Nghiên cứu sản xuất hydro sinh học từ vi khuẩn clostridium sp được phân lập từ dạ dày bò bằng phương pháp lên men tối

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
-----------------------

HOÀNG THỊ VUI

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT HYDRO SINH HỌC TỪ VI KHUẨN
Clostridiumsp. ĐƢỢC PHÂN LẬP TỪ DẠ DÀY BÒ BẰNG
PHƢƠNG PHÁP LÊN MEN TỐI

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội –2017


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
-----------------------

HOÀNG THỊ VUI

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT HYDRO SINH HỌC TỪ VI KHUẨN
Clostridiumsp. ĐƢỢC PHÂN LẬP TỪ DẠ DÀY BÒ BẰNG
PHƢƠNG PHÁP LÊN MEN TỐI
Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 60420107

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS.TS. BÙI THỊ VIỆT HÀ

Hà Nội – 2017


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn là kết quả của sự cố gắng và nỗ lực của bản thân trong
suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Bên cạnh đó, không thể không kể đến sự hỗ trợ
và hướng dẫn của rất nhiều cá nhân và tập thể đã giúp tôi hoàn thành công trình nghiên
cứu của mình.
Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới PGS.TS.
Bùi Thị Việt Hà, người đã trực tiếp giảng dạy, giúp đỡ và hướng dẫn tôi tận tình trong
suốt quá trình thực hiện đề tài. Cô đã luôn động viên khích lệ và chỉ bảo cho tôi những
kiến thức, lời khuyên, kinh nghiệm quý báu trong học tập và nghiên cứu.Nhờ vậy, tôi
mới có thể hoàn thành luận văn một cách tốt nhất.
Với tấm lòng biết ơn sâu sắc tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tất cả Thầy
Cô và các cán bộ, thành viên trong Bộ môn Vi sinh vật học, Phòng sinh học Nano và
ứng dụng – KLEPT, Khoa Sinh học và Khoa Môi trường, Trường Đại học Khoa học
Tự nhiên, Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học- ĐHQGHN, Bộ môn Công nghệ
sinh học - Khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ Thực phẩm – Trường Đại học Bách
khoa Hà Nội, đã nhiệt tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành luận
văn này.
Ngoài ra, tôi xin chân thành cảm ơn sự ủng hộ và giúp đỡ của các anh, chị, các
em sinh viên và bạn bè trong phòng thí nghiệm Hóa sinh và Vi sinh môi trường 105T2
trong suốt thời gian thực hiện đề tài.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè, những người thân yêu
đã luôn động viên và giúp đỡ tôi cả về mặt vật chất lẫn tinh thần trong suốt quá trình
học tập và nghiên cứu.
Hà Nội, ngày 20 tháng 06 năm 2017,
Học viên

Hoàng Thị Vui


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1
CHƢƠNG I - TỔNG QUAN ......................................................................................... 2
1.1. Hiện trạng nguồn năng lƣợng trên thế giới hiện nay........................................... 2
1.2. Một số nguồn năng lƣợng thay thế cho nhiên liệu hóa thạch ............................. 5
1.2.1. Năng lượng từ hệ thống pin nhiên liệu .............................................................. 5
1.2.2. Nguồn năng lượng mặt trời ................................................................................ 6
1.2.3. Nguồn năng lượng gió........................................................................................ 6
1.2.4. Năng lượng từ thủy triều .................................................................................... 6
1.2.5. Thủy điện ........................................................................................................... 6
1.2.6. Một số nhiên liệu sinh học ................................................................................. 7
1.3. Ứng dụng thực tiễn của nhiên liệu hydro ............................................................. 9
1.4. Một số phƣơng pháp sản xuất hydro .................................................................... 9
1.5. Phƣơng pháp lên men tối sản xuất hydro ........................................................... 11
1.6. Khả năng sinh hydro của các loài Clostridium ................................................... 13
1.6.1. Tổng quan về loài Clostridium sp. ................................................................... 13
1.6.2. Khả năng sinh hydro của một số loài Clostridium sp. ..................................... 15
1.7. Thách thức và triển vọng của phƣơng pháp lên men tối ................................... 18
1.7.1. Thách thức ........................................................................................................ 18
1.7.2. Triển vọng ........................................................................................................ 18
1.8. Đặc điểm hệ vi sinh vật dạ cỏ ............................................................................... 18
1.8.1. Vi khuẩn (Bacteria) .......................................................................................... 19
1.8.2. Động vật nguyên sinh (Protozoa)..................................................................... 20


1.8.3. Nấm (Fungi) ..................................................................................................... 21
1.9. Một số nguồn cơ chất thuộc thế hệ 2 ................................................................... 21

1.9.1. Bột bã sắn ......................................................................................................... 21
1.9.2. Bỗng rượu ........................................................................................................ 22
CHƢƠNG 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ............................................. 25
2.1. Nguyên liệu và thiết bị .......................................................................................... 25
2.1.1. Nguyên liệu ...................................................................................................... 25
2.1.2. Thiết bị ............................................................................................................. 25
2.1.3. Dụng cụ ............................................................................................................ 26
2.2. Môi trƣờng ............................................................................................................. 26
2.2.1. Môi trường PY (1000mL) ................................................................................ 26
2.2.2. Môi trường PYA .............................................................................................. 27
2.2.3. Môi trường PYG (1000 mL) ............................................................................ 27
2.2.4. Môi trường với nguồn cơ chất là bột bã sắn .................................................... 28
2.2.5. Môi trường với nguồn cơ chất là bỗng rượu .................................................... 29
2.2.6. Các môi trường khác ........................................................................................ 29
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu...................................................................................... 31
2.3.1. Phương pháp xử lý mẫu và nuôi cấy ................................................................ 32
2.3.2. Định danh vi khuẩn theo khóa định loại Bergey.............................................. 34
2.3.3. Định danh chủng sinh khí hydro dựa vào giải trình tự đoạn gen 16S rRNA ... 34
2.3.4. Xác định hoạt tính enzyme của các chủng Clostridium sp. ............................. 36
2.4. Các phƣơng pháp phân tích ................................................................................. 37
2.4.1. Xác định tổng khí biogas sinh ra ...................................................................... 37
2.4.2. Xác định hàm lượng đường khử bằng phương pháp DNS .............................. 38


