Nghiên cứu bào chế liposome amphotericin b bằng phương pháp bốc hơi pha đảo

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGÔ THỊ BÍCH PHƯỢNG

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ LIPOSOME
AMPHOTERICIN B BẰNG PHƯƠNG
PHÁP BỐC HƠI PHA ĐẢO
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2013


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGÔ THỊ BÍCH PHƯỢNG

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ LIPOSOME
AMPHOTERICIN B BẰNG PHƯƠNG
PHÁP BỐC HƠI PHA ĐẢO
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. TS. Trần Thị Hải Yến
2. DS. Đào Thị Thùy Dung
Nơi thực hiện:
Bộ môn Bào chế
Trường Đại học Dược Hà Nội

HÀ NỘI – 2013

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới:
TS. Trần Thị Hải Yến
DS. Đào Thị Thùy Dung
Là những người thầy đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn
thành khóa luận tốt nghiệp này.
Tôi cũng xin chân trọng cảm ơn PGS. TS. Phạm Thị Minh Huệ về những
chỉ bảo và định hướng của cô cho đề tài.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên bộ
môn Bào chế - Trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều kiện để tôi
hoàn thành khóa luận này.
Nhân đây, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn các thầy cô trong ban giám hiệu, các
phòng ban và cán bộ nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã dạy
bảo tôi trong suốt 5 năm học tập tại trường.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè những người đã giúp
đỡ, động viên tôi trong quá trình học tập và làm khóa luận.
Hà Nội, tháng 5 năm 2013
Sinh viên
Ngô Thị Bích Phượng


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ...........................................................................................................1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN.....................................................................................2
2.1.Đối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu, phương tiện nghiên cứu................17
2.3.Phương pháp nghiên cứu............................................................................18
2.3.2.Phương pháp bào chế liposome AMB...............................................18
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN................................24
3.1.Thẩm định phương pháp định lượng AMB.................................................24

3.1.1.Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc kí.....................................24
3.1.2.Độ đặc hiệu..........................................................................................24
3.1.3.Tính tuyến tính...................................................................................25
3.1.4.Độ lặp lại.............................................................................................26
3.1.5.Giới hạn phát hiện..............................................................................26
3.3.1.Bố trí thí nghiệm.................................................................................27
3.3.2.Đánh giá một số đặc tính của liposome AMB...................................28
3.3.2.1.Hình thức, hình thái, phân bố KTTP của liposome AMB...........28
3.3.2.2.Hiệu suất liposome hóa.................................................................31
3.3.2.3.Tính ổn định của liposome AMB..................................................33
3.4.Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ dược chất trong công thức đến đặc tính của
liposome...........................................................................................................36
3.5.Bàn luận......................................................................................................38
3.5.1.Về phương pháp định lượng AMB....................................................38
3.5.2.Về phương pháp bào chế....................................................................38
3.5.3.Về phương pháp đánh giá hiệu suất liposome hóa...........................39
3.5.4.Về xây dựng công thức.......................................................................40
3.5.5.Về độ ổn định của liposome AMB.....................................................41
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
TT
1
2
3
4
5
6

7
8
9
10

Viết tắt
AMB
Chol
DĐVN
DMPC
DMPG
DSC
DSPC
DSPG
EDTA
HPLC

Từ/ cụm từ đầy đủ
Amphotericin B
Cholesterol
Dược điển Việt Nam
α-Dimyristoylphosphatidylcholin
l-α-Dimyristoylphosphatidylglycerol
Phân tích nhiệt vi sai (Differential scanning calorimetry)
Distearoylphophatidylcholin
Distearoylphosphatidylglycerol
Ethylendiamin tetraacetic acid
Sắc kí lỏng hiệu năng cao (high performance liquid
chromatography)

11

HSPC

Phosphatidylcholin đậu nành hydrogen hóa (Hydrogenated soy

12

IC50

phosphatidylcholine)
Nồng độ thuốc ức chế 50% đối tượng thử (50 % inhibitory

13
14
15
16
17

KTTP
N/D
NSX
PDI
RBCPR

concentrations)
Kích thước tiểu phân
Nước/dầu
Nhà sản xuất

Chỉ số đa phân tán (Polydispersity index)
Chỉ số giải phóng kali ra khỏi tế bào hồng cầu (red blood cell

SPC
TEM

potassium release)
Phosphatidylcholin đậu nành (Soy phosphatidylcholine)
Kinh hiển vi điện tử truyền qua (Transmission electron

TKHH
USP

microscope)
Tinh khiết hóa học
United state Pharmacopoeia (Dược điển Mỹ)

18
19
20
21

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
Số hiệu
Bảng 1.1
Bảng 2.1
Bảng 3.1
Bảng 3.2
Bảng 3.3
Bảng 3.4

Bảng 3.5

Tên bảng biểu
Một số chế phẩm tiêm của AMB trên thị trường
Nguyên liệu
Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc kí
Mối tương quan giữa nồng độ AMB và diện tích peak
Kết quả khảo sát tính lặp lại của hệ thống sắc kí
Thành phần các công thức bào chế liposome AMB
KTTP và phân bố KTTP của các mẫu liposome AMB

Trang
4
17
24
25
27
28
29

Bảng 3.6
Bảng 3.7

Hiệu suất liposome hóa của các mẫu liposome AMB
KTTP, phân bố KTTP và hiệu suất liposome hóa của các

32
34

Bảng 3.8

Bảng 3.9

mẫu sau 1 tuần bảo quản
Thành phần công thức của mẫu liposome A553 và A554
Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ dược chất trong

