NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHUYỂN GEN VÀO CÂY HOA LILY SORBONE BẰNG VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
--------------------

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHUYỂN GEN VÀO
CÂY HOA LILY SORBONE BẰNG VI KHUẨN
Agrobacterium tumefaciens

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

Chuyên ngành: TRỒNG TRỌT
Mã số: 60.62.01

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. NGUYỄN THỊ LÝ ANH

HÀ NỘI - 2009


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này
là hoàn toàn trung thực và chưa được sử dụng để bảo vệ một học vị nào. Mọi
sự giúp đỡ cho việc hoàn thành luận văn này đều đã được cảm ơn. Các thông
tin, tài liệu trong luận văn này đã được ghi rõ nguồn gốc.

Tác giả

Hoàng Tùng

i

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU
CT

Công thức

2,4 D

2,4-Dichlorophenoxyacetic acid

BA

6-Benzyllamino purine

AS

Acetosyringone

TNC

Tiền nuôi cấy

ĐNC

Đồng nuôi cấy

MS

Murashige & Skoog, 1962

PPT

DL - Phosphinotricine

ii


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN.....................................................................................................................................................I
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU.........................................................................................II
MỤC LỤC..............................................................................................................................................................III
STT............................................................................................................................................................................V
TÊN BẢNG..............................................................................................................................................................V
TRANG....................................................................................................................................................................V
BẢNG 4.1.................................................................................................................................................................V
ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT CHỌN LỌC PPT ĐẾN TỶ LỆ SỐNG VÀ KHẢ NĂNG TÁI SINH CỦA
MÔ CALLUS LILY IN VITRO...........................................................................................................................V
38...............................................................................................................................................................................V
BẢNG 4.2.................................................................................................................................................................V
ẢNH HƯỞNG CỦA KHÁNG SINH CEFOTACIME ĐẾN TỶ LỆ SỐNG VÀ KHẢ NĂNG TÁI SINH
NĂNG TÁI SINH CALLUS LILY “SORBONE”.............................................................................................V
40...............................................................................................................................................................................V
BẢNG 4.3.................................................................................................................................................................V
ẢNH HƯỞNG CỦA NGUỒN MẪU CẤY ĐẾN KHẢ NĂNG CHUYỂN GEN CỦA VI KHUẨN
AGROBACTERIUM TUMEFASCIENS...........................................................................................................V
42...............................................................................................................................................................................V
BẢNG 4.4.................................................................................................................................................................V
ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN LÂY NHIỄM MẪU ĐẾN KHẢ NĂNG CHUYỂN GEN CỦA VI
KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFASCIENS...........................................................................................V
43...............................................................................................................................................................................V
BẢNG 4.5.................................................................................................................................................................V

ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN TIỀN NUÔI CẤY ĐẾN KHẢ NĂNG CHUYỂN GEN CỦA VI
KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFASCIENS...........................................................................................V
45...............................................................................................................................................................................V
BẢNG 4.6.................................................................................................................................................................V
ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN ĐỒNG NUÔI CẤY ĐẾN KHẢ NĂNG CHUYỂN GEN CỦA VI
KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFASCIENS...........................................................................................V
47...............................................................................................................................................................................V
BẢNG 4.7.................................................................................................................................................................V
ẢNH HƯỞNG CỦA PHƯƠNG THỨC LÂY NHIỄM ĐẾN KHẢ NĂNG CHUYỂN GEN CỦA VI
KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFASCIENS...........................................................................................V
49...............................................................................................................................................................................V
BẢNG 4.8.................................................................................................................................................................V

iii


ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC VÉC TƠ CHUYỂN GEN NHIỄM ĐẾN KHẢ NĂNG CHUYỂN GEN CỦA
VI KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFASCIENS.....................................................................................V
50...............................................................................................................................................................................V
DANH MỤC HÌNH..............................................................................................................................................VI
1. MỞ ĐẦU...............................................................................................................................................................1
2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU...................................................................................................................................3
3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......................................................................................29
3.2.3. THÍ NGHIỆM 1: THÍ NGHIỆM VỀ XÁC ĐỊNH NGƯỠNG PPT CHỌN LỌC............................35
4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN..............................................................................................37
4.1. ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT CHỌN LỌC PPT.........................................................................................37
BẢNG 4.1. ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT CHỌN LỌC PPT ĐẾN TỶ LỆ SỐNG VÀ KHẢ NĂNG TÁI
SINH CỦA TIỀN CHỒI LILY SORBONNE SAU 8 TUẦN..........................................................................37
BẢNG 4.2. ẢNH HƯỞNG CỦA KHÁNG SINH CEFOTACIME ĐẾN TỶ LỆ SỐNG VÀ KHẢ NĂNG
TÁI SINH NĂNG TÁI SINH TIỀN CHỒI LILY SORBONNE SAU 8 TUẦN...........................................40

BẢNG 4.3. ẢNH HƯỞNG CỦA NGUỒN MẪU CẤY ĐẾN KHẢ NĂNG CHUYỂN GEN CỦA VI
KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFASCIENS (SAU 8 TUẦN)..............................................................41
BẢNG 4.4. ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN LÂY NHIỄM MẪU ĐẾN KHẢ NĂNG CHUYỂN GEN
CỦA VI KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFASCIENS (SAU 8 TUẦN)..............................................42
BẢNG 4.5. ẢNH HƯỞNG CỦA PHƯƠNG THỨC LÂY NHIỄM ĐẾN KHẢ NĂNG CHUYỂN GEN
CỦA VI KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFASCIENS (SAU 8 TUẦN)..............................................45
BẢNG 4.6. ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN TIỀN NUÔI CẤY ĐẾN KHẢ NĂNG CHUYỂN GEN
CỦA VI KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFASCIENS (SAU 8 TUẦN)..............................................46
BẢNG 4.7. ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN ĐỒNG NUÔI CẤY ĐẾN KHẢ NĂNG CHUYỂN GEN
CỦA VI KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFASCIENS (SAU 8 TUẦN)..............................................49
BẢNG 4.8. ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC VÉC TƠ CHUYỂN GEN NHIỄM ĐẾN KHẢ NĂNG CHUYỂN
GEN CỦA VI KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFASCIENS (SAU 8 TUẦN)....................................50
PHẦN IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ................................................................................................................56
PHỤ LỤC................................................................................................................................................................60
THÀNH PHẦN NỒNG ĐỘ NỒNG ĐỘ DUNG DỊCH MẸ...........................................................................60

iv


DANH MỤC BẢNG
Tên bảng

STT
Trang
Bảng 4.1. Ảnh hưởng của chất chọn lọc PPT đến tỷ lệ sống
38

và khả năng tái sinh của mô callus Lily in vitro
Bảng 4.2. Ảnh hưởng của kháng sinh Cefotacime đến tỷ lệ

