Quy trình chiết xuất một số alcaloid từ lá dừa cạn

B ộ YTẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
•

•

•

•

soEQca
TRẦN THỊ HƯƠNG GIANG

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT MỘT
SỐ ALCALOID TỪ LÁ DỪA CẠN
((Catharanthus roseus) LÀM NGUYÊN LIỆU
TỔNG HỢP THUỐC CHỮA UNG THƯ

KHÓA LUẬN TỚT NGHIỆP DƯỢC SỸ ĐẠI HỌC
•

•

•

•

•

KHÓA 2005 - 2010

Người hướng dẫn:

ThS Nguyễn Nhị Hà

Nơi thực hiện:

Trung tâm Hóa Dược
Viện Hóa Công Nghiệp Việt Nam

Hà n ộ i, 2010


LỜI CẢM ƠN

Với ỉòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tôi xin bày tỏ sự cảm ơn chân
thành tới Th.s. Nguyễn Nhị Hà —Bộ môn Hóa Vô Cơ là người thầy trực tiếp
hướng dân và giúp đỡ tôi hoàn thành khóa ỉuận này.
Tiếp theo tỏi xin gửi lời cảm 07ĩ chân thành tới
TSNguyễn Thế Hùng —Bộ môn Dược c ổ Truyền.
TS Trần Bạch Dương —Trung tâm Hóa Dược, Viện Hóa Công
Nghiệp Việt Nam
Là những người đã dành nhiều thời gian, tận tình giúp đỡ tôi trong quá
trình thực hiện đề tài tại Trung tâm Hóa Dược, Viện Hóa Công Nghiệp, Việt
Nam.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới tất cả các cán bộ nhân viên Trung tâm
Hóa Dược, Viện Hỏa Công Nghiệp, Việt Nam cũng các thầy cô trong bộ môn
Dược Cổ Truyền đã tạo điều kiện thuận lợi để tỏi hoàn thành tốt khóa luận.
Cuối cùng, tói xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã luôn quan tâm
động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quả trình học tập cũng như trong thời gian
tôi thực hiện khóa luận này.

Hà Nội ngày 17 tháng 5 năm 2010
Sinh viên

Trần Thị Hương Giang


MỤC LỤC
Nội dung

Trang

Danh mục các chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình
ĐẶT VÁN Đ Ề ......................................................... .............................................. 1
PHẢN 1. TỔNG QUAN........................................................................................ 3
1.1 Vài nét về cây Dừa cạn....................................................................................3
1.1.1 Đặc điểm thực vật.........................................................................................3
1.1.2 Tác dụng dược lý của cây Dừa cạn..............................................................5
1.2. Các alcaloid - thành phần hóa học quan trọng nhất từ Dừa cạn................. 7
1.3. Một số phương pháp chiết tách đã được sử dụng................................. . 11
1.3.1 Trên thế giới ...............................................................................................11
1.3.2. Tình hình nghiên cứu và triển khai trong nước....................................... 14
PHÀN 2. ĐỐI TƯỢNG & PHƯƠNG PHÁP.....................................................17
2.1 Đối tượng nghiên cứu và dụng cụ thiết b ị...................................................17
2.1.1 Đối tượng nghiên cứu................................................................................. 17
2.1.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất..........................................................................17
2.2 Nội dung nghiên cứu....................................................................................20
2.3 Phương pháp thực nghiệm.............................................................................20

PHẦN 3. THỰC NGHIỆM KẾT QUẢ VÀ BÀN LU Ậ N ...............................22

3.1 Thực nghiệm và kết quả..............................................................................22


3.1.1 Độ ẩm của dược liệu.................................................................................. 22
3.1.2 Quá trình chiết “alcaloid toàn phần” ........................................................ 22
a) Chiết theo phương pháp ngấm kiệt................................................................ 23
b) Loại bỏ các chất béo và chất m àu................................................................. 24
c) Chiết phân bố.................................................................................................. 24
d) Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố trong quá trình chiết...... ................ 25
3.1.3 Sơ bộ đánh giá thành phần “alcaloid toàn phần” bằng HPLC - MS..... 29
3.1.4 Phân tách các alkaloid Dừa cạn từ “alcaloid toàn phần” bằng phương
pháp sắc ký lỏng trung áp................................................................................... 30
a) Giai đoạn tách thô bằng Sephadex.................................................................30
b) Giai đoạn làm giàu và tách chất.....................................................................32
c) Tinh chế lại bằng sắc ký cột nhanh................................................................ 34
3.1.5 Kết tinh làm sạch và xác định cấu trúc của các chất phân lập được..... 35
3.1.6 Phản ứng tạo muối Catharanthine sulphat............................................ .40
a) Khảo sát một số phương pháp sulfat hóa Catharanthine base......................40
b) Tạo nguyên liệu Catharanthine sulfat............................................................ 43
3.2