2.4.3. Định lượng khí hydro trong mô hình thí nghiệm ............................................. 38
2.4.4. Xác định thành phần cơ chất thế hệ 2 .............................................................. 39
2.5. Nghiên cứu quá trình sản xuất hydro sinh học của chủng Clostridium sp. ..... 40
2.5.1. So sánh sản lượng hydro của các chủng Clostridium sp. phân lập được với một
số chủng Clostridium khác ......................................................................................... 40
2.5.2. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn cơ chất đến khả năng sinh trưởng và sinh khí

của vi sinh vật............................................................................................................. 40
2.6. Tối ƣu hóa các điều kiện lên men để nâng cao sản lƣợng hydro bằng phƣơng
pháp đáp ứng bề mặt ................................................................................................... 40
2.7. Khảo sát khả năng sinh khí hydro của các chủng Clostridium sp. trên một số
nguồn cơ chất thuộc thế hệ thứ 2 ................................................................................ 41
2.7.1. Nguồn cơ chất là bột bã sắn ............................................................................. 41
2.7.2. Nguồn cơ chất là bỗng rượu ............................................................................. 41
2.8. Phƣơng pháp xử lý số liệu .................................................................................... 41
CHƢƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................ 42
3.1. Kết quả phân lập và định danh các chủng Clostridium sp. phân lập đƣợc từ dạ
dày bò ............................................................................................................................ 42
3.1.1. Đặc điểm hình thái vi khuẩn ............................................................................ 43
3.1.2. Kết quả định danh bằng khóa phân loại Bergey .............................................. 45
3.1.3. Kết quả định danh bằng phương pháp 16S rRNA ........................................... 46
3.1.4. Hoạt tính enzyme của các chủng Clostridium sp. phân lập ............................. 47
3.2. Nghiên cứu quá trình sản xuất hydro sinh học của chủng Clostridium sp. ..... 49
3.2.1. So sánh sản lượng hydro của các chủng Clostridium sp. phân lập được với một
số chủng Clostridium khác ......................................................................................... 49


3.2.2. Khảo sát khả năng trưởng và sinh khí hydo của chủng Clostridium sp. trên
một số nguồn cơ chất có sẵn ...................................................................................... 53
3.2.2.1. Khả năng sinh trưởng và sinh khí trên một số nguồn cơ chất có sẵn khi
lên men đơn chủng. ................................................................................................ 53
3.2.2.2. Khả năng sinh trưởng và sinh khí trên một số nguồn cơ chất có sẵn khi
lên men kết hợp 2 chủng......................................................................................... 56
3.2.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn cơ chất đến khả năng sinh trưởng và sinh
khí khi lên men kết hợp 3 chủng Clostridium sp. ................................................... 59
3.3. Tối ƣu hóa các điều kiện lên men để nâng cao sản lƣợng hydro bằng phƣơng
pháp đáp ứng bề mặt ................................................................................................... 60

3.4. Khảo sát khả năng sinh khí hydro của các chủng Clostridium sp. trên một số
nguồn cơ chất thuộc thế hệ thứ 2 ................................................................................ 64
3.4.1. Khả năng sinh hydro khi lên men với bột bã sắn ............................................. 64
3.4.2. Sản lượng hydro với nguồn cơ chất là bỗng rượu............................................ 67
KẾT LUẬN ................................................................................................................... 69
KIẾN NGHỊ .................................................................................................................. 70
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 71
PHỤ LỤC ...................................................................................................................... 83
Phụ lục 1: Kết quả giải trình tự .................................................................................. 83
Phụ lục 2: Một số kết quả thí nghiệm......................................................................... 85
Phụ lục 3: Kết quả đo sắc ký khí của một số mô hình có sản lƣợng hydro cao ..... 86
Phụ lục 4: Một số hình ảnh thí nghiệm. ..................................................................... 90


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Nguyên lý hoạt động của pin nhiên liệu .......................................................... 5
Hình 1.2: Sơ đồ lên men của Clostridium. Con đường dẫn tới sản lượng tối đa theo lý
thuyết là 4 mol H2/ mol glucose khi toàn bộ cơ chất chuyển hóa thành axit acetic theo
đường màu đỏ ................................................................................................................. 12
Hình 1.3: Ảnh hiển vi điện tử C. beijerinckii NCIMB 8052 ......................................... 13
Hình 1.4: Sơ đồ phản ứng phân giải các hợp chất hữu cơ trong quá trình lên men rượu [
........................................................................................................................................ 23
Hình 2.1: Sơ đồ nghiên cứu phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh hydro ......... 32
Hình 2.2: Phương pháp sục khí nitơ............................................................................... 33
Hình 2.3: Nguyên lý của phương pháp cột nước xác định tổng lượng khí sinh ra từ bể
phân hủy kỵ khí . ............................................................................................................ 37
Hình 3.1: Đặc điểm hình thái tế bào của các chủng phân lập ........................................ 44
Hình 3.2 : Kết quả điện di sản phẩm nhân bản gen 16S rRNA bằng kĩ thuật PCR ....... 46
Hình 3.3: Kết quả xác định hoạt tính enzyme của các chủng Clostridium sp. .............. 48
Hình 3.4: Khả năng sinh trưởng và sinh khí khi lên men đơn chủng các chủng

Clostridium sp. trên một số nguồn cơ chất có sẵn ......................................................... 54
Hình 3.5 : Khả năng sinh trưởng và sinh khí khi lên men kết hợp 2 chủng Clostridium
sp. trên một số nguồn cơ chất có sẵn ............................................................................. 57
Hình 3.6: Khả năng sinh trưởng và sinh khí khi lên men kết hợp 3 chủng Clostridium
sp. trên một số nguồn cơ chất có sẵn ............................................................................. 59
Hình 3.7: Hồi quy đáp ứng ảnh hưởng các yếu tố đến sản lượng hydro ....................... 63
Hình 3.8: Kết quả lên men các chủng Clostridium sp. với bột sắn ................................ 65
Hình 3.9: Kết quả lên men các chủng Clostridium sp. với bỗng rượu .......................... 67