40

sống và khả năng tái sinh năng tái sinh callus
lily “Sorbone”
Bảng 4.3. Ảnh hưởng của nguồn mẫu cấy đến khả năng

42

chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium
tumefasciens
Bảng 4.4. Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm mẫu đến khả

43

năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium
tumefasciens
Bảng 4.5. Ảnh hưởng của thời gian tiền nuôi cấy đến khả

45

năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium
tumefasciens
Bảng 4.6. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến khả

47

năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium
tumefasciens
Bảng 4.7. Ảnh hưởng của phương thức lây nhiễm đến khả

49

năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium
tumefasciens
Bảng 4.8. Ảnh hưởng của các véc tơ chuyển gen nhiễm đến
khả

năng

chuyển

gen

Agrobacterium tumefasciens
v

của

vi

khuẩn

50


DANH MỤC HÌNH
Hình 4.7. Kết quả điện di sản phẩm PCR của các dòng lily Sorbonne chuyển
gen...................................................................................................................54

vi

1. MỞ ĐẦU
1.1.

Đặt vấn đề
Trong nhiều năm qua, hoa lily luôn được đánh giá là một loại hoa cao

cấp, có giá trị kinh tế cũng như giá trị xuất khẩu cao. Nhu cầu về loại hoa này
trên thị trường hoa trong nước và trên thế giới là rất lớn. Vì thế, loại hoa này
hiện đang rất được quan tâm và chú trọng phát triển.
Tuy nhiên điều kiện khí hậu nóng ẩm, mưa nhiều của nước ta tạo điều
kiện cho rất nhiều các loại sâu bệnh hại phát triển và đây là một trong những
yếu tố hạn chế chủ yếu đến sản xuất nông nghiệp, trong đó có cây hoa. Cùng
với việc mở rộng diện tích và tăng cường về thành phần các giống hoa mới là
sự kéo theo của hàng loạt các loại sâu bệnh hại làm giảm năng suất, phẩm
chất, giá trị thẩm mỹ và thương phẩm của cây hoa. Đặc biệt, môi trường của
các vùng trồng hoa bị ô nhiễm nghiêm trọng do người sản xuất sử dụng thái
quá các thuốc bảo vệ thực vật hóa học. Chính vì thế, việc chọn tạo ra các giống
cây hoa có khả năng kháng sâu bệnh là một nhu cầu cấp thiết của thực tiễn.
Ngày nay, công nghệ chuyển gen cho phép nhà tạo giống cùng lúc đưa
vào một loài cây trồng những gen mong muốn có nguồn gốc từ những cơ thể
sống khác nhau, không chỉ giữa các loài có họ gần nhau mà còn ở những loài
rất xa nhau, từ đó chuyển được các gen mong muốn tạo ra các đặc tính mới lạ
(mầu sắc, cấu trúc hoa, hơng thơm, tuổi thọ của hoa cắm, các đặc tính kháng
sâu và bệnh hại, chống chịu với điều kiện bất thuận…)
Chính vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài:“Nghiên cứu xây dựng quy trình
chuyển gen vào cây hoa lily Sorbonne nhờ vi khuẩn Agrobacterium
tumerfaciens” nhằm góp phần đẩy mạnh hướng nghiên cứu về tạo giống cây
trồng bằng kỹ thuật gen ở nước ta.

1


1.2. Mục đích- yêu cầu
1.2.1. Mục đích:

- Xác định các thông số kĩ thuật cho các bước trong qui trình chuyển
gen mục tiêu nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens, làm cơ sở cho việc
tạo cây chuyển gen mang các đặc tính mong muốn.
1.2.2. Yêu cầu.

- Xác định được nồng độ Cefotacime chọn lọc
- Xác định được nồng độ PPT sử dụng để chọn lọc.
- Xác định được phương pháp lây nhiễm vi khuẩn và thời gian đồng
nuôi cấy thích hợp.
- Đánh giá sự biểu hiện của các gen sau chuyển nạp.
1.3

Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn

1.3.1 Ý nghĩa khoa học
Kết quả nghiên cứu của đề tài cho thấy khả năng có thể chuyển được
gen vào cây hoa lily Sorbonne, một loại cây thuộc nhóm một lá mầm bằng vi
khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Đồng thời, các thông số kĩ thuật đã xác
định được sẽ làm cơ sở cho việc tiếp tục chuyển các gen mong muốn khác
vào cây hoa lily Sorbonne nói riêng và các cây hoa lily nói chung.
1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả nghiên cứu của đề tài làm tiền đề và thúc đẩy việc ứng dụng
một phương pháp mới là tạo giống cây trồng chuyển gen mang đặc tính mong

muốn trong công tác chọn tạo giống cây trồng nói chung và cây hoa lily
Sorbonne riêng ở Việt Nam.