Bàn luận..................................................................... .............................. 44

PHẦN 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ X UẤT................................................................ 45

4.1 Kết luận.......................................................................................................... 46
4.2 Đề xuất........................................................................................................... 47

Danh mục các chữ viêt tăt
DL:

Dược liệu

SKLM:

Sắc ký lớp mỏng

Vind. :

Vindoline

Cath. :

Catharanthine

VLB:

Vinblastine

VCR:

Vincristine

RPLC:

Reversed Phase Liquid Chromatography
Sắc ký lỏng pha đảo

IELC:

lon - Exchange Liquid Chromatography
Sắc ký trao đổi ion

NPLC:

Normal Phase Liquid Chromatography
Sắc ký lỏng pha thuận

GPLC:

Gas Pressure Liquid Chromatography
Sắc ký khí lỏng

MPLC:

Medium Pressure Liquid Chromatography
Sắc ký lỏng trung áp

FC:

Fast Chromatography
Sắc ký cột nhanh

HPLC-MS:

High - Pressure Liquid Chromatography Mass Spectroscopy
Sắc ký lỏng cao áp kết nối phổ khối

TLC:

Thin Layer Chromatography
Sắc ký lớp mỏng

HMQC:

Heteronuclear Multiple Quantum Coherence

HMBC:

Heteronuclear Multiple Bond Connectivity

NMR :

Nuclear Magnetic Resonance


Danh muc các hình
Hình 1.1: Cây Dừa cạn

4

Hình 1.2: Nguyên liệu Dừa cạn

4

Hình 1.3: cấu trúc phân tử của Vindoline

8

Hình 1.5: cấu trúc phân tử của Vinblastine và Vincristine

8

Hình 1.6 : Công thức hóa học của Vindesine,Vinorelbine, Vinflunine
Anhydrovinblastine

9

Hình 1.7: Sơ đồ tóm tắt các quy trình tách chiết và phân lập acaloid

12

Hình 2.1: Thiết bị MPLC

18

Hình 2.2: Thiết bị TC

19

Hình 3.1: Quy trình chiết tách các Vinca alcaloid từ lá Dừa cạn

23

Hình 3.2 : Tỷ lệ acid acetic/ethanol và tỷ lệ alcaloid thu được

26

Hình 3.3 : Lượng alcaloid thu nhận được sau mỗi đợt chiết

28

Hình 3.4: Sơ đồ tách các alcaloid bằng phương pháp sắc ký

30

Hình 3.5: Công thức phân tử VI1+V21 - Vindoline

38

Hình 3.6: Công thức phân tử của V22 - Catharanthine

40

Hình 3.7: Catharanthine sulfat thử (T) và chuẩn (C)

43


4

9cm dài và 1 - 3,5cm rộng, xanh bóng, không lông, với gân lá giữa nhạt màu
hơn và cuống lá ngắn (dài 1 - l, 8 em); mọc thành các cặp đối. Hoa có màu từ
trắng tới hồng sẫm với phần tâm có màu đỏ hơn, ống tràng dài 2,5 - 3cm và
tràng hoa đường kính 2 - 5cm có 5 thùy tương tự như cánh hoa. Quả là một
cặp quả đại dài 2 - 4cm, rộng 3mm chứa 1 2 - 2 0 hạt nhỏ màu nâu nhạt, hình
trứng. [38]

Hình 1.1: Cây Dừa cạn

Hình 1.2: Nguyên liệu Dừa cạn

Trồng cấy và thu hải
Ở Việt Nam, cây Dừa cạn mọc tự nhiên suốt từ Bắc vào Nam và cũng
được trồng vì cho hoa đẹp. Đây là một giống cây có khả năng chịu hạn cao và
có thời gian canh tác ngắn. Các kết quả thử nghiệm của Trung tâm nghiên cứu
giống và chế biến thuốc Đà Lạt cho thấy cây Dừa cạn Catharanthus roseus có
thể phát triển tốt trên đất cát khô hạn, chỉ sau 5 tháng cây đã trưởng thành và
tích luỹ đủ hàm lượng alcaloid đạt tiêu chuẩn xuất khẩu. Công ty Vimedimex
II kết hợp với Trung tâm Nghiên cứu giống và chế biến cây thuốc Đà Lạt đã
thử nghiệm canh tác cây Dừa cạn trên các vùng đất cát ven biển các tỉnh miền
Trung để thu hoạch rễ và ỉá phục vụ xuất khẩu với sản lượng hàng trăm tấn
một năm. [2 ]


