xây dựng quy trình chuyển gen gus vào giống sắn km 94 thông qua vi khuẩn agrobacterium tumefaciens

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC TÂY BẮC


TRỊNH THỊ THƢƠNG


XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHUYỂN GEN GUS VÀO
GIỐNG SẮN KM 94 THÔNG QUA VI KHUẨN
AGROBACTERIUM TUMEFACIENS


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC





Sơn La, năm 2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC TÂY BẮC




TRỊNH THỊ THƢƠNG


XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHUYỂN GEN GUS VÀO

GIỐNG SẮN KM 94 THÔNG QUA VI KHUẨN
AGROBACTERIUM TUMEFACIENS


Chuyên ngành: Sinh lý thực vật


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC


Ngƣời hƣớng dẫn: ThS. Đỗ Hải Lan


Sơn La, năm 2014
LỜI CẢM ƠN

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cô Đỗ Hải Lan người trực tiếp
hướng dẫn, tận tình giúp đỡ và truyền thụ những kiến thức, kinh nghiệm cho em
trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận.
Em xin cảm ơn Ban chủ nhiệm khoa Sinh – Hóa , các thầy, cô giáo
phòng thực hành Di truyền – Thực vật đã tạo điều kiện cho chúng em về cơ sở
vật chất, trang thiết bị.
Em xin chân thành cảm ơn Phòng KHCN – HTQT - Trường Đại học
Tây Bắc đã giúp đỡ, ủng hộ nhiệt tình cho tôi trong suốt thời gian qua.
Cuối cùng, em xin gửi lời tri ân tới tất cả những người thân trong gia
đình cùng toàn thể bạn bè đã hết lòng quan tâm, giúp đỡ em trong suốt thời gian
thực hiện khóa luận.
Em xin chân thành cảm ơn!
Sơn La, tháng 05 năm 2014
Sinh viên thực hiện

Trịnh Thị Thƣơng
KÝ HIỆU VIẾT TẮT


AS : Acetosyringone (3,5-dimethoxy-4-hydrroxy Acetophenone)
A. tumefaciens: Agrobacterium tumefaciens
BAP : 6-benzylaminopurin
CIAT: Centro Internacional de Agricultura Tropical
DNA : Deoxiribonucleic Acid
FAO : Food and Agriculture Organization
Gus : β-1,4-Glucuronidase
MS : Murashige and Skoog, 1962
OD: Optical density
Ti-plasmid : Tumor-Inclucing Plasmid
T-DNA : Transfer-DNA
Vir : Virulence
VTM: Vitamin
X-gluc : 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 1
1. Lí do chọn đề tài 1
2. Mục tiêu đề tài 2
3. Nội dung nghiên cứu 2
4. Đối tượng và thời gian nghiên cứu 2
4.1. Đối tượng nghiên cứu 2
4.2. Thời gian nghiên cứu 2
5. Địa điểm và phạm vi nghiên cứu 2
5.1. Địa điểm 2
5.2. Phạm vi nghiên cứu 2

Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Giới thiệu chung về cây sắn 3
1.1.1. Nguồn gốc 3
1.1.2. Vị trí phân loại 3
1.1.3. Tính đa dạng và phân bố 3
1.1.4. Giá trị của cây sắn 4
1.1.5. Tình hình sản xuất sắn trên thế giới và Việt Nam 5
1.1.5.1. Tình hình sản xuất sắn trên thế giới 5
1.1.5.2. Tình hình sản xuất sắn ở Việt Nam 7
1.2. Tổng quan tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực của đề tài ở trong và ngoài
nước 8
1.2.1. Trên thế giới 8
1.2.2. Ở Việt Nam 10
1.3. Vi khuẩn A.tumefaciens và hiện tượng biến nạp gen ở thực vật 10
1.3.1. Giới thiệu chung về vi khuẩn A. tumefaciens 11
1.3.2. Cấu trúc và chức năng của Ti-plasmid 12
1.3.3. Cấu trúc và chức năng của T-ADN 13
1.3.4. Cơ chế phân tử của việc chuyển gen thông qua A. tumefaciens 13
1.4. Gen chỉ thị chọn lọc 14
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHA
́
P NGHIÊN CỨU 16
2.1. Vật liệu 16
2.1.1. Vật liệu thực vật 16
2.1.2. Vi khuẩn 16
2.2. Hóa chất, thiết bị và môi trường nuôi cấy 16
2.2.1. Hóa chất 16
2.2.2. Thiết bị 16
2.2.3. Môi trường sử dụng nuôi cấy mẫu 16
2.3. Phương pháp nghiên cứu 17

2.3.2. Tạo vật liệu chuyển gen 17
2.3.3 Các bước chuyển gen 19
2.3.4. Phương pháp xác định hiệu quả chuyển gen bằng nhuộm hóa tế bào 21
2.4. Xây dựng các công thức thí nghiệm 22
2.5. Xác định chỉ tiêu cho mỗi công thức 22
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 23
1. Biến nạp vi khuẩn mang gen Gus vào mảnh lá chưa trưởng thành của giống
sắn KM 94 23
2. Biến nạp vi khuẩn mang gen Gus vào đoạn thân non của giống sắn KM 94 26
3. Biến nạp vi khuẩn mang gen Gus vào mảnh lá mầm của giống sắn KM94 29
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 34
1. Kết luận 34
2. Kiến nghị 34
TÀI LIỆU THAM KHẢO 35

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1. Thành phần môi trường MS (Murashige và Skoog) 16
Bảng 2. Thành phần của môi trường sử dụng nuôi cấy mẫu 17
Bảng 3. Tỉ lệ tạo mô sẹo của mảnh lá chưa trưởng thànhgiống sắn KM 94 23
Bảng 4. Tỉ lệ mẫu bắt màu nhuộm Gus của mảnh lá chưa trưởng thành giống sắn
KM 94 25
Bảng 5. Tỉ lệ tạo mô sẹo của đoạn thân non giống sắn KM 94 27
Bảng 6. Tỉ lệ mẫu bắt màu nhuộm Gus của đoạn thân non giống sắn KM 94 28
Bảng 7. Tỉ lệ tạo mô sẹo của mảnh lá mầm giống sắn KM 94 30
Bảng 8. Tỉ lệ mẫu bắt màu nhộm Gus của mảnh lá mầm giống sắn KM 94 31

