Khảo sát ảnh hưởng của chitosan đến một số tính chất của vi nang probiotic alginat tinh bột

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN VĂN TOÀN
Mã sinh viên: 1201619

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA
CHITOSAN ĐẾN MỘT SỐ TÍNH CHẤT
CỦA VI NANG PROBIOTIC ALGINATTINH BỘT
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2017


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN VĂN TOÀN
Mã sinh viên: 1201619

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA
CHITOSAN ĐẾN MỘT SỐ TÍNH CHẤT
CỦA VI NANG PROBIOTIC ALGINATTINH BỘT
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:
1. Ts. Đàm Thanh Xuân
2. Ds. Nguyễn Thị Ngọc
Nơi thực hiện:
Bộ môn Công nghiệp Dược

HÀ NỘI – 2017


LỜI CẢM ƠN
Với tất cả sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc tôi xin gửi lời cảm ơn đến TS.
Đàm Thanh Xuân và DS. Nguyễn Thị Ngọc những người thầy đã luôn tận tình
hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi từ những bước đầu tiên cho đến khi hoàn thành
khóa luận này.
Đồng thời tôi xin cảm ơn tới các thầy cô giáo và các anh chị kỹ thuật viên trong
bộ môn Công Nghiệp Dược và Viện Công Nghệ Dược Phẩm Quốc Gia đã tạo mọi
điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài, chỉ bảo tôi trong thời gian
làm thực nghiệm.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô giáo
trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong
thời gian tôi học tập tại trường.
Và cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân và bạn bè đã động
viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
Hà Nội, ngày 08 tháng 05 năm 2017
Sinh viên

Nguyễn Văn Toàn


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ

1

Chương 1 TỔNG QUAN ..........................................................................................2
1.1 Tổng quan về vi nang ........................................................................................2
1.1.1 Khái niệm ...................................................................................................2
1.1.2 Đặc điểm ....................................................................................................2
1.1.3 Ưu điểm của vi nang ..................................................................................3
1.1.4 Nhược điểm của vi nang ............................................................................3
1.2 Phương pháp bào chế vi nang ...........................................................................4
1.2.1 Phương pháp đông tụ .................................................................................4
1.2.2 Phương pháp hóa rắn nhũ tương ................................................................5
1.3 Tổng quan một số thành phần sử dụng trong vi nang .......................................6
1.3.1 Alginat ........................................................................................................6
1.3.2 Chitosan......................................................................................................8
1.4 Một số phương pháp đánh giá sự có mặt của chitosan trong vi nang ...............9
1.4.1 Phương pháp đo phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến (UV-VIS) .....................10
1.4.2 Phương pháp đo phổ hấp thụ hồng ngoại (IR) .........................................11
1.5 Một số nghiên cứu sử dụng vi nang alginat phối hợp với tinh bột và chitosan
...............................................................................................................................12
Chương 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14
2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị ..............................................................................14
2.1.1 Nguyên vật liệu sử dụng ..........................................................................14
2.1.2 Thiết bị .....................................................................................................14
2.1.3 Các dung dịch sử dụng trong nghiên cứu ................................................15
2.2 Nội dung nghiên cứu .......................................................................................15
2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ calci clorid tới thời gian hình thành vi
nang. ..................................................................................................................15
2.2.2 Sơ bộ định tính chitosan trên vi nang bằng phương pháp đo phổ hồng
ngoại (IR). .........................................................................................................15

2.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của môi trường pH 3 đến tương tác chitosan-alginat
trên vi nang. .......................................................................................................15
2.3 Phương pháp nghiên cứu.................................................................................15
2.3.1 Phương pháp bào chế vi nang ..................................................................15
2.3.2 Phương pháp đông khô ............................................................................16
2.3.3 Phương pháp định tính chitosan trên vi nang bằng phương pháp đo phổ
hồng ngoại (IR) .................................................................................................17
2.3.4 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của môi trường pH 3 đến tương tác
chitosan-alginat trên vi nang. ............................................................................17
Chương 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ..................................18
3.1 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ calci clorid tới thời gian hình thành của vi
nang calci alginat. ..................................................................................................18
3.2 Định tính chitosan trên vi nang bằng phương pháp đo phổ hồng ngoại (IR). 20
3.3 Khảo sát ảnh hưởng của môi trường pH 3 đến tương tác chitosan-alginat trên
vi nang. ..................................................................................................................28
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC.

34


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

A

Độ hấp thụ

B. bifidum

Bifidobacterium bifidum

Cfu

Số đơn vị khuẩn lạc (Colony – Forming Units)

IR

Phổ hồng ngoại

M

Mẫu

MT

Môi trường

L. acidophilus

Lactobacillus acidophilus

L. gasseri

Lactobacillus gasseri

L. casei

Lactobacillus casei

TB

Tế bào

PL

Phụ lục

VSV

Vi sinh vật

VK

Vi khuẩn

λ

Bước sóng


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Các hóa chất dùng trong nghiên cứu ........................................................14
Bảng 2.2 Các thiết bị dùng trong nghiên cứu...........................................................14
Bảng 2.3 Bảng thiết kế công thức vi nang ...............................................................15
Bảng 3.1 Đặc tính các mẫu tạo thành khi thay đổi nồng độ calci clorid. ................18