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Một số loài thuộc chi Clostridium ................................................................. 14
Bảng 1.2 : Khả năng sản xuất hydro từ một số chủng vi sinh vật.................................. 15
Bảng 1.3: Sản lượng hydro từ các cơ chất khác nhau của một số loài thuộc chi
Clostridium ..................................................................................................................... 17
Bảng 3.1: Sản lượng khí hydro trong các mẫu làm giàu lần 3 ....................................... 43
Bảng 3.2: Tính chất sinh lý hóa sinh của các chủng đã phân lập từ dạ dày bò .............. 45
Bảng 3.3 : Kết quả định danh bằng kỹ thuật sinh học phân tử ...................................... 47
Bảng 3.4: Kết quả sản lượng hydro của các chủng phân lập ......................................... 50
Bảng 3.5: So sánh sản lượng hydro của các chủng Clostridium sp. phân lập từ dạ dày
bò với một số chủng Clostridium sp. khác ..................................................................... 51
Bảng 3.6: Ma trận thực nghiệm và kết quả lên men kết hợp 3 chủng Clostridium sp. .. 61
Bảng 3.7: Phương sai Anova của mô hình ..................................................................... 62


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
Từ viết tắt

Từ/cụm từ đầy đủ

Bp

Base pair

Btu

British Thermal Unit

C. beijerinckiiST1

Clostridium beijerinckiiST1

C. bifermentans ST4

Clostridium bifermentans ST4

C. butyricum ST5

Clostridium butyricum ST5

DNA

Deoxyribonucleic acid

dNTP

2’- deoxyribonucleotide 5’- triphosphate

EDTA

Ethylenediamintetraacetic acid

EtBr

Ethidium bromide

GC

Gas chromatography

OD

Opical Desity

PCR

Polymerase chain reaction

S

Svedberg (đơn vị lắng)

TAE

Tris – acetate – EDTA

VP

Voges-Proskauer

DNS

3,5-Dinitrosalisylic


Hoàng Thị Vui – CHK23 – Luận văn cao học – Chuyên ngành vi sinh vật học

MỞ ĐẦU
Hiện nay nền kinh tế toàn cầu và nhu cầu năng lượng chủ yếu dựa vào nhiên
liệu hóa thạch. Việc phụ thuộc nặng nề và sử dụng quá mức dẫn đến sự cạn kiệt nhiên
liệu không thể tái tạo này và làm tăng nồng độ của các carbon dioxide, carbon
monoxide, oxi của lưu huỳnh và nitơ (SOx và NOx). Điều này dẫn đến nhiều mối lo
ngại về môi trường như sự ấm lên của toàn cầu và những ảnh hưởng bất lợi đối với sức
khỏe của con người. Để giảm những mối nguy hại này, việc tìm ra những nguồn
nguyên liệu thay thế cho nhiên liệu hóa thạch là vấn đề hết sức cấp bách và là vấn đề
toàn cầu.
Hydro được coi là một nguồn nhiên liệu thay thế đầy hứa hẹn cho nhiên liệu hóa
thạch thông thường bởi vì nó có khả năng loại bỏ hầu hết các vấn đề do nhiên liệu hóa
thạch tạo ra. Bản thân hydro cũng được đề xuất làm nhiên liệu cho các phương tiện
giao thông như xe ô tô, xe tải và xe bus. Sản xuất hydro sinh học thu hút sự quan tâm
của toàn cầu vì được coi là năng lượng vô hạn, giá thành thấp và có thể tái tạo.
Lên men sản xuất hydro từ vi sinh vật là phương pháp đang được các nhà khoa
học quan tâm bởi vi sinh vật có khả năng sử dụng các chất thải hữu cơ để tạo ra các khí
sinh học, trong đó có hydro, tốc độ sản xuất nhanh và sản lượng khí sinh học sinh ra từ
vi sinh vật tương đối cao. Đồng thời đây là phương pháp đơn giản và dễ thực hiện.
Đề tài: “Nghiên cứu sản xuất hydro sinh học từ vi khuẩn Clostridium sp.
được phân lập từ dạ dày bò bằng phương pháp lên men tối” nhằm phân lập các
chủng Clostridium sp. từ dạ dày bò và nghiên cứu khả năng sản xuất khí hydro sinh
học từ vi sinh vật kỵ khí, xác định điều kiện tối ưu để thu được sản lượng hydro cao
nhất.

1


Hoàng Thị Vui – CHK23 – Luận văn cao học – Chuyên ngành vi sinh vật học

Chƣơng I - TỔNG QUAN
1.1. Hiện trạng nguồn năng lƣợng trên thế giới hiện nay
Đến nay, sự phân bố không đều trữ lượng năng lượng của một số quốc gia trên
thế giới làm cho vấn đề an ninh năng lượng trở nên phức tạp. Theo thống kê, bốn khu
vực có trữ lượng dầu mỏ nhiều nhất thế giới là Trung Đông, Bắc Phi, Trung Á và Bắc
Mĩ, chiếm 82,3% trữ lượng dầu mỏ thế giới, trong đó ở khu vực Trung Đông chiếm
64%, châu Mĩ (14%), châu Phi (7%), Nga (4,8%), châu Á-Thái Bình Dương (4,27%)
[9].
Đối với Trung Đông, đây là khu vực có trữ lượng dầu mỏ và khí đốt lớn nhất thế
giới, trữ lượng dầu mỏ chiếm hơn 50% tổng trữ lượng dầu mỏ thế giới với 727,314 tỷ
thùng dầu và gần một nửa trữ lượng khí đốt thế giới, với 2.591,653 Tcf (đơn vị đo khí
đốt .Đối với châu Phi, đây là khu vực có trữ lượng dầu mỏ đứng thứ 4 thế giới chiếm
10% tổng trữ lượng dầu mỏ thế giới, còn trữ lượng khí đốt xếp thứ 3 thế giới (sau
Trung Đông) và Trung Á, với 494,078 Tcf [6]. Đối Trung Á, đây là khu vực hàng đầu
thế giới về trữ lượng dầu khí và gas tự nhiên, tập trung chủ yếu ở Kazakhstan,
Turkmenistan và Uzbekistan [5].
Ở Mĩ Latinh, theo Tổ chức Năng lượng Mỹ Latinh (OLADE), trữ lượng dầu lửa
của khu vực này hiện đã được xác định là gần 1,7 ngàn tỷ thùng, chiếm 20% tổng trữ
lượng dầu lửa toàn cầu. Hiện nay, ít nhất 345 tỷ thùng dầu lửa ở Mỹ Latinh đã sẵn sàng
để khai thác [10]. Các nước có trữ lượng lớn về dầu lửa của khu vực là Venezuela,
Brazil, Mehico, Ecuardo…
Cạnh tranh chiến lược giữa các nước lớn
Như trên phân tích, nguồn tài nguyên năng lượng hầu hết tập trung ở các khu
vực Trung Á, châu Phi, Mỹ Latinh, Trung Đông… và việc xuất hiện các cường quốc