5

1.1.2 Tác dụng dược ỉý của cây Dừa cạn.
Tác dunz trong dân gian.
Trong dân gian, người ta thường sử dụng nước sắc Catharanthus
roseus với tác dụng lợi tiểu, hạ đường huyết, chữa bệnh lỵ, bệnh xuất huyết
hoặc chữa vết thương hở. Ở Châu Âu, Bắc Phi và Trung Phi, nước sắc của
Dừa cạn được sử dụng làm thuốc lợi tiểu, giảm xung huyết phổi, chữa viêm
họng. Ở Mỹ, Dừa cạn được dùng dưới dạng thuốc đắp để cầm máu. Người Ấn
Độ sử dụng cây này trong trường hợp bị côn trùng cắn. Ngoài ra Dừa cạn còn
được dùng làm thuốc chống viêm mắt ở Caribe và thuốc chữa ho ở Trung
Quốc. [6 ]

Hiện nay, Dừa cạn đã và đang được nhiều nhà khoa học trên thế giới
nghiên cứu tìm hiểu. Nhiều thử, nghiệm lâm sàng đã và đang được thực hiện
nhằm chứng minh các tác dụng chống ung thư của các alcaloid từ Dừa cạn.
Tác dung chốn2 ung thư của alcaỉoid từ Dừa can. [5-11,14,16,22,26]
Đầu những năm 1950, Noble tại phòng thí nghiệm Collipv - Đại học
Western Ontario - Canada đã nghiên cứu lá Dừa cạn với mục đích tìm hiểu
tác dụng của cây này trên lượng đường huyết trong cơ thể. Thay vì các hoạt
tính trên, ông nhận thấy trong lá Dừa cạn có những chất tác dụng mạnh đến tế
bào bạch cầu và tủy xương. Từ đó, theo hướng nghiên cứu các chất gây độc tế
bào hoặc ức chế phân bào bạch cầu ác tính, cùng với các nhà khoa học khác là
Beer và Cutts, Noble đã chiết ra được chất có hoạt tính chống ung thư đặt tên
là Vincaleukoblastine vào năm 1958, sau đó đổi tên thành Vinblastine. [16]
Cũng đồng thời trong khoảng thời gian đó, một nhóm các nhà khoa học
khác bao gồm Svoboda, Johnson, Neuss và Gorman tại phòng thí nghiệm
Lilly đã nghiên cứu và chứng minh rằng những phân đoạn alcaloid từ Dừa cạn


6

có tác dụng kéo dài khả năng sinh sản của tế bào DBA trên 2 chuột được cấy
tế bào lympho ung thư cấp tính (bệnh bạch cầu P-1534).[16]
Phát hiện ra hoạt tính chống lại bạch cầu P-1534 của Dừa cạn có ý
nghĩa rất quan trọng. Trong một nghiên cứu chuyên sâu về Leurosine,
Svoboda đã tìm ra một alcaloid cấu trúc đôi phân tử (dimeric alcaloid) có cấu
trúc tương tự như Vinblastine. Tác dụng chống tế bào bạch cầu P-1534 của tất
cả những aicaioid trên ỉần đầu tiên được chứng minh tại phòng thí nghiệm
Lilly. [16]
Ke từ sau những thử nghiệm lâm sàng đầu tiên vào thập niên 1960, các
alcaloid từ Dừa cạn như Vinblastine (biệt dược là Velban ® hoặc Velbe ®) và
Vincristine (biệt dược là OncoVin ®), đã được sử dụng rộng rãi như các hóa

trị liệu cho nhiều loại ung thư khác nhau: ung thư máu, ung thư mô bạch
huyết, ung thư tinh hoàn và ung thư vú. [ 1 0 ]
Có thể nói, việc phát hiện ra Vinblastine là một cột mốc quan trọng
trong sự phát triển của hóa trị liệu ung thư. Nó đã mở ra nhiều con đường
nghiên cứu khác như hóa học, sinh học, và lâm sàng nhằm phát hiện và chứng
minh các hoạt tính chống ung thư mới của các alcaloid từ Dừa cạn.
Cơ chế chống uns thư của Dừa can r8,13,16,24-26,361
Ngay sau khi phát hiện ra đặc tính kháng ung thư in vivo của các
alcaloid từ Dừa cạn, đã có rất nhiều thí nghiệm nghiên cứu tập trung vào giải
thích cơ chế tác dụng của chúng. Vinblastine liên kết đặc hiệu với tubulin protein heterodimeric phổ biến trong tất cả các tế bào nhân thật. Tubulin và
dạng polymer của nó là microtubules có vai trò quan trọng trong việc duy trì
hình thái tế bào, vận chuyển nội bào và xây dựng các thoi phân bào trong quá
trình phân chia tế bào. Các alcaloid ức chế sự kết hợp của tubulin vào
microtubules do đó ngăn chặn quá trình phân chia tế bào. Chúng liên kết với