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Hình ảnh mô tả cấu trúc của alginat .............................................................6
Hình 1.2 Mô hình vỉ trứng, vị trí của ion Ca2+ trong gel và sự tạo gel calci alginat...7
Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của chitosan......................................................................8
Hình 3.1 Hình ảnh vi nang M1 tạo thành theo thời gian...........................................19
Hình 3.2 Hình ảnh vi nang M2 tạo thành theo thời gian...........................................19
Hình 3.3 Phổ IR của chitosan chuẩn .........................................................................22
Hình 3.4 Phổ IR của vi nang trắng ............................................................................22
Hình 3.5 Phổ IR của vi nang M3...............................................................................23
Hình 3.6 Phổ IR của vi nang M4...............................................................................23
Hình 3.7 Phổ IR của vi nang M5...............................................................................24
Hình 3.8 Phổ IR của vi nang M6...............................................................................24
Hình 3.9 Hình ảnh so sánh phổ IR của chitosan, vi nang trắng và các vi nang M3,
M4, M5 và M6. .........................................................................................................25
Hình 3.10 Đồ thị biểu diễn A - λ của dung dịch chitosan và môi trường pH 3 sau khi
khảo sát hòa tan các vi nang M3, M4, M5 và M6.....................................................29
Hình 3.11 Phổ IR của vi nang M3 sau khi lắc 2 giờ trong MT pH 3. .......................29
Hình 3.12 Phổ IR của vi nang M4 sau khi lắc 2 giờ trong MT pH 3. .......................30
Hình 3.13 Phổ IR của vi nang M5 sau khi lắc 2 giờ trong MT pH 3 ........................30
Hình 3.14 Phổ IR của vi nang M6 sau khi lắc 2 giờ trong MT pH 3. .......................31
Hình 3.15 Hình ảnh so sánh phổ IR của chitosan, vi nang trắng và các vi nang M3,
M4, M5 và M6 sau khi lắc 2 giờ trong MT pH 3......................................................31


ĐẶT VẤN ĐỀ
Probiotics được biết đến là một nhóm vi sinh vật mang lại nhiều lợi ích cho con
người như ngăn ngừa nhiễm khuẩn đường ruột, cải thiện khả năng dung nạp lactose,
tăng cường miễn dịch, hấp thụ ure, hỗ trợ điều trị cho người suy thận, giảm cholesterol
máu,... [24], [26], [33]. Tuy nhiên, các vi sinh vật này dễ bị ảnh hưởng bởi các yếu tố
như pH, nhiệt độ, ánh sáng, hàm ẩm,…. Những yếu tố này làm giảm số lượng vi sinh
vật sống sót, ngăn cản việc thiết lập cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột.

Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu tạo ra các chế phẩm có khả năng đảm bảo
cung cấp đủ số lượng vi sinh vật đem lại tác dụng mong muốn. Trong đó, phương
pháp vi nang hóa tỏ ra có nhiều ưu điểm vượt trội giúp tăng độ ổn định và hoạt tính
trao đổi chất của tế bào khi có sự thay đổi về nhiệt độ, pH, các chất ức chế làm tế bào
kéo dài khả năng tồn tại. Các nghiên cứu gần đây tác giả sử dụng vi nang calci alginat
bao chitosan để bao gói các vi sinh vật, phương pháp bao chitosan lên vi nang có
nhiều lợi ích nổi bật. Chitosan giúp bảo vệ, làm tăng khả năng sống sót của vi sinh
vật, hạn chế tác động của acid dịch vị và muối mật khi vi sinh vật đi qua đường tiêu
hóa [27], [29]. Ngày nay phương pháp vi nang hóa bao chitosan được ứng dụng nhiều
trong việc bao gói các vi sinh vật tạo ra sản phẩm probiotics mang nhiều lợi ích. Từ
các lý do trên chúng tôi thực hiện đề tài “Khảo sát ảnh hưởng của chitosan đến
một số tính chất của vi nang probiotic alginat – tinh bột” với các mục tiêu sau:
1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ calci clorid tới thời gian hình thành vi nang.
2. Sơ bộ định tính chitosan trên vi nang bằng phương pháp đo phổ hồng ngoại
(IR).
3. Khảo sát ảnh hưởng của môi trường pH 3 đến tương tác chitosan-alginat trên
vi nang.

1


Chương 1 TỔNG QUAN
1.1 Tổng quan về vi nang
1.1.1 Khái niệm
Vi nang là những tiểu phân hình cầu hoặc không xác định, kích thước từ 0,1µm
tới 5mm (thường từ 100-500µm) [4]. Vi nang hóa là một trong những phương pháp
cố định tế bào được sử dụng rộng rãi hiện nay. Phương pháp sử dụng các chất tạo
màng (tạo gel) là các polyme có nguồn gốc tự nhiên như gelatin, alginat, chitosan,
cellulose,… hoặc có nguồn gốc nhân tạo như polyamid, polystyren, polyacrylat,
polyacrylamid, polyester, polyvinyl pyrrolidon (PVP), polyethylen glycon (PEG),…