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1. Ti-Plasmid 12

Hình 2. Mảnh lá chưa trưởng thành và đoạn thân đặt trên môi trường tạo mô sẹo
18
Hình 4. Mảnh lá non chưa trưởng thànhcủa giống sắn KM 94 cảm ứng tạo mô
sẹo 23
Hình 5. Mô sẹo của mảnh lá chưa trưởng thành có mặt gen Gus 25
Hình 6. Đoạn thân non giống sắn KM 94 cảm ứng tạo mô sẹo 26
Hình 7. Mô sẹo của đoạn thân non giống sắn KM 94 có mặt gen Gus 28
Hình 8. Mảnh lá mầm giống sắn KM 94 cảm ứng tạo mô sẹo 29
Hình 9. Mô sẹo mảnh lá mầm của giống sắn KM 94 có mặt gen Gus 31


1
MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Sắn (Manihot esculenta Crantz) là cây có củ được trồng ở vùng cận nhiệt
đới của Châu Phi, Châu Á và Mỹ Latin, đáp ứng nhu cầu cho 500 triệu người.
Củ có hàm lượng chất khô chiếm 20% trong đó 80% là tinh bột. Mục đích sử
dụng sắn khác nhau ở các vùng, ở Châu Phi, sắn được sử dụng chủ yếu làm
lương thực, trong khi đó ở Thái Lan, một nửa sản lượng 20 triệu tấn sắn hàng
năm được sử dụng cho công nghiệp tinh bột. Với sự phát triển kinh tế, lượng
tinh bột cần cho công nghiệp tăng lên ở các quốc gia đang phát triển. Mặc dù
các nước nhiệt đới có nguồn tinh bột sắn (hoặc khoai tây, củ cải), nhưng vẫn
phải nhập khẩu tinh bột ngô đắt đỏ. Để đủ lượng tinh bột sử dụng, tinh bột phải
được biến đổi theo nhiều cách khác nhau. Nếu tinh bột sắn với những đặc tính
mong muốn được tạo ra, đây sẽ là nguồn tinh bột cạnh tranh với các nguồn tinh
bột khác, người nông dân có thể trồng sắn để tăng thu nhập [27].
Trên thực tế, lai giống truyền thống khó có khả năng cung cấp giải pháp
toàn diện để cải thiện cây trồng cho phù hợp với nhu cầu của người nông dân và
sản xuất thương mại khác nhau ở vùng nhiệt đới. Việc áp dụng công nghệ biến đổi
gen để đưa những tính trạng nông dân mong muốn vào giống cây trồng tạo ra dòng

ưu tú có năng suất cao, có hàm lượng tinh bột cao nhằm đáp ứng giải quyết các vấn
đề thực tiễn cũng như khoa học là hết sức cần thiết, đặc biệt trong sản xuất nhiên
liệu sinh học, hàm lượng tinh bột được đánh giá cao hơn năng suất [24].
KM 94 là một trong những giống sắn chủ lực ở Việt Nam do năng suất và
hàm lượng tinh bột ổn định và cao hơn các giống mới, được lựa chọn làm đối
tượng chuyển gen. Trong đó gen chỉ thị Gus thường được sử dụng để đánh giá
hiệu quả của một quy trình chuyển gen trước khi tiến hành chuyển các gen đích
mong muốn. Do vậy để tạo tiền đề cho những nghiên cứu tạo ra giống sắn mang
gen đích mong muốn và đạt kết quả cao cần phải xây dựng một quy trình chuyển
gen hoàn chỉnh.
Xuất phát từ thực tế đó, tôi tiến hành thực hiện đề tài “Xây dựng quy
trình chuyển gen Gus vào giống sắn KM 94 thông qua vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens”

2
2. Mục tiêu đề tài
Xây dựng được quy trình chuyển gen Gus vào giống sắn KM 94 thông qua
vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.
3. Nội dung nghiên cứu
- Tạo nguyên liệu chuyển gen: nhân nhanh giống sắn KM 94.
- Tiến hành quá trình biến nạp vi khuẩn A. Tumefaciens và nuôi cấy mẫu
của giống sắn KM 94.
- Kiểm tra và xác định hiệu quả chuyển gen.
4. Đối tƣợng và thời gian nghiên cứu
4.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Quy trình chuyển gen Gus vào giống sắn KM 94 thông qua vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens
4.2. Thời gian nghiên cứu
Khóa luận được thực hiện từ tháng 9/2013 đến 5/2014, chia làm các giai đoạn:
- Trong tháng 9/2013: Thu thập thông tin liên quan đến khóa luận.

- Từ tháng 10/2013 – 4/2014: Tiến hành biến nạp gen Gus, nuôi cấy mẫu
của giống sắn KM 94 và kiểm tra sự có mặt của gen Gus.
- Tháng 5/2014: Viết và bảo vệ khóa luận.
5. Địa điểm và phạm vi nghiên cứu
5.1. Địa điểm
Phòng thực hành Thực vật – Di truyền – Phương pháp – Vi sinh, khoa Sinh
Hóa, trường đại học Tây Bắc, thành phố Sơn La, tỉnh Sơn La.
5.2. Phạm vi nghiên cứu
Sự có mặt của gen Gus ở giống sắn KM 94.

3
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu chung về cây sắn
1.1.1. Nguồn gốc
Lịch sử tiến hóa của cây sắn cũng như các cây có củ khác là rất khó xác
định được chính xác nguồn gốc phát sinh. Vì những di chỉ khảo cổ còn lại đối
với các bộ phận của cây có bột rất hiếm hoi. Qua rất nhiều tranh cãi thì gần đây
nhiều tác giả kết luận: Cây sắn có nguồn gốc phức tạp và có 4 trung tâm phát
sinh là ở Braxin có 2 trung tâm và còn lại là ở Mêhicô và Bolivia. Sắn được
trồng cách đây khoảng 3000 – 7000 năm [9].