tiêu thụ năng lượng mới (như Mỹ, EU, Trung Quốc, Nhật, Ấn Độ…) với nhu cầu tiêu

2


Hoàng Thị Vui – CHK23 – Luận văn cao học – Chuyên ngành vi sinh vật học

thụ ngày càng tăng trong khi nguồn cung đang cạn kiệt đã tác động mạnh mẽ tới cơ cấu
quyền lực của thế giới, vấn đề an ninh năng lượng ngày càng trở nên cấp bách.
Tại Hội nghị thượng đỉnh EU (22/5/2013), dự kiến đến năm 2035, EU phải nhập
80% lượng khí đốt, nhập khẩu dầu 90%, than đá 70%. Ấn Độ sẽ sớm trở thành nước
tiêu thụ năng lượng lớn thứ 4 thế giới sau Hoa Kì, Trung Quốc, Nhật Bản[46].
Các dự báo đều cho rằng, nguồn cung dầu mỏ của thế giới chỉ gia tăng thêm
trong khoảng nửa thập kỉ nữa trước khi đạt đỉnh điểm rồi bắt đầu giảm, còn nguồn
cung khí đốt sẽ tiếp tục tăng thêm 1-2 thập kỷ rồi cũng giảm. Điều này làm cho cuộc
cạnh tranh giành giật các nguồn tài nguyên như: dầu mỏ, khí đốt, than và uranium ngày
càng quyết liệt trên toàn cầu. Rõ ràng vấn đề an ninh năng lượng buộc các quốc gia
phải điều chỉnh chiến lược đối ngoại của mình, đi tìm kiếm những nguồn cung cấp
năng lượng ổn định.
Tất cả những vấn đề trên đây làm cho triển vọng phát triển năng lượng toàn cầu
liên quan tới việc nâng cao tính minh bạch, dự báo được và tính ổn định của thị trường
toàn cầu. Cải thiện môi trường đầu tư và lĩnh vực năng lượng, nâng cao hiệu quả sử
dụng và tiết kiệm năng lượng, đa dạng hóa các dạng năng lượng, bảo đảm an ninh năng
lượng cũng như an ninh vận chuyển năng lượng, hạ tầng năng lượng, giảm bớt thiếu
hụt năng lượng qui mô lớn, giải quyết các vấn đề biến đổi khí hậu và phát triển bền
vững.
Đi tìm giải pháp cho cuộc khủng hoảng năng lượng
Trong bối cảnh các nguồn năng lượng ngày càng khan hiếm dần, đe dọa trực
tiếp đến sự ổn định, đời sống kinh tế-xã hội của tất cả con người, mọi quốc gia trên
hành tinh. Ba giải pháp sau đây được cộng đồng thế giới thường dùng.

 Tiết kiệm tối đa việc sử dụng năng lượng.
 Tìm kiếm các nguồn năng lượng thay thế và giải pháp;
3


Hoàng Thị Vui – CHK23 – Luận văn cao học – Chuyên ngành vi sinh vật học

 Chỉ một số nước áp dụng, là dùng các biện pháp an ninh, quân sự, kinh tế
… nắm lại các nguồn nguyên liệu năng lượng chiến lược.
Tuy nhiên, các nguồn năng lượng thay thế vẫn còn nhiều bất cập, chưa phù hợp
và chưa phổ biến. Đến nay, thế giới đã và đang tập trung phát triển năng lượng hạt
nhân, năng lượng tái sinh và năng lượng sinh học, tuy nhiên khó khăn là năng lượng
hạt nhân thường đi kèm với nguy cơ rò rỉ phóng xạ, các nước lợi dụng sản xuất vũ khí
hạt nhân, hạn chế về tài chính… Hiện có 45 quốc gia sử dụng năng lượng tái sinh, 60
nước có chương trình quốc gia phát triển năng lượng tái sinh, 19 nước khuyến khích sử
dụng năng lượng mặt trời và sưởi ấm, nhưng nhược điểm của nó phụ thuộc vào thời
tiết, công trình thủy điện dễ gây biến đổi địa chất, khan hiếm nguồn nước. [10]
Đối với Việt Nam, vấn đề năng lượng và an ninh năng lượng cũng có những tác
động lớn đến nền kinh tế của đất nước, vì thế Việt Nam đã đưa ra yêu cầu cấp thiết
“Chiến lược Phát triển năng lượng quốc gia” đến năm 2020, tầm nhìn 2050
(19/12/2007) [11].Mặc dù, vấn đề thực hiện còn nhiều hạn chế do phụ thuộc vào nhiều
nhân tố, nhưng nhìn chung với chiến lược kể trên, tương lai Việt Nam có nhiều cơ hội
để mở rộng hợp tác trong lĩnh vực năng lượng, khai thác, sử dụng và sản xuất năng
lượng với các quốc gia, tổ chức khu vực và trên thế giới.
Hiện tại, dầu mỏ, than đá và khí đốt vẫn là nguồn năng lượng chủ yếu, tác động
đến mọi sinh hoạt, đời sống nhân loại. Tuy nhiên, các nguồn tài nguyên này có nguy cơ
cạn kiệt trong 50 năm tới. Vì vậy, vấn đề nan giải và trong một vài thập niên tới là khả
năng phát hiện và đưa vào sử dụng các nguồn năng lượng mới của thế giới. Theo đánh
giá của nhiều chuyên gia, vẫn chỉ ở mức dự án tiền khả thi. Do vậy, sức ép về thiếu hụt
năng lượng lại tiếp tục gia tăng, dù có nhiều quan điểm lạc quan, nhưng vấn đề an ninh

năng lượng đối với nhân loại vẫn là vấn đề bất cập giống như thế kỉ trước, nếu không
muốn nói là còn căng thẳng ít nhất trong khoảng ¾ đầu thế kỉ XXI.Cuộc khủng hoảng
năng lượng vẫn tiếp tục được dự báo, thậm chí mang tính phức tạp hơn. Trong bối cảnh
4