để bẫy, nhốt và bao gói các tế bào, cơ thể vi sinh vật sống [5], [19].
1.1.2 Đặc điểm
Vi nang có cấu tạo như một màng bán thấm hình cầu giúp tế bào được cách ly với
môi trường xung quanh, bảo vệ và làm giảm sự tổn thương cũng như sự tổn thất số
lượng tế bào vi sinh vật, bằng cách này chúng sẽ được bảo vệ tốt hơn trong các điều
kiện bất lợi như acid cao, pH thấp, muối mật, sốc nhiệt,... và chỉ giải phóng tế bào tại
nơi mong muốn [25]. Ngoài ra vi nang hóa cũng giúp ổn định hoạt tính trao đổi chất
của tế bào trong quá trình lên men [30], [41].
Vi nang hóa cho phép cố định một lượng lớn tế bào vi sinh vật [41]. Độ bền cơ học
của lớp màng bao vi nang đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ và giải phóng vi
sinh vật khi cần thiết. Lớp màng phải có độ bền cơ học tương đối để có thể bảo vệ
được các vi sinh vật sống bên trong, tuy nhiên lại không được quá vững chắc vì như
thế sẽ ảnh hưởng đến sự giải phóng vi sinh vật khi cần thiết [5], [25].
Kích thước hạt vi nang cũng là một yếu tố quan trọng. Giữa kích thước hạt, độ bền
vững và khả năng giải phóng tế bào có mối quan hệ với nhau. Kích thước hạt càng
lớn thì độ bền vững của hạt càng cao, khả năng bảo vệ vi sinh vật càng cao, nhưng
giải phóng vi sinh vật khi cần thiết chậm và khó khăn. Ngược lại, kích thước hạt nhỏ

2


thì độ bền cơ học của hạt thấp, khả năng chứa và bảo vệ vi sinh vật giảm nhưng khả
năng giải phóng vi sinh vật thì nhanh và dễ dàng hơn.
Vi sinh vật được giải phóng theo các cơ chế như: gãy vỡ màng, hòa tan màng hoặc
khếch tán qua màng,… [25].
1.1.3 Ưu điểm của vi nang
Vi nang giúp bảo vệ vi khuẩn khỏi các yếu tố bất lợi của môi trường như oxy và
điều kiện acid ở dạ dày. Ngoài ra, vi nang làm ổn định hoạt tính trao đổi chất của tế
bào khi có sự thay đổi pH, nhiệt độ hay sự có mặt của các chất ức chế có trong môi
trường lên men do đó làm tăng độ ổn định và kéo dài khả năng tồn tại của vi khuẩn.

Trong vi nang khả năng tồn tại của vi khuẩn được tăng lên, tạo điều kiện để điều
khiển tế bào và cho phép kiểm soát liều lượng. Vi nang cũng cho phép điều chỉnh tốc
độ sinh trưởng của VSV, cho phép sử dụng TB ở một pha riêng biệt đối với MT lên
men, do đó có khả năng dừng phản ứng nhanh [5], [25].
Vi nang có khả năng tạo ra mật độ VSV lớn do có thể cố định một lượng lớn TB
sống. Trong các ngành thực phẩm có các sản phẩm lên men như bia, rượu,… thì kỹ
thuật vi nang hóa là một trong những phương pháp cố định TB VSV trong công đoạn
lên men, từ đó sử dụng VSV tiết kiệm, tối ưu và hiệu quả hơn [30], [37].
1.1.4 Nhược điểm của vi nang
Tế bào vi sinh vật sản sinh ra nhiều enzym trong quá trình trao đổi chất của nó, có
những enzym có thể cho xúc tác các phản ứng không mong muốn làm tổn hại đến lớp
bao gói và cả chính tế bào. Để giải quyết vấn đề này phải chọn lựa giống vi sinh vật
thích hợp (có thể biến đổi hoặc xử lý giống) để hạn chế tế bào không tạo ra các enzym
không mong muốn và tăng hoạt tính của các enzym mong muốn [5], [41].
Đa số các vật liệu vi nang như thạch, gelatin… đều là những nguồn dinh dưỡng
mà vi sinh vật có thể tiêu hóa được. Điều này dẫn đến nhược điểm đó là vi sinh vật
được bao gói bên trong hoặc vi sinh vật tạp nhiễm từ bên ngoài có thể tiêu hóa làm
cho lớp vi nang bị rách, thủng và như vậy hiệu quả vi nang hóa sẽ giảm đáng kể.

3


1.2 Phương pháp bào chế vi nang
Việc lựa chọn phương pháp bào chế phụ thuộc vào đặc điểm, tính chất của nguyên
vật liệu như độ tan, tính tương đồng, kích thước vi nang… Vi nang có thể được bào
chế bằng nhiều phương pháp khác nhau nhưng có thể tổng quát thành các phương
pháp sau.
1.2.1 Phương pháp đông tụ

Phương pháp này thường được áp dụng đối với các dung dịch polyme thân nước,

polyme được dùng phải có khả năng tạo thành màng phim. Nếu chỉ sử dụng một loại
dung dịch keo thì gọi là phương pháp đông tụ đơn giản, nếu sử dụng nhiều loại dung
dịch keo thì gọi là phương pháp đông tụ phức tạp.
a. Đông tụ đơn giản
Nguyên tắc: Là quá trình loại nước của các keo thân nước dùng trong hệ do đó làm
giảm độ tan của các chất keo, các chất keo sẽ tủa lại trên bề mặt tiểu phân phân tán
(dung dịch tế bào tự do) [1].
Trong phương pháp này thường chỉ sử dụng một loại polyme (gelatin, polyvinyl
alcol, carboxymethyl cellulose). Làm giảm độ tan của chất keo bằng cách thêm vào
một dung môi có thể trộn lẫn với nước (ethanol, aceton, isopropanol,…) hoặc thêm
vào một muối vô cơ hay thay đổi nhiệt độ [1].
b. Đông tụ phức tạp
Nguyên tắc: Là quá trình tương tác giữa các phân tử tích điện âm và tích điện
dương của 2 hay nhiều hợp chất cao phân tử, thường do sự thay đổi nồng độ các chất
tan cao phân tử hay pH. Các polyme càng có sự khác nhau về điểm đẳng điện càng
dễ dàng tạo thành hạt đông tụ [4], [9].
Kĩ thuật đông tụ hóa muối còn được biết đến là kỹ thuật ion hóa cố định gel, ion
hóa tạo gel để tạo ra các hạt gel không tan (hydrogel). Trong phương pháp này các
polyanion như alginat kết hợp với các ion đa hóa trị tạo thành các hạt gel có mạng
lưới không gian ba chiều bao gói lấy VSV hoặc có thể kết hợp tạo phức với các
4