2


2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Kỹ thuật chuyển gen vào thực vật
2.1.1. Khái niệm về Kỹ thuật chuyển gen

Kỹ thuật chuyển gen là kỹ thuật đưa một hay nhiều gen lạ đã được thiết
kế ở dạng ADN tái tổ hợp vào tế bào chủ của cây trồng nói riêng và của các
sinh vật nói chung (vi sinh vật, động vật…) làm cho gen lạ có thể tồn tại ở
dạng plasmid tái tổ hợp hoặc gắn vào bộ gen tế bào chủ. Trong tế bào chủ, các
gen này hoạt động tổng hợp nên các protein đặc trng dẫn tới việc xuất hiện các
đặc tính mới của cơ thể chuyển gen.
Chuyển gen ở thực vật có ý nghĩa lớn về mặt khoa học, nó khẳng định
tính khách quan tự nhiên của vật chất di truyền như: khả năng mã hoá cho các
tính trạng nhất định, khả năng phiên mã, dịch mã và khả năng di truyền .Thông
qua chuyển gen, các nhà sinh lý, hoá sinh và di truyền có thể nghiên cứu các
quá trình điều khiển, thể hiện và ảnh hởng của các yếu tố di truyền và ngoại
cảnh lên hoạt động của gen.
Trong kỹ thuật chuyển gen vào cơ thể thực vật, thì nguồn vật liệu
thường được sử dụng để chuyển gen là: mô lá, mô thân, mẩu callus, phôi,
những tế bào tách rời… Những vật liệu này sau khi đã được biến nạp thành
công, các tế bào đã dung nạp những gen ngoại lai, ta phải tìm cách làm cho
những tế bào này tái sinh được thành một cơ thể hoàn chỉnh bằng cách đặt nó
vào một môi trường tái sinh thích hợp. Nếu như, sự tái sinh thành cây hoàn
chỉnh không thành công thì tất cả những vật liệu đã được biến nạp đó sẽ trở
nên vô nghĩa. Chính vì vậy, sự thành công của kỹ thuật chuyển gen phụ thuộc

vào sự tái sinh của tế bào. Do vậy, việc lựa chọn và điều chỉnh môi trường
nuôi cấy mô và tế bào thực vật đóng vai trò hết sức quan trọng, mang tính
quyết định tới thành công hay thất bại của thí nghiệm biến nạp, bên cạnh đó,
vấn đề sử dụng mô hay tế bào thích hợp để biến nạp cũng là mục tiêu nghiên
3


cứu không kém phần quan trọng (Potrykus, 1991).[17]
James F. Hutchinson, Daniel Isenegger, Savitri Nadesan, Neil Smith
and Peter Waterhouse, (2000)[18] nhận thấy: để có thể tạo được giống mới
nhờ cải biến di truyền một cách hiệu quả thì phải đảm bảo 04 yêu cầu sau:


Hệ thống tái sinh thích hợp để tái sinh được cây đã chuyển gen;



Hệ thống vectơ thích hợp để có thể đưa các gen lạ vào bộ DNA;



Có các gen thích hợp đã được nhân dòng và đã xác định được các đặc tính;



Các phương pháp để đánh giá các cây chuyển gen trong phòng thí nghiệm,

nhà kính và đồng ruộng.
2.1.2. Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
2.1.2.1. Cơ sở khoa học về khả năngchuyển gen ở thực vật

Một số nguyên tắc sinh học
Khi đặt ra mục đích và thực hiện thí nghiệm chuyển gen cần chú ý một
số vấn đề sinh học ảnh hưởng đến quá trình chuyển gen như sau:
- Không phải toàn bộ tế bào đều thể hiện tính toàn năng (totipotency).
- Các cây khác nhau có phản ứng không giống nhau với sự xâm nhập của
một gen ngoại lai.
- Cây biến nạp chỉ có thể tái sinh từ các tế bào có khả năng tái sinh và
khả năng thu nhận gen biến nạp vào genome.
- Mô thực vật là hỗn hợp các quần thể tế bào có khả năng khác nhau.
Cần xem xét một số vấn đề như: chỉ có một số ít tế bào có khả năng biến nạp
và tái sinh cây. Ở các tế bào khác có hai trường hợp có thể xảy ra: một số tế
bào nếu được tạo điều kiện phù hợp thì trở nên có khả năng, một số khác hoàn
toàn không có khả năng biến nạp và tái sinh cây.
- Thành phần của các quần thể tế bào được xác định bởi loài, kiểu gen,
từng cơ quan, từng giai đoạn phát triển của mô và cơ quan.

4


- Thành tế bào ngăn cản sự xâm nhập của DNA ngoại lai. Vì thế, cho đến
nay chỉ có thể chuyển gen vào tế bào có thành cellulose thông qua
Agrobacterium, virus và bắn gen hoặc phải phá bỏ thành tế bào để chuyển gen
bằng phương pháp xung điện, siêu âm và vi tiêm.
- Khả năng xâm nhập ổn định của gen vào genome không tỷ lệ với sự
biểu hiện tạm thời của gen.
- Các DNA (trừ virus) khi xâm nhập vào genome của tế bào vật chủ chưa
đảm bảo là đã liên kết ổn định với genome.
- Các DNA (trừ virus) không chuyển từ tế bào này sang tế bào kia, nó chỉ
ở nơi mà nó được đưa vào.
- Trong khi đó, DNA của virus khi xâm nhập vào genom cây chủ lại

không liên kết với genome mà chuyển từ tế bào này sang tế bào khác ngoại
trừ mô phân sinh (meristem).
2.1.2.2. Phản ứng của tế bào với quá trình chuyển gen

Mục đích chính của chuyển gen là đưa một đoạn DNA ngoại lai vào
genome của tế bào vật chủ có khả năng tái sinh cây và biểu hiện ổn định tính
trạng mới. Nếu quá trình biến nạp xảy ra mà tế bào không tái sinh được thành
cây, hoặc sự tái sinh diễn ra mà không kèm theo sự biến nạp thì thí nghiệm
biến nạp chưa thành công.
Ở rất nhiều loài thực vật, điều khó khăn là phải xác định cho được kiểu
tế bào nào trong cây có khả năng tiếp nhận sự biến nạp. Hạt phấn hay tế bào
noãn sau khi được biến nạp có thể được dùng để tạo ra cây biến nạp hoàn
toàn, thông qua quá trình thụ tinh bình thường. Hạt phấn thường được coi là
nguyên liệu lý tưởng để gây biến nạp. Trong khi đó, việc biến nạp gen vào
hợp tử in vivo hay in vitro lại gặp nhiều khó khăn. Trong trường hợp này,
người ta thường phải kết hợp với kỹ thuật cứu phôi. Việc biến nạp gen đối với