7

p-tubulin tại các vị trí khác nhau (được gọi là miền Vinca của tubulin - miền
này chưa xác định chính xác vị trí). Vì vậy, hoạt tính chống tăng sinh của các
alcaloid Dừa cạn được cho là kết quả của sự tương tác của chúng với các thoi
phân bào. [8,13,36]
Trong các nghiên cứu in vỉữo, tác dụng của Vinca alcaloid trên tubulin
phụ thuộc vào nồng độ. Ở nồng độ thấp (submicromolar), chúng ức chế chức
năng và sự hình thành của microtubules từ tubulin. Ở nồng độ cao nó diệt
được cả tế bào.[25]
Gần đây, Knossow và cộng sự đã công bố tìm ra vị trí gắn kết chính
xác của các alcaloid Dừa cạn trên tubulin. Họ cũng đồng thời công bố các
hình ảnh thu được bằng nhiễu xạ tia X cho thấy vị trí gắn kết này bị xen phủ
một phần với vị trí gắn kết của phomopsin A, một peptit mạch vòng được

phân lập từ loài nấm Phomopsỉn leptostromỉ/omỉs cũng có tác dụng ức chế sự
trùng hợp của các tubulin. [24,25]
1.2. Các alcaloid —thành phần hóa học quan trọng nhất từ Dừa cạn
Phần ở trên mặt đất của cây chứa 0,2 - 1% alcaloid. Đã có khoảng 150
alcaloid được phân lập từ Catharanthus. Nhờ sự phát triển của việc nghiên
cứu tế bào và các phương pháp phân tích bằng sắc ký lỏng cao áp mà số
lượng các chất được phát hiện ra ngày càng nhiều hơn. [7]
Xét về mặt cấu trúc, các alcaloid chứa trong loài Catharanthus tồn tại
dưới hai dạng monomer và dimer. Theo I.s. Johnson và cộng sự thì có thể
sắp xếp các alcaloid này vào 3 nhóm lớn:[3]
1. Các alcaloid monomer ( như Vindoline, Catharanthine...)
2. Nhóm các alcaloid dimer indole - dihydroindole (loại Vinblastine)
3. Các alcaloid dimer loại không phải Vinblastine


8

Vindoline (C25H32N 2O6) được Kamat và cộng sự phân lập từ năm 1958,
Gorman và cộng sự xác định cấu trúc năm 1962, được nghiên cứu là có tác
dụng hạ đường huyết.[3] Các nghiên cứu tiếp theo cho thấy Vindoline là một
dihydroindol alcaloid có thể dùng làm nguyên liệu để sinh tổng họp và tổng
hợp hoá học lên các dimer alcaloid. Pierre Fabre là hãng dược phẩm đầu tiên
đã thương mại hóa sản phẩm Vinblastine bán tổng hợp từ Vindoline và
Catharanthine. [7]
- Vindoline có nhiều trong lá Dừa cạn khoảng 3 tháng tuổi.
- Là tinh thể có điểm chảy 150-155°c [ a] 26D= -18°/CHC13
- ƯVmax 212, 254, 304nm.

Catharanthine

(C 2 1H 2 4 N 2 O 2 ),

được N. Neuss và M. Gorman phân lập và

xác định cấu trúc năm 1961, là alcaloid nhân indol tham gia vào cấu trúc của
Vinblastine. Catharanthine được nghiên cứu là có tác dụng lợi tiểu.[3,7]
- Là tinh thể có điểm chảy 126-128°c, [a]26D= +298°/CHCl3
- ƯVmax 226, 284, 292nm

COOCH3

Hình 1.4: cấu trúc phân tử của Catharanthine (2)


9

Phần được nhiều nhà khoa học quan tâm hơn cả là nhóm 20 alcaloid
cấu trúc đôi phân tử có khả năng chống ung thư, đáng chú ý là Vinblastine và
Vincristine. Các alcaloid này được cấu tạo từ hai phần: một vòng indole và
một vòng dihydroindole. Vì vậy chúng được gọi ỉà các alcaloid đôi phân tử
hay “ bis-indole alcaloid” (thuộc nhóm 1).[3]
Vinblastine được cấu tạo bởi hai alcaloid đơn phân tử là Catharanthine
( ín rlr\1

và ^indolin** ^HiVivHrninHnle^ r*ả hai rViật r»ậy
tư do

trong cây. Vincristine có cấu trúc tương tự như Vinblastine nhưng thay cho
nhóm N-methyl ở vòng indole ở phần Vindoline là nhóm N-formyl (hình 1.5).

Hàm lượng hai alcaloid này trong cây là rất nhỏ (Vincristine chỉ đạt khoảng
0.0002% khối lượng trong dược liệu khô).[3]

Vinblastine(3)

Vincristine(4)

Hình 1.5 Cấu trúc phân tử của Vinblastine và Vincristine
Mặc dù nhu cầu thực tế đòi hỏi lượng Vinblastine nhiều hơn lượng
Vincristine nhưng cây lại sản xuất ra nhiều Vincristine hơn. Do đó, người ta
đã tìm cách chuyển từ Vincristine sang Vinblastine hoặc chất khác theo con
đường vi sinh sử dụng Streptomyces albogryseolus để N- demethyl hóa. [7]
Hai alcaloid chống ung thư tự nhiên khác của Dừa cạn, Vindesine (5)
(Eldesine ®) và Vinorelbine (6 ) (Navelbine ®) đã được phát triển thành sản
phẩm chống ung thư. Gần đây, Vinflunine (7) có cấu trúc tương tự


10

fluorinated, được chỉ ra có hoạt tính chống ung thư mạnh đã được đưa vào
các thử nghiệm lâm sàng giai đoạn III tại Châu Âu từ năm 2005.