Hoàng Thị Vui – CHK23 – Luận văn cao học – Chuyên ngành vi sinh vật học

đó, Việt Nam càng cần phải xây dựng một chiến lược hiệu quả về an ninh năng lượng
cho quốc gia đến 100 năm tới.
1.2. Một số nguồn năng lƣợng thay thế cho nhiên liệu hóa thạch
1.2.1. Năng lượng từ hệ thống pin nhiên liệu
Pin nhiên liệu là một thiết bị điện hoá mà trong đó biến đổi hoá năng thành điện
năng nhờ quá trình oxy hoá nhiên liệu, mà nhiên liệu thường dùng ở đây là khí H2 và
khí O2 hoặc không khí [13]. Quá trình biến đổi năng lượng trong pin nhiên liệu ở đây là
trực tiếp từ hoá năng sang điện năng nhờ có tác dụng của chất xúc tác, thường là các
màng platin nguyên chất hoặc hỗn hợp platin, hoặc các chất điện phân như kiềm, muối
cacbonat, oxit rắn ... theo phản ứng:
H2 + O2 = H2O + dòng điện

Hình 1.1: Nguyên lý hoạt động của pin nhiên liệu [13]
Người ta phân loại các pin nhiên liệu theo chất điện phân, điện cực và các chất
xúc tác trong pin nhưng nguồn nguyên liệu vẫn chỉ là H2 và O2/không khí. Trước đây,
H2 được dùng để biến đổi thành nhiệt năng dưới dạng đốt cháy, sau đó từ nhiệt năng sẽ
biến đổi thành cơ năng qua các tua bin khí và các tua bin đó dẫn động các máy phát
điện để biến đổi thành dòng điện. Với biến đổi gián tiếp như vậy thì hiệu suất của quá
trình sẽ thấp. Từ đó ta dễ dàng so sánh quá trình biến đổi trực tiếp trong pin nhiên liệu
là có hiệu suất rất cao [2].
5

Hoàng Thị Vui – CHK23 – Luận văn cao học – Chuyên ngành vi sinh vật học

1.2.2. Nguồn năng lượng mặt trời
Năng lượng Mặt Trời là năng lượng của dòng bức xạ điện từ xuất phát từ Mặt
Trời, cộng với một phần nhỏ năng lượng của các hạt hạ nguyên tử khác phóng ra từ
ngôi sao này. Năng lượng Mặt Trời là một nguồn năng lượng quan trọng điều khiển các
quá trình khí tượng học và duy trì sự sống trên Trái Đất dòng năng lượng này sẽ tiếp
tục phát ra cho đến khi phản ứng hạt nhân trên Mặt Trời hết nhiên liệu, vào khoảng 5 tỷ
năm nữa [13]
Năng lượng mặt trời có những ưu điểm tuyệt vời đó là sạch, chi phí nhiên liệu
và bảo dưỡng thấp, an toàn cho người sử dụng… Tuy nhiên vẫn có một số hạn chế như
chi phí sản xuất cao, diện tích lắp đặt các tấm năng lượng mặt trời, phụ thuộc hoàn toàn
vào yếu tố thời tiết,…
1.2.3. Nguồn năng lượng gió
Gió là sự di chuyển của các khối không khí từ nơi có áp suất cao đến nơi có áp
suất thấp, do đó đây đũng được coi là một nguồn năng lượng sạch và gần như vô tận.
Những vị trí địa lý có nguồn năng lượng gió lớn nhất là các cao nguyên vùng núi và
biển. Trên thế giới và ngay tại Việt Nam cũng đã có rất nhiều dự án sử dụng các
turbine gió để tạo ra năng lượng phục vụ cho đời sống con người
1.2.4. Năng lượng từ thủy triều
Năng lượng thủy triều của toàn thế giới theo các nhà khoa học ước chừng
khoảng 3 tỷ kw. Nguyên lý phát điện thủy triều tương tự như nguyên lý phát điện thủy
lực, tức là lợi dụng sự chênh lệch mức nước triều lên xuống để làm quay động cơ và
máy phát điện. Đây cũng được coi là một trong những nguồn năng lượng vô tận và
miễn phí [5].
1.2.5. Thủy điện
Người ta có thể khai thác sức mạnh dòng chảy của nước và chuyển động năng
và thế năng của dòng chảy thành điện năng. Dạng chuyển đổi năng lượng này gọi là
6

Hoàng Thị Vui – CHK23 – Luận văn cao học – Chuyên ngành vi sinh vật học

thủy điện. Ngày nay thủy điện đã trở thành nguồn năng lượng quan trọng thứ nhì sau
năng lượng hóa thạch. Hiện tại chiếm 20% nguồn điện năng của thế giới [5].
1.2.6. Một số nhiên liệu sinh học
Nhiên liệu sinh học là loại nhiên liệu được hình thành từ các hợp chất có nguồn
gốc động vật và thực vật, ví dụ như nhiên liệu chế xuất từ chất béo của động thực vật
(mỡ động vật, dầu dừa,…), ngũ cốc ( lúa mỳ, ngô, đậu tương,…), chất thải nông
nghiệp (rơm rạ, phân,…), phế phẩm công nghiệp (mùn cưa, sản phẩm gỗ thải,…)
Nhiên liệu sinh học có thể được phân loại thành các nhóm chính như sau:


Diesel sinh học (Biodiesel) là một loại nhiên liệu lỏng có tính năng tương tự và có
thể sử dụng thay thế cho loại dầu diesel truyền thống. Biodiesel được điều chế bằng
cách dẫn xuất từ một số loại dầu mỡ sinh học (dầu thực vật, mỡ động vật), thường
được thực hiện thông qua quá trình transester hóa bằng cách cho phản ứng với các
loại rượu phổ biến nhất là methanol.