polycation khác trên bề mặt của hạt gel alginat để tạo lớp màng có độ bền cơ học cao
hơn và ngăn thấm tốt hơn.
Kỹ thuật đông tụ hóa muối sử dụng alginat và calci clorid làm chất bao gói có
những ưu điểm như đơn giản, dễ làm, chi phí thấp, không cần sử dụng nhiệt độ cao
hoặc các dung môi hữu cơ. Đông tụ cho phép kết hợp một số lượng lớn VSV với chất
bao gói, tuy nhiên nhược điểm là gây thất thoát VSV trong quá trình bào chế [18].
Kỹ thuật nhỏ giọt thường cho các vi nang có kích thước lớn nằm trong khoảng 2 - 5

mm [29]. Đối với kỹ thuật phun đông tụ, sử dụng hệ thống phun dung dịch alginat
dưới áp suất không khí tạo các giọt nhỏ và trở thành đông tụ khi gặp môi trường có
tác nhân liên kết chéo. Kỹ thuật này cho vi nang có kích thước bé (5 – 15µm) nhưng
yêu cầu bắt buộc là phải có thiết bị thích hợp, tốn kém, khả năng tắc nghẽn cao [34].
Nồng độ alginat thường được sử dụng để tạo thành gel khoảng 0,6 - 2% và nồng
độ dung dịch calci clorid là 0,05 - 2 M. Kích thước và hình dạng của vi nang khác
nhau tùy thuộc vào các thiết bị sử dụng [29].
Kỹ thuật phun đông tụ: Sử dụng hệ thống phun dung dịch alginat dưới áp suất
không khí tạo các giọt nhỏ và đông tụ khi gặp môi trường có tác nhân liên kết chéo.
Kỹ thuật này cho vi nang có kích thước bé (5-15µm) nhưng yêu cầu bắt buộc phải có
thiết bị thích hợp, tốn kém và khả năng tắc nghẽn cao [34].
Kỹ thuật nhỏ giọt: Phương pháp nhỏ giọt ứng dụng nguyên lý căn bản là khi một
chất lỏng được để rơi tự do thì sẽ tạo thành giọt hình cầu do sức căng bề mặt của chất
lỏng. Phương pháp nhỏ giọt được thực hiện theo nguyên tắc tạo giọt đồng thời và
lồng vào nhau của hỗn dịch tế bào và dung dịch tạo vỏ gói. Sự tạo giọt được thực hiện
bằng cách ép các chất lỏng qua các ống đồng tâm, ở quy mô nhỏ có thể dùng bơm
tiêm để ép chất lỏng qua bộ phận tạo giọt.
1.2.2 Phương pháp hóa rắn nhũ tương
Vi nang có thể được tạo ra từ nhũ tương gồm hai hay nhiều chất lỏng không đồng
tan với nhau. Nhũ tương tạo thành có thể là loại dầu/nước (D/N) hoặc nước/dầu
(N/D) phụ thuộc vào độ tan của hoạt chất trong nước và polyme sử dụng. Dựa vào

5


phương pháp hóa rắn nhũ tương mà có thể chia thành 3 kỹ thuật: bốc hơi dung môi,
thay đổi dung môi và tạo liên kết chéo.
Phương pháp hóa rắn nhũ tương là một phương pháp thích hợp để vi nang hóa
probiotic trong các vi nang có kích thước nhỏ hơn 1 mm [35], [40]. Loại và lượng
chất diện hoạt cũng như lượng dầu và dung dịch calci clorid có thể ảnh hưởng đến

hiệu suất của quá trình tạo vi nang. Các nghiên cứu gợi ý sử dụng tỷ lệ pha dầu/alginat
là 2:1 trong bao gói probiotic, Tween 80 được sử dụng như là một chất diện hoạt
trong quá trình tạo vi nang probiotic [35], [40]. Phương pháp đông tụ từ nhũ tương
có hiệu quả trong việc giữ số lượng của L. acidophilus LA – 5 và B. bifidum BB - 12
cao hơn mức tối thiểu điều trị (> 107 cfu/g).
1.3 Tổng quan một số thành phần sử dụng trong vi nang
1.3.1 Alginat
a. Cấu tạo
Alginat là tên gọi chung cho các muối của acid alginic. Acid alginic là một acid
hữu cơ có trong họ tảo nâu (thuộc họ Rhaephyceae). Alginat là một polyme có các
monome là hai acid manunuronic (viết tắt là M) và acid guluronic (viết tắt là G) gắn
với nhau bằng liên kết 1 – 4 glycosid [19]. Alginat có tỷ lệ khối G cao (tỷ số M/G
thấp) tạo gel cứng hơn. Ngược lại, alginat chủ yếu là khối M thì gel hình thành mềm
hơn và đàn hồi hơn [32].