Vindesine (5)

Vinorelbine (6)

cooch3

Vinflunine (7)

AnhydroVinblastin(8)

Hình 1.6: Công thức hóa học của Vindesine,Vinorelbine,
Vinflunine, anhydroVinblastine
Những thành công của việc bán tổng hợp alcaloid từ Dừa cạn dựa trên
một giả thuyết sinh học liên quan đến Catharanthine và Vindoline là tiền chất.
Vinblastine, cũng như các alcaloid dimeric từ Dừa cạn khác, có thể là kết quả
của sự kết hợp các phần Vindoline với một dẫn xuất trung gian xuất phát từ


11

Catharanthine. Sau nhiều nỗ lực nghiên cứu, một alcaloid kiểu Vinblastine có cấu hình s ở C18, được tạo ra bằng cách áp dụng một chuyển hóa của phản
ứng Polonovski, cũng được gọi là phản ứng Polonovski - Potier, hoặc phản
ứng nhờ enzym peroxidase kiềm hay phản ứng thông qua ion sắt trong môi
trường acid, tạo thành alcaloid mới anhydroVinblastine, có cấu hình 18'S tự
nhiên. [ 1 0 , 28]
Do

đươc tôĩĩữ hrm đ^r

2 Ìảp

từ Catbararithire và Vindoline

anhydroVinblastine được coi là một chất trung gian trọng điểm, hấp dẫn trong
tống hợp các alcaloid dimeric khác. Từ anhydroVinblastine(8 ), bằng nhiều
cách khác nhau, các nhà nghiên cứu đã tổng họp nên nhiều loại thuốc chống
ung thư nổi tiếng hiện nay như Vinblastine(3), Vindesine(5),Vinorelbine(6)
và Vinflunine(7)[10,35,36]

Một số ankaloid có hoạt tính khác như Leurosine (20’- epiVinplastine),
Leurosine (15’, 20’- epoxyVinblastine), Ajmalicine (Raubasine), Lochnerine,
Serpentine, và Tetrahydroalstonine .[7]
1.3. Một số phương pháp chiết tách đã được sử dụng
1.3.1 Trên thế giới [2,12,14,15,17]
Vinblastine và Vinristine là các alcaloid dimeric nhóm 2, tích tụ trong
lá và hoa của cây Dừa cạn với hàm lượng thấp (10'5- 10"4%), do đó việc phân
lập tinh khiết các chất này thường rất phức tạp và đòi hỏi kĩ thuật chiết tách ở
trình độ cao. Mặc dù vậy, hiện nay các quy trình công nghệ chiết Dừa cạn vẫn
được xây dựng dựa trên các phương pháp chiết alcaloid chung, sử dụng chiết
phân bố bằng các dung môi hữu cơ khác nhau cùng với việc thay đổi pH phù
họp với từng giai đoạn chiết cụ thể.
Sơ đồ tóm tắt một số phương pháp chiết truyền thống và hiện đại đang
được áp dụng trong nghiên cứu và sản xuất các alcaloid từ Dừa cạn.


12

Chiẻt xuât
Indole-Inđoloalkaloids

Chiết xuẩt
Ajmalicm&danchất
Chloroform

NaBH4

CÔlậpvàphânđoạn
Vinbastm&Vmcristm

Hydrohóavàphântách
Ajmalicin

ỈELC&GPLC

IELC&NPLC

Tetrahỵdroserpentme
NPLC&RPLC

NPLC&RPLC

Hình 1.7: Sơ đồ tóm tắt các quy trình tách chiết và phân lập
acaloid.
Theo Noble và cộng sự, lá Dừa cạn được chiết bằng hỗn hợp ethanol
với acid theo tỷ lệ thích hợp. Cao lỏng thu được sau khi cất bằng dung môi
được hoà vào dung dịch HC1 2% và lọc loại sạch tạp chất không tan. Dịch lọc
được điều chỉnh tới pH 4 và rửa bằng dung benzen để loại bỏ các tạp chất
màu và các chất ít phân cực không có tính kiềm. Dịch chiết acid còn lại được
trung hoà bằng NH 4OH rồi đem chiết lấy hỗn họp “alcaloid toàn phần” bằng
benzen và chloroform
“Alcaloid toàn phần” được phân tách bằng sắc ký cột trên chất hấp phụ
là nhôm oxít (Woehlem AI2O3 Grade 4 - 5 ) với hệ dung môi benzen dicloromethane rửa giải theo gradient nồng độ. Các phân đoạn sắc ký được