37
37

công thức đến các đặc tính của liposome AMB


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Số hiệu
Hình 1.1
Hình 1.2

Tên hình vẽ, đồ thị
Cấu trúc của liposome
Dạng tồn tại của các chất lưỡng tính khi phân tán trong môi

Trang
5
6

Hình 1.3
Hình 1.4
Hình 1.5

trường nước

Cấu trúc của phospholipid ở dưới và trên nhiệt độ chuyển pha
Cơ chế hình thành liposome bằng phương pháp bốc hơi pha đảo
Cơ chế giảm KTTP liposome bằng phương pháp đùn ép

7
11
16

Hình 2.1

(extrusion)
Sơ đồ tóm tắt các giai đoạn của quy trình bào chế liposome

20

Hình 3.1

AMB
Đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa nồng độ AMB và diện tích

26

Hình 3.2
Hình 3.3
Hình 3.4

peak
Hỗn dịch liposome AMB sau khi bào chế
Đồ thị biểu diễn KTTP của các mẫu liposome AMB
Đồ thị biểu diễn KTTP, phân bố KTTP của các mẫu liposome

29
30
30

Hình 3.5

nhóm A
Đồ thị biểu diễn KTTP, phân bố KTTP của các mẫu liposome

30

Hình 3.6
Hình 3.7

nhóm B
Đồ thị biểu diễn hiệu suất liposome hóa của các mẫu liposome
Đồ thị biểu diễn sự thay đổi KTTP của các mẫu liposome sau 1

33
35

Hình 3.8

tuần bảo quản
Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hiệu suất liposome hóa của các

36

Hình 3.9

mẫu liposome sau 1 tuần bảo quản
Đồ thị biểu diễn KTTP và phân bố KTTP của các mẫu có tỷ lệ

38

% mol dược chất/tổng lượng lipid khác nhau
Hình 3.10 Đồ thị biểu diễn hiệu suất liposome hóa của các mẫu có tỷ lệ %

38

mol dược chất/tổng lượng lipid khác nhau


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Ngày nay, cùng với sự phát triển của khoa học và công nghệ, ngày càng có
nhiều dạng thuốc mới ra đời với những tính năng vượt trội hơn so với các dạng
thuốc quy ước. Trong đó, liposome được đánh giá là một hệ vận chuyển thuốc có
tính tương hợp sinh học cao, có khả năng vận chuyển thuốc hướng đích tách dụng,
tăng sinh khả dụng và giảm độc tính của thuốc. Đây được coi là một hướng nghiên
cứu mới trong lĩnh vực công nghệ dược phẩm và đang được đầu tư nghiên cứu rất
nhiều ở các nước trên thế giới và ở Việt Nam.
Amphotericin B là một dược chất thân dầu, có tác dụng kháng nấm, được chỉ
định trong trường hợp nhiễm nấm nặng toàn thân do hoạt tính kháng nấm mạnh và
phổ tác dụng rộng. Tuy nhiên, thuốc có độc tính cao do tính chọn lọc giữa tế bào
nấm và tế bào cơ thể người thấp, vì vậy việc sử dụng còn hạn chế. Đã có rất nhiều
hướng nghiên cứu nhằm giảm độc tính của thuốc, trong đó sử dụng liposome làm
chất mang đang là một hướng đi đầy triển vọng.

Để góp phần ứng dụng liposome làm chất mang làm giảm độc tính của
thuốc, đề tài “Nghiên cứu bào chế liposome amphotericin B bằng phương pháp
bốc hơi pha đảo” nhằm mục tiêu:
+ Bào chế được liposome amphotericin B bằng phương pháp bốc hơi pha đảo.
+ Đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố thuộc về công thức bào chế đến đặc tính
của liposome amphotericin B.


2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Amphotericin B
1.1.1. Công thức hóa học

Công thức phân tử: C47H73NO17.
Khối lượng phân tử: 924,08.
pKa: 5,5; 10 .
1.1.2. Đặc tính lý hóa
• Lý tính:
- Bột kết tinh màu vàng hoặc vàng da cam.
- Độ tan: không tan trong nước ở pH từ 6 đến 7, tan trong dimethylsulphoxid (30 –
40 mg/ml) và propylene glycol, khó tan trong dimethylformamid (2 – 4 mg/ml),
rất khó tan trong methanol .
• Hóa tính: Hóa tính chính của AMB là của hệ dây nối đôi luân phiên, nhóm amin
và nhóm carboxylic tự do, do đó AMB có tính chất sau:
- Tính lưỡng tính.
- Tạo muối hơi tan trong nước khi tác dụng với acid hydrochloric hoặc các dung
dịch kiềm.
- Dung dịch 0,0005 % trong methanol ở vùng sóng từ 300-450 nm có 3 cực đại
hấp thụ ở 362, 381 và 405 nm. Tỷ lệ độ hấp thụ ở 362 nm so với 381 nm là 0,570,61, tỷ lệ độ hấp thụ ở 381 nm so với 405 nm là 0,87-0,93 .