Hình 1.1 Hình ảnh mô tả cấu trúc của alginat
6


b. Đặc điểm, tính chất liên quan đến bào chế vi nang
Alginat có tính ưa nước, tương hợp sinh học cao, rẻ tiền và được ứng dụng rộng
rãi trong nhiều lĩnh vực. Alginat có hai tính chất quan trọng là độ nhớt dung dịch và
khả năng tạo gel [19].
Độ nhớt dung dịch alginat phụ thuộc vào số lượng nhánh của phân tử alginat.
Ngoài ra, độ nhớt của dung dịch còn thay đổi tùy theo nồng độ, nhiệt độ, pH và sự có
mặt của ion kim loại [12], [23].
Dung dịch alginat có khả năng tạo gel khi phản ứng với các ion kim loại hóa trị
II, III, sự tạo gel được giải thích qua mô hình vỉ trứng. Bình thường trong dung dịch
alginat tồn tại block M là các dải hẹp và block G là các dải gấp khúc. Khi có mặt ion
kim loại đa hóa trị (Ca2+ , Ba2+ , Sr2+ ,…) ở nồng độ thích hợp thì sự tạo gel xảy ra.

Các phân tử alginat sắp xếp lại song song nhau, các phần gấp khúc tạo thành khoảng
không gian giống như chỗ đặt trứng [21]. Các ion Ca2+ khớp vào các khoảng trống
này tạo nên mạng lưới không gian 3 chiều. Với cấu trúc gel này khi sử dụng làm
màng bao, chúng có vai trò như 1 tấm chắn chống lại những yếu tố bất lợi của môi
trường và cho phép giải phóng vi sinh vật được bao theo hướng kiểm soát được [19].

Hình 1.2 Mô hình vỉ trứng, vị trí của ion Ca2+ trong gel và sự tạo gel calci alginat

7


c. Ưu nhược điểm của alginat sử dụng làm vật liệu trong vi nang probiotic
Alginat là nguyên liệu an toàn, không độc, dễ sử dụng và giá thành rẻ. Alginat gel
hóa nhanh chóng ở pH trung tính và nhiệt độ thường, thích hợp cho các tế bào sống
và phân tử sinh học nhạy cảm như protein và acid nucleic [40]. Alginat dễ dàng tạo
gel bao bọc các tế bào vi khuẩn, lớp gel tạo thành có độ ổn định cao. Quá trình vi
nang hóa vi khuẩn bằng alginat thực hiện dễ dàng, đơn giản, có thể thực hiện ở nhiệt
độ thường nên ít ảnh hưởng đến vi khuẩn sống và gel tạo thành có tính thuận nghịch
giúp giải phóng tế bào bên trong. Hạt vi nang hình thành đẹp và tương đối đồng đều
[12].
Tuy nhiên, sử dụng alginat để vi nang hóa tế bào vi sinh vật cũng có một số nhược
điểm. Độ bền gel phụ thuộc một số ion hóa trị I và các chất tạo phức với ion Ca2+.
Gel alginat rã khi các cation hóa trị II phối hợp được thay thế bằng các cation hóa trị
I hoặc các chất tạo phức với Ca2+. Sự tương tác giữa alginat và các cation hóa trị I
dẫn đến hiện tượng hòa tan của gel [16].
1.3.2 Chitosan
a. Nguồn gốc
Chitosan là một polyaminosaccarid sinh học tự nhiên thu được từ phản ứng
deacetyl hóa của chitin, một polyme tự nhiên chuỗi dài của N-acetylglucosamine và
dẫn xuất đường glucose. Chitin là thành phần chính của thành tế bào nấm, xương

ngoài động vật chân đốt như tôm, cua, côn trùng [38].
b. Công thức hóa học

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của chitosan
8


c. Tính chất của chitosan
Phân tử lượng từ 3.800 đến 2.000.000 dalton, mức độ acetyl hóa từ 66% đến 95%.
Kích thước tiểu phân, phân tử lượng, tỷ trọng, độ nhớt, mức độ acetyl hóa là những
đặc tính quan trọng ảnh hưởng đến khả năng ứng dụng làm tá dược trong kỹ thuật
bào chế [38].
Độ nhớt của dung dịch chitosan tăng lên khi tăng nồng độ chitosan, giảm nhiệt độ
và phụ thuộc mức độ deacetyl hóa của chitosan.
Nhóm amino của chitosan có pka xấp xỉ 6.5. Chitosan mang điện tích dương, có
tính base yếu, thấm nước, tan trong hầu hết các dung dịch acid hữu cơ ở pH nhỏ hơn
6.5 như acid formic, acid acetic, acid tartaric và acid citric, nhưng không tan trong
acid sulfuric và acid phosphoric. Các muối glutamat, clorid của chitosan tan trong
nước. Chitosan không tan trong môi trường kiềm, môi trường trung tính. Đặc tính
này được ứng dụng để chế tạo vi cầu, vi nang chitosan [38].
Tính chất tích điện dương giúp cho chitosan hoạt động như một chất bám dính
sinh học, có khả năng bám vào các bề mặt tích điện âm như màng nhầy. Chitosan có
rất nhiều loại có khối lượng phân tử và mức độ deacetyl hóa khác nhau, đây là những
yếu tố ảnh hưởng đến kích thước phân tử, sự hình thành, kết tập phân tử và ứng dụng
của chitosan.
1.4 Một số phương pháp đánh giá sự có mặt của chitosan trong vi nang
Sự có mặt của chitosan trên vi nang giúp vi sinh vật được bảo vệ tốt nhất trong
môi trường pH dạ dày và muối mật gây nên bởi các phản ứng trao đổi ion [31]. Một
phức hợp không hòa tan giữa chitosan và muối mật được tạo thành, giúp hạn chế việc
khuếch tán của muối mật vào bên trong, điều này sẽ bảo vệ vi sinh vật khỏi sự ảnh