17

PHẦN 2. ĐỚI TƯỢNG & PHƯƠNG PHÁP
2.1 Đối tượng nghiên cửu và dụng cụ thiết bị
2.1.1 Đối tương nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu của đề tài là lá và hoa của cây Dừa cạn hoa đỏ
Catharanthus roseus (L.) G.Donn. (Vinca rosea L.) thuộc họ Trúc đào
(Apocynaceae)
được
trồngO ' tại
TuvJ Hòa làm neuyên
liệu
xuất khẩu của công
tv»
V JL
✓
s
•
•
J
•
W
Vimedimex II. Nguyên liệu Dừa cạn thu hoạch vào tháng 10 - 2008 tách riêng
phần lá, hoa và cành non (tính từ ngọn có hoa đến vòng lá thứ

6

- 7)(gọi

chung là “nguyên liệu” hoặc “lá”). Sau khi thu hoạch phơi nguyên liệu dưới
bóng mát, sấy ở nhiệt độ 50 - 60°c và xay thành bột trong cỡ rây 0,5 - l,5mm.
Tiêu chuẩn nguyên liệu của đề tài:
- Độ ẩm: ~ 9%;
- Hàm lượng Vinblastin: ~ 0,013%;
- Hàm lượng alcaloid toàn phần: ~ 1,0%.

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất.
Quá trình chiết nguyên liệu lá Dừa cạn lấy “aỉcaloid toàn p h ầ n ”sử
dụng các thiết bị chính sau đây:
- Bình chiết ngấm kiệt thể tích 80 lít có van thoát dịch chiết.
- Bình chiết phân bố thể tích 80 lít có bơm ly tâm tuần hoàn lưu lượng
50 líưphút.
- Bình chiết thủy tinh thể tích 2 lít.
Quá trình tách các Vỉnca aỉcaỉoid từ “aỉcaloid toàn phần ”sử dụng các
thiết bị chính sau đây:
a) Sắc ký lớp mỏng:


22

PHẦN 3. THựC NGHIỆM KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1 Thực nghiệm và kết quả
3.1.1 Đô ẩm của dươc liêu
•

•

•

Sấy khô 100,0g bột nguyên liệu ở 60° c dưới áp suất 100 mmHg cho
đến khi khối lượng không đổi. Cân lại khối lượng bột được 91,8g. Áp dụng
công thức (*) ta tính được độ ấm của neuvên liệu:
o

V

/

•

•

O

•/

•

X = 100,0 ~ 91,80 X100 % = 8,2%
100,0

3.1.2 Quá trình chiết “alcaloid toàn phần”
Sơ đồ mô tả quy trình chiết tách các Vinca alcaloid từ lá Dừa cạn được
mô tả trong hình 3.2.1 sau đây:


23

Làm ẩm

CH3COOH/EtC)H90%

Chiết 3 lần
12h/ lằn
CH3COOH/EtOH90%
pH = 2 - 3

t° phòng

Cô quay áp suất giảm
p = lOÒmmHg
chiết 3 lần
n-hexane
dm/dịch cô =1/3 (v/v)
(loại acid béo và chất màu)
kiềm hóa
NaHCOs 10%
pH = 9-10

chiết
---------- 7------- dichloromethane
có khuấy trộn

cô quay áp suất giảm
p = lOOmmHg
t° = 50-60°C

Hình 3.1: Quy trình chiết tách các Vinca aỉcaloid từ lá Dừa cạn
a) Chiết theo phương pháp ngấm kiệt
Bột lá Dừa cạn được trộn với một trong các hệ dung môi chiết: dung
dịch ÊkSCVethanol,

dung

dịch

CH3COOH/ethanol hoặc

dung

dịch

CH3COOH/nước cho ngấm đều. Khối bột nhão được nạp vào bình chiết 80 lít,


24

bổ sung dung môi cho ngập hết nguyên liệu, để qua đêm. Rút dịch chiết, bổ
sung dung môi chiết vào bình chiết và tiếp tục chiết kiệt vài lần cho đến khi
dịch chiết không còn cho phản ứng với thuốc thử DragenDorff - Munier thì
dừng lại. Các dịch chiết được gộp lại cô dưới áp suất thấp (~ lOOmmHg) đến
thể tích 1/10. Điều chỉnh pH của dịch cô rồi đem chiết phân bố với dung môi
hữu cơ để thu nhận “alcaloid toàn phần”.
b) Loại bỏ các chất béo và chất màu
Khuấy trộn dịch cô trong bình chiết với tốc độ từ 50 - 70 vòng/phút bổ
sung n-hexane vào dịch chiết đến tỉ lệ dịch cô/n-hexane = 3:1 theo thể tích.
Khuấy trộn trong 30 phút rồi dừng lại, để tĩnh hỗn dịch trong 12 giờ ở nhiệt
độ phòng. Bùn diệp lục và các chất màu không tan được tách ra khỏi hỗn hợp
bằng cách lọc vắt ly tâm qua giấy lọc dầu với tốc độ ly tâm

1200

vòng/phút.