1.1.3. Tác dụng dược lý
- AMB là kháng sinh chống nấm nhờ gắn vào sterol (chủ yếu là ergosterol) ở màng
tế bào nấm làm thay đổi tính thấm của màng tế bào và làm giải phóng các thành


3

phần bên trong ra ngoài môi trường. AMB cũng gắn vào sterol bào chất ở người
(cholesterol) gây độc tính cho cơ thể.
- AMB có tác dụng kìm nấm đối với một số loại nấm như: Absidia spp,
Aspergillus spp, Basidiobolus spp, Blastomyces dermatitidis, Candida spp... Nồng
độ ức chế tối thiểu đối với các loại nấm này là 0,03 – 1 mcg/ml.
- Thuốc không có tác dụng đối với virus, vi khuẩn và ricketsia .
1.1.4. Dược động học
- AMB hấp thu rất kém qua đường tiêu hóa, chủ yếu dùng đường tiêm truyền tĩnh
mạch để điều trị nhiễm nấm nặng toàn thân, chỉ dùng đường uống để điều trị
nhiễm nấm đường tiêu hóa và niêm mạc miệng.
- AMB liên kết với protein ở mức cao. Thuốc phân bố rộng rãi trong cơ thể.
- AMB bài tiết rất chậm qua thận, 2-5 % liều dùng bài tiết dưới dạng hoạt tính sinh
học. AMB có nguy cơ gây độc cao với thận, không loại được thuốc ra khỏi cơ thể
bằng thẩm tách máu .
1.1.5. Chỉ định
- Thuốc uống (viên, hỗn dịch) dùng tại chỗ để điều trị nhiễm nấm Candida
albicans ở miệng và đường tiêu hóa.
- Tiêm tĩnh mạch AMB dùng điều trị nhiễm nấm toàn thân nặng do nhiễm
Aspergillus,

Blastomyces,

Candida,

Coccidioidesimmitis,

Cryptococcus,

Histoplasma, Mucor, Paracoccidioides và Sporotrichum.
- Phòng nhiễm nấm cho bệnh nhân sốt kéo dài và giảm bạch cầu trung tính đã điều
trị lâu bằng kháng sinh phổ rộng hoặc sau điều trị ung thư bằng hóa chất.
- Dạng liposome hoặc phức hợp lipid: chỉ định cho trường hợp điều trị thất bại
bằng AMB thông thường hoặc trường hợp AMB có thể gây độc cho thận hoặc
gây suy thận .
1.1.6. Tác dụng không mong muốn
- Phản ứng chung: sốt, rét run, đau đầu, đau cơ khi mới tiêm truyền.
- Độc với thận: giảm sức lọc cầu thận, hoại tử thận.
- Tác dụng không mong muốn khác: thiếu máu, độc với gan, tim, giảm K + và
Mg2+ huyết… .
1.1.7. Liều dùng
Đường tiêm tĩnh mạch:


4

-

AMB thông thường: bắt đầu với liều 0,25 mg/kg/ngày, tăng dần tới tối đa 1
mg/kg/ngày, trường hợp nặng, liều có thể cần tới 1,5 mg/kg/ngày hoặc cho cách

-

1 ngày.

AMB dạng liposome: bắt đầu với liều 1 mg/kg/ngày, tăng dần tới 3-4

-

mg/kg/ngày.
Dạng phức hợp phospholipid: thường dùng với liều 5 mg/kg/ngày.

Đường uống:
-

Viên 10 mg hoặc hỗn dịch chứa 100 mg/ml.

+ Nhiễm nấm Candida ở miệng: hỗn dịch dùng 1ml/lần ×4 lần/ngày, giữ thuốc trong
miệng ít nhất 1 phút trước khi nuốt, viên tan trong miệng dùng 4 lần/ngày.
+ Nhiễm nấm Candida ở ruột: 100 – 200 mg/ngày, 4 lần/ngày .
1.1.8. Một số chế phẩm tiêm của AMB trên thị trường
Bảng 1.1. Một số chế phẩm tiêm của AMB trên thị trường
T

Tên chế

Hàm

T
1

phẩm
Fungizone

2

Abelcet

3

4

Amphotec

Ambisome

Thành phần

Dạng cấu

Dạng bào

lượng
50 mg

phức hợp AMB với natri

trúc
micel

chế
bột đông

100mg/
20ml

deoxycholat
DMPC:DMPG:AMB
(tỷ lệ mol 7:3:10)

phức hợp

khô
hỗn dịch

50 mg,

phức hợp AMB với

lipid
phức hợp

bột đông

100 mg

cholesteryl sulfate
(tỷ lệ mol 1:1)
HSPC:DSPG:Chol:AMB

lipid

khô

liposome

bột đông

50 mg

(tỷ lệ mol 2:0,8:1:0,4)

khô

1.2. Liposome
1.2.1. Khái niệm
Liposome là dạng đặc biệt của vi nang và siêu vi nang, gồm một nhân nước ở
giữa được bao bọc bởi một vỏ phospholipid gồm một hay nhiều lớp đồng tâm, có
kích thước thay đổi từ hàng chục nanomet đến hàng chục micromet .


5

Hình 1.1. Cấu trúc của liposome
1.2.2. Thành phần
Phospholipid
Là thành phần cơ bản cấu tạo nên tiểu phân liposome, là những phân tử
lưỡng tính vừa thân dầu vừa thân nước, cấu tạo từ khung phân tử glycerol gắn với
các nhóm phân cực và các acid béo. Nhóm phân cực có thể tích điện dương, âm
hoặc không tích điện, các acid béo có thể no hoặc không no. Các phospholipid có
khả năng tự đóng vòng để tạo thành liposome khi chúng được trộn lẫn với môi
trường nước, đầu phân cực sẽ hướng ra ngoài tương tác với môi trường nước, chuỗi
acid béo sẽ quay vào trong, tạo ra lớp lipid kép . Các phospholid này có chỉ số
packing parameter (PP) xấp xỉ 1, trong khi các chất diện hoạt khác có chỉ số PP >>1
hoặc <<1 chỉ có khả năng tạo thành dạng cấu trúc micel hoặc micel đảo khi phân

tán trong môi trường nước :
Packing parameter =
Trong đó:
V: là thể tích chiếm chỗ của nhóm thân dầu.
a: là diện tích bề mặt bao quanh nhóm thân nước tại bề mặt phân cách pha
giữa nước và không khí.