Xăng sinh học (Biogasoline) là một loại nhiên liệu lỏng, trong đó có sử
dụng ethanol như là một loại phụ gia nhiên liệu pha trộn vào xăng thay phụ gia chì.
Ethanol được chế biến thông qua quá trình lên men các sản phẩm hữu cơ như tinh
bột, xen-lu-lô, lignocellulose. Ethanol được pha chế với tỷ lệ thích hợp với xăng tạo
thành xăng sinh học có thể thay thế hoàn toàn cho loại xăng sử dụng phụ gia chì
truyền thống.



Khí sinh học (Biogas) là một loại khí hữu cơ gồm Methane và các đồng đẳng khác.
Biogas được tạo ra sau quá trình ủ lên men các sinh khối hữu cơ phế thải nông
nghiệp, chủ yếu là cellulose, tạo thành sản phẩm ở dạng khí. Biogas có thể dùng
làm nhiên liệu khí thay cho sản phẩm khí gas từ sản phẩm dầu mỏ [30].
Trước kia, nhiên liệu sinh học hoàn toàn không được chú trọng. Hầu như đây chỉ là

một loại nhiên liệu thay thế phụ, tận dụng ở quy mô nhỏ. Tuy nhiên, sau khi xuất hiện

7


Hoàng Thị Vui – CHK23 – Luận văn cao học – Chuyên ngành vi sinh vật học

tình trạng khủng hoảng nhiên liệu ở quy mô toàn cầu cũng như ý thức bảo vệ môi
trường lên cao, nhiên liệu sinh học bắt đầu được chú ý phát triển ở quy mô lớn hơn do
có nhiều ưu điểm nổi bật so với các loại nhiên liệu truyền thống (dầu khí, than đá...):
 Thân thiện với môi trường: chúng có nguồn gốc từ thực vật, mà thực vật trong
quá trình sinh trưởng (quang hợp) lại sử dụng điôxít cácbon (là khí gây hiệu ứng
nhà kính - một hiệu ứng vật lý khiến Trái Đất nóng lên) nên được xem như
không góp phần làm trái đất nóng lên.
 Nguồn nhiên liệu tái sinh: các nhiên liệu này lấy từ hoạt động sản xuất nông
nghiệp và có thể tái sinh. Chúng giúp giảm sự lệ thuộc vào nguồn tài nguyên
nhiên liệu không tái sinh truyền thống.
Tuy vậy, việc sản xuất cồn sinh học từ các nguồn tinh bột hoặc các cây thực
phẩm được cho là không bền vững do ảnh hưởng tới an ninh lương thực. Khả năng sản
xuất với quy mô lớn cũng còn kém do nguồn cung cấp không ổn định vì phụ thuộc vào
thời tiết và nông nghiệp. Bên cạnh đó, giá thành sản xuất nhiên liệu sinh học vẫn cao
hơn nhiều so với nhiên liệu truyền thống từ đó việc ứng dụng và sử dụng nhiên liệu
sinh học vào đời sống chưa thể phổ biến rộng.

Tại Việt Nam, khí sinh học được áp dụng ở nhiều miền quê, bằng cách ủ phân
để lấy khí đốt. Trên thực tế, xăng sinh học E5 đã được lưu hành trên thị trường trong
nước từ năm 2010. Từ năm 2011, Việt Nam có chính sách sử dụng xăng sinh học E5
(gồm hàm lượng ethanol 5% và 95% xăng thông thường) làm nguyên liệu thay thế cho
xăng A92 truyền thống. Tuy nhiên, nhiều người còn lo ngại vì tính hút nước và dễ
bị oxy hóa của ethanol có thể làm hư hại buồng đốt nhiên liệu của động cơ.
Để giải đáp nghi ngại này thì một số chuyên gia cho rằng: Do ethanol có trị số
Octan cao tới 109 nên khi pha vào xăng sẽ làm tăng trị số Octane (tăng khả năng chống
kích nổ của nhiên liệu). Thêm vào đó, với hàm lượng ôxy cao hơn xăng thông dụng,
giúp quá trình cháy trong động cơ diễn ra triệt để hơn, tăng công suất, giảm tiêu hao
nhiên liệu, đồng thời giảm thiểu phát thải các chất độc hại trong khí thải động cơ. Vì
8


Hoàng Thị Vui – CHK23 – Luận văn cao học – Chuyên ngành vi sinh vật học

vậy, nhiên liệu xăng sinh học được coi là nhiên liệu của tương lai, được cả thế giới
quan tâm[30, 78].
1.3. Ứng dụng thực tiễn của nhiên liệu hydro
Ngoài nhiên liệu hóa thạch, hydo cũng là một nguồn nguyên liệu đầy tiềm năng
với nhiều ưu điểm thuận lợi về môi trường và kinh tế. Hydro là nguồn năng lượng
sạch, hoàn toàn không tạo ra khí gây ô nhiễm mà chỉ sinh ra hơi nước. Từ nước ta lại
có thể điện phân để thu hồi hydro. Vì vậy, hydro là nguồn năng lượng gần như vô tận
và có thể tái sinh được.
Hydro có thể trực tiếp được sử dụng làm nhiên liệu trong các động cơ đốt trong,
tương tự như trong các loại phương tiện giao thông chạy bằng xăng dầu hiện nay.
Hydro còn được dùng để cung cấp năng lượng cho các nhu cầu dân dụng hàng ngày
như đun nấu, sưởi ấm, chiếu sáng…
Ngoài ra, hydro còn có thể được sử dụng làm nguồn năng lượng cung cấp cho
hệ thống pin nhiên liệu, nhờ quá trình điện hóa để tái tạo điện năng. Pin nhiên liệu

không gây ô nhiễm môi trường mà còn đạt hiệu suất sử dụng cao hơn so với động cơ
đốt trong, vì thế mà tiết kiệm năng lượng hơn. Sử dụng pin nhiên liệu có thể cung cấp
dòng điện ở mọi nơi với mọi công suất lớn nhỏ mà không cần các nhà máy điện đồ sộ.
Do vậy, pin nhiên liệu hứa hẹn sẽ là nguồn nhiên liệu đầy triển vọng, là một thành
phần chủ chốt của nền kinh tếhydro trong tương lai [69].
1.4. Một số phƣơng pháp sản xuất hydro
Có ba phương pháp cơ bản để tạo ra hydro


Phương pháp chuyển hóa hydrocarbon (nhiên liệu hóa thạch, sinh khối)
bằng nhiệt.