1.1.2. Vị trí phân loại
Sắn hay khoai mì có tên khoa học là Manihot esculenta Crantz thuộc
ngành Magnoliophyta, lớp Magnoliopsida, bộ Tricorceae, họ Euphorbiaceae, chi
Manihot. Sắn có số lượng nhiễm sắc thể 2n = 36 là loại cây mang lại giá trị kinh
tế cũng như giá trị dinh dưỡng cao.
Sắn gồm 2 loại: Sắn đắng và sắn ngọt.
Sắn đắng: là sắn có hàm lượng acid hydrocyanic lớn hơn 50mg/kg sắn tươi.
Sắn ngọt: là sắn có hàm lượng acid hydrocyanic ít hơn 50mg/kg sắn tươi [9]

1.1.3. Tính đa dạng và phân bố
Trong chi Manihot có 19 giống và trên 100 loài, trong đó có một số giống
sắn phổ biến ở Việt Nam như: KM 94, KM 140, KM 98-5, KM 98-1, SM 937-
26, KM 419, KM 325
Trong đề tài này chúng tôi chỉ nghiên cứu giống sắn: KM 94
*Đặc điểm giống sắn KM 94
KM 94 có tên gốc là KU50 được nhập nội từ CIAT/Thái Lan trong bộ
giống khảo nghiệm Liên Á năm 1990. KM 94 là con lai của tổ hợp lai Rayong1
× Rayong 90.
Đặc điểm: KM 94 thuộc nhóm sắn đắng, thân xanh, hơi cong ở phần gốc,
không phân nhánh ở đồng bằng nhưng lại phân nhánh cấp một ở những tỉnh miền

4
núi. Giống ít bị nhiễm bệnh cháy lá, củ đồng đều, thịt củ màu trắng, năng suất củ
tươi: 33,0 tấn/ha, hàm lượng tinh bột 28,7%, thời gian thu hoạch 9-11 tháng.
Giống sắn KM 94 là giống sắn được trồng phổ biến nhất trên phạm vi
toàn quốc. Điển hình là Tây Ninh và Đồng Nai đã áp dụng giống KM 94 với
diện tích hàng trăm ha/hộ, đạt năng suất trên 30 tấn/ha [9].
1.1.4. Giá trị của cây sắn
Cây sắn có giá trị kinh tế lớn về nhiều mặt. Sắn là nguồn lương thực đáng
kể cho con người, là nguồn thức ăn dồi dào cho chăn nuôi, nguồn nguyên liệu
cho công nghiệp. Tất cả các bộ phận của cây sắn đều có thể sử dụng vào mục
đích kinh tế.
 Thành phần hóa học chính của củ sắn là gluxit, ở củ sắn tươi có tỷ lệ các
chất khoáng và vitamin khá cao đặc biệt là canxi. Tuy nhiên, sắn có tỷ lệ
protein và lipit thấp, vì vậy khi sử dụng sắn làm lương thực phải bổ sung thêm
thức ăn giàu đạm và lipit mới cung cấp đủ năng lượng cho cơ thể.
 Sử dụng sắn làm lương thực: Thực tế ở nhiều vùng trên thế giới đã coi sắn
và các sản phẩm từ sắn là nguồn lương thực chính, đặc biệt là các nước Châu
Phi. Sắn đứng vị trí thư tư trên thế giới về mặt cung cấp năng lượng cho con

người. Trong thập kỉ 20, có khoảng 450-500 triệu người ở 26 nước nhiệt đới sử
dụng nguồn năng lượng tứ sắn tới 300 kcal/ngày. Từ sau năm 1991, đặc biệt từ
năm 1996 đến nay nhờ sự tiến bộ trong công tác nghiên cứu tuyển chọn giống
sắn mới và khuyến nông sắn, với việc giới thiệu giống sắn mới KM 60, KM 94
vào sản xuất đã tạo ra bước đột phá trong nghề trồng sắn ở Việt Nam cùng với
việc đưa 42 nhà máy chế biến tinh bột sắn vào hoạt động, đã đánh dấu sự
chuyển dịch vị trí cây sắn từ cây lương thực thành cây trồng hàng hóa [9].
 Sử dụng sắn làm thức ăn gia súc: Bên cạnh sử dụng lương thực và chế biến
tinh bột phục vụ cho các ngành công nghiệp, sắn còn là nguồn thức ăn cho gia
súc. Ở nước ta, sắn là nguồn thức ăn quan trọng trong chăn nuôi của các hộ gia
đình. Trong những năm gần đây, bên cạnh phối hợp sắn vào khẩu phần thức ăn
hỗn hợp trong công nghiệp chế biến thức ăn gia súc, việc nghiên cứu ủ chua sắn
củ tươi phục vụ chăn nuôi lợn quy mô gia đình đã được chú ý và đã xây dựng

5
thành quy trình kỹ thuật đang được nhiều hộ gia đình áp dụng vào chăn nuôi
lợn ở khu vực miền Trung.
 Chế biến tinh bột từ củ sắn: Củ sắn là nguyên liệu chế biến tinh bột và tinh bột
biến tính. Trong đó Châu Á là lục địa chế biến và xuất khẩu đứng đầu thế giới.
 Sử dụng lá sắn: Lá sắn có chứa nhiều chất dinh dưỡng. Lá sắn ngọt là một
loại rau đối với Châu Phi, lá sắn được bó thành bó bán ở chợ như một loại rau. Ở
Việt Nam, nhân dân ta dùng lá sắn non để luộc ăn hoặc muối chua [9].
1.1.5. Tình hình sản xuất sắn trên thế giới và Việt Nam
1.1.5.1. Tình hình sản xuất sắn trên thế giới
Sản lượng sắn thế giới năm 2006/07 đạt 226,34 triệu tấn củ tươi so với
2005/06 là 211,26 triệu tấn và 1961 là 71,26 triệu tấn. Nước có sản lượng sắn
nhiều nhất thế giới là Nigeria (45,72 triệu tấn), kế đến là Thái Lan (22,58 triệu
tấn) và Indonesia (19,92 triệu tấn). Việt Nam đứng thứ mười trên thế giới về sản
lượng sắn (7,71 triệu tấn). Nước có năng suất sắn cao nhất hiện nay là Ấn Độ
(31,43 tấn/ha), kế đến là Thái Lan (21,09 tấn/ha), so với năng suất sắn bình quân

của thế giới là 12,16 tấn/ha (FAO, 2008).
Trên thế giới, sắn được trồng bởi những hộ nông dân sản xuất nhỏ để làm
lương thực- thực phẩm, thức ăn gia súc và để bán. Sắn chủ yếu trồng trên đất
nghèo và dùng kỹ thuật canh tác truyền thống. Mức tiêu thụ sắn bình quân toàn
thế giới khoảng 18 kg/người/năm. Sản lượng sắn của thế giới được tiêu dùng
trong nước khoảng 85% (lương thực 58%, thức ăn gia súc 28%, chế biến công
nghiệp 3%, hao hụt 11 %), còn lại 15% (gần 30 triệu tấn) được xuất khẩu dưới
dạng sắn lát khô, sắn viên và tinh bột (CIAT, 1993). Nhu cầu sắn làm thức ăn
gia súc trên toàn cầu đang giữ mức độ ổn định trong năm 2006 (FAO, 2007).
Sắn chiếm tỷ trọng cao trong cơ cấu lương thực ở châu Phi, bình quân khoảng
96 kg/người/năm. Zaire là nước sử dụng sắn nhiếu nhất với 391 kg/người/năm
(hoặc 1123 calori/ngày). Nhu cầu sắn làm lương thực chủ yếu tại vùng Saharan
châu Phi cả hai dạng củ tươi và sản phẩm chế biến ước tính khoảng 115 triệu
tấn, tăng hơn năm 2005 khoảng 1 triệu tấn. Buôn bán sắn trên thế giới năm 2006
ước đạt 6,9 triệu tấn sản phẩm, tăng 11% so với năm 2005 (6,2 triệu tấn), giảm

6
14,8% so với năm 2004 (8,1 triệu tấn). Trong đó tinh bột sắn (starch) và bột sắn
(flour) chiếm 3,5 triệu tấn, sắn lát (chips) và sắn viên (pellets) 3,4 triệu tấn [9].
Trung Quốc hiện là nước nhập khẩu sắn nhiều nhất thế giới để làm cồn
sinh học (bio ethanol), tinh bột biến tính (modify starch), thức ăn gia súc và
dùng trong công nghiệp thực phẩm dược liệu. Địa điểm chính tại tỉnh Quảng
Tây. Năm 2005, Trung Quốc đã nhập khẩu 1,03 triệu tấn tinh bột, bột sắn và
3,03 triệu tấn sắn lát, sắn viên. Năm 2006, Trung Quốc đã nhập khẩu 1,15 triệu
tấn tinh bột, bột sắn và 3,40 triệu tấn sắn lát và sắn viên. Thái Lan chiếm trên
85% lượng xuất khẩu sắn toàn cầu, kế đến là Indonesia và Việt Nam. Thị trường
xuất khẩu sắn chủ yếu của Thái Lan là Trung Quốc, Đài Loan, Nhật Bản và
cộng đồng châu Âu với tỷ trọng xuất khẩu sắn khoảng 40% bột và tinh bột sắn,
25% là sắn lát và sắn viên (TTTA, 2006; FAO, 2007). Năm 2006 được coi là
năm có giá sắn cao đối với cả bột, tinh bột và sắn lát. Việc xuất khẩu sắn làm

thức ăn gia súc sang các nước cộng đồng châu Âu hiện đã giảm sút nhưng giá
sắn năm 2006 vẫn được duy trì ở mức cao do có thị trường lớn tại Trung Quốc
và Nhật Bản [9].
Viện Nghiên cứu Chính sách lương thực thế giới (IFPRI), đã tính toán
nhiều mặt và dự báo tình hình sản xuất và tiêu thụ sắn toàn cầu với tầm nhìn đến
năm 2020. Năm 2020 sản lượng sắn toàn cầu ước đạt 275,10 triệu tấn, trong đó
sản xuất sắn chủ yếu ở các nước đang phát triển là 274,7 triệu tấn, các nước đã
phát triển khoảng 0,40 triệu tấn. Mức tiêu thụ sắn ở các nước đang phát triển dự
báo đạt 254,60 triệu tấn so với các nước đã phát triển là 20,5 triệu tấn. Khối
lượng sản phẩm sắn toàn cầu sử dụng làm lương thực thực phẩm dự báo nhu cầu
là 176,3 triệu tấn và thức ăn gia súc 53,4 triệu tấn. Tốc độ tăng hàng năm của
nhu cầu sử dụng sản phẩm sắn làm lương thực, thực phẩm và thức ăn gia súc đạt
tương ứng là 1,98% và 0,95%. Châu Phi vẫn là khu vực dẫn đầu sản lượng sắn
toàn cầu với dự báo sản lượng năm 2020 sẽ đạt 168,6 triệu tấn. Trong đó, khối
lượng sản phẩm sử dụng làm lương thực thực phẩm là 77,2%, làm thức ăn gia
súc là 4,4%. Châu Mỹ La tinh giai đoạn 1993-2020, ước tốc độ tiêu thụ sản
phẩm sắn tăng hàng năm là 1,3%, so với châu Phi là 2,44% và châu Á là 0,84 -

7
0,96%. Cây sắn tiếp tục giữ vai trò quan trọng trong nhiều nước châu Á, đặc biệt
là các nước vùng Đông Nam Á nơi cây sắn có tổng diện tích đứng thứ ba sau lúa
và ngô và tổng sản lượng đứng thứ ba sau lúa và mía. Chiều hướng sản xuất sắn
phụ thuộc vào khả năng cạnh tranh cây trồng. Giải pháp chính là tăng năng suất
sắn bằng cách áp dụng giống mới và các biện pháp kỹ thuật tiến bộ [9].
1.1.5.2. Tình hình sản xuất sắn ở Việt Nam
Ở Việt Nam, sắn là cây lương thực, thức ăn gia súc quan trọng sau lúa và
ngô. Năm 2005, cây sắn có diện tích thu hoạch 432 nghìn ha, năng suất 15,35
tấn/ha, sản lượng 6,6 triệu tấn, so với cây lúa có diện tích 7.326 ha, năng suất
4,88 tấn/ha, sản lượng 35,8 triệu tấn, cây ngô có diện tích 995 ha, năng suất 3,51
tấn/ha, sản lượng gần một triệu tấn (FAO, 2007). Cây sắn là nguồn thu nhập