6

Lc: là chiều dài của nhóm thân dầu.

Hình 1.2. Dạng tồn tại của các chất diện hoạt khi phân tán trong môi trường
nước
Lớp màng lipip kép được tạo thành khi tăng nhiệt độ lên trên nhiệt độ chuyển
pha Tc của lipip, là nhiệt độ mà tại đó phân tử lipid chuyển từ trạng thái gel sang
trạng thái tinh thể lỏng (liquid crystalline). T c của lipid phụ thuộc vào chiều dài và
mức độ no của chuỗi acid béo cũng như đặc điểm của nhóm phân cực. Lớp lipid
kép trở nên linh động và dễ thấm tại và trên T c làm giải phóng các thành phần bên
trong ra ngoài môi trường . Liposome sử dụng trong điều trị cần ổn định trong điều
kiện sinh lí, do đó nên sử dụng các phospholipid có Tc > 37 ºC .
Cholesterol
Cholesterol và các dẫn chất được sử dụng trong bào chế liposome với vai trò
làm tăng tính cứng và giảm tính thấm của lớp màng lipip đối với các chất mang .
Màng phospholipid kép tồn tại ở 2 trạng thái: trạng thái gel và trạng thái tinh
thể lỏng. Ở trạng thái gel, mạch hydrocacbon ở dạng cấu hình trans (hình 1.3), diện
tích không gian giữa các phân tử phospholipid nhỏ nhất, độ dày của màng lipid kép
cao nhất, chuyển động quay của phân tử hạn chế ở mức tối đa. Ở trạng thái tinh thể

7

lỏng, mạch hydrocacbon ở dạng cấu hình gauche (hình 1.3), diện tích không gian
giữa các phân tử lớn hơn, màng lipid kép lỏng lẻo hơn, chuyển động quay nội phân
tử và giữa các phân tử diễn ra mạnh hơn. Quá trình chuyển trạng thái của lớp màng
lipid khi không có cholesterol diễn ra trong khoảng nhiệt độ hẹp. Sự có mặt của
cholesterol làm nới rộng khoảng chuyển pha, giảm enthalpy chuyển pha, giảm diện
tích không gian giữa các phân tử, giảm chuyển động quay của các hydrocacbon, làm
cho các phân tử phospholipid sắp xếp một cách có trật tự và tạo thành một lớp màng
lipid kép cứng chắc hơn .

Hình 1.3. Cấu trúc của phospholipid ở dưới và trên nhiệt độ chuyển pha
Cholesterol còn giúp làm tăng tính ổn định của liposome trong các dịch sinh
học như huyết tương. Liposome không chứa cholesterol sẽ tương tác nhanh với các
protein trong huyết tương như albumin, transferin, macrogloburin. Các protein này
có xu hướng lôi các phân tử phospholipid ra khỏi cấu trúc màng lipid, làm phá vỡ
lớp màng kép. Sự có mặt của cholesterol làm giảm tương tác này .
Ngoài phospholipid và cholesterol, các chất diện hoạt, các chất tích điện cho
lớp màng lipid… cũng được sử dụng trong bào chế liposome.
1.2.3. Ưu nhược điểm
1.2.3.1. Ưu điểm
Liposome có thành phần cấu tạo và tính chất lí hóa tương tự màng sinh học
như tính thấm, tính đẳng trương... Do đó đây được coi là hệ vận chuyển thuốc có
tính tương hợp sinh học cao .


8

Do đặc điểm cấu trúc mà liposome có thể mang được cả dược chất thân dầu
và thân nước. Dược chất thân nước được bao trong nhân nước, còn dược chất thân

dầu được gắn kết trên lớp màng lipid kép .
Dược chất được bảo vệ khỏi tác động của các yếu tố bất lợi bên ngoài môi
trường, do đó hạn chế được tác động bất lợi của đường dùng thuốc đến tác dụng của
thuốc, như ảnh hưởng của các enzym phân hủy thuốc .
Giảm độc tính của thuốc, ví dụ như: ở dạng bào chế liposome, AMB liên kết
bền chặt với lớp màng lipid do tạo thành phức hợp AMB – chol, làm giảm khả năng
liên kết với chol trên màng tế bào người dẫn đến giảm độc tính của thuốc. Chỉ khi
thuốc phân bố đến các tổ chức viêm nhiễm do ái lực của AMB với ergosterol cao
hơn với chol làm giải phóng AMB ra khỏi lớp màng lipid, hình thành phức hợp
AMB - ergosterol trên màng tế bào nấm và phát huy tác dụng của thuốc .
Liposome cho phép vận chuyển thuốc tới tế bào đích thậm chí là đến các tổ
chức bên trong tế bào đích bằng cách gắn thêm các ligand trên màng liposome, do
đó làm thay đổi chỉ số điều trị của thuốc , .
1.2.3.2. Nhược điểm
Mặc dù có rất nhiều ưu điểm nhưng hiện liposome vẫn chưa được sử dụng
rộng rãi do có một số nhược điểm sau:
Chất lượng nguyên liệu: các phospholipid sử dụng đa số được tách chiết từ
nguồn nguyên liệu tự nhiên, do đó rất khó kiểm soát mức độ tinh khiết của nguyên
liệu. Phospholipid có thể lẫn các lysophospholipid hoặc các sản phẩm của quá trình
oxy hóa phospholipid .
Đa số các phương pháp bào chế liposome đều sử dụng dung môi hữu cơ để
hòa tan lipid gây tác động bất lợi đến sức khỏe nguời sử dụng cũng như môi
trường .
Độ ổn định thấp: liposome kém ổn định cả về mặt vật lí và hóa học .
Hầu hết các phương pháp bào chế liposome chỉ thích hợp ở quy mô phòng
thí nghiệm, rất khó để sản xuất ở quy mô lớn .


9

Hiện vẫn chưa có thông tin đầy đủ về mức độ an toàn của các chế phẩm
liposome. Ví dụ như: hội chứng tay chân (“hand and foot” syndrome) không xuất
hiện khi sử dụng doxorubicin dạng tự do nhưng lại được tìm thấy khi sử dụng
liposome doxorubicin tuần hoàn kéo dài .
1.2.4. Độ ổn định
Liposome được coi là dạng bào chế kém ổn định cả về mặt vật lí, hóa học và
sinh học. Sự thay đổi đặc tính lí hóa của liposome có thể xảy ra ngay trong quá trình
bào chế cũng như trong quá trình bảo quản.
Về mặt hóa học: sự kém ổn định về mặt hóa học của liposome là do quá trình
oxy hóa chuỗi acid béo không no của phân tử phospholipid và quá trình thủy phân
liên kết ester của phospholipid tạo ra các lysophospholid. Có thể dùng các kĩ thuật
sắc kí khác nhau để đánh giá mức độ tinh khiết, định tính, định lượng lipid trong
liposome .
Về mặt vật lí: sự thay đổi đặc tính vật lí của liposome do quá trình thấm
thuốc qua màng và do sự có mặt của các thành phần tích điện trên bề mặt gây ra
hiện tượng kết tụ tiểu phân trong quá trình bảo quản. Trạng thái vật lí của liposome
có thể được đánh giá thông qua các chỉ số: kích thước tiểu phân và thế Zeta . Thế
Zeta cho biết mức độ tích điện trên bề mặt tiểu phân liposome. Nếu tiểu phân tích
điện lớn thì lực đẩy tĩnh điện mạnh, các tiểu phân cách xa nhau và hạn chế quá trình
kết tụ tiểu phân. Sự tích điện càng gần không thì chuyển động Brown càng nhanh
làm cho các tiểu phân va chạm và kết tập, hệ keo kém ổn định .
Kĩ thuật đông khô được sử dụng để tăng độ ổn định của liposome trong quá
trình bảo quản. Một mặt, quá trình này giúp loại nước khỏi hỗn dịch liposome làm
giảm quá trình thủy phân phospholipid, mặt khác nó làm chậm quá trình biến đổi
vật lí và hóa học của dạng bào chế do sản phẩm tồn tại ở trạng thái rắn bền vững
hơn . Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng quá trình đông khô không ảnh hưởng đến
hiệu quả điều trị của thuốc .
1.3. Bào chế liposome bằng phương pháp bốc hơi pha đảo
1.3.1. Tạo liposome thô

10

Liposome được tạo ra bằng phương pháp bốc hơi pha đảo nhờ quá trình
trung gian tạo micel đảo. Phospholipid, cholesterol và các chất tan trong dầu được
hòa tan bằng dung môi hữu cơ thích hợp, sau đó đem cất quay để loại bỏ dung môi.
Hòa tan trở lại hỗn hợp các thành phần bằng một dung môi không hỗn hòa với
nước. Để tạo micel đảo, thêm pha nước và siêu âm trong khoảng thời gian thích hợp
cho đến khi tạo thành hệ phân tán một pha đồng nhất. Các micel đảo có cấu trúc
gồm lớp phospholipid đơn lớp bao quang nhân nước. Bốc hơi từ từ dưới áp suất
giảm để loại dung môi hữu cơ, khi đó các micel sát nhập vào nhau, hệ chuyển sang
trạng thái gel. Tiếp tục quá tình bốc hơi dung môi, khi đạt tới điểm giới hạn, trạng
thái gel bị bẻ gẫy, các micel bị phá vỡ và phospholipid tái sắp xếp tạo cấu trúc lipid
kép và hình thành liposome.
Pha dầu có thể sử dụng các loại dung môi khác nhau như: diethyl ether,
isopropyl ether, halothane hoặc trifloro tricloro ethane để hòa tan các phospholipid.
Trường hợp phospholipid có độ tan thấp trong các dung môi trên, có thể thêm một
tỷ lệ nhỏ chloroform hoặc methanol để tăng độ tan. Nồng độ phospholipid sử dụng
thường từ 10 – 100 mmol/ml hỗn dịch sản phẩm. Khi sử dụng nồng độ lipid thấp
hoặc hỗn hợp lipid không chứa cholesterol thì quá trình tạo trạng thái gel và bẻ gẫy
các micel đảo để hình thành liposome sẽ không xảy ra.


11

Hình 1.4. Cơ chế hình thành liposome bằng phương pháp bốc hơi pha đảo
Ưu điểm của phương pháp này là tạo ra các tiểu phân liposome chứa 1 thể
tích khoang nước lớn và do đó tăng hiệu suất gắn thuốc đối với các dược chất tan
trong nước. Phương pháp này rất phù hợp để bào chế các tiểu phân liposome mang
các chất có cấu trúc phân tử cồng kềnh, kích thước lớn như albumin, các

phosphatase kiềm, ferritin. Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp là tạo ra các
liposome có kích thước lớn, không đồng nhất và có sự phơi nhiễm với dung môi
hữu cơ .
1.3.2. Giảm kích thước tiểu phân liposome
Mục đích của quá trình này là tạo ra liposome có kích thước nhỏ và phân bố
kích thước hẹp, điều này giúp tăng độ ổn định về mặt vật lí, cải thiện hình thức cho
chế phẩm, đồng thời cho phép lọc loại khuẩn liposome và sử dụng liposome bằng
đường tiêm tĩnh mạch .
Hơn nữa, KTTP là một trong những yếu tố quyết định tỷ lệ liposome bị bắt
giữ bởi hệ thống đại thực bào (RES), quá trình opsonin hóa liposome có kích thước
nhỏ (< 100 nm) diễn ra chậm hơn các liposome có kích thước lớn (> 100 nm). Các
liposome có kích thước nhỏ có thể dễ dàng đi qua các khe kẽ trên màng tế bào vào


12

trong bào tương và phát huy tác dụng tại tế bào đích. Như vậy, KTTP ảnh hưởng tới
hiệu quả điều trị của dạng thuốc .
Hai phương pháp chính hay được sử dụng để làm giảm KTTP là siêu âm
(sonication) và đùn ép qua màng (extrution):
Với phương pháp siêu âm, liposome được làm nhỏ nhờ năng lượng của sóng
siêu âm, thu được các tiểu phân kích thước nhỏ và tương đối đồng nhất. Nhược
điểm của phương pháp: gây hiện tượng tăng nhiệt cục bộ trong quá trình siêu âm và
giải phóng kim loại ở đầu que siêu âm (titan) vào sản phẩm. So với phương pháp
đùn ép, phương pháp siêu âm tiến hành trong thời gian ngắn hơn nhưng không có sự
đồng nhất giữa các lô mẻ , .
Với phương pháp đùn ép, hỗn dịch liposome được đùn ép qua màng
polycarbonat có kích thước lỗ màng xác định, thu được hỗn dịch liposome đơn lớp,
kích thước gần với kích thước của lỗ màng. Nguyên lí của phương pháp được mô tả
như sau: hỗn dịch liposome được đùn qua màng có các lỗ màng hình trụ, sắp xếp

đồng trục, kích thước xác định, ở áp suất vừa phải, nhiệt độ trên nhiệt độ chuyển
pha Tc của phospholipid và với số lần thích hợp. Khi đó các tiểu phân có kích thước
lớn hơn kích thích lỗ màng sẽ được làm nhỏ khi đi qua qua màng, còn các tiểu phân
kích nhỏ thì hầu như không thay đổi kích thước khi qua màng, do đó thu được hỗn
dịch liposome có kích thước đồng nhất. Ưu điểm của phương pháp này là có tính
lặp lại cao giữa các lô mẻ , .

Hình 1.5. Cơ chế giảm KTTP liposome bằng phương pháp đùn ép (extrusion)


13

1.3.3. Phương pháp tinh chế liposome
Mục đích của quá trình tinh chế liposome là loại bỏ các thành phần không
được gắn vào liposome và các chất tẩy rửa sử dụng trong quá trình bào chế .
Với dược chất tan trong nước:
Lọc qua gel (gel filtration)
Phương pháp cho phép phân tách các chất dựa trên sự khác nhau về khối
lượng phân tử và kích thước tiểu phân dựa trên nguyên lí: môi trường lọc gel được
chứa trong cột lọc, cho hệ pha động và mẫu chảy qua cột. Khi đó các phân tử kích
thước nhỏ thẩm thấu vào trong các hạt chứa trong cột và lưu lại trong cột lâu hơn,
còn những phân tử, tiểu phân có kích thước lớn không thẩm thấu được vào trong
các hạt, theo pha động chảy ra khỏi cột. Như vậy, liposome không đi vào các hạt và
bị rửa giải trước các phân tử dược chất không gắn vào liposome .
Ly tâm (centrifugation)
Có 3 kiểu ly tâm được ứng dụng để tinh chế liposome: ly tâm vi phân, ly tâm
theo gradient tỷ trọng và ly tâm có sử dụng các lưới lọc phân tử. Điều kiện li tâm tối
ưu phụ thuộc vào loại lipid, loại liposome, hệ đệm và nhiệt độ .
Với các dược chất tan trong dầu:
Dược chất tan trong dầu khi tách khỏi lớp màng lipid kép sẽ tồn tại dưới

dạng tinh thể hoặc dạng vô định hình. Để tách loại các tinh thể dược chất ra khỏi
liposome có thể li tâm hỗn dịch trong 10 – 30 giây ở tốc độ cao, khi đó những tinh
thể dược chất bị lắng xuống. Phương pháp này yêu cầu đánh giá lại nồng độ
phospholipid sau quá trình li tâm để khẳng định liposome không bị lắng xuống
trong quá trình li tâm. Ngoài ra, có thể đùn ép hỗn dịch liposome qua màng
polycacbonat có kích thước lỗ lọc dưới 100 nm để loại tinh thể dược chất, khi đó
chỉ có liposome có tính chất mềm dẻo đi qua màng lọc còn tinh thể dược chất thì
không. Nhược điểm của phương pháp là sử dụng lực nén lớn trong quá trình đùn ép
làm tăng sự tách pha của dược chất ra khỏi lớp màng lipid kép .


14

1.4.