hưởng của muối mật [42]. Koo S. và cộng sự cũng báo cáo rằng Bifidobacteria và L.
casei được bao gói trong hạt alginat - chitosan có khả năng sống sót cao hơn so với
alginat mà không có chitosan [28]. Các tác giả đã sử dụng nhiều phương pháp khác
nhau để đánh giá sự có mặt của chitosan trên vi nang alginat – chitosan. Zanjani K.
và cộng sự đã thấy rằng vi nang sau khi bao chitosan có đường kính tăng lên so với
trước khi bao chitosan [27]. Shu và Zhu đã đo được mật độ của chitosan trên bề mặt

9


vi nang [36]. Một số tác giả lại sử dụng phương pháp đo phổ hồng ngoại để xác định
sự có mặt của chitosan như của Donghong Li và cộng sự,… [15]. Tuy nhiên, do hạn
chế về trang thiết bị cũng như thời gian thực hiện nên nghiên cứu chỉ sử dụng 2
phương pháp đo phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến (UV-VIS) và phương pháp đo phổ
hấp thụ hồng ngoại (IR) để xác định sự xuất hiện của chitosan trên vi nang.
1.4.1 Phương pháp đo phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến (UV-VIS)
Phổ tử ngoại và khả kiến của các chất hữu cơ gắn liền với bước chuyển electron
giữa mức năng lượng electron trong phân tử khi các electron chuyển từ các obitan
liên kết hoặc không liên kết lên các obitan phản liên kết có mức năng lượng cao hơn,
đòi hỏi phải hấp thụ năng lượng từ bên ngoài.
a. Nguyên tắc
Chiếu một chùm tia sáng có bước sóng λ và cường độ I0 qua dung dịch đồng nhất
có nồng độ C, bề dày lớp dung dịch là l. Khi đi qua dung dịch, một phần ánh sáng bị
hấp thụ, một phần bị phản xạ, phần còn lại I đi qua dung dịch.
b. Ứng dụng
Phương pháp phổ tử ngoại và khả kiến có ý nghĩa quan trọng trong lĩnh vực phân
tích định tính và phân tích định lượng.
1. Phân tích định tính
Về nguyên tắc có thể dựa vào phổ chất cần nghiên cứu với phổ chất chuẩn để định
tính. Với phổ UV- VIS có rất ít thông tin đặc trưng về cấu trúc nên thường dùng phổ

IR để xác định cấu trúc chính xác hơn. Tuy nhiên, trong một số trường hợp có thể
định tính một số chất bằng cách so sánh vị trí cực đại và cực tiểu hấp thụ và tỷ lệ mật
độ quang giữa các bước sóng đó phải nằm trong một giới hạn cho phép [2].
2. Phân tích định lượng
Nguyên tắc của phương pháp phân tích định lượng là dựa vào mối quan hệ giữa
mật độ quang và nồng độ dung dịch theo định luật Lambert – Beer. Ưu điểm của
phương pháp quang phổ tử ngoại và khả kiến trong phân tích định lượng là có độ
nhạy cao, có thể phát hiện được một lượng nhỏ chất hữu cơ hoặc ion vô cơ trong dung
dịch, sai số tương đối nhỏ (chỉ 1 đến 3%).
10


1.4.2 Phương pháp đo phổ hấp thụ hồng ngoại (IR)
Phương pháp phân tích theo phổ hồng ngoại là một trong những kỹ thuật phân tích
rất hiệu quả. Một trong những ưu điểm quan trọng nhất của phương pháp phổ hồng
ngoại vượt hơn những phương pháp phân tích cấu trúc khác (nhiễu xạ tia X, cộng
hưởng từ điện tử…) là cung cấp thông tin về cấu trúc phân tử nhanh, không đòi hỏi
các công thức tính toán phức tạp.
a. Nguyên tắc
Khi các phân tử hấp thụ năng lượng từ bên ngoài có thể dẫn đến quá trình quay,
dao động xung quanh vị trí cân bằng của nó. Tùy theo năng lượng kích thích lớn hay
nhỏ có thể xảy ra quá trình quay, dao động hay cả quay và dao động đồng thời.
Để có thể hấp thụ bức xạ hồng ngoại, phân tử đó phải đáp ứng các yêu cầu sau:
 Độ dài sóng chính xác của bức xạ: một phân tử hấp thụ bức xạ hồng ngoại chỉ
khi nào tần số dao động tự nhiên của một phần phân tử (các nguyên tử hay các
nhóm nguyên tử của phân tử) cũng là tần số của bức xạ tới.
 Một phân tử chỉ hấp thụ bức xạ hồng ngoại khi sự hấp thụ đó gây nên sự biến
thiên momen lưỡng cực của chúng.
Mặc dù phương pháp phổ dao động là một trong những phương pháp hữu hiệu
nhất để xác định các chất về định tính cũng như định lượng, được ứng dụng rộng rãi

trong nghiên cứu khoa học cũng như trong kiểm tra công nghiệp, phương pháp này
cũng có những hạn chế nhất định:
 Phổ hồng ngoại không cung cấp thông tin về các vị trí tương đối của các nhóm
chức khác nhau trên một phân tử.
 Chỉ riêng phổ hồng ngoại thì đôi khi chưa thể kết luận là chất nguyên chất hay
chất hỗn hợp vì có trường hợp 2 chất có phổ hồng ngoại giống nhau.
b. Ứng dụng
1. Phân tích định tính
Trước khi ghi phổ hồng ngoại, nói chung ta đã có thể có nhiều thông tin về hợp
chất hoặc hỗn hợp cần nghiên cứu, như trạng thái vật lý, độ tan, điểm nóng chảy.