5


các tế bào đơn của các mô phức tạp như phôi hay mô phân sinh thường cho ra
những cây khảm.
Từ nhiều thập kỷ qua người ta đã biết rằng, tính toàn thể của tế bào thực
vật đã tạo điều kiện cho sự tái sinh cây hoàn chỉnh in vitro qua quá trình phát
sinh cơ quan (hình thành chồi) hay phát sinh phôi. Các chồi bất định hay phôi
được hình thành từ các tế bào đơn được hoạt hóa là những bộ phận dễ dàng
tiếp nhận sự biến nạp và có khả năng cho những cây biến nạp hoàn chỉnh
(không có tính khảm).
2.1.2.3. Các bước cơ bản của chuyển gen

Từ khi người ta khám phá ra rằng các thí nghiệm chuyển gen có thể thực
hiện nhờ một loại vi khuẩn đất Agrobacterium tumefaciens, thì các nhà khoa
học tin rằng Agrobacterium có thể chuyển gen vào tất cả các cây trồng.
Nhưng sau đó kết quả thực tế cho thấy chuyển gen bằng Agrobacterium
không thể thực hiện được trên cây ngũ cốc (một lá mầm) vì thế hàng loạt kỹ
thuật chuyển gen khác đã được phát triển đó là các kỹ thuật chuyển gen trực
tiếp như bắn gen bằng vi đạn (bombardement/gene gun), vi tiêm
(microinjection), xung điện (electroporation), silicon carbide, điện di
(electrophoresis), siêu âm (ultrasonic), chuyển gen qua ống phấn (pollen
tube)... Đến nay, nhờ cải tiến các vector chuyển gen nên kỹ thuật chuyển
bằng A. tumefaciens đã thành công cả ở cây ngũ cốc đặc biệt là lúa. Kỹ thuật
này trở nên một kỹ thuật đầy triển vọng đối với cây chuyển gen ở thực vật.
Quá trình chuyển gen được thực hiện qua các bước sau :
- Xác định gen liên quan đến tính trạng cần quan tâm.
- Phân lập gen (PCR hoặc sàng lọc từ thư viện cDNA hoặc từ thư viện
genomic DNA).
- Gắn gen vào vector biểu hiện (expression vector) để biến nạp.
- Biến nạp vào E. coli.
6


- Tách chiết DNA plasmid.
- Biến nạp vào mô hoặc tế bào thực vật bằng một trong các phương pháp
khác nhau đã kể trên.
- Chọn lọc các thể biến nạp trên môi trường chọn lọc.
- Tái sinh cây biến nạp.
- Phân tích để xác nhận cá thể chuyển gen (PCR hoặc Southern blot) và
đánh giá mức độ biểu hiện của chúng (Northern blot, Western blot, ELISA
hoặc các thử nghiệm in vivo khác...).
Nguyên liệu để thực hiện sự biến nạp là các tế bào thực vật riêng lẽ, các

mô hoặc cây hoàn chỉnh.
Cản trở lớn nhất của sự tiếp nhận DNA ở phần lớn sinh vật là thành tế
bào. Muốn làm mất thành tế bào thực vật người ta thường sử dụng enzyme và
dưới những điều kiện thích hợp người ta có thể tạo ra tế bào trần, tế bào trần
tiếp nhận DNA nói chung dễ dàng. Chẳng hạn sử dụng phương pháp xung
điện, ở đây tế bào được đặt ở trong một xung điện ngắn, xung điện này có thể
làm xuất hiện những lỗ tạm thời ở trên màng tế bào, những phân tử DNA có
thể đi vào bên trong tế bào. Sau khi biến nạp người ta tách những enzyme
phân giải và để cho tế bào phát triển, thành tế bào mới được tạo nên. Các tế
bào biến nạp này được nuôi cấy trên các môi trường nhân tạo thích hợp cùng
với các chất kích thích sinh trưởng để tạo nên cây hoàn chỉnh. Sau đó bằng
các phương pháp phân tích genome như PCR, Southern blot, Northern blot
được thực hiện để tìm ra chính xác những cây biến đổi gen.
Bên cạnh các phương pháp biến nạp Agrobacterium hoặc xung điện,
hiện nay có hai phương pháp khác cũng thường được sử dụng để đưa DNA
vào trong tế bào. Phương pháp thứ nhất là vi tiêm: với một cái pipet rất nhỏ
người ta có thể đưa các phân tử DNA trực tiếp vào nhân tế bào mà người ta
muốn biến nạp. Phương pháp này đầu tiên chỉ được sử dụng ở tế bào động
vật, nhưng sau này người ta đã sử dụng cho tế bào thực vật. Phương pháp thứ
7


hai là bắn vào tế bào các vi đạn (microprojectile), thường bằng vàng hoặc
wolfram, được bao bọc bởi DNA. Phương pháp này được gọi là phi sinh học
và được sử dụng thành công ở nhiều loại tế bào khác nhau.
Ở động-thực vật chuyển gen, sản phẩm cuối cùng thường không phải là
tế bào biến nạp, mà là một cơ thể biến nạp hoàn toàn. Phần lớn thực vật được
tái sinh dễ dàng bằng nuôi cấy mô tế bào. Tuy nhiên, tái sinh cây một lá mầm
như ngũ cốc và các loại cỏ khác cũng gặp một vài khó khăn. Từ một tế bào
biến nạp duy nhất người ta có thể tạo ra một cây chuyển gen, trong đó mỗi tế

bào mang DNA ngoại lai và tiếp tục chuyển cho thế hệ sau sau khi nở hoa và
tạo hạt.
2.1.2.4. Các phương pháp xác định cây chuyển gen

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)
Kỹ thuật PCR còn gọi là phản ứng chuỗi trùng hợp hay kỹ thuât nhân
ADN đặc hiệu, được sử dụng cho mục đích nhân nhanh một số lượng không
hạn chế nguyên bản của một đoạn ADN nhất định. PCR là một phương pháp
sử dụng khá phổ biến hiện nay để kiểm tra đánh kết quả chuyển gen ở mức độ
phân tử. Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, sử dụng ADN khuôn
và các hóa chất như Taq – polymerase, và các nucleotit, các cặp primer đặc
hiệu. Ưu điểm của kỹ thuật này là nhanh nhạy và đặc biệt là không cần dùng
đồng vị phóng xạ. Tuy nhiên, kỹ thuật này còn bộc lộ một số hạn chế đáng kể
như: mức độ ngoại nhiễm cao, giới hạn kích thước của trình tự cần khuyếch
đại, sai sót trong quá trình tổng hợp Taq –polymerase... Vì vậy, đây được xem
là bước đầu tiên trong đánh giá sự có mặt của gen chuyển vào cây ở mức độ
phân tử.