Dùng phễu chiết tách lấy dịch nước acid chứa alcaloid ra khỏi hỗn dịch lọc.
Dịch chiết n-hexane được cô kiệt để thu hồi n-hexane.
c) Chiết phân bố

Dịch cô từ quá trình chiết nguyên liệu được nạp lên bình chiết phân bố
dung tích 80 lít, sử dụng

N H 4O H

điều chỉnh môi trường của dịch cô đến pH

thích hợp. Dung môi chiết là n-hexane, chloroform hoặc dichlomethane nạp
vào hỗn hợp đến tỷ lệ thích hợp và tiến hành chiết.
Việc khuấy trộn hỗn hợp chiết được thực hiện bởi bơm ly tâm tuần
hoàn lưu lượng 50 líưphút. Sau khi bơm khuấy trộn làm đồng nhất, hỗn họp
chiết được để tĩnh 1 giờ để tách lớp. Lóp dung môi hưu cơ chứa alcaloid được
tách ra, bổ sung dung dịch chiết tiếp cho đến khi dịch chiết dung môi không
còn cho phản ứng với thuốc thử Dragendorff - Munier thì dừng lại. Các dịch
chiết được gộp lại, cô loại kiệt dung môi, làm khô cà cân xác định lượng cao
“alcaloid toàn phàn”.


25

r

r

Bảng 3.1: Kêt quả của giai đoạn chiêt lá Dừa cạn

I

Giai đoạn chiết ngấm kiệt

1

Lượng nguyên liệu dùng

2

Thành phân dung môi chiêt

3

Lượng dung môi làm âm

10

lít

4

Lượng dung môi /1 lân chiêt

10

lít

5

Thời gian ngâm chiêt

12

6

Sô lượt chiêt

3 lân

7

Lượng ethanol thu hôi

35 lít

8

Lượng dịch cô thu thu được

3 lít

II

5kg
CH3COOH/C2H5OH(90%)=055:10(v/v)

giờ

Giai đoan loai chât béo & chât màu
•

1

Lượng n-hexan cân dùng

2

Màng lọc ly tâm

3

Lượng n-hexan thu hôi

4

Tôc độ văt ly tâm

5

Pha nước acid chứa alcaloid

III

•

llít
giây lọc dâu dày 1,5- 3mm
0 ,8
1200

lít

vòng/phút

2 lít

Giai đoạn chiêíphân bô

1

Lượng CH2Cl2/llân chiêt

2

2

Sô lượt chiêt

3 lân

3

Lượng chloroform thu hôi

4,5 lít

4

Lượng alc tông sô thu được

49g

lít

d) Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố trong quá trình chiết
Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lề acid acetic/ethanol đến năng suất thu
nhân aỉcaỉoỉd:
Tiến hành chiết nguyên liệu Dừa cạn theo quy trình 3.1.2.a). Tỷ lệ dung
môi chiết acid acetic/ethanol 90% được khảo sát từ 0,01 đến 0,1.


30

3.1.4 Phân tách các alkaloid Dừa cạn từ “alcaloid toàn phần” bằng
phương pháp sắc ký lỏng trung áp.
Quá trình tách sắc ký các alcaloid từ alcaloid toàn phần của lá Dừa cạn
được mô tả trong sơ đồ sau:

Cột Sephadex

MeOH

MeOH

Phân đoạn V2

Cột Silica gel
gradient

Cột Silica gel

CH2Ch/MeOH
99:1 (v/v)

CH2Cb/MeOH
0-1% MeOH

MeOH

CH2Ch/MeOH
. l-3%MeOH

MeOH

CH2Ch/MeOH
3-4%MeOH

MeOH

Hình 3.4: Sơ đồ tách các aỉcaloỉd bằng phương pháp sắc ký
a) Giai đoạn tách thô bằng Sephadex.
Điều kiện thực nghiệm:
- Kỹ thuật: Sắc ký lỏng trung áp (MPLC);
- Cột tách: Id X L = 50 X 330mm nạp 500g Sephadex LH 20;
- Pha động: CH3OH;
- Tốc độ dòng: 60 mL/phút;


35

thể hiện màu Von’s. Dựa vào sự thể hiện thành phần trên bản mỏng ta tách
riêng các phân đoạn. Tiến hành cô các phân đoạn thu được.
Thực hiện tương tự với lượng mẫu còn lại. Cô kiệt xác định lượng cân
và thu hồi dung môi.