quan trọng của các hộ nông dân nghèo do sắn dễ trồng, ít kén đất, ít vốn đầu tư,
phù hợp sinh thái và điều kiện kinh tế nông hộ. Sắn chủ yếu dùng để bán
(48,6%) kế đến dùng làm thức ăn gia súc (22,4%), chế biến thủ công (16,8%),
chỉ có 12,2% dùng tiêu thụ tươi [9].
Sắn cũng là cây công nghiệp có giá trị xuất khẩu và tiêu thụ trong nước.
Sắn là nguyên liệu chính để chế biến bột ngọt, mì ăn liền, bánh kẹo, siro, nước
giải khát, bao bì, ván ép, phụ gia dược phẩm, màng phủ sinh học và chất giữ
ẩm cho đất. Toàn quốc hiện có trên 60 nhà máy chế biến tinh bột sắn với tổng
công suất khoảng 3,8 triệu tấn củ tươi/năm và nhiều cơ sở chế biến sắn thủ
công rãi rác tại hầu hết các tỉnh trồng sắn. Việt Nam hiện sản xuất mỗi năm
khoảng 800.000 – 1.200.000 tấn tinh bột sắn, trong đó trên 70% xuất khẩu và
gần 30% tiêu thụ trong nước. Sản phẩm sắn xuất khẩu của Việt Nam chủ yếu là
tinh bột, sắn lát và bột sắn. Thị trường chính là Trung Quốc, Đài Loan, Nhật
Bản, Singapo, Hàn Quốc. Đầu tư nhà máy chế biến bio- etanol là một hướng
lớn triển vọng [9].
Sản xuất lương thực là ngành trọng tâm và có thế mạnh của Việt Nam
tầm nhìn đến năm 2.020. Chính phủ Việt Nam chủ trương đẩy mạnh sản xuất
lúa, ngô và coi trọng việc sản xuất sắn, khoai lang ở những vùng, những vụ có
điều kiện phát triển. Thị trường xuất khẩu sắn lát và tinh bột sắn Việt Nam dự

8
báo thuận lợi và có lợi thế cạnh tranh cao do có nhu cầu cao về chế biến
bioethanol, bột ngọt, thức ăn gia súc và những sản phẩm tinh bột biến tính. Diện
tích sắn của Việt Nam dự kiến ổn định khoảng 450 nghìn ha nhưng sẽ tăng năng
suất và sản lượng sắn bằng cách chọn tạo và phát triển các giống sắn tốt có năng
suất củ tươi và hàm lượng tinh bột cao, xây dựng và hoàn thiện quy trình kỹ
thuật canh tác sắn bền vững và thích hợp vùng sinh thái [9].
1.2. Tổng quan tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực của đề tài ở trong và
ngoài nƣớc
1.2.1. Trên thế giới

Các chương trình nhân giống truyền thống tại Centro Internacional de
Agricultura Tropical (CIAT), Colombia, và Viện Nông nghiệp Nhiệt đới Quốc
tế (IITA), Nigeria, hai Trung tâm CGIAR đã thành công trong việc phát triển và
tạo các giống sắn tăng khả năng kháng bệnh và côn trùng, hàm lượng chất khô
và cải thiện chất lượng sắn ở châu Phi, châu Á và châu Mỹ. Lai giống truyền
thống khó có khả năng cung cấp giải pháp toàn diện để cải thiện cây trồng cho
phù hợp với nhu cầu của người nông dân và sản xuất thương mại khác nhau ở
vùng nhiệt đới. Việc áp dụng công nghệ biến đổi gen để đưa những tính trạng
nông dân mong muốn vào giống cây trồng tạo ra dòng ưu tú [24].
Trên thực tế, khả năng chuyển vật liệu di truyền mới vào hệ gen cây sắn
theo cách này là cần thiết. Sau một thời gian phát triển công nghệ trong những
năm 1990 đã có tiến bộ đáng kể ở lĩnh vực tạo cây sắn biến đổi gen để tăng
cường giá trị cho người sản xuất và người tiêu dùng. Mọi nỗ lực hướng vào tích
hợp những đặc điểm nông dân mong muốn vào giống cây dành cho thương mại
trong tương lai. Công nghệ biến đổi gen có đầy đủ tiềm năng đưa cây sắn trở
thành cây lương thực và hàng hóa trong thế kỷ 21 [24].
Là một trong số ít các cây lương thực chính không trồng trong các quốc
gia công nghiệp hóa, tầm quan trọng của sắn không rõ hoặc được đánh giá
không đúng. Tuy nhiên, sắn đóng một vai trò quan trọng trong cung cấp thực
phẩm và đảm bảo an ninh kinh tế của những quốc gia thiếu lương thực và kém
phát triển nhất trên thế giới. Hiện nay, hơn 600 triệu người tiêu thụ sản phẩm

9
sản xuất từ sắn hàng ngày, chỉ sau lúa và ngô, là nguồn năng lượng quan trọng
trong chế độ ăn uống của người dân vùng nhiệt đới. Sản xuất dự kiến sẽ tăng
60% vào năm 2020 để đáp ứng nhu cầu của dân số ngày càng tăng trong các khu
vực này [24].
Thiếu đầu tư vào nghiên cứu về sắn và giai đoạn phát triển những năm
1980 đã dẫn đến một phần đáng kể năng suất sắn chưa được khai thác, được
chứng minh bằng sản lượng tiềm năng có thể là 80 - 100 tấn trọng lượng tươi

của rễ trên mỗi ha trong khi sản lượng trung bình trên thế giới là 10,7 tấn/ ha và
8,9 t/ha ở châu Phi (FAO). Mở khóa tiềm năng di truyền này để tăng sản lượng
và cải thiện các tính trạng như tinh bột và chất lượng dinh dưỡng, đặc tính sau
thu hoạch và giảm hàm lượng cyanogen (HCN) đã trở thành tâm điểm của
chương trình cải thiện [24].
Công nghệ biến đổi gen cho phép những tính trạng có lợi được chuyển từ
một giống sắn này tới giống sắn khác và từ họ hàng hoang dại, vượt qua ranh
giới loài và các vấn đề về thụ phấn chéo và giao phối cận huyết. Ngoài ra,
chuyển vật chất di truyền từ các nguồn ngoại lai như virus cho chiến lược kháng
tác nhân gây bệnh, và gene vi khuẩn kháng sâu có thể được phát triển và triển
khai mang lại lợi nhuận cho nông dân trồng sắn. Công nghệ chuyển gene ở sắn
cũng như các loại cây trồng khác, hệ thống biến đổi gen trong sắn phụ thuộc vào
khả năng tạo các tế bào toàn năng và mô của hệ thống nuôi cấy mô. Đây là mục
tiêu cho chuyển gene, sau khi chọn lọc thành công tái sinh cây chuyển gene
hoàn chỉnh [20]. Ở sắn, không hệ thống tái sinh nào tái sinh được cây từ mô
trưởng thành. Tuy nhiên, nghiên cứu ban đầu đã xác định rằng phôi soma có thể
được cảm ứng và cây được tạo ra từ mẫu lá chưa hoàn chỉnh trên môi trường
Murashige và Skoog (1962) bổ sung auxin. Cây tái sinh theo cách này là dạng
vô tính của vật liệu gốc trưởng thành, giữ nguyên tất cả các tính trạng của các tế
bào mầm có được. Những cấu trúc phôi đa bào và phôi thứ cấp có thể được tạo
ra từ các tế bào mầm, đã được sử dụng làm mục tiêu cho chuyển gen khi chương
trình kỹ thuật di truyền của sắn được bắt đầu vào đầu những năm 1990. Sau một
thời gian thất bại, đã có bằng chứng cho việc tạo phôi và thực vật chuyển gen

10
lần đầu tiên được đưa ra vào năm 1994. Tiếp theo là bước đột phá trong tái sinh
cây từ hệ thống phôi, dẫn đến phục hồi xác nhận cây sắn biến đổi gen biểu hiện
uidA và gen chỉ thị luciferine [24].
1.2.2. Ở Việt Nam
Hiện nay, nghiên cứu tạo giống cây trồng biến đổi gen vẫn còn mới mẻ ở

Việt Nam. Chỉ sau năm 2000, nước ta mới có một vài đề tài nghiên cứu đầu tiên
về tạo giống cây trồng biến đổi gen. Tuy nhiên, các loại cây biến đổi gen vẫn
chưa được mở rộng gieo trồng ở Việt Nam, mà mới trong phạm vi phòng thí
nghiệm và trồng thử nghiệm.
Có rất nhiều công trình chuyển gen thành công trên các giống cây trồng
như: đậu tương, ngô, lúa, bông, cà chua nhờ vi khuẩn Agrobacterium. Tuy
nhiên, ở Việt Nam chưa có một công trình chuyển gen thành công nào ở sắn
thông qua vi khuẩn Agrobacterium được công bố mà chỉ có một công trình
chuyển gen bằng phương pháp bắn gen được công bố như:
+ Xây dựng quy trình biến nạp gen bar – gen kháng thuốc diệt cỏ vào cây khoai
mì bằng phương pháp bắn gen.
Trước khi tiến hành chuyển gen, cần nghiên cứu hệ thống tái sinh làm cơ
sở để tái sinh cây sau khi chọn lọc. Hiện nay đã có một số công trình liên quan
được công bố như:
+ Nghiên cứu khả năng tái sinh và tiếp nhận gen của một số giống sắn (Manihot
esculenta Cantz) Việt Nam.
+ Nghiên cư
́
u hệ thống tái sinh cây sắn (Manihot esculenta Crantz) qua phôi soma
từ đỉnh chồi.
1.3. Vi khuẩn A.tumefaciens và hiện tƣợng biến nạp gen ở thực vật
Hiện nay, có rất nhiều các phương pháp chuyển gen vào thực vật khác
nhau như sử dụng súng bắn gen, dùng xung điện, dùng vi tiêm, chuyển gen
thông qua con đường ống phấn,… Tuy nhiên, phương pháp chuyển gen gián
tiếp nhờ vi khuẩn A.tumefaciens là phương pháp được sử dụng phổ biến hiện
nay. Phương pháp này được sử dụng trong khóa luận này để chuyển gen Gus
vào cây sắn.

11
1.3.1. Giới thiệu chung về vi khuẩn A. tumefaciens

A.tumefaciens là loài vi khuẩn sống trong đất gây ra bệnh khối u hình
chóp ở các vị trí tổn thương của thực vật Hai lá mầm. Chỉ rất ít thực vật Một lá
mầm thuộc họ Liliaceae và Amaryllidaceae là dễ bị bệnh khối u hình chóp. Sự
sinh trưởng khối u có thể tiếp diễn khi vắng mặt vi khuẩn và mô khối u có thể
được sinh trưởng vô trùng bằng nuôi cấy mô trong các môi trường thiếu sự bổ
xung auxin và cytokinie ngoại sinh mà bình thường là cần thiết để xúc tiến sự
sinh trưởng của mô thực vật in vitro. Mô khối u tổng hợp amino acid và các dẫn
xuất của đường được biết chung là opine. Loại opine tổng hợp trong khối u (ví
dụ như nopaline, octopine, agrocinopine, mannopine và agropine) phụ thuộc vào
dòng Agrobacterium khởi đầu sự hình thành khối u. Octopine và nopaline là hai
loại opine có nguồn gốc từ arginine và dễ dàng phát hiện nhất trong mô khối u
hình chóp. Do đó nhiều dòng A. tumefaciens phổ biến được thiết kế theo kiểu
octopine hoặc nopaline [5].
A. tumefaciens có khả năng xâm nhiễm tế bào thực vật bằng cách
chuyển một đoạn ADN của nó vào tế bào thực vật. Khi ADN vi khuẩn được
hợp nhất với nhiễm sắc thể thực vật, nó sẽ tấn công vào hệ thống tổ chức của
tế bào một cách có hiệu quả và sử dụng nó để đảm bảo cho sự sinh sổi của
quần thể vi khuẩn
Để khai thác và sử dụng A.tumefaciens như là một vector chuyển gen các
nhà khoa học đã loại bỏ các gen gây khối u và gen mã hóa opine của T-ADN và
thay thế vào đó là các marker chọn lọc, trong khi vẫn duy trì các vùng bờ phải
và bờ trái của T-ADN và các gen vir. Gen chuyển được xen vào giữa các vùng
bờ của T-ADN. Nó sẽ được chuyển vào tế bào và trở nên hợp nhất với nhiễm
sắc thể tế bào thực vật [5].
Phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ A. tumefaciens đã được kiểm tra
đối với sự xâm nhập bền vững, sự biểu hiện và sự di truyền của các gen
chuyển đặc biệt. Tuy nhiên, một vài yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả biến nạp
là loại mô được biến nạp, giai đoạn phát triển của mô, mức khởi đầu của vi
khuẩn A. tumefaciens sử dụng, môi trường để nuôi cấy mô sau khi biến nạp,

12
marker được sử dụng để chọn lọc thể biến nạp, loại vector sử dụng và kiểu
gen của thực vật [5].
1.3.2. Cấu trúc và chức năng của Ti-plasmid
Ti-plasmid là các vòng DNA tự do sinh sản độc lập. Ở vi khuẩn, plasmid
liên quan tới yếu tố giới tính của tế bào, đến khả năng chống chịu các loại kháng
sinh,… Đặc điểm quan trọng của plasmid là chúng có thể liên kết vào nhiễm sắc
thể nhưng cũng có thể tồn tại bên ngoài nhiễm sắc thể một cách độc lập.

Hình 1. Ti-Plasmid
Ti-plasmid được tìm thấy trong tất cả các dòng A. tumefaciens gây độc, có
kích thước khoảng 200-250 kb. Chúng được duy trì ổn định trong A. tumefaciens
ở nhiệt độ dưới 30
0
C. Bằng phương pháp lai ADN-ADN và lập bản đồ chuỗi
kép di hợp (heteroduplex mapping), người ta đã xác định được Ti-plasmid có 4
vùng tương đồng. Kết quả phân tích di truyền cho thấy vùng T-ADN
(transferred DNA) và vùng gây độc (virulence) liên quan đến sự hình thành khối
u trong khi hai vùng khác liên quan đến sự tiếp hợp và sự tái bản của plasmid
trong A. Tumefaciens [5].
Trong khi hình thành khối u, T-ADN được chuyển vào tế bào thực vật và
hợp nhất với genome nhân. T-ADN ổn định trong genome nhân. Lai Ti-plasmid
với ADN của khối u đã cho thấy T-ADN trong tế bào thực vật là tương ứng song
song với T-ADN trong Ti-plasmid của A. tumefaciens. Kết quả này chứng tỏ không
có sự sắp xếp lại vị trí của T-ADN trong lúc khối u được tạo thành. Một hoặc nhiều
bản sao của T-ADN có thể có mặt ở các đoạn lặp nối tiếp. Chúng cũng có thể tách

13
ra và liên kết với các vùng khác nhau của ADN thực vật. Vị trí hợp nhất của T-
ADN vào ADN thực vật là tương đồng [5].

1.3.3. Cấu trúc và chức năng của T-ADN
T-ADN là một đoạn ADN có kích thước 25 kb, trong đó chứa gen mã hóa
cho sinh tổng hợp auxin, cytokinin, opine và các gen gây khối u. Trong Ti-
plasmid, vị trí của T-ADN được giới hạn bằng bờ phải (RB- Right Border) và
bờ trái (LB-Left Border). Ngoài T-ADN, trên Ti-plasmid còn có các vùng ADN
mã hóa cho việc tái sinh plasmid, cho khả năng lấy nhiễm và tiếp hợp (vùng
vir), cho việc tiêu hóa opine.
Ở Ti-plasmid dạng nopalin, T-ADN xâm nhập vào genom thực vật ở dạng
một đoạn liên tục dài 22 kb. Trong khi ở Ti-plasmid dạng octopine, T-ADN là
một đoạn gen liên tục dài 13 kb. T-ADN mang rất nhiều gen như: (1) Các gen
mã hoá những enzyme cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp opine; (2) Các gen
gây khối u như tms1, tms2, tmsr mã hoá cho các enzyme liên quan đến quá trình
sinh tổng hợp auxin và cytokinine.
Trong các vùng ADN của Ti-plasmid, ngoài T-ADN được nghiên cứu
nhiều hơn cả là vùng ADN phụ trách khả năng lây nhiễm còn gọi là vùng vir.
Sản phẩm hoạt động của các gen nằm trong vùng vir dưới tác động kích thích
của các hợp chất phenol tiết ra từ vết thương là một loạt các protein đặc hiệu
như virE
2
, virB, virD, virD
2
,… Các protein này nhận biết các vết thương ở các
cây chủ thích hợp (hầu hết là cây hai lá mầm), kích thích sản sinh ra các đoạn T-
ADN, bao bọc che chở các đoạn ADN này và giúp chúng tiếp cận với hệ gen
của cây chủ một cách an toàn [5].
1.3.4. Cơ chế phân tử của việc chuyển gen thông qua A. tumefaciens
Các tế bào cây bị tổn thương sẽ tiết ra các hợp chất hoá học dẫn dụ vi
khuẩn như: AS, Dưới tác dụng của các hợp chất này, A.tumefaciens nhận biết
rồi bám vào thành tế bào chủ và chuyển T-ADN vào tế bào thực vật. Quá trình
này được sự trợ giúp đặc biệt của các gen vir và bờ phải (RB- Right Border) và

bờ trái (LB-Left Border). Cũng chính các hợp chất này là AS, với vai trò cảm
ứng, giúp cho các gen vùng vir hoạt động và tăng cường biểu hiện.

14
Sự tiếp xúc của A. tumefaciens với các hợp chất giải phóng từ mô thực vật
bị tổn thương đã làm cho vùng vir của Ti-plasmid phiên mã. Trong quá trình này
một chất có hoạt tính hóa học cao và đặc trưng đã được nhận biết là AS. Gen
virA và gen virC được biểu hiện ở vi khuẩn sinh trưởng sinh dưỡng mặc dù gen
virC chỉ được phiên mã ở mức độ thấp. Khi A. tumefaciens gặp dịch rỉ của các tế
bào thực vật bị tổn thương, hoặc AS tinh khiết, sản phẩm của gen virA (có thể
liên kết với màng) sẽ nhận diện và tương tác với AS và truyền tín hiệu ngoại bào
vào trong tế bào này làm hoạt hóa sản phẩm của gen virC. Sau đó protein virC
đã biến đổi hoạt hóa làm cho các gen virB, virC, virD và virE không hoạt động
và làm tăng cường sự phiên mã của gen virC.
Sự cảm ứng gen vir xảy ra nhờ sự xuất hiện các điểm đứt sợi đơn trong
các trình tự biên 25 bp nằm ở mép của T-ADN và sự xuất hiện phân tử sợi đơn
mạch thẳng tương ứng với T-ADN. Các sản phẩm của operon vir D có hoạt tính
endonuclease. Bằng một cơ chế tương tự sự tiếp hợp của vi khuẩn, T-ADN được
chuyển sang tế bào thực vật và xen một cách ổn định vào ADN nhân [5].
1.4. Gen chỉ thị chọn lọc
Gen chỉ thị thường được sử dụng là các gen β-glucuronidase (gus A): là
gen mã hóa cho sinh tổng hợp enzyme β-glucuronidase. β-glucuronidase là một
hydrolase xúc tác cho sự phân giải các β-glucuronide, sản phẩm phân giải có
màu xanh chàm đặc trưng, dễ nhận biết. β-glucuronide thường dùng nhất trong
phản ứng để nhận biết sự tồn tại của gen gus A là X-gluc (5-bromo-4-chloro-3-
indolyl-β-D-glucuronide). Dung dịch X-gluc không màu dưới tác động của
enzyme β-glucuronidase sẽ chuyển sang màu xanh chàm đặc trưng [11] .
* Phương pháp xác định hiệu quả chuyển gen bằng nhuộm hóa tế bào
Do không phải toàn bộ các tế bào và các mẫu chuyển gen đều mang gen
chuyển nên nhất thiết phải tiến hành sàng lọc các tế bào chuyển gen. Dựa vào

các gen chọn lọc được thiết kế trong vector chuyển gen mà người ta sử dụng các
kháng sinh phù hợp để thu được các tế bào, mẫu mang gen chuyển.
Có thể nhuộm hóa tế bào để khẳng định sự của mặt của sản phẩm thông
qua một loại gen chỉ thị được sử dụng phổ biến trong chuyển gen thực vật là gen