Kỹ thuật lai Southern blotting
8


Kỹ thuật lai phân tử (molecular hybriddization) nói chung và lai
Southern blotting nói riêng dựa trên nguyên lý là lai phân tử giữa mẫu dò
ADN (ARN) với các phân tử ADN (ARN, protein) được lưu giữ trên giá thể
để dò tìm các phân tử sinh học đặc trưng. Kỹ thuật này có hiệu quả trong
nghiên cứu phát hiện các đại phân tử sinh học có cấu trúc phân tử tử phức tạp.
Nó có thể áp dụng cho mọi loại đại phân tử sinh học có khả năng gắn kết vào
giá thể lưu trữ như màng notrocelluose, màng nilon, màng giấy cellulose
nhưng vẫn duy trì được khả năng gắn kết với các nhóm chất hiển thị khác.

Kỹ thuật lai Northern (Northern blotting)
Lai Northern là phương pháp xác định kích thước và số lượng các phân
tử mARN trong ARN tổng số hoặc poly(A) +ARN. Để làm việc này, trước hết
ARN tách đoạn bằng điện di trên gel agarose biến tính sau đó được thấm
truyền lên màng cellulose, nitro-cellulose, lên kính hay lên màng nilon. Về
nguyên tắc, lai Northern cũng tương tự như lai Sounthern. Điều khác biệt là
trong lai Northern, ARN được thấm truyền và sau đó được lai với ADN hoặc
ARN đánh dấu còn ở lai SountherADN được thấ truyền sau đó được lai với
ADN đánh dấu. Kỹ thuật này nhằm đánh giá hoạt động sao chép của gen
chuyển khi được gắn vào genome của cây chủ.
Kỹ thuật lai Western (Western blotting)
Kỹ thuật lai Western là kỹ thuật lai protein-protein. Protein mẫu sau khi
được phân tách bằng điện di trên gel acrylamide sẽ được chuyển sang cố định
trên một chất giá thể cũng bằng điện di. Chất giá thể thường sử dụng là các
loại màng khác nhau như màng nitrocellulose, diazophenylythio (DPT),
diazobenzyloxymethyl (DBM), nilon... Protein đã cố định trên màng sẽ được
phát hiện bằng phản ứng miễn dịch kép. Kỹ thuật lai Western là bước quan
trọng nhằm đánh giá mức độ biểu hiện của gen chuyển khi được đưa vào cây
ở mức độ protein và thể hiện tính trạng.
9


2.1.3 Khả năng chuyển nạp gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
Chuyển nạp gen thành công trên cây trồng đã được ghi nhận bằng cách sử
dụng vectơ Ti-plasmid, thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens để đưa
gen mong muốn vào trong bộ gen cây trồng.
Chi Agrobacterium được chia làm một số loài dựa vào triệu chứng gây
bệnh và kí chủ. Một số loài thuộc chi Agrobacterium như: A. radiobacter (loài
này không gây bệnh cho cây), A. tumefaciens và A. rhizogens gây bệnh khối u
(crown gall) và bệnh rễ tơ (hairy root disease), A. rubi gây bệnh khối u trên

cây mía, A. vitis gây bệnh khối u trên cây nho và một số loài cây khác (Otten
và ctv, 1984).

Hình 2.1. Một số khối u do vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens tạo ra. A:
một khối u rất lớn hình thành trên thân cây hoa Hồng, B: một dãy khối u
nằm trên nhánh của cây Nho.
Agrobacterium tumefaciens là loài vi khuẩn được sử dụng phổ biến
nhất trong chuyển nạp gen. Agrobacterium tumefaciens thuộc vi khuẩn đất,
gram âm, hình que, có khả năng di động (có 5-11 lông roi), không sinh bào tử
và cùng họ với vi khuẩn cố định đạm Rhizobium (Deacon và ctv, 2005). Vi
khuẩn Agrobacterium tumefaciens là vi khuẩn hiếu khí, phát triển tối ưu ở
nhiệt độ 290C. Agrobacterium tumefaciens là tác nhân gây bệnh cho cây do nó
có khả năng chuyển T-DNA vào tế bào cây chủ (Hansen và Chilton, 1999,
Gelvin, 2000), sau đó T-DNA này hợp nhất vào bộ gen của tế bào cây chủ dẫn
10


đến hình thành khối u. Khối u được hình thành trên rễ (phần nằm trên mặt đất)
và đỉnh của nhiều loài cây hai lá mầm, một số loài cây ăn quả như táo, lê, đào,
nho và những cây cảnh như hoa hồng. Khi tế bào cây bị tổn thương, tế bào vi
khuẩn sẽ di chuyển đến vị trí vết thương và xâm nhập vào cây qua vết thương
đó. Vi khuẩn độc mang một hoặc nhiều plasmid, một trong số đó có mang gen
tạo khối u và được biết với tên gọi là Ti-plasmid. Ti-plasmid cũng mang các
gen để xác định kí chủ và triệu chứng khi nhiễm vào cây. Những vi khuẩn
không mang Ti-plasmid được xem như là vi khuẩn không độc và không có khả
năng gây bệnh khối u cho cây. Khối u đầu tiên xuất hiện nhỏ mầu trắng, sau
lớn dần và xuất hiện các vết lốm đốm nâu đen do các tế bào ngoại biên chết đi
(hình II.1 và II.2). Các khối u có thể mềm và xốp, có thể bị vỡ vụn khi chạm
vào, nhưng cũng có thể cứng và xuất hiện các u nhỏ hoặc nhiều mấu. Các khối
u có đường kính đến 30 cm nhưng phổ biến là 5-10 cm. Cây bị nhiễm vi khuẩn

sẽ trở nên còi cọc, lá úa vàng và rất nhạy cảm với các điều kiện môi trường.
Khi xâm nhiễm vào cây, một phần gen trên Ti-plasmid sẽ gắn vào nhiễm sắc
thể của cây làm cho các tế bào phát triển mạnh và sản xuất ra một chất đặc biệt
gọi là Opine. Vi khuẩn sẽ sử dụng chất này làm nguồn cacbon cho các hoạt
động biến dưỡng (Zhu và ctv, 2000).[23]

Hình 2.2. Một khối u do vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens tạo ra

11


Bộ nhiễm sắc thể vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens có kiến trúc
vòng, kích thước 2,6 Mb. Ngoài ra vi khuẩn còn mang plasmid lớn có kích
thước 200-800 kbp (Gelvin, 2003)[19], phần lớn những gen có liên quan đến
sự hình thành khối u ở thực vật đều nằm trong plasmid này nên được gọi là
Ti-plasmid.
2.1.3.1. Ti-plasmid

Ti-plasmid là một phân tử DNA sợi đôi mạch vòng nằm tách biệt với nhiễm
sắc thể và có khả năng nhân lên một cách độc lập trong tế bào vi khuẩn. Việc
xác định Ti-plasmid như một nguyên lý tạo bướu TIP (tumor inducing
principle) đã đánh dấu bước khởi động của một giai đoạn mới trong nghiên
cứu về Agrobacterium tumefaciens. Điều này đã mở ra khả năng nghiên cứu
cấu trúc và chức năng của plasmid bằng kỹ thuật di truyền phân tử (Bùi Chí
Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999)[2].
Cấu trúc chung của một Ti-plasmid gồm: vùng T-DNA - trình tự mã
hoá được chuyển vào trong cây, vùng mang các gen vir - vùng trực tiếp tham
gia tạo T-DNA sợi đơn và chuyển T-DNA này vào tế bào cây, vùng rep - cần
cho sự tái bản của Ti-plasmid, vị trí tra và trb - tham gia vào quá trình chuyển
tiếp hợp của Ti-plasmid, các gen cần cho việc hấp thu và chuyển hoá các

opine (Zhu và ctv, 2000). Hai yếu tố quan trọng trong cấu trúc của Ti-plasmid
cần cho sự chuyển gen vào cây là đoạn T- DNA bao gồm cả trình tự 25 bp ở
hai bờ của đoạn T- DNA và gen vir (Gelvin, 2003)[19].
2.1.3.2. Chức năng của T-DNA
T-DNA là một đoạn DNA có kích thước 10-30 kbp (Gelvin, 2003), có
mang các gen mã hoá cho việc tổng hợp auxins, cytokinins, opines và các
gen gây khối u. Trong Ti-plasmid, vị trí của T-DNA được giới hạn bởi các
trình tự lập lại có chiều dài khoảng 25 bp nằm ở 2 đầu gọi là bờ phải và bờ
trái. Tuy nhiên, bờ trái của T-DNA bị mất không ảnh hưởng đến tính độc
nhiều, trong khi đó bờ phải lại cần thiết và được đề nghị rằng tiến trình
12


chuyển nạp diễn ra với bờ phải trước rồi tiến dần về phía trái. Việc đảo ngược
bờ phải sẽ làm yếu đi khả năng tạo khối u (Gelvin, 2003)[19].
T-DNA mã hóa một vài protein, protein này biểu hiện trong tế bào cây
được chuyển gen sẽ làm thay đổi hình thái của cây. Theo Binns và Costantino
(1998), T-DNA mã hóa cho 13 protein và những vùng không sao mã của các
gen được chuyển mang nhiều đặc điểm của các gen trong nhân của thực vật,
thí dụ như kiểu hộp TATA (TATA box) và hộp CAAT (CAAT box). Một nhóm
các gen của T-DNA điều khiển tổng hợp các hormon sinh trưởng của cây,
những hormon này làm các tế bào tăng sinh và làm thay đổi hình dạng bên
ngoài. Sản phẩm của gen iaaM và gen iaaH điều khiển sự chuyển hoá
tryptophan thông qua indolacetamin thành indolacetic axit (auxin). Sản phẩm
của gen ipt giúp gắn kết isopentenyl pyrophosphat với AMP (Binns và
Costantino, 1998)[10] và các enzyme trong cây được cho là chuyển hoá
isopentenyl-AMP thành cytokinin zeatin bằng cách loại bỏ nhóm
phosphoribosyl và loại bỏ phân tử hydro của một nhóm methyl của
isopentenyl. Hai gen trên T-DNA khác được cho là có chức năng trong tạo
khối u là 5 và tml (cũng còn gọi là 6b). Sản phẩm của gen 5 điều khiển sinh

tổng hợp indole-3-lactate, đó là một chất đồng đẳng với auxin. Trong khi đó
gen tml (cũng còn gọi là 6b) làm tăng mức độ nhạy cảm của các tế bào cây
với phytohormon bằng một cơ chế chưa được giải thích. Gen tml có thể kích
thích tạo các khối u ngay cả khi vắng mặt các gen gây khối u khác.
Một nhóm gen được chuyển thứ hai điều khiển sản xuất nguồn dinh
dưỡng cho vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens phát triển, đó là các opines.
Đây là một dạng kết hợp giữa một amino axit với một ceto (keto) axit hoặc
với một đường (Dessaux và ctv, 1998)[11]. Các tế bào chuyển gen tổng hợp
và tiết ra một số lượng lớn các opines. Các opines này hấp dẫn vi khuẩn mang
kiểu gen tiêu biểu (bên ngoài vùng T-DNA và thường trên plasmid độc) cần
cho việc phân giải các opines được tổng hợp từ khối u (Ziemienowicz, 2001)
13


[24]. Dựa trên các kiểu opines được hình thành từ các khối u mà phân chia
nhóm vi khuẩn Agrobacterium thành các chủng như là: octopine, nopaline,
succinamopine và agropine. Hiện có ít nhất là 20 loại opine khác nhau, mỗi
chủng tạo ra và phân giải một nhóm opine chuyên biệt. Chẳng hạn như, các
Ti-plasmid kiểu octopine điều khiển tổng hợp ít nhất 8 opine. Gen ocs mã hóa
cho octopine synthase, enzym này gắn pyruvate với arginine, lysine, histidine
hoặc ornithine để tạo ra octopine, lysopine, histopine hoặc octopinic axit và
tất cả những opine này đều được tìm thấy trong các khối u (Dessaux và ctv,
1998)[11]. Sản phẩm của gen mas2’ được cho là làm kết nối glutamine hoặc
glutamic axit với glucoz (mặc dù điều này chưa được chứng minh bằng thực
nghiệm), trong khi đó sản phẩm của mas1’ lại làm giảm bớt các dạng trung
gian mannopine và mannopinic axit. Sản phẩm của gen ags sẽ làm lacto hóa
mannopine thành agropine. Mannopine và agropine cũng có thể lactate hóa
thành agropinic axit (Dessaux và ctv, 1998)[11]. Bởi vậy, các khối u được tạo
ra bởi Ti-plasmid kiểu octopine có thể tạo 4 loại octopine và 4 kiểu thuộc
nhóm mannityl opine.

2.1.3.3. Chức năng của gen Vir

Quá trình chuyển T-DNA từ vi khuẩn A. tumefaciens sang tế bào cây
chủ được thực hiện bởi hoạt động của các gen vir. Có ít nhất 25 gen được
nhận biết trong 7 đơn vị phiên mã là: virA, virB, virC, virD, virE, virG, virF
và vùng này có kích thước khoảng 30- 40 kbp (de la Riva và ctv, 1998). Theo
Stachel và ctv. (1987) vùng này có 20 gen nằm trên 6 operon, các gen đó là:
virA, virB, virC, virD, virE và virG. Những gen vir này có vai trò trong việc
tạo sợi đơn T-DNA trong vi khuẩn và chuyển nó vào tế bào cây chủ rồi gắn
vào nhiễm sắc thể cây chủ.
Các gen vir có vai trò trong việc nhận diện ra vết thương của cây thông
qua tín hiệu hoá học (Acetosyringone) tiết từ vết thương. Các tín hiệu hoá học
14


từ vết thương ở tế bào cây chủ tạo ra được nhận biết trước tiên bởi protein
virA, rồi đến protein virG để làm kích hoạt các gen độc khác ở vùng vir, tạo
ra các protein cần thiết. Sự cảm ứng gen vir phụ thuộc vào nhiệt độ thấp và
điều kiện pH axit. Hệ thống điều hoà gen vir hoạt động thông qua hai gen
độc: virA và virG. Biểu hiện cơ bản của gen virA tổng hợp nên protein nằm
trong màng tế bào. Protein virA đáp ứng với sự trao đổi chất của vết thương
của cây và có thể đáp ứng nhạy cảm với sự thay đổi của môi trường. Với một
nồng độ AS thích hợp virA có thể được kích thích bởi đường, các opine khối u
hoặc amino axit (Ziemienowicz, 2001)[25]. Protein virA sẽ tự phosphoryl
hoá, sự tự phosphoryl hoá này sẽ làm protein nội bào virG được phosphoryl
hoá bởi aspartic axit còn lại sau khi virA tự phosphoryl hoá và kích hoạt sao
mã cho tất cả các gen vir. Các promoter của gen vir có kích thước khoảng 12
bp trong trình tự “vir box” (Winans và ctv, 1987). Sự phosphoryl hoá làm cho
protein virG gắn kết vào “vir boxes” và kích hoạt sự sao mã của các gen
virBCDEFGH (Ziemienowicz, 2001)[24].

Các gen vir có vai trò trong việc tạo sợi đơn T-DNA trong vi khuẩn
(hình II.3) và đưa sợi đơn T-DNA vào trong tế bào cây. Các protein được mã
hoá bởi gen virD và virE thực hiện chức năng tạo ra phức hợp T-DNA.
Protein virD2 là một endonucleaz, protein này có chức năng xúc tác cắt sợi TDNA ở vị trí 5’của bờ phải sau đó virD1 cắt rời sợi T-DNA tại vị trí đầu 3 ’ của
bờ trái tạo thành một sợi đơn. Ngoài chức năng cắt sợi T-DNA virD2 còn có
chức năng khác như bám dính vào đầu 5’ để tránh sự tác động của enzim
nucleaz và chuyển sợi đơn T-DNA vào nhân tế bào thực vật vì trong virD2
còn chứa một tín hiệu gọi là tín hiệu định vị trong nhân (nuclear locolization
signal). Hai giả thuyết về chức năng của protein VirD2 trong sự kết nạp TDNA đã được đề nghị: virD2 vừa làm nhiệm vụ của một enzim integraz vừa
làm nhiệm vụ của một enzim ligaz (Ziemienowicz, 2001)[24].
VirE2 là một protein nối kết vào sợi đơn T-DNA, nó sẽ bảo vệ T-DNA
15


khỏi sự phân giải của các enzim nucleaz trong tế bào cây (Deng và ctv, 1998)
giống như virD2, virE2 cũng có chứa một tín hiệu định vị trong nhân. VirB có
chức năng hình thành một cái kênh xuyên qua vách tế bào thực vật, giúp
chuyển sợi đơn T-DNA vượt xuyên qua tế bào vi khuẩn đến vách, màng tế
bào thực vật và sau đó vượt qua các lỗ nhân để vào nhân tế bào. Hai sản phẩm
của gen vir cũng được cho là có chức năng trong việc tạo T-DNA sợi đơn là:
virC1 và virC2. virC1 đã được thấy gắn kết vào vùng “overdrive”, vùng này
nằm gần bờ phải, và bởi vậy giúp tăng cường sự cắt T-DNA ở vị trí bờ vai của
virD1/virD2 endonucleaz (Gelvin, 2003)[19]. Một số tác giả khác cho rằng
virC1 và virC2 không cần cho tạo T-DNA sợi đơn. Nhưng khi vắng mặt hai
protein này thì hiệu quả chuyển nạp T-DNA vào cây khá thấp. Do đó đề nghị
rằng chúng có chức năng trong việc tăng cường sản xuất sợi đơn T-DNA (Zhu
và ctv, 2000)[23]. Cùng với protein virD4, mười một protein virB, virE2 và
virF tham gia đưa T-DNA vào nhân. Hệ thống chuyển nạp T-DNA được mã
hóa bởi operon virB, operon này mang 11 gen. Sự chuyển phức hợp T-DNA
dựa trên chiên mao (pili) do operon virB mã hoá và đột biến ở bất kì gen nào