Bảng 3.8: Kết quả quá trình tinh chế các chất phân lập được.
Phân đoạn đem tinh chê

V11+V21

V22

V23

Khôi lượng môi phân đoạn đem tách

4,6g

0,65g

0 ,6 g

Tỷ lệ dung môi pha động (CH2Cl2/MeOH)

99:1

49:1

29:1

Lượng dung môi đâu loại bỏ/lân tách

lOOmL

180mL

50mL

Thê tích phân đoạn săc ký sạch thu

lOOmL

150mL

60mL

3,8g

0,58g

0,55g

được/lần tách
Lượng alcaloid sạch thu được

Chấm kiểm tra lại các phân đoạn sắc ký ta nhận thấy các chất thu được
tương đối sạch. Có thể đem kết tinh và làm sạch ở giai đoạn tiếp theo.
3.1.5 Kết tinh làm sạch và xác định cấu trúc của các chất phân lập được
V11+V21, V22, V23 sau khi được kết tinh từ các phân đoạn sắc ký
tương ứng trong dung môi methanol. Kết quả như sau:
3.1.5.1 V11+V21:
V 11+V21: 3g được phân lập dưới dạng tinh thề màu trắng ngà, nhiệt độ
nóng chảy: 153 - 155°c.

36

Bảng 3.9: số liệu phổ , 3C-NMR của V11+V21
Vi trí c

ỏc (ppm) [14]

ôc (ppm) (báo cáo)

2

83,5

83.35

3

79,7

79,61

4

76,5

76,35

5

43,1

42,94

6

130,7

130,52

7

124,0

124,01

8

51,2

51,09

10

52,1

52,00

11

44,2

44,00

12

52,9

52,79

13

125,2

125,04

14

122,7

122,67

15

104,9

104,65

16

161,4

161,20

17

96,0

95,87

18

153,9

153,74

19

67,3

67,16

20

30,9

30,81

21

7,8

7,63

•


37

23

170,5

170,76

24

171,9

171,91

25

2 1 ,0

2 1 ,0 1

26

52,1

52,29

27

55,1

55,36

Bảng 3.10: số liệu phổ ^ -N M R của V11+V21
ỏc (ppm)(báo cáo)

ỏc (ppm) [30]

0,48 (3H, t, J=6,5, CH2CH3)

0,49 (3H, t, J=7, 5Hz, CH 2CH 3)
1,14 (1H, dd, J=15Hz; J=7,5Hz, CH 2CH3)

1,35 (2H,q,J=6,5, CH2CH3)

1,65 (1H, dd, J=15Hz; J=7,5Hz, CH 2CH3)
2,67 (3H, s, NCH 3)

2,65 (3H, s, NCH3)
2,68 (3H, s, COCH3)

3,78 (1H, s, CH3O)
3,80 (6 H, s, 2xOCH3)
3,79 (1H, s, CH3O)
5,23 (1H, d, J=5,55, CH)

5,24 (1H, IĨ1, CH)

5,88 (1H, dd, J=3,5; J=10,3,CH)

5,85 (1H, IĨ1, CH)
6,08(1 H,d,J=2Hz, acromatical protons)

6,08-6,91 (3H,m, acromatical
protons)

6,30(lH,m, acromatical protons)
6,89(1 H,d,J=8 Hz, acromatical protons)

Phổ ^-N M R và

13C-NMR

của V11+V21 xuất hiện các tín hiệu đặc

trưng của một alcaloid có khung bis-indole. Chúng tôi so sánh phổ của
V1+V21 với phổ của Vindoline [14] thì thấy hoàn toàn có sự tương đồng. Vì
vậy có thể khẳng định VI1+V21 là Vindoline.


40

bis-indole). Chúng tôi so sánh phổ của V22 với phổ của Catharanthine [30,14]
thì thấy hoàn toàn có sự tương đồng. Vì vậy có thể khẳng định V22 là
Vindoline

14

17

18

19

Hình 3.6: Công thức phân tử của V22 - Catharanthine
3.I.5.3. V23
V23: 500 mg được phân lập dưới dạng tinh thể màu vàng nhạt. Chúng
tôi đang tiến hành đo phổ và xác định tính chất vật lý của V23 (chất X).
3.1.6 Phản ứng tạo muối Catharanthine sulphat.
Catharanthine dạng base không bền, dễ bị oxi hóa ở nhiệt độ thường
trong môi trường không khí gây khó khăn trong bảo quản và sử dụng.
Ở dạng base Catharanthine rất ít tan trong nước nên khả năng tiếp xúc
vói Vindoline trong môi trường này là rất hạn chế. Đây cũng được cho là
nguyên nhân làm phản ứng bán tổng hợp dimer alcaloid trong môi trường
H20 không thực hiện được.
Với mục đích khắc phục những hạn chế trên, tôi tiến hành phản ứng
hóa muối sulfat đối với Catharanthine base.

a) Khảo sát một số phương pháp sulfat hóa Catharanthỉne base [34,35]
Dụng cụ: