phục hồi
chức năng của dây thần kinh không bị thương ở chuột [43]. Ngoài ra còn giúp
ngăn ngừa tổn thương tế bào glutamate gây ra trên tế bào thần kinh [51].
 Ức chế sự phát triển khối u: Hợp chất polysaccharide trong dịch chiết rễ
ngưu tất đã được chứng minh có tác dụng ức chế sự phát triển khối u trong
thử nghiệm của Yu S, Zhang Y [45].
 Hạ cholesterol: Dịch chiết nước của rễ ngưu tất có tác dụng ức chế tạo
mạch và kiểm soát trọng lượng cơ thể ở chuột được cho ăn với chế độ giàu
chất béo [37].

8


1.2.

Tổng quan về hợp chất Saponin

1.2.1. Cấu trúc hóa học và phân loại [4]
Saponin có cấu trúc gồm 2 phần: phần đường và phần sapogenin.
 Phần sapogenin: có cấu trúc triterpen với khung 30 carbon hoặc steroid với
27 carbon dẫn xuất từ khung cholestan. Nhóm thế trong sapogenin thường chỉ
là nhóm hydroxyl đôi khi gặp nhóm oxo hay sulfat.
 Phần đường: Đa số saponin có từ 1- 2 mạch đường. Tổng số đơn vị đường
trong saponin thường là 1- 4 đường, tối đa có thể lên đến 11 đơn vị. Đường
trong saponin là các đường thông thường như β-D-glucose, β-D-xylose, α-Lrhamnose và α-L-arabinose…
Phân loại saponin:

Saponin

Saponin triterpenoid
Saponin
triterpenoid 5
vòng

Saponin
triterpenoid 4
vòng

Saponin steroid

Saponin steroid
alkaloid

Nhóm
Dammaran

Nhóm
Spirostan

Nhóm
aminofurostan

Nhóm Lanostan

Nhóm Furostan

Nhóm
Spirosolan

Nhóm Olean
Nhóm Ursan

Saponin steroid

Nhóm
Taraxasteran
Nhóm Lupan

Nhóm
Tirucallan

Nhóm
Solanidan

Nhóm
Cucurbitan

Nhóm Hopan

Nhóm khác:
Taraxeran, Glutinan,..

Hình 1.4: Phân loại saponin theo khung sapogenin
9

Các nhóm khác

Cấu trúc khung cơ bản của một số nhóm saponin:
Nhóm Oleanan:

Hình 1.5: Khung oleanan và cấu trúc acid oleanolic
Phần lớn các saponin triterpenoid trong tự nhiên đều thuộc nhóm này.
Saponin trong rễ ngưu tất phần lớn có khung cơ bản là oleanan, đặc biệt là acid
oleanolic.
Đôi nét về acid Oleanolic:
 Tính chất vật lý [14], [35]: Bột kết tinh màu trắng; công thức phân tử:
C30H48O3; khối lượng phân tử: 456,71 g/mol; nhiệt độ nóng chảy: > 300oC
(572oF; 573 K); góc quay cực: +83,3o; pKa= 4,59.
 Tính tan: Không tan trong nước, tan trong 65 phần ether, 108 phần cồn
95 %, 35 phần cồn 95 % sôi, 118 phần chloroform, 118 phần aceton, 235 phần
MeOH.
 Một số tác dụng dược lý: Tác dụng chống tác nhân gây khối u và kháng
virus [28]; tác dụng chống HIV và HCV in vitro [44]; góp phần bảo vệ tế bào
gan [22], [29].
 Một số dược liệu có thành phần là acid oleanolic: Ngưu tất, cỏ xước, giảo
cổ lam, bồ kết, oliu,…
Ngoài ra lớp chất saponin còn một số khung khác như:

10


Hình 1.6: Cấu trúc khung cơ bản của một số nhóm saponin
1.2.2. Tính chất hóa lý của saponin
1.2.1.1. Tính chất vật lý [4]
 Saponin là những chất vô định hình, không màu tới màu trắng ngà. Đa
số saponin có vị đắng, trừ một số có vị ngọt.
 Saponin là những chất phân cực, tan trong các dung môi phân cực: alcol,

cồn- nước, nước, dimethyl sulfoxid, acid acetic, pyridin, butanol, ít tan
trong: aceton, ether, hexan,...tủa bởi: chì acetat, bari hydroxyl, muối
amoni sulfat,..
 Saponin có cấu trúc lưỡng cực nên có tính chất hoạt động bề mặt.
 Khối lượng phân tử lớn nên saponin khó bị thẩm tích.
1.2.1.2. Tính chất hóa học [4]
 Khả năng làm vỡ hồng cầu
 Độc với cá, các động vật thân mềm vì làm tăng tính thấm biểu mô đường
hô hấp nên làm mất điện giải cần thiết của các động vật này.
 Tạo phức với cholesterol hoặc với các chất 3-β-hydroxysteroid khác.
 Tùy nhóm thế mà saponin có tính acid hoặc kiềm.
1.3.