 Phương pháp điện phân nước (Electrolysis)
 Phương pháp sinh học.
9


Hoàng Thị Vui – CHK23 – Luận văn cao học – Chuyên ngành vi sinh vật học

Hiện nay, khoảng 95% hydro thương mại được sản xuất bằng phương pháp hóa
nhiệt và điện phân nước. Tuy nhiên, phương pháp hóa nhiệt yêu cầu nhiệt độ và áp suất
cao rất tốn kém năng lượng, đồng thời lại gây ô nhiễm môi trường. Phương pháp điện
phân nước thì để tạo hydro thì khá dễ dàng nhưng hệ thống thiết bị lại rất đắt [25].
Phương pháp sinh học hiện nay đang được quan tâm và chú ý. Vi sinh vật có thể
tự hồi phục và tập trung năng lượng từ dung dịch hữu cơ như nước thải công nghiệp và
loại bùn có thể sử dụng được. Sản xuất biohydrogen là làm giảm quá trình entropy, cái
mà có thể không được nhận biết bằng máy móc hoặc hóa chất. Hơn nữa, công nghệ
sinh học hoàn toàn phù hợp cho việc sản xuất năng lượng tự do trong một quy mô nhỏ
được đặt tại nơi có sẵn sinh khối hoặc rác thải, do đó tránh được tiêu hao năng lượng
và chi phí cho phương tiện giao thông. Tuy nhiên sản xuất hydro theo phương pháp

sinh học hiện nay vẫn đang nằm trong giai đoạn nghiên cứu và đánh giá về mặt kỹ
thuật và kinh tế. Hydro được tạo thành từ quá trình lên men của vi sinh vật từ các hợp
chất hữu cơ ở điều kiện nhiệt độ và áp suất thông thường. Có thể nói, trên thế giới,
trong những năm gần đây công nghệ sản suất hydro nhờ quá trình lên men đã phát triển
nhanh chóng và trở thành công nghệ tiềm năng do nhu cầu về nguồn năng lượng bền
vững này [34].
Nghiên cứu sản xuất biohydrogen tập trung vào sự quang phân sinh học của
nước có chứa tảo và cyanobacteria, phân hủy quang học của hợp chất hữu cơ nhờ sự
quang hợp của vi khuẩn và lên men tối hợp chất hữu cơ trong môi trường kỵ khí. Trong
những quá trình sinh học này, quá trình lên men kỵ khí hydro dường như có triển vọng
hơn do hydro được sản xuất với tốc độ cao và nguồn cơ chất là các chất thải hữu cơ và
nước thải được bổ sung carbonhydrate nên chi phí sản xuất thấp. Những nghiên cứu
trong 2 thập kỷ trước đây cho thấy tiềm năng sản xuất hydro bằng phương pháp lên
men tối. Nó thật sự làm cải thiện và phát triển tốc độ sản xuất cả về sản lượng và thể
tích của lên men hydro. Ứng dụng thực tế cho thấy ý nghĩa kinh tế, sản lượng và tốc độ
sản xuất hydro ít nhất cũng hơn đáng kể so với kết quả hiện nay, đạt ngưỡng 4
10


Hoàng Thị Vui – CHK23 – Luận văn cao học – Chuyên ngành vi sinh vật học

molH2/mol glucose. Bước đột phá công nghệ nhằm mục đích thu hầu hết hydro từ cơ
chất, nếu không phải là tất cả [34, 77].
1.5. Phƣơng pháp lên men tối sản xuất hydro
Lên men tối là phương pháp lên men trong điều kiện kỵ khí hoặc thiếu oxy để
tạo ra hydro. Trong quá trình lên men tối, phân tử hydro thường được hình thành theo 2
hướng là nhờ sự có mặt của các enzyme đặc hiệu và nhờ các phản ứng phân giải axit
formic hoặc các phản ứng oxy hóa khử NADH(Phương trình 1 và 2).
NADH + H+ + 2Fd2+ → 2H+ + NAD+ + 2Fd+

(1)

2Fd + 2H+

(2)

hydrogenase 2Fd2+ + H2

Phản ứng đường phân hoặc thủy phân được ứng dụng để chuyển hóa glucose
thành pyruvate liên quan đến quá trình chuyển hóa NADH thành NAD + thông qua thủy
phân kỵ khí, được mô tả trong phương trình 3.
C6H12O6 + 2NAD+ → 2CH3COCOOH + 2NADH + 2H+(3)

Hydro được tạo thành thông qua phản ứng oxy hóa khử của NADH nhờ một vài
vi sinh vật đặc biệt dưới điều kiện acid có ferredoxin oxidoreductase và hydrogenase.
Con đường chuyển hóa này đã được ứng dụng với một số loài của Clostridium. Trong
điều kiện kỵ khí bắt buộc thì Clostridiathiếu hệ thống phân bào đặc trưng và thu năng
lượng bởi mức phosphoryl hóa cơ chất trong khi lên men. Oxy hóa carbonhydrate tạo
ra điện tích để duy trì điện trung tính [76]. Đối với saccharolytic Clostridia, hydro chủ
yếu được tạo ra nhờ hydrogenase, thông qua các tế bào có electron dư thừa từ phản ứng
oxy hóa carbonhydrate. Chức năng chính của enzyme khử NADH-ferredoxin là chất
mang điện tích và oxy hóa pyruvate tạo thành acetyl-CoA và carbondioxides cũng như
làm giảm proton phân tử H2. Clostridia phá vỡ acetyl-CoA để sản xuất 2 mol NADH
và 2 mol ferredoxin [34].

