SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ ĐỂ PHÁT HIỆN NHANH CỘNG ĐỒNG VI KHUẨN KHỬ CHLOR YẾM KHÍ 2,3,7,8 – TETRACHLORODIBENZO – P DIOXIN CHO ĐẤT/BÙN Ô NHIỄM CHẤT ĐỘC DA CAM
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (2.6 MB, 176 trang )
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
BÁO CÁO TỔNG KẾT
ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP BỘ
SỬ DỤNG PHƢƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ
ĐỂ PHÁT HIỆN NHANH CỘNG ĐỒNG VI KHUẨN KHỬ
CHLOR YẾM KHÍ 2,3,7,8 – TETRACHLORODIBENZO – P
DIOXIN CHO ĐẤT/BÙN Ô NHIỄM
CHẤT ĐỘC DA CAM
Mã số: B2011–16–03
Chủ nhiệm đề tài: Ths. Châu Thị Anh Thy
Cần Thơ, Tháng 12–2014
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
BÁO CÁO TỔNG KẾT
ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP BỘ
SỬ DỤNG PHƢƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ
ĐỂ PHÁT HIỆN NHANH CỘNG ĐỒNG VI KHUẨN KHỬ
CHLOR YẾM KHÍ 2,3,7,8 – TETRACHLORODIBENZO – P
DIOXIN CHO ĐẤT/BÙN Ô NHIỄM
CHẤT ĐỘC DA CAM
Mã số B2011–16–03
Xác nhận của cơ quan
chủ trì đề tài
Chủ nhiệm đề tài
Ths. Châu Thị Anh Thy
Cần Thơ, Tháng 12–2014
DANH SÁCH THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI
STT
Họ và tên
Đơn vị công tác
1
Ths. Châu Thị Anh Thy
Bm. Khoa học Đất, Đại học Cần Thơ
2
Ts. Dƣơng Minh Viễn
Bm. Khoa học Đất, Đại học Cần Thơ
3
Ts. Trần Văn Dũng
Bm. Khoa học Đất, Đại học Cần Thơ
4
Ts. Trần Nhân Dũng
Viện NCPT CNSH, ĐH. Cần Thơ
5
Ts. Đỗ Thị Xuân
Bm. Khoa học Đất, Đại học Cần Thơ
6
Ks. Nguyễn Thị Thu Hà
Bm. Khoa học Đất, Đại học Cần Thơ
7
HVCH. Lâm Tử Lăng
Bm. Khoa học Đất, Đại học Cần Thơ
8
HVCH. Diệp
Diễm Châu
9
Ks. Nguyễn Vũ Bằng
10
Ths. Nguyễn Thị Tố Quyên Bm. Khoa học Đất, Đại học Cần Thơ
Nguyễn Bm. Khoa học Đất, Đại học Cần Thơ
Bm. Khoa học Đất, Đại học Cần Thơ
DANH SÁCH ĐƠN VỊ PHỐI HỢP CHÍNH
STT
Họ và tên
Đơn vị công tác
1
PGS. Ts Nils Hogberg
Đại học Nông nghiệp Upsala Thụy Điển
2
Gs. Ts. Max M. Haggblom
ĐH. Rutgers, Hoa Kỳ
MỤC LỤC
Trang
Mục lục .............................................................................................................. i
Danh sách hình .................................................................................................v
Danh sách bảng ............................................................................................ viii
Danh sách từ viết tắt ........................................................................................x
Thuyết minh đề tài ......................................................................................... xi
Thông tin kết quả nghiên cứu tiếng Việt .................................................... xiii
Thông tin kết quả nghiên cứu tiếng Anh .................................................. xvii
CHƢƠNG MỞ ĐẦU ........................................................................................1
I. TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU .............................................1
1. Tổng quan về dioxins và dibenzofurans ........................................................1
1.1 Cấu trúc hóa học của dioxins và dibenzofurans ..........................................1
1.2 Độc tính của dioxins và cơ chế ảnh hưởng lên sức khỏe con người và động
vật……………………… ...................................................................................2
1.3 Nguồn gốc phát sinh dioxins trong môi trường………………… ...............3
1.4 Tính chất của dioxins trong môi trường ......................................................4
1.5 Sự tích tụ dioxins trong môi trường và trong chuỗi thức ăn ........................4
2. Tình hình ô nhiễm dioxins trên thế giới và ở Việt Nam ................................5
2.1 Ô nhiễm dioxins trên thế giới .......................................................................5
2.2 Ô nhiễm dioxins ở Việt Nam ........................................................................6
2.2.1 Nguyên nhân ô nhiễm dioxins ở Việt Nam ................................................6
2.2.2 Mức độ ô nhiễm dioxins tại một số điểm nóng ở Việt Nam và ảnh hưởng
của sự lưu tồn dioxins đến sức khỏe con người .................................................7
3. Một số biện pháp khắc phục ô nhiễm dioxins ..............................................10
3.1 Phương pháp xử lý hoá học, lý học và cơ học ...........................................10
3.2 Phương pháp phân hủy sinh học ................................................................10
4. Sự khử chlor của các hợp chất PCDDs/Fs bởi vi khuẩn kỵ khí .................11
i
5. Giới thiệu gene chuyên biệt 16S rRNA và gene chức năng dehalogenase khử
chlor của vi sinh vật .........................................................................................12
5.1 Gene 16S rRNA chuyên biệt .......................................................................12
5.2 Gene chức năng dehalogenase (rdh) .........................................................13
6. Một số phƣơng pháp sinh học phân tử sử dụng trong phân tích sự đa dạng cộng
đồng vi sinh vật............................................................................................... 14
6.1 Phản ứng chuỗi polymerase (PCR – Polymerase Chain Reaction) ..........14
6.2 Phương pháp điện di biến tính tăng cấp (DGGE–Denaturing Gradient Gel
Electrophoresis)................................................................................................15
6.3 Phương pháp pyrosequencing ....................................................................15
7. Phƣơng pháp phân tích trên sắc ký khí khối phổ (GCMS – Gas
Chromatography– Mass Spectrometry) ...........................................................17
II. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI ...........................................................17
III. MỤC TIÊU ĐỀ TÀI ................................................................................19
IV. CÁCH TIẾP CẬN ĐỀ TÀI .....................................................................19
V. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU ..................................................................20
VI. PHẠM VI NGHIÊN CỨU ......................................................................20
VII. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ..................................................................21
VIII. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................21
A. PHƢƠNG TIỆN ........................................................................................21
B. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................22
Nội dung 1: Phân lập các dòng vi khuẩn yếm khí ...........................................22
Nội dung 2: Xác định gene 16S rRNA chuyên biệt và gene chức năng
dehalogenase rdh khử chlor của các dòng vi khuẩn ........................................25
Nội dung 3: Thiết kế và thử nghiệm các cặp mồi (primers) nhắm vào gene 16S
rRNA chuyên biệt và gene chức năng dehalogenase rdh khử chlor yếm khí
dioxins của các dòng vi khuẩn bản địa ............................................................32
Nội dung 4: Xây dựng quy trình ứng dụng phƣơng pháp sinh học phân tử phát
hiện vi khuẩn khử chlor yếm khí dioxins .........................................................36
C. PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH................................................................37
1. Phƣơng pháp lấy mẫu ...................................................................................37
ii
2. Phân tích dioxins ..........................................................................................38
3. Phƣơng pháp trích DNA .............................................................................39
4. Phƣơng pháp thực hiện phản ứng PCR với các mồi chuyên biệt nhắm vào 16S
rRNA gene và gene chức năng dehalogenase rdh ...........................................41
5. Phƣơng pháp pyrosequencing ......................................................................41
CHƢƠNG 1. PHÂN LẬP CỘNG ĐỒNG VI KHUẨN KHỬ CHLOR YẾM
KHÍ PCDDs ....................................................................................................42
1.1 Đánh giá khả năng khử yếm khí chlor dioxins 1,2,3,4–TCDD của cộng đồng
vi khuẩn khu vực A Lƣới và Cam Lộ, Quảng Trị, Biên Hòa, Đà Nẵng ..........42
1.1.1 Khả năng khử yếm khí chlor 1,2,3,4–TCDD khu vực A Lưới và Cam Lộ,
Quảng Trị .........................................................................................................42
1.1.2 Khả năng khử yếm khí chlor 1,2,3,4–TCDD khu vực Biên Hòa, Đà Nẵng45
1.1.3 Khả năng khử yếm khí chlor 1,2,3,4–TCDD trong thí nghiệm với mẫu thu
tại A Lưới và Cùa của đợt lấy lần 2 .................................................................48
1.1.4 Khả năng khử chlor yếm khí 1,2,3,4–TCDD khu vực Huế, Quảng Trị trên
silica .................................................................................................................49
1.2 Đánh giá khả năng khử yếm khí chlor dioxins 2,3,7,8–TCDD ................50
1.2.1 Khả năng khử chlor yếm khí 2,3–DCDD và 2,3,7,8–TCDD tại khu vực A
Lưới và Cam Lộ, Quảng Trị.............................................................................50
1.2.2. Lưu tồn dioxins và khả năng khử chlor yếm khí dioxins của cộng đồng vi
khuẩn ở đất và bùn sân bay Biên Hoà và Đà Nẵng .........................................51
1.2.3 Hoạt động khử chlor yếm khí 2,3,7,8–TCDD của cộng đồng vi khuẩn khu
vực A Lưới và Cam Lộ, Quảng Trị, Biên Hòa, Đà Nẵng .................................53
1.2.4 Khả năng khử chlor yếm khí 2,3,7,8–TCDD của cộng đồng vi khuẩn khu
vực A Lưới và Cam Lộ, Quảng Trị (thí nghiệm 2, mẫu lấy đợt 2) ...................54
1.3 Khảo sát đa dạng cộng đồng vi khuẩn khử yếm khí chlor dioxins ............55
1.3.1 Khảo sát đa dạng cộng đồng vi khuẩn khử yếm khí chlor dioxins ở khu vực
A Lưới và Cam Lộ, Quảng Trị .........................................................................55
1.3.2 Sự đa dạng của cộng đồng vi khuẩn khử chlor yếm khí dioxins trong đất,
bùn sân bay Biên Hoà ......................................................................................58
1.3.3 Đa dạng cộng đồng vi khuẩn khử chlor dioxins yếm khí trong đất và bùn
sân bay Đà Nẵng .............................................................................................60
iii
1.3.4 So sánh cộng đồng vi khuẩn khử chlor yếm khí dioxins ở sân bay Biên Hoà,
Đà Nẵng với một số vùng ô nhiễm khác như huyện A Lưới, Thừa Thiên Huế và xã
Cam Nghĩa, huyện Cam Lộ, Quảng Trị ...........................................................62
CHƢƠNG 2. THỬ NGHIỆM CÁC CẶP MỒI CHUYÊN BIỆT NHẮM
VÀO GENE 16S rRNA VÀ GENE CHỨC NĂNG DEHALOGENASE KHỬ
CHLOR YẾM KHÍ DIOXINS CỦA CÁC DÒNG VI KHUẨN BẢN ĐỊA67
2.1 Sự hiện diện và đa dạng của các cộng đồng vi khuẩn khử chlor yếm khí
PCDDs ..............................................................................................................63
2.1.1 Sự hiện diện của các cộng đồng vi khuẩn khử chlor yếm khí PCDDs ...63
2.1.2 Kết quả chạy PCR với các cặp mồi chuyên biệt nhắm vào gene 16S rRNA
của 10 mẫu được chọn để chạy pyrosequencing .............................................68
2.1.3 Khảo sát đa dạng cộng đồng vi khuẩn khử chlor yếm khí dioxins bằng
phương pháp pyrosequencing ..........................................................................72
2.2 Sự hiện diện gene chức năng dehalogenase rdh của các cộng đồng vi khuẩn
khử chlor yếm khí PCDDs ...............................................................................76
CHƢƠNG 3. XÂY DỰNG QUY TRÌNH ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP
SINH HỌC PHÂN TỬ PHÁT HIỆN VI KHUẨN KHỬ CHLOR YẾM KHÍ
DIOXINS .........................................................................................................79
3.1 Quy trình thu mẫu đất/ bùn và trữ mẫu ......................................................79
3.2 Quy trình trích DNA ..................................................................................79
3.3 Quy trình thực hiện phản ứng PCR với các cặp mồi chuyên biệt nhắm vào
gene16S rRNA và các cặp mồi gene chức năng dehalogenase rdh.................80
3.3.1 Quy trình thực hiện phản ứng PCR với các cặp mồi chuyên biệt nhắm vào
gene 16S rRNA .................................................................................................80
3.3.2 Quy trình thực hiện phản ứng PCR với các cặp mồi chuyên biệt nhắm vào
gene chức năng rdh .........................................................................................81
3.4 Quy trình điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose .......................82
CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................84
4.1 KẾT LUẬN ...............................................................................................84
4.2 KIẾN NGHỊ ..............................................................................................84
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................86
PHỤ CHƢƠNG .................................................................................................. 104
iv
DANH SÁCH HÌNH
Hình
Tên hình
Trang
1
Cấu trúc hóa học của Polychlorinated dioxins
1
2
Cơ chế tạo ra sản phẩm phụ 2,3,7,8–TCDD trong quá trình
tổng hợp chất diệt cỏ 2,4,5–T
4
3
Phƣơng thức loại bỏ Chlor của 1,2,3,4– TCDD (A) và
1,2,3,7,8– PeCDD (B) của loài Dehaloccoides sp. dòng
CBDB1
11
4
Các chu kỳ của kỹ thuật PCR
15
5
Cấu tạo máy sắc ký khí khối phổ GCMS
17
1.1
Hoạt động khử yếm khí chlor 1,2,3,4–TCDD
43
1.2
Tốc độ và cách thức khử chlor 1,2,3,4–TCDD trong mẫu bùn
suối Vĩnh Phƣớc
43
1.3
Tốc độ và cách thức khử chlor 1,2,3,4–TCDD trong mẫu bùn
hồ Mai Lộc
44
1.4
Tốc độ và cách thức khử chlor 1,2,3,4–TCDD trong mẫu bùn
hồ Đội 4
44
1.5
Hoạt động khử chlor yếm khí 1,2,3,4–TCDD trong mẫu đất sân
bay Biên Hòa (BHĐ) nuôi ủ với 1,2,3,4–TCDD theo thời gian
nuôi
45
1.6
Hoạt động khử chlor yếm khí 1,2,3,4–TCDD ở mẫu bùn sân
bay Biên Hòa
46
1.7
Hoạt động khử yếm khí chlor 1,2,3,4–TCDD trong bùn và đất
sau 7 tháng ủ
47
1.8
Hoạt động khử chlor 1,2,3,4–TCDD trong lọ ủ yếm khí với
bùn hồ Bàu Sen, sân bay Đà Nẵng
47
1.9
Hoạt động khử chlor yếm khí 1,2,3,4–TCDD trong đất và bùn
sau 38 tháng ủ (đợt lấy mẫu 2)
48
1.10
Khả năng khử chlor kỵ khí của cộng đồng vi khuẩn đối với
1,2,3,4–TCDD trong đất/bùn suối Vĩnh Phƣớc, đập Mai Đàn,
đập Đội 4, sân bay Đà Nẵng, sân bay Biên Hòa
49
1.11
Hoạt động khử chlor kỵ khí của cộng đồng vi khuẩn đối với
1,2,3,4–TCDD khi chuyển sang môi trƣờng mới
50
1.12
Tốc độ và cách thức khử chlor 2,3–DCDD
51
1.13
Sự khử chlor 2,3,7,8–TCDD bởi vi khuẩn yếm khí hồ Lâm Ly
51
v
1.14
Hoạt động khử chlor dioxins trong nghiệm thức không cấy
dioxins sau 7 tháng ủ
53
1.15
Khả năng khử chlor yếm khí 2,3,7,8 –TCDD
54
1.16
Hoạt động khử yếm khí chlor 2,3,7,8 –TCDD trong bùn và đất
sau 38 tháng ủ
55
1.17
Vi khuẩn ngành Chloroflexi trong các mẫu đất/bùn có khả
năng khử yếm khí chlor dioxins
56
1.18
Cây phả hệ thể hiện mối quan hệ một số loài vi khuẩn thuộc
nhóm Chloroflexi có trong các mẫu bùn/đất tại A lƣới và Cam
Nghĩa, Quãng Trị với nhau và với một số loài vi khuẩn yếm
khí khử chlor đƣợc biết trên thế giới
57
1.19
Điện di đồ sản phẩm PCR của nhóm vi khuẩn khử chlor
Chloroflexi trong mẫu đất và bùn Biên Hoà với cặp mồi
338F/1101R
58
1.20
Kết quả chạy DGGE các mẫu bùn sân bay ở các mẫu đối
chứng sống (ĐCS) 7 tháng nuôi, mẫu bắt đầu, ủ với 1,2,3,4–
TCDD và 2,3,7,8–TCDD
59
1.21
Kết quả chạy DGGE các mẫu đất sân bay ở các mẫu đối chứng
sống ở các tháng nuôi, mẫu bắt đầu nuôi với 1,2,3,4–TCDD và
2,3,7,8–TCDD
60
1.22
Điện di đồ sản phẩm PCR của nhóm vi khuẩn khử chlor
Chloroflexi trong các nghiệm thức bùn hồ Bàu Sen với cặp mồi
338F/1101R
61
1.23
Điện di đồ sản phẩm PCR (DGGE) của các nghiệm thức hồ
Bàu Sen, sân bay Đà Nẵng
61
1.24
So sánh đa dạng cộng đồng khử chlor yếm dioxins ở bùn sân
bay Biên Hoà, Đà Nẵng và một số ô nhiễm khác nhƣ: hồ Lâm
Ly, Huyện A Lƣới, Thừa Thiên Huế (TTH) và Đập Đội 4, Xã
Cam Nghĩa, huyện Cam Lộ, Quảng Trị
62
2.1
Kết quả PCR với cặp mồi DHC1F/DHC264R
67
2.2
Kết quả chạy PCR với cặp mồi DHC730F/DHC1350R
69
2.3
Kết quả PCR với cặp mồi DHC 1F/1350R
69
2.4
Kết quả PCR với cặp mồi Chl348F/Dehal884R
70
2.5
Kết quả PCR với cặp mồi Dsb406F/Dsb619R
71
2.6
Kết quả PCR với cặp mồi 338F/Chl1101R
72
2.7
Phần trăm sự hiện diện của các ngành (phylum) đƣợc xác định
bằng phƣơng pháp pyrosequencing có trong 10 nghiệm thức
74
vi
2.8
Tỉ lệ mole còn lại của ba hoạt chất 1,2,3,4–TCDD, 23–DCDD
và 2,3,7,8–TCDD tại thời điểm lấy mẫu của 10 nghiệm thức
74
2.9
Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi rdh01F/01R
78
2.10
Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi rdh02F/02R
78
2.11
Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi rdh06F/06R
78
vii
DANH SÁCH BẢNG
Bảng
Tên bảng
Trang
1
Hệ số độc chất tƣơng đƣơng TEF theo hệ thống quốc tế (I–
TEFs; Kutz et al., 1990) và theo Tổ chức Y tế Thế giới WHO
(WHO–TEFs; Van Den Berg et al., 1998, 2000)
3
2
Hàm lƣợng dioxins chứa trong một số hợp chất khai hoang
7
3
Dƣ lƣợng dioxins trong động vật và các sản phẩm nông
nghiệp ở A Lƣới
8
4
Dƣ lƣợng dioxins trong ngƣời ở A Lƣới
8
5
Ngƣỡng dioxins trong đất và bùn tại các điểm bị ô nhiễm
nặng dioxins tiêu chuẩn quốc gia (TCVN 8183 : 2009)
8
6
Mức độ ảnh hƣởng đến con ngƣời ứng với từng nồng độ
dioxins
9
7
Dƣ tồn PCDDs/DFs trong đất (0 – 10 cm) năm 1999 ở A
Lƣới
9
8
Danh sách các cặp mồi chuyên biệt nhắm vào gene 16S
rRNA của các vi khuẩn kỵ khí khử chlor các hợp chất hữu cơ
26
9
Trình tự các cặp mồi nhắm vào gen dehalogenase rdh
29
10
Thông tin 28 mẫu trích DNA đƣợc chạy PCR với cặp mồi
chuyên biệt cho gene 16S rRNA và gene chức năng rdh
33
11
Thông tin về 10 cộng đồng vi khuẩn (10 nghiệm thức) đƣợc
lựa chọn khảo sát đa dạng bằng phƣơng pháp
pyrosequencing
36
12
Danh sách những mẫu đất đƣợc lấy ở các vùng từng bị rãi
chất độc da cam của huyện A Lƣới, Thừa Thiên Huế; địa bàn
Cùa, Quảng Trị, sân bay quân sự cũ Đà Nẵng và sân bay
Biên Hòa
37
1.1
Lƣu tồn dioxins trong đất/bùn (pg/g, trọng lƣợng khô)
51
2.1
Tổng hợp kết quả PCR với các cặp mồi chuyên biệt nhắm
vào gene 16S rRNA của các mẫu trích DNA từ thí nghiệm
khảo sát khả năng khử chlor dioxin yếm khí
63
2.2
Tổng hợp kết quả PCR với các cặp mồi chuyên biệt nhắm
vào gene 16S rRNA của các mẫu đƣợc chọn chạy
pyrosequencing
68
2.3
Kết quả chạy điện di sản phẩm PCR với 26 cặp mồi thiết kế
cho gene dehalogenase
76
viii
3.1
Chu trình luân nhiệt thực hiện phản ứng PCR các mồi
chuyên biệt nhắm vào gene 16S rRNA
81
3.2
Chu trình luân nhiệt thực hiện phản ứng PCR các mồi gene
chức năng dehalogenase (rdh)
81
ix
DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT
Chữ tắt
Từ gốc
1,2,3,4–TCDD
1,2,3,4–Tetrachlorodibenzo–p–dioxin
2,3,7,8–TCDD
2,3,7,8 – Tetrachlorodibenzo–p–dioxin
bp
Base pair
DD
Dibenzo–p–Dioxin
DF
Dibenzofuran
DGGE
Denaturing Gradient Gel Electrophoresis
DNA
Deoxyribonucleic acid
GCMS – QP 2010 Gas Chromatography Mass Spectometry QP–2010
NCBI
National Center for Biotechnology
PCBs
Polychlorinated Biphenyls
PCDDs
Polychlorodibenzo–p–dioxins
PCDFs
Polychlorinated dibenzofurans
PCR
Polymerase Chain Reaction
rdh
Reductive dehalogenase homoleogous
rRNA
Ribosomal ribonucleic acid
TEFs
Toxic Equivalance Factors
pg
Pico–gram = 10–12 g
WHO
World Health Organization
x
THUYẾT MINH ĐỀ TÀI
xi
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
THUYẾT MINH ĐỀ TÀI
KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP BỘ
1. TÊN ĐỀ TÀI
2. MÃ SỐ
Sử dụng phƣơng pháp sinh học phân tử để phát hiện
nhanh cộng đồng vi khuẩn khử chlor yếm khí B2011– 16– 03
2,3,7,8–tetrachlorodibenzo–p–dioxin cho đất/bùn ô
nhiễm chất độc da cam.
3. LĨNH VỰC NGHIÊN CỨU
4. LOẠI HÌNH NGHIÊN CỨU
Kỹ
Môi
Cơ
Ứng
Triển
Tự nhiên
thuật
trƣờng
bản
dụng
khai
Kinh tế;
Nông
ATLĐ
XH–NV
Lâm
x
Y
Sở hữu
Giáo dục
Dƣợc
trí tuệ
5. THỜI GIAN THỰC HIỆN
24 tháng
Từ tháng 01 năm 2011
đến tháng 12 năm 2012
6. CƠ QUAN CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI
Tên cơ quan: Trƣờng Đại học Cần Thơ
Điện thoại: 0710–3831530
E–mail:
Địa chỉ: Đƣờng 3/2, Q. Ninh Kiều, TP. Cần Thơ
Họ và tên thủ trƣởng cơ quan chủ trì: Nguyễn Anh Tuấn
7. CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI
Họ và tên: Dƣơng Minh Viễn
Học vị: Tiến sĩ
Chức danh khoa học: Giảng viên
Năm sinh: 10/02/1971
Địa chỉ cơ quan: Bm. Khoa học Đất
Địa chỉ nhà riêng: 138/29/21 Trần Hƣng Đạo, TP.
Đƣờng 3/2, Khu II, ĐH.
Cần Thơ
Cần Thơ, TP. Cần Thơ
Điện thoại nhà riêng:
Điện thoại cơ quan: 0710–3782584
Fax:
Di động: 0919455148
E–mail:
8. NHỮNG THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI
Đơn vị công tác và
Nội dung nghiên cứu cụ
TT
Họ và tên
Chữ ký
lĩnh vực chuyên môn
thể đƣợc giao
1
Ts. Trần Nhân
Viện NCPT CNSH, Hổ trợ thiết bị, kỹ thuật, tƣ
Dũng
sinh học phân tử, vấn chuyên môn trong lĩnh
ĐH. Cần Thơ
vực sinh học phân tử.
2
ThS. Trần Văn
Bm. Khoa học Đất, Tham gia thiết kế kiểm tra
vi sinh vật đất, ĐH. primers.
1
Dũng
3
4
5
Cần Thơ.
Bm. Khoa học Đất,
vi sinh vật đất, ĐH.
ThS. Châu Thị Anh Cần Thơ
Thy
Bm. Khoa học Đất,
vi sinh vật đất, ĐH.
Ks. Nguyễn Thị
Cần
Thu Hà
Ts. Dƣơng Minh
Bm. Khoa học Đất,
Viễn
vi sinh vật đất, ĐH.
Cần
– Theo dõi các thí nghiệm
theo chuyên đề
Theo dõi các thí nghiệm
theo chuyên đề
Quản lý chung về việc
thực hiện các nội dung
trong đề tài, đánh giá kết
quả
9. ĐƠN VỊ PHỐI HỢP CHÍNH
Tên đơn vị
trong và ngoài nƣớc
Họ và tên
Nội dung phối hợp nghiên cứu
ngƣời đại diện
đơn vị
1. Bm. Sinh hoá & Vi sinh, Hổ trợ kỹ thuật trong phân tích dioxins, thiết kế Gs. Max M.
ĐH. Rutgers, Mỹ
primers, thảo luận đánh giá kết quả
Haggblom
2. Bm. Đất & QL Nƣớc, Hổ trợ kỹ thuật trong lĩnh vực vi sinh, thảo luận Gs.
Dirk
ĐH. Leuven, Bỉ
đánh giá kết quả
Springael
2
10. TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU THUỘC LĨNH VỰC CỦA ĐỀ
TÀI Ở TRONG VÀ NGOÀI NƢỚC
10.1. Ngoài nƣớc (phân tích, đánh giá tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực của đề tài trên thế
giới, liệt kê danh mục các công trình nghiên cứu, tài liệu có liên quan đến đề tài được trích dẫn
khi đánh giá tổng quan)
Dioxins là nhóm hợp chất có gồm có hai vòng thơm nối với nhau qua một hoặc hai cầu
nối oxy. Chúng có thể bị chlor hoá từ 0 đến 8 chlor và đƣợc gọi theo tiếng Anh là
Polychlorinated dibenzo–p–dioxins và Polychlorinated Dibenzofurans (PCDD/Fs). Các chất
dioxins thuộc nhóm PCDD/Fs có mức độ độc hại khác nhau tuỳ thuộc vào số chlor và vị trí của
chúng. Độc tính của các chất PCDD/Fs đƣợc phân loại dựa trên chỉ số độc tƣơng đƣơng TEF
của WHO. Trong đó, chất dioxin chứa 4 chlor 2,3,7,8 TCDD/Fs độc nhất và có chỉ số TEF
bằng 1. Quá trình phân huỷ sinh học dioxins trong tự nhiên đƣợc thực hiện chủ yếu bởi một số
loài vi sinh vật chuyên biệt thuộc nhóm hiếu khí hoặc yếm khí (Mohn and Tiedje, 1992). Nhóm
yếm khí khử chlor có vai trò rất quan trọng trong phân hủy dioxins có mức chlor hóa cao (lớn
hơn hai chlor) vì thƣờng chúng không thể bị phân hủy dƣới tác động của vi khuẩn phân hủy
hiếu khí. Ngoài ra, sự khử chlor cũng làm giảm độc tính của dioxins, đặc biệt đối với 2,3,7,8–
tetrachlorodibenzo–p–dioxin.
Hoạt động khử chlor yếm khí PCDD/Fs trong môi trƣờng đất/bùn ô nhiễm có thể đƣợc
xác định dựa trên sự hiện diện các sản phẩm dioxins con (dioxins có mức chlor thấp hình thành
từ sự khử chlor của các dioxins có mức chlor hoá cao hơn) qua phƣơng pháp phân tích trực tiếp
(phân tích các mẫu đất/bùn lấy từ môi trƣờng) và gián tiếp (phân tích các mẫu đất/bùn đƣợc ủ
yếm khí và có bổ sung dioxins trƣớc khi ủ). Với phƣơng pháp trực tiếp, tất cả các hợp chất
dioxins trong mẫu đất/bùn cần đƣợc ly trích và làm sạch theo quy trình phức tạp và nghiêm
ngặt với sử dụng nhiều dung môi khác nhau để trích nhƣ toluene, acetone, dichloromethane.
Dung dịch chứa dioxins sau khi trích cần đƣợc làm sạch để loại bỏ các tạp chất hữu cơ khác có
thể ảnh hƣởng lên độ nhạy và kết quả phân tích dioxins nhƣ các cột ly tách chứa silica và
alumina (Dwernychuk et al., 2002; Lohmann et al, 1998). Đối với đất/bùn đƣợc gọi là ô nhiễm
dioxins nặng nhƣ sân bay Aso thì tổng hàm lƣợng các chất chỉ đạt khoảng 1000 pg/g
(Dwernychuck et al, 2002). Với hàm lƣợng thấp nhƣ vậy việc phân tích cần thiết bị có độ nhạy
rất cao là sắc ký khối phổ có độ phân giải cao HRGC/HRMS (Dwernychuk et al, 2002;
Lohman, 1998) và đây là thiết bị rất hiện đại và đắt tiền nên ít phòng thí nghiệm trên thế giới
có đƣợc. Do đó, ở Việt Nam do thiếu phƣơng tiện nên việc thực hiện phân tích dioxins trong
mẫu đất/bùn thu từ vùng ô nhiễm có nhiều trở ngại. Hơn nữa, ngay cả khi phát hiện các chất
dioxins có số chlor hoá thấp trong môi trƣờng chƣa hẳn 100% nói lên đƣợc trong đất có hoạt
động khử chlor do có khả năng chúng đã hiện diện sẵn trong thuốc khai hoang màu da cam.
Đối với phƣơng pháp gián tiếp, do có bổ sung thêm dioxins vào trong mẫu trƣớc khi ủ nên
trong trƣờng hợp trong mẫu có vi khuẩn yếm khí khử chlor chất dioxin đƣợc cấy vào, thì sau
thời gian ủ khoảng vài tháng nếu hoạt động khử chlor yếm khí xảy ra thì có khả năng sẽ xuất
hiện các sản phẩm dioxins con. Do mẫu đƣợc cấy thêm dioxin nên hàm lƣợng các sản phẩm
con cũng sẽ cao và có thể kiểm tra sự hiện diện của chúng trên máy sắc ký khối phổ GC/MS
sau khi trích và làm sạch mẫu. Nhƣ vậy, cả hai phƣơng pháp đều có những trở ngại chung là
quá trình trích mẫu tốn nhiều thời gian, phức tạp, hóa chất rất đắt tiền, cần độ tinh khiết cao,
thiết bị rất hiện đại. Ngoài ra, các phòng thí nghiệm đáp ứng đủ các tiêu chuẩn để phân tích
đƣợc dioxins rất ít ở Việt Nam. Đối với phƣơng pháp gián tiếp còn có thêm trở ngại là phải bổ
sung thêm dioxins và cần thời gian ủ dài, mất nhiều thời gian. Tuy thiết bị để phân tích trong
phƣơng pháp gián tiếp là GC/MS thông thƣờng, nhƣng đây cũng là thiết bị rất đắt tiền và ít
phòng thí nghiệm có. Ngoài ra, dioxins là hóa chất rất đắt tiền và độc hại nên việc bổ sung
dioxins vào mẫu ủ có nhiều bất cập.
Hiện nay phƣơng pháp sinh học phân tử đƣợc ứng dụng rất nhiều vào trong việc xác
3
định sự hiện diện, sự đa dạng và hoạt động chức năng của các loài vi sinh vật từ các mẫu
đất/bùn thu từ môi trƣờng. Ƣu điểm của các phƣơng pháp sinh học phân tử cho phép có thể
kiểm tra sự hiện diện của vi sinh vật trong môi trƣờng tự nhiên thông qua sự hiện diện của một
chuổi DNA hoặc gene đặc trƣng nào đó của chúng không cần qua sự nuôi cấy trƣớc trong môi
trƣờng nhân tạo. Với bộ kit đặc hiệu để chạy PCR cho chủng loài nào đó có thể dễ dàng nhận
dạng chúng trong môi trƣờng. Nhƣ vậy, phƣơng pháp sinh học phân tử tránh đƣợc yếu điểm
của phƣơng pháp nuôi cấy trong môi trƣờng nhân tạo là nhiều vi sinh vật không thể tồn tại
đƣợc trong môi trƣờng nhân tạo. Đồng thời với bộ kit đặc hiệu việc nhận biết cộng đồng vi sinh
vật than gia khử chlor yếm khí cũng dễ dàng và ít tốn chi phí, thời gian và chính xác hơn nhiều
so với phƣơng pháp phân tích hoá học. Hiện nay, nhiều nghiên cứu ở nƣớc ngoài đã phân lập
một số dòng vi khuẩn khử chlor yếm khí một số các hợp chất hữu cơ chứa chlor nhƣ
tetrachloroethane (TCE), PCB và polychlorinated dioxins… nhƣ Dehalococcoides cbdb1, 195,
BAV1 và FL2 ( (Bunge et al. 2003, He at al. 2002, Loffler et al. 2002) Một số dòng vi khuẩn
yếm khí thuộc Dehalococcoides có thể khử chlor yếm khí PCDD/Fs bởi enzyme dehalogenase
(rdh) và Viện nghiên cứu Genomic đã tìm thấy gần 17 gene có khả năng tham gia khử chlor
trong dòng Dehalococcoides ethenogen 195 (Villemur et al, 2002). Phần lớn vi khuẩn yếm khí
khử chlor thuộc họ Cloroflexi và một số primers đặc hiệu cũng đã đƣợc phát triển để nhận diện
và đánh giá tính đa dạng của chúng (Watts et al. 2005).
Tài liệu liên quan:
Bunge M., L. Adrian, A. Kraus, M. Opel, W. Lorenz, J. Andreesen, H. Gorish, U. Lechner.
2003. Reductive dehalogenation of chlorinated dioxins by anaerobic bacterium. Letters to
nature. Natural Publishing Group.
He, J., Y. Sung, M. E. Dollhopf, B. Z. Fathepure, J. M. Tiedje, and F. E. Löffler. 2002. Acetate
versus hydrogen as direct electron donors to stimulate the microbial reductive dechlorination
process at chloroethene–contaminated sites. Environ. Sci. Technol. 36: 2945–3952.
Loffler, F.E., Q. Sun, J. Li and J.M. Tiedje. 2002. 16S rRNA gene –based detection of
tetrachloroethene–dechlorinating Desulforomonas and Dehaloccocoides species. Appl.
Environ. Microbiol. 66: 1369–1374.
Maymo–Gatell X, Chien Y, Gossett JM, Zinder SH. 1997. Isolation of a bacterium that
reductively dechlorinates tetrachloroethene to ethene". Science 276 (5318): 1568–1571
Mohn, W. W., and J. M. Tiedje. 1992. Microbial Reductive Dehalogenation. Microbiological
reviews. Vol.56, No. 3, 482–507.
Villemur, R., M. Saucier, A., Gauthier, R. Beaudet. Can. J. Microbiol. 2002, 48, 697–706.
Watts, J. E. M., S. K. Fagervold, K. R. Sowers. And H. D. May. 2005. A PCR based specific
assay reveals a population of bacteria within the Chloroflexi associated with the reductive
dehalogenation of polychlorinated biphenyls. Microbiology. 2: 710–719.
10.2. Trong nƣớc (phân tích, đánh giá tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực của đề tài ở Việt
Nam, liệt kê danh mục các công trình nghiên cứu, tài liệu có liên quan đến đề tài được trích
dẫn khi đánh giá tổng quan)
Theo thông tin của Bộ Tài Nguyên và Môi Trƣờng mức độ ô nhiễm dioxins tại một số điểm
nóng ở Việt Nam hiện nay vẫn còn cao, đƣợc các cơ quan chức năng nghiên cứu và đặc biệt
quan tâm là các khu vực sân bay quân sự cũ nhƣ Aso (thuộc huyện A Lƣới), sân bay Đà Nẵng,
Phù Cát, Biên Hòa. Cho đến nay các nghiên cứu về dioxins ở Việt Nam phần lớn tập trung vào
nghiên cứu dƣ tồn dioxins trong đất, xâm nhập của chúng vào con ngƣời qua chuổi thức ăn ở
các vùng ô nhiễm và tác động lên sức khoẻ của con ngƣời nhƣ: Dự án “Giải quyết hậu quả của
các chất diệt cỏ và phát quang tại vùng A Lƣới – tỉnh Thừa Thiên Huế” của Uỷ ban 10–80 là đề
tài có nhiều nghiên cứu sâu về tác động của chất diệt cỏ Mỹ sử dụng trong chiến tranh ở Việt
Nam tác động lên môi trƣờng và con ngƣời; Nghiên cứu của tổ chức Hatfield tại khu vực A
4
Lƣới cũng cho thấy dƣ tồn cao của chất độc dioxins trong đất và sự xâm nhiễm dioxin vào cơ
thể động vật và ngƣời sống trong khu vực theo chuỗi thức ăn (Dwernychuk et al. 2002). Tuy
nhiên các nghiên cứu về phân hủy sinh học dioxins ở nƣớc ta chƣa đƣợc thấy trình bày trong
các tạp chí Khoa học trong và ngoài nƣớc. Trong dự án “Tồn dƣ dioxins và phân lập vi khuẩn
phân huỷ dioxins vùng nhiễm chất độc da cam A Lƣới, Thừa Thiên Huế” do quỹ nghiên cứu
khoa học quốc tế IFS tài trợ, tác giả bản thuyết minh đề tài cũng đã phân lập đƣợc một số dòng
vi khuẩn hiếu khí có khả năng phân huỷ dibenzofuran không chứa chlor (tài liệu chƣa xuất
bản). Trong nghiên cứu khác chƣa đƣợc công bố đƣợc thực hiện trong thời gian nghiên cứu sau
tiến sĩ 2008–2009 tại Bộ môn Sinh hóa, Trƣờng ĐH. Quốc gia bang New Jersey (ĐH. Rutgers),
tác giả bản thuyết minh đã nuôi cấy, làm giàu đƣợc một số cộng đồng vi khuẩn khử chlor yếm
khí khử chlor dioxins (một mắt xích đặc biệt quan trọng trong khử độc dioxins bằng biện pháp
sinh học, nhất là đối với 2,3,7,8–tetrachlorodibenzo–p–dioxin, chất độc nhất trong nhóm chất
dioxins) từ các mẫu đất/bùn thuộc khu vực A Lƣới, Huế và Cam Lộ, Quãng Trị. Kết quả
nghiên cứu cũng cho thấy sự đa dạng trong cách thức khử chlor và tính thƣờng trú khá cao của
một số dòng vi khuẩn tại A Lƣới và Cam Lộ.
Tài liệu liên quan:
Dwernychuk, L. W., Hoang, D. C., Hatfield C. T., Boivin T. G., Tran, M. H., Phung, T. D.,
Nguyen, D. T. 2002. Dioxin reservoirs in southern Viet Nam – A legacy of Agent Orange.
Chemosphere. 47: 117–137.
10.3. Danh mục các công trình đã công bố thuộc lĩnh vực của đề tài của chủ nhiệm và những
thành viên tham gia nghiên cứu (họ và tên tác giả; bài báo; ấn phẩm; các yếu tố về xuất bản)
Dƣơng Minh Viễn: Tồn dƣ dioxins và phân lập vi khuẩn phân huỷ dioxins vùng nhiễm chất
độc da cam A Lƣới, Thừa Thiên Huế. Đề tài NCKH đƣợc tài trợ của IFS, 2006 (Quỹ Nghiên
cứu Khoa học Quốc tế).
Dƣơng Minh Viễn: Nghiên cứu sau tiến sĩ tại ĐH. Rutgers, Mỹ về “Khử chlor yếm khí
dibenzo–p–dioxins trong đất/bùn của vùng bị phun chất độc da cam” dƣới tài trợ của Quỹ
Giáo dục Việt Nam (Vietnam Education Foundation) 2008–2009.
Dƣơng Minh Viễn: Khả năng phân hủy dioxins bị chlor hóa của quần thể vi khuẩn hiếu khí và
yếm khí. Đề tài NCKH cấp Bộ 2009.
Tran Van Dung, D.M. Vien, V.T. Guong, Domingues P., Merckx R., Springael D. 2010.
Diversity of the Actinomycetes Community Colonising Rice Straw Residues in Cultured
Soil Undergoing Various Crop Rotation Systems in the Mekong Delta of Vietnam. IJERD 1–
1: 104–112
Ahn Y–B, Liu F, Fennell DE, Häggblom MM. 2008. Biostimulation and bioaugmentation to
enhance dechlorination of polychlorinated–p–dioxins in contaminated sediments. FEMS
Microbiology Ecology 66:271–281.
Ahn Y–B, Rhee S–K, Fennell DE, Kerkhof LJ, Hentschel U, Häggblom MM (2003) Reductive
dehalogenation of brominated phenolic compounds by microorganisms associated with the
marine sponge Aplysina aerophoba. Appl. Environ. Microbiol. 69:4159–4166.
Häggblom MM, Bossert ID (2003) Organohalides – a global perspective. In: Häggblom MM,
Bossert ID (eds) Dehalogenation: Microbial Processes and Environmental Applications, pp.,
3–29, Kluwer Academic Publishers, Boston.
De Wilde, T., Spanoghe P., Debaer C., Ryckeboer J., Springael D., and Jaeken P. 2007.
Overview of on–farm bioremediation systems to reduce the occurrence of point source
contamination. Pest Management Science 63: 111–128.
Breugelmans, P., D’Huys J.P., De Mot R., and Springael D. 2007. Characterization of novel
5
linuron–mineralizing bacterial consortia enriched from long–term linuron–treated
agricultural soils. FEMS Microbiol. Ecol. 62: 374–385.
Breugelmans, P., Barken K. B., Tolker–Nielsen T., Hofkens J., Dejonghe W and Springael D.
2008. Architecture and spatial organization of a triple–species bacterial biofilm degrading
synergistically the phenylurea herbicide linuron. FEMS Microbiol. Ecol. 64: 271–282.
11. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Các hợp chất dioxins có chứa chlor thƣờng có tính độc cao, đặc biệt là 2,3,7,8–
tetrachlorodibenzo–p–dioxin (2,3,7,8–TCDD) và chúng không có khả năng bị phân huỷ sinh
học nếu nhƣ chƣa đƣợc khử bỏ chlor (Mohn and Tiedje, 1992; Häggblom and Bossert, 2003).
Trong khảo sát về ô nhiễm dioxins ở A Lƣới, Dwernychuck và ctv (2002) đã tìm thấy 2,3,7,8–
TCDD chiểm tỉ lệ 90–97% trong tổng số độc chất I–TEQ do các hợp chất dioxins gây ra. Ngoài
ra, sau nhiều năm từ khi chất độc da cam đƣợc rãi ở Việt Nam, chúng có thể theo lớp đất mặt bị
rửa trôi tích tụ trong các bùn của ao, hồ và sông suối. Vì vậy, nguy cơ gây hại cho môi trƣờng
và sức khoẻ con ngƣời rất cao do chúng có thể xâm nhập vào chuổi thức ăn từ ốc, cá sống ở ao
hồ, sông suối. Do đó, hoạt động khử chlor yếm khí đối với chất độc 2,3,7,8–
tetrachlorodibenzo–p–dioxin của cộng đồng vi khuẩn khử chlor yếm khí Dehalococcoides rất
quan trọng trong vấn đề khử độc dioxin tại các nơi ô nhiễm dioxin do quân đội Mỹ phun thuốc
khai hoang trong thời gian chiến tranh và trong bùn nơi chúng có khả năng tích tụ. Mật số vi
khuẩn khử chlor yếm khí đối với chlorodibenzo–p–dioxins trong tự nhiên rất ít và phân lập
chúng rất khó và tốn nhiều thời gian. Vì vậy, vấn đề kiểm tra sự hiện diện và hoạt động của
chúng trong tự nhiên bằng phƣơng pháp nuôi cấy vi sinh vật gặp nhiều khó khăn về thời gian
và tốn nhiều chi phí cho việc phân tích dioxins. Tuy nhiên, bằng phƣơng pháp công nghệ sinh
học có thể xác định đƣợc sự hiện diện của cộng đồng vi khuẩn khử chlor yếm khí cũng nhƣ
hoạt động khử chlor yếm khí của chúng. Kết quả nghiên cứu trên một số mẫu đất và bùn ở A
Lƣới, Thừa Thiên Huế và Cam Nghĩa, Quảng Trị, chúng tôi đã tìm thấy hoạt động khử chlor
bởi vi sinh vật yếm khí đối với chlorodibenzo–p–dioxins ở A Lƣới, Thừa Thiên Huế và Cam
Nghĩa, Quảng Trị. Kết quả khảo sát sơ bộ cho thấy các dòng vi sinh vật khử chlor của
chlorodibenzo–p–dioxins tại A Lƣới, Thừa Thiên Huế và Cam Nghĩa, Quảng Trị có nhiều khả
năng khác với với các dòng khử chlor đã đƣợc biết đến trên thế giới. Do đó, việc sử dụng các
primers đặc hiệu nhằm vào 16S rRNA gene hoặc gene chức năng và xây dựng phƣơng pháp sử
dụng các primers đó để dò tìm, phát hiện nhanh cộng đồng vi khuẩn khử chlor yếm khí dioxins
sẽ giúp rất nhiều đối với việc khảo sát và nghiên cứu hoạt động khử chlor dioxins của các loài
vi sinh vật bản địa trong công tác đánh giá và khôi phục đất/bùn ô nhiễm dioxins.
12. MỤC TIÊU ĐỀ TÀI
cộng đồng vi khuẩn khử chlor yếm khí 2,3,7,8–
tetrachlorodibenzo–p–dioxin cho đất/bùn ô nhiễm chất độc da cam bằng phƣơng pháp PCR bao
gồm: sử dụng primers chuyên biệt nhằm vào 16S rRNA gene và primers nhắm vào
dehalogenase gene, quy trình trích mẫu DNA từ đất/bùn, chu trình luân nhiệt và đảm bảo độ
nhạy cao với cộng đồng vi sinh vật yếm khí khử chlor dioxins.
13. ĐỐI TƢỢNG, PHẠM VI NGHIÊN CỨU
13.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Đối tƣợng nghiên cứu là các dòng vi khuẩn yếm khí bản địa có khả năng khử chlor các hợp
chất chlorodibenzo–p–dioxins (còn đƣợc gọi chung là dioxins) đƣợc nuôi cấy từ vùng đất ô
nhiễm dioxins ở A Lƣới, Huế và Cam Lộ, Quảng Trị. Để có thể kiểm tra đƣợc sự hiện diện,
thành phần cũng nhƣ hoạt động khử chlor của các dòng vi khuẩn bản địa trong môi trƣờng tự
6
nhiên, trọng tâm của đề tài nhằm vào khảo sát trình tự của 16S rRNA của các dòng vi khuẩn
nuôi cấy và các gene chức năng khử chlor để từ đó có thể thiết kế đƣợc primers phù hợp có thể
ứng dụng dò tìm, phân tích nhanh thành phần của chúng trong môi trƣờng bằng các phƣơng
pháp phân tích thông thƣờng nhƣ PCR (polymerase chain reaction) và điện di biến tính DGGE
(denaturing gradient gel electrophoresis).
13.2. Phạm vi nghiên cứu
Hiện nay ở nƣớc ta vẫn còn một số địa điểm bị ô nhiễm dioxins nặng nhƣ các sân bay Đà
Nẵng, Phù Cát, Biên Hòa và Aso thuộc huyện A Lƣới, Huế. Ngoài ra còn một số khu vực vẫn
bị ô nhiễm dioxin nhƣ khu vực xung quanh sân bay Aso thuộc huyện A Lƣới và Cam Lộ,
Quảng Trị. Dioxins có khả năng còn lƣu tồn trong bùn của sông, hồ dọc theo từ vùng bị rãi chất
độc trƣớc đây cho đến vùng hạ lƣu do sự rửa trôi do xói mòn của lớp đất mặt nhiễm dioxins và
lắng tụ trong bùn của ao hồ và sông suối. Sự khử độc dioxins bởi cộng đồng vi sinh vật trong
đất rất quan trọng, đặc biệt đối với các vùng bị rãi chất độc da cam vì lớp đất mặt/bùn bị nhiễm
dioxins trên vùng rộng lớn không thể đƣợc thu gom về một nơi để xử lý. Sự phân hủy chúng lệ
thuộc vào hoạt động phân hủy của cộng đồng vi sinh vật trong đất/bùn nơi bị ô nhiễm. Câu hỏi
liệu dioxins trong đất ở các vùng bị rãi chất độc da cam có đang đƣợc phân hủy và vi sinh vật
nào đang tham gia vào quá trình đó rất cần thiết trong việc đánh giá sự hồi phục của đất bị ô
nhiễm hay nguy cơ về sự đe dọa của tồn dƣ dioxins đối với môi trƣờng và con ngƣời. Cho đến
hiện nay, hai vùng A lƣới, Huế và Cùa Quảng Trị đƣợc ghi nhận là có nhiều ngƣời bị ảnh
hƣởng của chất độc da cam. Do đó phạm vi nghiên cứu chính của đề tài thuộc khu vực A Lƣới,
Huế và Cùa, Quảng Trị. Các đối tƣợng vi khuẩn nghiên cứu đƣợc nuôi cấy từ hai vùng này và
cũng đã có nhiều nghiên cứu về tồn dƣ của dioxins trong đất tại A Lƣới (Dwernychuk et al.
2000). Cho đến nay, chúng tôi đã nuôi cấy và kiểm tra cho thấy khả năng khử chlor tốt đối với
1,2,3,4–tetrachlorodibenzo–p–dioxin,
2,3–dichlorodibenzo–p–dioxin
và
2,3,7,8–
tetrachlorodibenzo–p–dioxin của cộng đồng vi khuẩn yếm khí thuộc một số mẫu đất/bùn đƣợc
thu từ nhiều điểm thuộc hai khu vực trên. Ngoài ra, chúng tôi cũng mong muốn đƣợc kiểm
nghiệm sản phẩm nghiên cứu trên đất bùn tại điểm nóng ô nhiễm dioxins hiện nay nhƣ sân bay
Đà Nẵng nếu có điều kiện vào đƣợc khu vực ô nhiễm lấy mẫu. Hiện nay khu ô nhiễm thuộc sân
bay Đà Năng và Biên Hoà thuộc khu vực quân sự nên việc vào lấy mẫu có nhiều hạn chế.
Do đối tƣợng nghiên cứu là vi khuẩn yếm khí khử chlor dioxins và nội dung nghiên cứu
đi sâu vào lĩnh vực sinh học phân tử nên các hoạt động nghiên cứu của đề tài thuộc lĩnh vi sinh
môi trƣờng, công nghệ sinh học ứng dụng và hóa môi trƣờng.
7
14. CÁCH TIẾP CẬN, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
14.1. Cách tiếp cận
Cách tiếp cận nghiên cứu của đề tài đƣợc thực hiện theo hƣớng đi từ những kết quả nghiên cứu
thực tế trong lĩnh vực liên quan kết hợp với lý thuyết và phƣơng pháp đƣợc biết để đề ra các
nội dung cần thực hiện cho đề tài, xây dựng phƣơng pháp thực hiện. Sản phẩm, kết quả thí
nghiệm của đề tài sẽ đƣợc thử nghiệm thực tế để đi đến kết luận. Trên cơ sở cách tiếp cận đó,
đề tài sẽ tiếp tục sử dụng các cộng đồng vi khuẩn khử chlor yếm khí dioxins đã đƣợc làm giàu
trong các đề tài nghiên cứu trƣớc đây từ khu vực A Lƣới, Huế và Cam Lộ, Quảng Trị làm đối
tƣợng nghiên cứu cho việc thiết kế các primers chuyên biệt và xây dựng quy trình chạy PCR để
có thể phát hiện và kiểm tra hoạt động chức năng của vi khuẩn khử chlor yếmkhí dioxins trong
môi trƣờng. Các tài liệu khoa học đƣợc đăng trên các tạp chí quốc tế và trong nƣớc liên quan
đến nội dung nghiên cứu của đề tài cũng sẽ đƣợc chúng tôi nghiên cứu kỹ lƣỡng. Đặc biệt
chúng tôi sẽ chú ý đến nghiên cứu đã có trên các dòng vi khuẩn khử chlor yếm khí đã đƣợc
phân lập ở nƣớc ngoài và giải mã toàn bộ genome nhƣ Dehalococcoides ethenogen strain 195,
Dehalococcoides sp. strain CBDB1, strain BAV1, strain FL2 đƣợc biết có khả năng khử chlor
dioxins. Trong đề tài chúng tôi sẽ sử dụng cơ sở dữ liệu gene của Trung tâm Quốc gia Thông
tin Công nghệ Sinh học NCBI của Mỹ (National Center for Biotechnology) để thu thập thông
tin về gene của các dòng vi khuẩn khử chlor yếm khí dioxins, PCB (polychlorinated biphenyl)
hoặc của các độc chất hữu cơ chứa chlor khác để làm cơ sở tham chiếu trong việc khảo sát,
thiết kế primers cho các gene tƣơng ứng.
Vị trí thu thập mẫu đất/bùn bùn để tìm kiếm các dòng vi khuẩn yếm khí khử chlor của dioxins
đƣợc thực hiện dựa trên thông tin đã nghiên cứu về ô nhiễm dioxins ở A Lƣới, Huế
(Dwernychuk et al. 2000) và thông tin hổ trợ của Sở Tài Nguyên Môi Trƣờng Huế và Quảng
Trị. Từ các mẫu đất/bùn trên trong nghiên cứu trƣớc chúng tôi đã nuôi cấy đƣợc vi khuẩn yếm
khí khử chlor của 1,2,3,4–tetrachlorodibenzo–p–dioxin, 2,3–dichlorodibenzo–p–dioxin
2,3,7,8–tetrachlorodibenzo–p–dioxin. Đây là nguồn vi sinh vật bản địa làm đối tƣợng cho
nghiên cứu trong đề tài này.
14.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
Một số phƣơng pháp trong lĩnh vực công nghệ sinh học và phân tích sau đƣợc sử dụng trong
nghiên cứu:
-
Nuôi cấy làm giàu các vi khuẩn yếm khí trong môi trƣờng chuyên biệt có sử dụng
chlorodibenzo–p–dioxin làm chất nhận điện tử trong hoạt động hô hấp yếm khí để loại bỏ
dần các loài vi khuẩn khác không liên quan đến hoạt động khử chlor dioxins ra khỏi cộng
đồng, hƣớng tới phân lập đƣợc các dòng vi khuẩn yếm khí thuần có khả năng khử chlor
dioxins.
-
Kiểm chứng hoạt động khử chlor dioxins của các dòng vi khuẩn trong quá trình nuôi cấy
làm giàu hoặc phân lập thông qua phân tích thay đổi thành phần của các chất dioxins đƣợc
bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy. Chất dioxins đƣợc trích ly từ các mẫu và làm sạch theo
quy trình 1613B của cơ quan bảo vệ môi trƣờng Mỹ EPA và sau đó đƣợc phân tích trên
GC/MS.
-
Kỹ thuật PCR đƣợc sử dụng để nhân các đoạn trình tự DNA đƣợc khảo sát.
-
Kỹ thuật điện di biến tính DGGE đƣợc sử dụng để khảo sát sự đa dạng của cộng đồng vi
khuẩn yếm khí trong môi trƣờng nuôi cấy và đồng thời giúp phân tách các chuổi trình tự
DNA khác nhau của cộng đồng vi khuẩn yếm khí trong môi trƣờng nuôi cấy để từ đó có thể
làm khuôn mồi cho chạy PCR và giải mã trình tự trong chuổi DNA của dòng vi khuẩn đƣợc
khảo sát.
8
-
Nhân bản sản phẩm PCR vào plasmid vector chuyển vào tế bào E. coli để phân lập các
đoạn DNA đƣợc nhân trong PCR.
-
Tổng hợp cDNA (complementary DNA) từ mRNA đƣợc trích và làm sạch từ các dòng vi
khuẩn yếm khí khử chlor và giải mã trình tự cDNA để có thể dò tìm gene chức năng liên
quan đến khử chlor dioxins.
-
Giải mã trình tự DNA
15. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU VÀ TIẾN ĐỘ THỰC HIỆN
15.1. Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1. Phân lập các dòng vi khuẩn yếm khí:
Cơ sở thiết kế các trình tự nucleic acid trong primers đặc hiệu cho các dòng vi khuẩn bản
địa khử chlor yếm khí dựa trên giải mã trình tự acid nucleic trong gene 16S rRNA. Hiện nay
chúng tôi đã nuôi cấy đƣợc 6 cộng đồng vi khuẩn yếm khí có tốc độ và cách thức khử chlor
dioxins khác nhau. Qua khảo sát sơ bộ về cấu trúc bằng phƣơng pháp DGGE cho thấy trong
mỗi cộng đồng có thể có một số dòng vi khuẩn khác nhau tham gia khử chlor. Do đó, phần
quan trọng trong đề tài là cần phân lập đƣợc các dòng vi khuẩn này để có thể giải mã trình tự
DNA của 16S rRNA chúng và các gene chức năng liên quan đến khử chlor dioxins để có thể
thiết kế primers đặc hiệu và phƣơng pháp ứng dụng phù hợp.