11


Nếu có thể thì cần biết mẫu là chất nguyên chất hay hỗn hợp. Sau khi ghi phổ hồng
ngoại, nếu chất nghiên cứu là hợp chất hữu cơ thì nghiên cứu vùng dao động co giãn
của H trước để xác định mẫu thuộc loại hợp chất vòng thơm hay mạch thẳng hoặc cả
hai. Sau đó nghiên cứu các vùng tần số nhóm để xác định có hay không có các nhóm
chức.
Trong nhiều trường hợp việc đọc phổ (giải phổ) và tìm các tần số đặc trưng không
đủ để nhận biết một cách toàn diện về chất nghiên cứu, nhưng có thể suy đoán được
kiểu hoặc loại hợp chất.
2. Phân tích định lượng
Phương pháp phổ hồng ngoại có thể được ứng dụng trong phân tích định lượng
một chất trong dung dịch hay trong hỗn hợp. Cơ sở của phương pháp này dựa trên
phương trình định luật Lambert – Beer biểu hiện mối quan hệ giữa sự hấp thụ ánh
sáng và nồng độ chất. Phương pháp phân tích định lượng nhờ phổ hồng ngoại cũng
có thể thực hiện theo cách lập đường chuẩn.
1.5 Một số nghiên cứu sử dụng vi nang alginat phối hợp với tinh bột và
chitosan

Vi nang calci alginat đã được biết đến, nghiên cứu và ứng dụng trong khoảng thời
gian rất dài. Từ những năm đầu thập niên chín mươi của thế kỷ XX Sheu và Marshall
(1993) đã sử dụng calci alginat để cố định và bảo quản lactobacilli [35]. Sang thế kỷ
XXI Chandramouli V và cộng sự (2003) đã sử dụng vi nang calci alginat để bảo vệ
và làm tăng khả năng sống sót của vi khuẩn Lactobacillus acidophilus khi đi qua dạ
dày [13]. Khosravi Zanjania và cộng sự (2014) đã nghiên cứu và đánh giá ảnh hưởng
của vi nang alginat - tinh bột - chitosan đến sự cải thiện khả năng sống sót trong môi
trường dạ dày của Lactobacillus casei và Bifidobacterium bifidum [27]. Theo nghiên
cứu của Maria Chavarri và cộng sự số lượng vi sinh vật Lactobacillus gasseri và
Bifidobacterium bifidum được bao gói trong vi nang alginat – chitosan có khả năng
tồn tại cao hơn việc chỉ bao gói bằng alginat [14].
Theo nghiên cứu của Đàm Thanh Xuân và cộng sự, tác giả đã sử dụng vi nang
alginat-tinh bột bao chitosan để làm tăng khả năng bảo vệ của L. acidophilus ATCC
12


4356 [8]. Tác giả Đàm Thanh Xuân và cộng sự đã đánh giá vai trò của tinh bột và sữa
gầy đến quá trình tạo vi nang probiotic chứa vi khuẩn L. acidophilus ATCC 4356 [7].
Theo nghiên cứu của Phạm Thị Phương thì khả năng bao gói vi sinh vật trong vi nang
alginat – chitosan cao gấp 50 lần so với vi nang không có chitosan và hiệu quả bảo
vệ vi sinh vật trong môi trường pH 1,2 cũng tăng lên [6]. Chitosan cũng được ứng
dụng rộng rãi trong công nghệ nano. Theo tác giả Đặng Thị Lệ Hằng và cộng sự, tác
giả đã sử dụng chitosan để bào chế nano chitosan-curcumin ứng dụng trong tái tạo
mô [3].

13


Chương 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị

2.1.1 Nguyên vật liệu sử dụng
 Nguyên liệu
Bảng 2.1 Các hóa chất dùng trong nghiên cứu
Tên hóa chất

Nguồn gốc

Tên hóa chất

Nguồn gốc

Tinh bột

Việt Nam

KBr

Trung Quốc

Calci clorid

Trung Quốc

Acid acetic

Trung Quốc

Alginat

Trung Quốc

Natri clorid

Trung Quốc

Chitosan

Trung Quốc

NaOH

Trung Quốc

HCl

Trung Quốc

2.1.2 Thiết bị
Bảng 2.2 Các thiết bị dùng trong nghiên cứu
Tên thiết bị

Nguồn gốc

Máy khuấy từ

Wisd (Hàn Quốc)
KIKA (Đức)

Máy lắc
Cân kĩ thuật

Satorious (Đức)

Nồi hấp tiệt khuẩn

ALP (Nhật)

Tủ lạnh sâu

HAIER DW86W420 (Đức)

Máy đông khô

Christ Alpha 1-LD (Đức)

Máy đo phổ IR

Nhật (Jasco)

Máy đo UV-VIS

Hitachi U-1900 (Nhật)