Một số phương pháp định tính, định lượng saponin
11


1.3.1. Các phương pháp định tính
1.3.1.1. Phản ứng tạo bọt [3]
Lấy 2,0 g bột dược liệu, thêm 50 ml dung dịch natri cloride 1 % (kl/ tt)
(TT), đun sôi nhẹ, lọc, cho dịch lọc vào ống nghiệm, lắc, xuất hiện nhiều bọt
bền vững chứng tỏ có saponin trong dược liệu.
1.3.1.2. Phản ứng màu [38]
Cân 1,0 g bột mẫu cho vào ống ly tâm 50 ml, thêm 10 ml
dichloromethane. Đưa vào máy siêu âm 560 W trong 30 phút. Sau đó ly tâm
3000 vòng/phút trong 5 phút. Lọc qua bộ lọc RC 0,45 µm. Chuyển 0,5 ml dịch
lọc vào ống nghiệm khác. Nhỏ từ từ 0,5 ml acid sulfuric men theo thành ống.
Để yên 20 phút. Sẽ thấy giữa lớp tiếp xúc 2 dung dịch xuất hiện vòng màu nâu
đỏ hoặc nâu vàng.
1.3.1.3. Sắc kí lớp mỏng [3]

 Bản mỏng : Silicagel G
 Hệ dung môi: Cloroform: MeOH (40:1) hoặc dichloromethane: acetate (5:1)
[38].
 Chuẩn: Dung dịch acid oleanolic chuẩn 0,1 % (kl/ tt) trong EtOH.
 Hiện màu: Dung dịch acid phosphomolypdic 5 % (kl/tt) trong EtOH (TT).
Sấy ở 100oC trong 10 phút.
1.3.2. Các phương pháp định lượng
1.3.2.1. Phương pháp khối lượng
Chiết saponin rồi cân. Có thể thủy phân saponin, phần sapogenin rất ít
tan trong nước được lọc hoặc được hoà tan trong dung môi hữu cơ rồi đem bốc
hơi dung môi hữu cơ, sấy, cân. Từ lượng dược liệu và lượng sapogenin cân
được tính ra hàm lượng saponin trong dược liệu [4]. Tuy nhiên phương pháp
này cho kết quả kém chính xác và không đánh giá được hết lượng saponin trong
dược liệu, vì vậy ngày nay phương pháp này ít được sử dụng.
12


1.3.2.2. Phương pháp đo quang
Định lượng bằng phương pháp đo quang có nhiều ưu điểm là tiến hành
nhanh, đơn giản, được sử dụng phổ biến trong phân tích các hoạt chất của dược
liệu. Đối với saponin, cần tiến hành làm phản ứng màu với thuốc thử, sản phẩm
tạo thành có khả năng hấp thụ ở vùng ánh sáng khả kiến. Đo độ hấp thụ của
dung dịch thử và so sánh với chuẩn, tính được hàm lượng saponin toàn phần.
Đối với nhóm triterpenoid có thể dùng thuốc thử vanillin- sulfuric hoặc
acid percloric, các saponin cho màu tím với thuốc thử này. Zhuohong và cộng
sự [42] xác định hàm lượng saponin tổng trong bột giảo cổ lam bằng cách chiết
Soxhlet với EtOH. Sử dụng thuốc thử là Vanilin trong acid acetic băng 5 % và
acid percloric 70 %. Ủ hỗn hợp ở 60ºC trong 15 phút. Làm lạnh nhanh bằng
nước đá. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 550 nm. Tính kết quả saponin toàn phần
dựa vào chuẩn gypenoside. Thuốc thử này cũng được sử dụng để xác định hàm

lượng saponin trong nghiên cứu cây giảo cổ lam của Nguyễn Thu Hương [9].
1.4. Tổng quan về phương pháp HPLC
1.4.1. Nguyên tắc hoạt động [2], [8], [19]
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC): là một phương pháp phân tích hóa lý,
dùng để tách và định lượng các thành phần trong hỗn hợp dựa vào ái lực khác
nhau của chất tan với 2 pha: pha tĩnh và pha động. Khi dung dịch của hỗn hợp
các chất cần phân tích đưa vào cột, chúng sẽ được hấp phụ hoặc phân bố vào
pha tĩnh tùy thuộc vào bản chất của cột và của chất cần phân tích. Khi ta bơm
dung môi pha động bằng bơm với áp suất cao thì tùy thuộc vào ái lực của các
chất với hai pha, chúng sẽ di chuyển qua cột với vận tốc khác nhau dẫn đến sự
phân tách.
Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ được detector phát hiện và chuyển qua bộ
phận xử lí số liệu.