trong số 11 gen của operon này đều làm mất khả năng tạo pili và tạo khối u.
Các protein virB điều khiển tạo chiên mao này (chiên mao này tương tự như
chiên mao tiếp hợp) và virB2 là tiểu phần chính của chiên mao này. Hai
protein virB là virB4 và virB11 có hoạt tính ATPaz và được cho là cung cấp
năng lượng cho việc xuất các tiểu phần protein khác, cho vận chuyển T-DNA,
hoặc cả hai. Hệ thống virB đưa T-DNA tới tế bào chất của tế bào cây, nơi đây
các bước cần cho chuyển T-DNA vào nhân và kết nạp với DNA của cây được
thực hiện (Zhu và ctv, 2000)[23]. Cầu nối virB có thể gắn kết với phức hợp TDNA bởi protein virD4, protein này nằm trong màng và rất cần cho việc
chuyển nạp. Hệ thống virB/virD4 đưa phức hợp T-DNA–virD2 và protein
virE2 vào tế bào chất của tế bào cây, phức hợp T-DNA cuối cùng được tạo ra
bằng cách phủ T-DNA với protein virE2 (Ziemienowicz, 2001).
16


2.1.3.4. Cơ chế lây nhiễm

Vi khuẩn A. tumefaciens được tìm thấy ở trên và xung quanh bề mặt rễ.
Nhưng vi khuẩn chỉ xâm nhiễm được vào cây khi cây bị tổn thương do nhiều
nguyên nhân. Điều này có thể dễ dàng được chứng minh bằng các thí nghiệm.
Trong điều kiện tự nhiên, các tế bào vi khuẩn được dẫn dụ đến vết thương
nhờ các tín hiệu hoá học. Tuy nhiên, chủng vi khuẩn có mang Ti-plasmid sẽ
đáp ứng mạnh hơn bởi vì chúng nhận diện được các hợp chất phenolic tiết ra
từ vết thương như acetosyringone (AS).
Chất này có tác dụng rất mạnh dù ở nồng độ thấp (10 -7 M). Bởi vậy,
một trong những chức năng của Ti-plasmid là mã hoá cho các thụ thể
(receptor) nhận biết các hợp chất hoá học. Những thụ thể này nằm trên màng
tế bào vi khuẩn và có thể giúp cho vi khuẩn nhận biết ra các vùng bị tổn
thương. Acetosyringone đóng vai trò quan trọng trong tiến trình xâm nhiễm. ở
nồng độ cao (10-5 – 10-4 M) hơn nó sẽ kích hoạt các gen vir trên Ti-plasmid
(Deacon và ctv, 2005). Các gen vir được kích hoạt tốt nhất ở nhiệt độ 25270C. Tuy nhiên, hầu hết các chủng Agrobacterium hoạt động ổn định ở nhiệt

độ 18-200C (Gelvin, 2003).

Hình 2.3: Quá trình tạo phức hợp sợi đơn T-DNA
Sau khi được kích hoạt, các gen vir sẽ điều khiển quá trình tạo T-DNA
sợi đơn trong tế bào vi khuẩn (hình II.3). Quá trình tạo T-DNA sợi đơn được
thực hiện trong tế bào vi khuẩn và do các protein virD1 và virD2 thực hiện.
Sau đó protein virD2 gắn vào sợi đơn T-DNA để tạo thành phức hợp T-DNA.
17


Ngoài virD1, virD2 người ta còn cho rằng virC1 và virC2 cũng tham gia vào
quá trình tạo T-DNA sợi đơn. Phức hợp T-DNA-virD2 cùng với protein virE2
được chuyển vào trong tế bào cây thông qua hệ thống chuyển nạp được mã
hoá bởi các gen virB. Cùng với một số thành phần trong tế bào chất của tế bào
cây, các protein của vi khuẩn sẽ tiếp tục đưa phức hợp T-DNA vào trong nhân
tế bào (Ziemienowicz, 2001).
Trong nhân tế bào cây, T-DNA được kết nạp vào bộ gen của cây (hình
II.4) không theo một quy luật tái tổ hợp nào cả. Mô hình cơ sở cho sự kết nạp
T-DNA vào bộ gen của cây đã được đề nghị. Theo mô hình này, đầu tiên đầu
3’ của T-DNA nhận diện các đoạn tương đồng với DNA của cây và gắn vào.
Cả việc tách sợi DNA của cây và overhang đầu 3’ của T-DNA đều được
enzyme nucleaz thực hiện. Cuối cùng nucleotide gắn với virD2 tìm các đoạn
vi tương đồng (microhomology) trên DNA của cây và gắn vào. Sự gắn kết
này mang cầu nối phosphotyrosine có ái lực điện tử của đầu 5’ đến gần đầu 3’
nucleophilic của DNA cây mà bị tách ra. Cuối cùng sự gắn kết trên sợi DNA
của cây được hoàn thành và cây chuẩn bị một cơ chế sinh tổng hợp đoạn TDNA dẫn đến sự kết nạp của T-DNA hoàn thành.
Cuối cùng, sau khi sự kết nạp hoàn thành các gen trên T-DNA hoạt
động tổng
hợp

nên

các

sản

phẩm cần
thiết
vi

cho
khuẩn
Hình 2.4: Quá trình kết nạp T-DNA vào bộ gen của tế bào cây

(Ziemienowicz, 2001)[24]. Các opines được tạo ra từ các khối u do vi khuẩn
Agrobacterium nhiễm vào được vi khuẩn biến dưỡng nhờ vào các gen ở vùng
18