Một số nghiên cứu về liposome Amphotericin B
Pleumchitt Rojanapanthu cùng cộng sự đã nghiên cứu đặc tính lý hóa của

liposome amphotericin B bào chế từ phosphatidylcholin (PC), cholesterol bằng
phương pháp bốc hơi pha đảo, sử dụng tỷ lệ diethylether: dung dịch NaCl 0,9 % là
3:1 v/v, siêu âm trong 5 phút ở 7 ºC, bốc hơi ở 25 ºC để loại ether. Đánh giá hiệu
suất liposome hóa bằng kĩ thuật thẩm tích qua màng thẩm tích (molecular cutoff
12000 dalton), môi trường thẩm tích là dung dịch NaCl 0,9 %, ở 30 ºC, có khuấy từ.
Kết quả cho thấy, liposome chứa 2 % mol AMB trên tổng lượng lipid cho hiệu suất
gắn thuốc cao nhất (khoảng 95%), KTTP trong khoảng 1307 – 1451 nm với tỷ lệ
PC: chol là 1:1. Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, khi tăng tỷ lệ % về số mol AMB/tổng
lượng lipip trên 3 % thì hiệu suất liposome hóa giảm, do độ tan hạn chế của AMB
trong diethyl ether (< 0,01 mg/ml) .
S.P. Shah và cộng sự đã nghiên cứu bào chế liposome AMB dạng bột xông
hít dùng điều trị nhiễm nấm xâm lấn ở phổi bằng phương pháp bốc hơi pha đảo sử

dụng hỗn hợp ethyl acetat và ethanol làm pha dung môi hữu cơ, pha nước là dung
dịch đệm Tris 0,01 M pH 6,5 chứa 1 mM EDTA. Liposome tạo ra được đùn ép qua
màng polycarbonat 2 µm, ở nhiệt độ 60ºC, loại dược chất không được gắn vào
liposome bằng phương pháp li tâm với lực li tâm là 4,38 × 10 3 g trong 90 giây. Sử
dụng HSPC, chol và phosphatidylglycerol đậu nành (7:3:0,5) hoặc stearylamin
(1:1:0,1) để tạo liposome AMB tích điện âm (AMB 1) hoặc dương (AMB 2), đông
khô liposome bằng cách sử dụng các chất tạo khung khác nhau, sau đó sử dụng
Sorbolac 400 và Pharmatose 325M đã rây qua rây 500 để làm tá dược độn tạo dạng
liposome bột xông hít. Kết quả khảo sát các điều kiện thí nghiệm cho thấy với tỷ lệ
ethyl acetat: ethanol là 1:1, tỷ lệ pha nước: pha dung môi hữu cơ là 1:5 tạo ra các
liposome có đặc tính tốt nhất với kích thước 1,8 ± 0,2 µm (AMB 1) và 2,0 ± 0,3 µm
(AMB 2), hiệu suất gắn thuốc 95,8 ± 1,5 % (AMB 1) và 87,9 ± 1,3 (AMB 2). Trong
các chất tạo khung đã khảo sát, sucrose được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo
với tỷ lệ tối ưu lipid: sucrose là 1:5, sản phẩm sau khi tạo dạng bột xông hít thì hiệu


15

suất gắn dược chất là 22,5 ± 2,2 % (AMB 1) và 16,8 ± 2,2 % (AMB 2). Liposome
AMB tạo ra bảo quản ở 2-8 ºC có tuổi thọ trên 1 năm .
Deepak Singodia cùng cộng sự nghiên cứu bào chế liposome AMB sử dụng
phosphatidylglycerol, chol và DMPC (F - 1a) hoặc SPC (F - 2a) bằng phương pháp
pha loãng ethanol như sau: AMB hòa tan trong dimethyl acetamid được acid hóa
bằng dung dịch HCl 0,1 %, trộn lẫn với dung dịch lipid hòa tan trong ethanol rồi
tiêm nhanh vào 1 thể tích lớn dung dịch dextrose 5 % để thu được liposome AMB.
Kết quả cho thấy các liposome bào chế bằng phương pháp này có KTTP khoảng
100 nm, thế zeta -43,3 ± 2,8 mV và hiệu suất gắn thuốc trên 95 % đối với tất cả các
mẫu, khả năng giải phóng dược chất in vitro trong 24 giờ và giá trị IC50 của 2 công
thức hầu như không có sự khác biệt so với chế phẩm Ambisome .
A. Manosroi cùng cộng sự đã nghiên cứu bào chế liposome AMB với nguyên

liệu là HSPC, chol và các phospholipid tích điện: dicetylphosphat (-), stearylamine
(+) với các tỷ lệ 1:1:0, 7:2:0, 7:2:1 (-), 7:2:1 (+), ở nồng độ 0,05 mg AMB/mg lipid
bằng phương pháp hydrat hóa màng film, sử dụng kĩ thuật siêu âm để đồng nhất hóa
và giảm KTTP, sử dụng phân tích nhiệt vi sai để đánh giá mức độ ổn định của
liposome. Đánh giá hiệu suất liposome hóa bằng phương pháp li tâm với lực li tâm
là 50000 g (ở 4 ºC), trong 1h. Kết quả thu được các liposome có KTTP từ 115 – 364
nm, hiệu suất liposome hóa trên 85 % với tất cả các mẫu, trong đó mẫu 7:2:1 (+)
AMB cho hiệu suất gắn thuốc cao nhất và ổn định nhất .
Maryam Iman cùng cộng sự đã nghiên cứu bào chế liposome AMB sử dụng
1,2 – distigmasterylhemisuccinoyl – sn – 3 – phosphocholin (DSHemsPC), là một
loại lipid mới, được tổng hợp từ 2 phân tử stigmasterol (là sterol ở tế bào thực vật)
liên kết với acid succinic và glycerolphosphocholin. Nghiên cứu khảo sát ảnh
hưởng của tỷ lệ DSHemPC, DMPC, DMPG ở các pH khác nhau (7,4 ; 6,5; 5,5) đến
đặc tính vật lí, khả năng giải phóng ion kali ra khỏi tế bào hồng cầu (RBCPR), hoạt
tính kháng nấm in vitro, kháng hắc nhiệt da (Leishmania major), đồng thời so sánh
với 2 chế phẩm hiện có trên thị trường là Ambisome và Fungizone nhằm xác định
khả năng sử dụng sterol thực vật thay thế chol trong bào chế liposome. Kết quả