13


Hệ thống HPLC gồm có các bộ phận
cơ bản:
 Hệ thống cấp pha động
 Bơm sắc kí lỏng
 Bộ phận tiêm mẫu
 Cột
 Detector
 Bộ phận thu nhận và xử lí dữ liệu
Hình 1.7: Sơ đồ khối của một máy sắc kí
lỏng hiệu năng cao [32]
1.4.2. Cấu tạo HPLC [2], [8], [19]
1.4.2.1. Hệ thống cấp pha động
Pha động trước khi đưa vào cột cần được lọc bằng màng lọc 0,45 µm và

đuổi khí hòa tan trong pha động bằng cách: rung siêu âm, sục khí trơ Heli,…
Có 2 chế độ pha động rửa giải:
 Đẳng dòng (isocratic): Thành phần pha động không thay đổi trong quá
trình sắc kí.
 Chương trình dung môi (gradient): pha động là hỗn hợp của nhiều dung
môi. Tỷ lệ các thành phần dung môi thay đổi theo chương trình rửa giải.
1.4.2.2. Hệ thống bơm
Dùng để bơm pha động vào cột. Yêu cầu của hệ thống bơm:
 Có khả năng hoạt động ở áp suất đầu vào khoảng 5000 psi trở lên
 Đảm bảo lưu lượng lặp lại trong khoảng 0,01- 5,0 ml/phút
1.4.2.3. Hệ tiêm mẫu
Mẫu được tiêm thẳng vào pha động cao áp ở ngay đầu cột mà không cần
dừng dòng bằng một van tiêm có vòng chứa mẫu.
1.4.2.4. Cột
14


 Cột sắc kí lỏng hiệu năng cao thường được chế tạo bằng thép không gỉ,
thủy tinh hoặc chất dẻo.
 Chiều dài cột: 10 – 30 cm
 Đường kính trong cột: 4 – 10 mm
 Hạt nhồi cột: có thể được chế tạo từ silica, nhôm oxit, polymer xốp, nhựa
trao đổi ion. Các hạt silica gel hình thành thường được bao một lớp mỏng hữu
cơ liên kết với bề mặt.
 Cột bảo vệ: được đặt trước cột sắc kí để loại bớt tạp.
 Điều nhiệt cột: đảm bảo nhiệt độ ổn định cho cột.
1.4.2.5. Detector
Là bộ phận phát hiện chất phân tích, tùy theo bản chất của chất cần phân
tích mà sử dụng detector thích hợp. Các loại detector hiện đang được sử dụng:
 Detector hấp thụ UV-VIS: áp dụng cho những chất có khả năng hấp thụ

ánh sáng trong vùng tử ngoại hoặc khả kiến
 Detector huỳnh quang (RF): sử dụng để phát hiện các chất có khả năng
phát huỳnh quang. Đối với những chất bản chất không phát huỳnh quang cần
phải dẫn xuất hóa chất phân tích để tạo sản phẩm có khả năng này.
 Detector chỉ số khúc xạ (RI): thường dùng để định lượng hợp chất đường.
 Detector độ dẫn: phù hợp với các chất có hoạt tính điện hóa
Ngoài ra còn có: detector tán xạ bay hơi (ELSD), detector điện hóa (ED),
detector độ dẫn (IC), detector khối phổ (MS),…
1.4.3. Ứng dụng của phương pháp HPLC trong định lượng saponin
Một số nghiên cứu sử dụng phương pháp HPLC trong định lượng saponin.
Bảng 1.3. Các nghiên cứu định lượng saponin bằng HPLC
Phương pháp tiêu
chuẩn/ công trình
nghiên cứu

Điều kiện HPLC

15

Thời
gian lưu
(phút)


Dược điển Hồng  Cột C18 (300⨯3,9 mm; 4 µm)
 Pha động: HCl 0,0012 M và Acetonitrile
Kông (2010) [38]
(20:80, v/v)
 Detector: UV, λ =208 nm
 Tốc độ dòng: 1,0 ml /phút

 Thể tích tiêm: 10 µl
Trịnh Thị Nhung  Cột: Inertsil ODS (250⨯4,6 mm; 5 µm),
nhiệt độ cột 40oC
(2012) [11]
 Pha động: ACN và dd H3PO4 0,1 % (70: 30,
v/v)
 Detector: UV 208 nm
 Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút
 Thể tích tiêm: 10 µl

15

Hồ Thị Thu Hương  Cột: Inersil C18 (250⨯4,6 mm; 5 µm)
(2012) [7]
 Pha động: methanol và đệm kali
dihydrophospat 0,03 M (92:8, v/v), pH
=2,8
 Detector: UV 215 nm
 Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút
 Thể tích tiêm: 10 μl
Zhou Chunhua et  Cột: RP C18 (250⨯4,6 mm; 5 µm)
 Pha động: MeOH và đệm phosphat 0,03
al. (2007) [50]
M (88:12, v/v), pH =2,8
 Detector: UV 210 nm
 Tốc độ dòng : 1,0 ml/ phút
 Thể tích tiêm : 10 µl

11

Chen Qinhua et al.  Cột: DL-C18 (250⨯4,6 mm, 5,0 µm), nhiệt
độ cột: 30°C
(2011) [17]
 Pha động: MeOH và dd acid formic 10 mM
(83:17, v/v)
 Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút
 Thể tích tiêm : 10 µl
 Detector: MS - Nguồn ion hóa ESI –

43

16

28

19