Sáu cộng đồng vi khuẩn trên đƣợc nuôi cấy riêng lẽ trong môi trƣờng yếm khí chuyên
biệt có bổ sung các hợp chất nhận điện tử là dioxins. Vi khuẩn đƣợc luân chuyển nhiều lần
trong các môi trƣờng trên để giảm dần sự hiện diện của các vi khuẩn không liên quan đến khử
chlor. Trong quá trình phân lập khả năng khử chlor dioxins của các dòng vi khuẩn trong quá
trình nuôi cấy phân lập cũng đƣợc kiểm tra song song với tính thuần của chúng dựa trên kỹ
thuật điện di biến tính chuổi DNA (DGGE). Các thí nghiệm trong nội dung này bao gồm:
1.1 Nuôi cấy các cộng đồng vi khuẩn khử chlor dioxins trong môi trƣờng yếm khí chuyên biệt
có bổ sung chlorodibenzo–p–dioxin.
1.2 Kiểm tra khả năng khử chlor 2,3,7,8–TCDD của vi khuẩn trong quá trình phân lập.
Nội dung 2. Xác định gene 16S rRNA chuyên biệt và gene chức năng khử chlor của các
dòng vi khuẩn
Nội dung này đƣợc thực hiện sau khi có đƣợc các dòng vi khuẩn thuần. Giải mã trình tự DNA
trong 16S rRNA hoặc của gene chức năng đƣợc thực hiện sau khi ly trích DNA và mRNA của
các dòng vi khuẩn thuần. Các kỹ thuật nhƣ PCR, giải trình tự và tổng hợp cDNA từ mRNA
đƣợc áp dụng để có thể có đƣợc trình tự của các gene nghiên cứu. Các thí nghiệm của phần nội
dung này nhƣ sau:
2.1 Xác định gene 16S rRNA chuyên biệt của các vi khử yếm khí chlor dioxins:
- Trích và nhân DNA của toàn bộ 16S rRNA gene của các dòng vi khuẩn thuần.
- Giải mã trình tự DNA của bộ gene 16S rRNA của các dòng vi khuẩn
- Xác định gene
2.2 Xác định gene chức năng rdh khử yếm khí chlor dioxins
- Trích mRNA của các dòng vi khuẩn
- Tổng hợp cDNA từ mRNA
- Giải mã trình tự cDNA
- Xác định gene
9
Nội dung 3: Thiết kế và thử nghiệm các bộ mồi (primers) nhắm vào gene 16S rRNA
chuyên biệt và gene chức năng rdh khử chlor yếm khí dioxins của các dòng vi khuẩn bản
địa: mồi đƣợc thiết kế dựa trên khảo sát trình tự của 16S rRNA gene và gene chức năng và sự
hổ trợ của phần mềm PrimerGene. Chuổi oligonucleotide trong primers sau khi thiết kế và tổng
hợp sẽ đƣợc khảo nghiệm tính chuyên biệt đối với các dòng vi khuẩn phân lập và các mẫu môi
trƣờng. Ngoài ra, tính chuyên biệt của primer thiết kế đối với các dòng vi khuẩn bản địa cũng
sẽ đƣợc so sánh với các loại primers đƣợc thiết kế dựa trên trình tự DNA của các dòng vi
khuẩn đã đƣợc nghiên cứu ở nƣớc ngoài nhƣ: Dehalococcoides ethenogens dòng 195,
Dehalococcoides sp. dòng cbdb1, 195, BAV1 và FL2. Nội dung này của đề tài đƣợc thực hiện
qua các thí nghiệm sau:
3.1
3.2
3.3
Thiết kế mồi (primers) cho 16S rRNA gene: thiết kế mồi và xây dựng chƣơng trình luân
nhiệt chạy PCR cho mồi.
Thiết kế mồi (primers) cho gene chức năng khử chlor rdh và và xây dựng chƣơng trình
luân nhiệt chạy PCR cho mồi.
Kiểm tra tính đặc hiệu của mồi đối với các dòng vi khuẩn bản địa
Nội dung 4. Xây dựng qui trình ứng dụng phƣơng pháp sinh học phân tử phát hiện vi
khuẩn khử chlor yếm khí dioxin
Thiết lập và thử nghiệm và xây dựng qui trình phƣơng pháp ứng dụng các bộ mồi (primers) đặc
hiều nhằm vào gene 16S rRNA và gene chức năng khử chlor rdh để dò tìm sự hiện diện và hoạt
động của vi khuẩn khử yếm khí chlor dioxins: bắt đầu việc lấy mẫu đất/bùn, trữ mẫu, trích và
làm sạch DNA, chƣơng trình nhiệt chạy PCR, qui trình phân tích trên DGGE (trong trƣờng hợp
cần phân tích thành phần cộng đồng vi khuẩn khử chlor), điện di agarose gel và chụp ảnh gel.
Nội dung của phần này gồm các hoạt động sau:
4.1 Xây dựng quy trình phƣơng pháp ứng dụng các bộ mồi
4.2 Kiểm nghiệm độ nhạy của quy trình phƣơng pháp đối với hoạt động khử yếm khí chlor
dioxins
15.2. Tiến độ thực hiện
STT
Các nội dung, công việc
Thực hiện
1
Phân lập các dòng vi khuẩn yếm
khí:
-
-
Nuôi cấy các cộng đồng vi
khuẩn khử chlor dioxins trong
môi trƣờng yếm khí chuyên
biệt
có
bổ
sung
chlorodibenzo–p–dioxin.
Kiểm tra khả năng khử chlor
2,3,7,8–TCDD của vi khuẩn
trong quá trình phân lập.
Thời
gian
Ngƣời thực
(bắt đầu–
hiện
kết thúc)
– Chuyên đề 1: Sự đa 01/2011 Châu
Thị
dạng và tiềm năng của đến
Anh Thy
cộng đồng vi khuẩn bản 08/2012
địa khử chlor yếm khí
dioxins.
– Các dòng vi sinh vật
khử chlor yếm khí
dioxins.
– Đánh giá khả năng
khử yếm khí chlor của
các dòng vi khuẩn phân
lập
Sản phẩm
10
Xác định gene 16S rRNA
chuyên biệt và gene chức năng
khử chlor của các dòng vi
khuẩn
- Xác định gene 16S rRNA
chuyên biệt của các vi khử
yếm khí chlor dioxins
- Xác định gene chức năng rdh
khử yếm khí chlor dioxins
– Chuyên đề 2: Xác 06/2011
định gene 16S rRNA vi đến
khuẩn khử chlor yếm 8/2012
khí dioxins
– Chuyên đề 3: Xác
định gene chức năng
khử yếm khí chlor
dioxins
Trần
Dũng
Thiết kế và thử nghiệm các bộ
mồi (primers) nhắm vào gene
16S rRNA chuyên biệt và gene
chức năng rdh khử chlor yếm
khí dioxins của các dòng vi
khuẩn bản địa
- Thiết kế mồi (primers) cho
16S rRNA gene: thiết kế mồi
và xây dựng chƣơng trình luân
nhiệt chạy PCR cho mồi
- Thiết kế mồi (primers) cho
gene chức năng khử chlor rdh
và và xây dựng chƣơng trình
luân nhiệt chạy PCR cho mồi.
- Kiểm tra tính đặc hiệu của
mồi đối với các dòng vi khuẩn
bản địa
– Chuyên đề 4: Thiết kế 03/2011
mồi cho 16S rRNA đến
gene
08/2012
– Chuyên đề 5: thiết kế
mồi cho gene chức
năng khử yếm khí chlor
rdh
Nguyễn Thị
Thu Hà
4
Xây dựng qui trình ứng dụng
phƣơng pháp sinh học phân tử
phát hiện vi khuẩn khử chlor
yếm khí dioxin
- Xây dựng quy trình phƣơng
pháp ứng dụng các bộ mồi.
- Kiểm nghiệm độ nhạy của quy
trình phƣơng pháp đối với
hoạt động khử yếm khí chlor
dioxins
– Chuyên đề 6: Quy 12/2011
trình, phƣơng pháp ứng đến
dụng bộ mồi để dò tìm 12/2012
sự hiện diện và hoạt
động khử yếm khí chlor
dioxins đƣợc kiểm
nghiệm
Trần Nhân
Dũng,
Dƣơng Minh
Viễn
5
Lập báo cáo tổng kết đề tài
Nghiệm thu đề tài
Các báo cáo khoa học
Các sản phẩm
Dƣơng Minh
Viễn
2
3
11/2012
–
12/2012
Văn
11