16

nghiên cứu cho thấy hầu hết các công thức đều có các đặc tính tương đương với
Ambisome: KTTP khoảng 100 nm, phân bố kích thước hẹp, giá trị RBCPR, IC50
tương đương hoặc nhỏ hơn khi sử dụng Ambisome, hoạt tính kháng nấm in vitro và
kháng hắc nhiệt da gần như tương đương với Ambisome và Fungizone, liều tiêm
tĩnh mạch tối đa của các công thức dưới 10 mg/kg. Tuy nhiên, ở tỷ lệ
DSHemsPC/DMPC/DMPG/AMB là 1,25/5,0/1,5/1,0 pH 5,5 cho kết quả tốt hơn cả
và tương đương với Ambisome, liều tiêm tĩnh mạch có thể lên tới 60 mg/kg, điều đó
cho thấy có thể sử dụng sterol thực vật thay thế chol động vật nhằm giảm giá thành
của sản phẩm từ đó cho phép sử dụng một cách rộng rãi chế phẩm dạng liposome

AMB .
Tại Việt Nam, hiện chưa có nghiên cứu nào về liposome AMB đã công bố.


17

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu, phương tiện nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu: liposome AMB.
- Nguyên liệu:
Bảng 2.1. Nguyên liệu
TT
1
2
3

Tên nguyên liệu
Amphotericin B
Cholesterol
Phosphatidylcholin đậu nành

Nguồn gốc
Trung Quốc
Trung Quốc
Avanti polar Lipids –

Tiêu chuẩn
USP
NSX
NSX

(soy phosphatidylcholine)
4
Chloroform
5
Methanol
6
Methanol dùng cho HPLC
7
Acetonitril dùng cho HPLC
8
Natri EDTA
9
Nước tinh khiết
10
Dinatri hydrophosphat
11
Kali dihydrophosphat
- Phương tiện nghiên cứu:

Mỹ
Labscan – Thái Lan
Trung Quốc
Baker - Mỹ
Baker – Mỹ
Trung Quốc
Việt Nam
Trung Quốc
Trung Quốc

NSX
TKHH
NSX
NSX
NSX
DĐVN
TKHH
TKHH

+ Hệ thống cất quay Rovapor R – 210 (Buchi – Đức), bình cầu NS 29/32, dung tích
1000 ml (Buchi – Đức).
+ Hệ thống thiết bị phân tích kích thước Zetasizer nano ZS90 (Malvern – Anh).
+ Thiết bị liposome extruder (Eastern Scientific – Mỹ).
+ Hệ thống máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Aligent.
+ Bể siêu âm Ultrasonic LC 60H.
+ Kính hiển vi điển tử truyền qua (TEM) JEOL 1010 (Nhật Bản).
+ Cân phân tích Satorius BP121S, máy đo pH InoLab, tủ sấy, tủ lạnh, cân kĩ thuật,
các dụng cụ thủy tinh.
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng AMB trong liposome.
- Khảo sát độ tan bão hòa của AMB trong môi trường đệm phosphat pH khác
nhau.
- Lựa chọn các thông số kĩ thuật bào chế liposome AMB bằng phương pháp bốc
hơi pha đảo.
- Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố thuộc về công thức đến các đặc tính của
liposome AMB.


18

2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp xác định độ tan bão hòa của AMB trong môi trường đệm
phosphat pH khác nhau
- Tiến hành khảo sát độ tan bão hòa của AMB trong môi trường đệm phosphat có
pH lần lượt là 3, 4, 5, 6, và 7,4.
- Cân một lượng dư AMB (khoảng 0,1 g AMB), cho vào bình nón có nắp đậy dung
tích 250 ml, thêm khoảng 100 ml môi trường khảo sát, khuấy từ liên tục trong 24
h, ở nhiệt độ phòng (khoảng 25 ºC).
- Sau 24 h, hút khoảng 5 ml dịch, đem li tâm ở tốc độ 12 000 v/p, nhiệt độ phòng,
trong 30 phút để loại phần AMB không tan. Lấy phần dịch phía trên, đem lọc qua
màng celulose acetat 0,45 µm.
- Tiến hành xác định nồng độ của AMB trong từng môi trường bằng phương pháp
HPLC với các điều kiện đã mô tả ở mục 2.3.3.3.1, thu được diện tích peak tương
ứng Si.
- Xác định nồng độ AMB (Ci) trong từng môi trường bằng phương pháp so sánh
diện tích peak với dung dịch AMB chuẩn pha trong dung môi thử có nồng độ C o,

diện tích peak S0 xác định: Ci =

× Co.

2.3.2. Phương pháp bào chế liposome AMB
Nghiên cứu đã tiến hành lựa chọn phương pháp bốc hơi pha đảo để bào chế
liposome AMB.
Quy trình bào chế liposome AMB như sau:
Cân và hòa tan AMB trong 50 ml methanol (0,2 mg AMB/ml methanol).
Cân và hòa tan SPC, chol trong 15 ml chloroform.
Phối hợp 2 dung dịch trên, khuấy trộn để thu được dung dịch đồng nhất.
Chuyển dung dịch lipid vào bình cầu dung tích 1000 ml của hệ thống cất quay. Tiến
hành cất quay ở điều kiện nhiệt độ 40 – 41 ºC, tốc độ quay 150 vòng/phút (v/p). Hệ

thống cất quay được hút chân không, điều chỉnh áp suất để dung môi bay hơi từ từ.