11


Hoàng Thị Vui – CHK23 – Luận văn cao học – Chuyên ngành vi sinh vật học

Hình 1.2: Sơ đồ lên men của Clostridium. Con đƣờng dẫn tới sản lƣợng tối đa theo
lý thuyết là 4 mol H2/ mol glucose khi toàn bộ cơ chất chuyển hóa thành axit acetic
theo đƣờng màu đỏ [34]
Trong điều kiện kỵ khí Clostridia,formate không phải là thành phần chính trong
sự phân giải pyruvate, mặc dù sinh vật có chứa formate dehydrogenase. Ngược lại, các
vi khuẩn kỵ khí tùy tiện đặc biệt là Enterobacteriacease có thể chuyển hóa pyruvate
thành axit formic và các sản phẩm khác trong quá trình lên men axit formic. Với loài
Clostridia thì phải loại bỏ hết chất khử dư thừa trong quá trình lên men, và được thực
hiện ở giai đoạn cuối cùng. Đầu tiên pyruvate được chuyển hóa thành axit formic bằng
pyruvate-formate lyase với sản lượng của acetyl-CoA, và năng lượng được bảo toàn do
ATP được hình thành nhờ acetyl-phosphate. Trong điều kiện kỵ khí và không có các
12


Hoàng Thị Vui – CHK23 – Luận văn cao học – Chuyên ngành vi sinh vật học

electron thích hợp, axit formic sẽ tiếp tục phân hủy thành hydro và carbon dioxide nhờ
formic hydrogelyase.
CH3COCOOH + H CoA → CH3COCoA + HCOOH
HCOOH → H2 + CO2

(4)
(5)

Cần lưu ý rằng, NADH được tạo ra trong quá trình đường phân rất hiếm khi sử
dụng để sản xuất hydro bằng các vi khuẩn thuộc ngành Enterobacteriacease, do thiếu
các coenzyme đặc hiệu như ferredoxin oxireductase. Tuy nhiên, NADH vẫn phải oxy
hóa thành NAD+ và đường phân kỵ khí sẽ chấm dứt. Nhiều vi sinh vật giải quyết vấn
đề này bằng cách làm chậm hoặc ngừng hoạt động của pyruvate dehydrogenase và sử
dụng pyruvate hoặc một trong các dẫn xuất của nó làm electron tà tiếp nhận hydro để

tái oxi hóa trong quá trình lên men. Kết quả là phản ứng oxy hóa khử được cân bằng
thông qua việc sử dụng NADH để tạo thành một lượng lớn hỗn hợp gồm các axit và
cồn. Hầu hết các sản phẩm chứa ít hydro thường đi kèm với sự hình thành formate.
1.6. Khả năng sinh hydro của các loài Clostridium
1.6.1. Tổng quan về loài Clostridium sp.

Hình 1.3: Ảnh hiển vi điện tử C. beijerinckii NCIMB 8052 (Lou Ann Miller and
Scott Robinson, University of Illinois)
 Phân loại: Chi Clostridium thuộc [24]:

13


Hoàng Thị Vui – CHK23 – Luận văn cao học – Chuyên ngành vi sinh vật học

Giới: Vi khuẩn
Nghành: Firmcutes
Lớp: Clostridia
Bộ: Clostridiales
Họ: Clostridiaceae
Chi Clostridium hiện đang có khoảng 203 loài và 5 phân loài.Dựa vào những
nghiên cứu về trình 16s rRNA, trong số các loài này, 21 loài đã được phân loại chi
khác và 5 loài khác đã được phân loại vào chi.
Bảng 1.1: Một số loài thuộc chi Clostridium

14


Hoàng Thị Vui – CHK23 – Luận văn cao học – Chuyên ngành vi sinh vật học

 Đặc điểm:
Vi khuẩn Gram dương nhưng có thể biến thành Gram âm vào giai đoạn già, có
vách murein dày, tỷ lệ G + C thấp, hình que, kị khí nghiêm ngặt, ưa ấm, hầu hết có khả
năng hình thành bào tử trong điều kiện bất lợi. Thường phân bố trong đất, phân và
đường ruột của người và động vật [24]. Tuy nhiên theo một số kết quả nghiên cứu gần
đây chi Clostridium cũng có cả những loài Gram âm và có những loài có thể chịu được
điều kiện có oxy [28].
- Tế bào sinh dưỡng hình que, trong giai đoạn tăng trưởng theo cấp số nhân, kích thước
tế bào thường từ 0.5-1.8 nm. Bào tử có kích thước lớn hơn chiều ngang của tế bào sinh
dưỡng nên khi mang bào tử, tế bào sẽ có dạng hình thoi hay dùi trống [66].
- Một số loại chứa độc tố có khả năng gây bệnh. Một số có khả năng cố định nitơ
như Clostridium butyricum.
1.6.2. Khả năng sinh hydro của một số loài Clostridium sp.
Trong số các vi khuẩn lên men yếm khí, Clostridia được biết đến nhiều nhất và
được nghiên cứu rộng rãi bởi chúng có khả năng sử dụng nhiều loại cơ chất
carbohydrate như xylose, arabinose, galactose, cellobiose, sucrose và fructose với hiệu
suất và sản lượng hydro cao. Ngoài ra chúng còn được biết đến với khả năng sinh
hydro trong quá trình lên men tối [41].
Bảng 1.2 : Khả năng sản xuất hydro từ một số chủng vi sinh vật
Điều kiện nuôi cấy

Sản lƣợng
Tham
Hydro
khảo
Nhiệtđộ Cơ chất
(mol/mol
0
C
cơ chất)

Phƣơng
thức nuôi
cấy

pH

Clostridiumsp. no 2

Liên tục

6,5

36

Glucose

2,4

[83]

C.paraputrificum M-21

Theo mẻ
(batch)

Không
điều chỉnh

37

Glucose

2,4

[35]

Vi sinh vật
Kị khí nghiêm ngặt

15