Máy ly tâm

Rotina 46 (Đức)

Tủ lạnh

LG (Hàn Quốc)

Đĩa petri, bình nón, cốc có mỏ…

14


2.1.3 Các dung dịch sử dụng trong nghiên cứu
 Dung dịch acid acetic 0,5%.
 Dung dịch NaCl 0,9% pH 3.
2.2 Nội dung nghiên cứu
2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ calci clorid tới thời gian hình thành vi
nang.
 Ảnh hưởng của nồng độ calci clorid 1%.
 Ảnh hưởng của nồng độ calci clorid 2%.
2.2.2 Sơ bộ định tính chitosan trên vi nang bằng phương pháp đo phổ hồng
ngoại (IR).
2.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của môi trường pH 3 đến tương tác chitosan-alginat
trên vi nang.
 Khảo sát khả năng hòa tan của vi nang trong môi trường pH 3.
 Khảo sát ảnh hưởng của MT pH 3 đến tương tác chitosan-alginat trên vi
nang.
2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp bào chế vi nang
Bảng 2.3 Bảng thiết kế công thức vi nang

Nồng độ

Tinh bột

Natri alginat

Chitosan

Calci clorid

10%

2%

0,5%

1% hoặc 2%

Chuẩn bị các dung dịch:
 Tiệt khuẩn tinh bột: Cân một lượng tinh bột nhất định cho vào bình nón, đậy
kín bằng nút bông, đun cách thủy ở 700C-800C trong 1 giờ, ủ bình trong tủ ấm
ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ. Lặp lại thao tác trong 3 ngày liên tục.

15


 Chuẩn bị dung dịch alginat 2%: Cân chính xác 2,00 gam natri alginat, phân
tán đều trong 100ml nước cất. Để yên 30 phút cho alginat trương nở, đem hấp
tiệt trùng ở 1150C trong 20 phút cho alginat đồng nhất.
 Chuẩn bị hỗn dịch alginat - tinh bột: Cân 5,00 gam tinh bột, phân tán vào 50ml
dung dịch alginat 2%, đồng nhất hóa bằng máy khuấy từ trong 20 phút thu
được hỗn dịch alginat-tinh bột.
 Chuẩn bị dung dịch calci clorid 1%, 2%: Cân chính xác 1.00 gam, 2.00 gam
calci clorid vào bình nón chứa 80ml nước cất, hòa tan rồi bổ sung nước cất
vừa đủ 100ml đậy nút bông.

 Chuẩn bị dung dịch chitosan 0,5% trong acid acetic [27]: Cân 0,5 gam
chitosan, hòa tan trong dung dịch có chứa 90ml nước cất và 0,5 ml acid acetic
băng, khuấy đều cho chitosan hòa tan hoàn toàn. Điều chỉnh pH trong khoảng
5,5 – 6,0 bằng dung dịch NaOH 1N. Bổ sung nước đủ 100ml. Cho vào bình
nón đậy nút bông. Hấp tiệt khuẩn ở 1150C trong 20 phút, để nguội đến nhiệt
độ phòng.
 Chuẩn bị dung dịch chitosan – calci clorid [36]: Cân calci clorid, cân chitosan
rồi hòa tan cả hai trong dung dịch có chứa 90ml nước cất và 0,5ml acid acetic
băng sau đó tiến hành tương tự như chuẩn bị dung dịch chitosan.
Tạo vi nang [22]: dùng pipet hút 5ml hỗn dịch alginat – tinh bột đã đồng nhất nhỏ
từ từ xuống dung dịch calci clorid (hoặc dung dịch hỗn hợp chitosan – calci clorid
tùy từng thí nghiệm), ngâm hạt trong thời gian thích hợp.
2.3.2 Phương pháp đông khô
Vi nang sau khi vớt ra được rửa sạch bằng nước cất 2 lần rồi tiến hành tiền đông
24 giờ trong tủ lạnh sâu - 700C cho tới khi vi nang đông rắn hoàn toàn.
Sau khi tiền đông mẫu được làm khô trong buồng lạnh của máy đông khô ở nhiệt
độ - 480C, áp suất 0,200 mbar trong 24 giờ. Kết thúc quá trình làm khô, lấy mẫu ra
khỏi thiết bị. Mẫu được đựng trong lọ thủy tinh kín, bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt
độ 2 – 80C.
16


2.3.3 Phương pháp định tính chitosan trên vi nang bằng phương pháp đo phổ
hồng ngoại (IR)
Vi nang sau khi đông khô được nghiền mịn trong cối sứ rồi trộn đều với bột KBr
trong cối mã não theo tỉ lệ 1/200 đến đồng đều. Hỗn hợp bột được ép thành viên mỏng
bằng bơm thủy lực, sau đó đo phổ IR với máy Jasco [2].
2.3.4 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của môi trường pH 3 đến tương tác
chitosan-alginat trên vi nang.
Chuẩn bị môi trường muối natri clorid 0,9% pH 3 [20]: Cân 0,9 gam natri clorid,

hòa tan vào 90ml nước cất, khuấy cho tan hoàn toàn. Dùng HCl điều chỉnh pH của
dung dịch đến pH 3, bổ sung nước cất đủ 100ml.
Cân 2 gam vi nang cho vào bình nón chứa 100ml dung dịch môi trường , lắc ở tốc
độ 300 vòng/phút. Sau 2 giờ lọc tách riêng dịch môi trường đi đo phổ UV và vi nang
còn lại đi đo phổ IR.

17