15
Gus hay gen uidA. Gen Gus nằm ở locus uid của vi khuẩn E. coli và mã hóa cho
enzyme β-glucuronidase. Đây là một enzyme hydrolase có khả năng phân hủy
các hợp chất có gốc β- glucuronide tạo thành chất trung gian, khi chất này bị oxi
hóa sẽ có màu xanh đậm đặc trưng. Do đó, enzyme này được xác định rất dễ
dàng và thuận tiện bằng hợp chất indole- β-glucuronide [10].
Người ta thường sử dụng dung dịch muối 5-Br-4-Cl-3-indolyl β-D-
glucuronide cyclohexylamine (X-Gluc) để nhuộm mô tế bào. Sản phẩm sơ cấp
5-Br-4-Cl-3indolyl vẫn còn là một chất dễ tan, không màu. Nhưng ngay sau đó
sản phẩm này bị ôxy hóa và dimmer hóa thành một phức hệ không tan có màu
xanh. Sự có mặt của ferri và ferrocyanide trong dung dịch nhuộm làm tăng quá
trình hình thành sản phẩm cuối cùng, đồng thời cũng góp phần hạn chế việc
khuếch tán sản phẩm sơ cấp đến vùng không có Gus [10].


16
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHA
́
P NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
2.1.1. Vật liệu thực vật
- Đoạn thân non, mảnh lá chưa trưởng thành, mảnh lá mầm sắn KM 94.
2.1.2. Vi khuẩn
- Chủng vi khuẩn được sử dụng là A.tumefaciens CV58 mang gen Gus làm
chỉ thị sàng lọc.

2.2. Hóa chất, thiết bị và môi trƣờng nuôi cấy
2.2.1. Hóa chất
- Yeast extract, beef extract, Bacto pepton, NaCl NH
4
NO
3
, KNO
3
,
CaCl
2
.2H
2
O, MgSO
4
.7H
2
O, KH
2
PO
4
, KI, H
3
BO
3
,

MnSO
4
.4H

2
O, ZnSO
4
.7H
2
O,
CuSO
4
.5H
2
O, COCl
2
. 6H
2
O, Na
2
MO
4
.2H
2
O, Na
2
EDTA, FeSO
4
.7H
2
O, Nicotinic
acid, Pyridoxin HCl, Thiamin HCl, Glycine
- Cồn 96%, nước cất vô trùng, agar, đường saccarose,
- Vitamin C, Vitamin mix.

- Các loại kháng sinh: Kanamycin, rifamycin, cefotaxim.
- Các chất khác như: BAP, picloram, AS, Tris/NaCl, X-Glux, Triton X-100.
2.2.2. Thiết bị
Các thiết bị được sử dụng trong thí nghiệm này là : Buồng cấy vô trùng, nồi khử
trùng, tủ sấy, tủ lạnh, cân điện tử, máy đo pH, bếp điện, bình nuôi cấy, đĩa petri, đèn
cồn, ống đong, micropipette, giấy parafilm, giấy thấm vô tru
̀
ng, kéo, dao mô
̉
, panh,
que cấy, khay đựng, máy li tâm lạnh, máy lắc nằm ngang 100-200 vòng/phút…
2.2.3. Môi trƣờng sử dụng nuôi cấy mẫu
Bảng 1. Thành phần môi trường MS (Murashige và Skoog)
Môi trƣờng MS
Thành phần
MS I
NH
4
NO
3
1650,0mg/l+ KNO
3
1900mg/l+ KH
2
PO
4

170mg/l+ MgSO
4
.7H

2
O 370mg/l + CaCl
2
.2H
2
O 440mg/l
MS II
Na
2
EDTA 37,3mg/l+ FeSO
4
.7H
2
O 27,8mg/l
MS III
KI 0,83mg/l + CuSO
4
.5H
2
O 0,025mg/l + COCl
2
. 6H
2
O
0,025mg/l + Na
2
MO
4
.2H
2

O 0,25mg/l
MS IV
MnSO
4
.4H
2
O

22,3mg/l+ H
3
BO
3
6,2mg/l+ ZnSO
4
.7H
2
O
8,6mg/l
MS V
Nicotinic acid 0,025g/l + Pyridoxin HCl 0,5mg/l+ Thiamin
HCl 0,1mg/l+ Glycine 2,0mg/l

17
Bảng 2. Thành phần của môi trường sử dụng nuôi cấy mẫu
Môi trƣờng
Thành phần
Môi trƣờng
cấy chuyển
MS đặc
Môi trƣờng

nuôi khuẩn
(YEB)
YEB
lỏng
Yeast extract 1g/l + beef extract 5g/l + pepton 5g/l+
NaCl 5g/l+ saccarose 5g/l
YEB
đặc
Yeast extract 1g/l+ beef extract 5g/l+ pepton 5g/l+
NaCl 5g/l+ saccarose 5g/l+ agar 15g/l
Môi trƣờng
đồng nuôi
cấy
MS đặc + Picloram 12mg/l + AS 200mg/l, pH 5.8
Môi trƣờng
chọn lọc
MS + Picloram12mg/l + Kanamycin + Cefotaxim 500 mg/l, pH 5,8
Môi trƣờng
tạo mô sẹo
hay tái sinh
MS bột + Picloram 12 mg/l + VTM C 1ml/l + VTM mix 1ml/l
MS đặc
20ml/l MS I + 10ml/l MS II + 10ml/l MS III +10ml/l MS IV +
10ml/l MS V + saccarose 30g/l + agar 7,5g/l, pH 5,8
½ MS lỏng
10ml/l MS I + 5ml/l MS II + 5ml/l MS III +5ml/l MS IV +
5ml/l MS V + saccarose 30g/l , pH 5,8, không bổ sung agar

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.2. Tạo vật liệu chuyển gen

Vật liệu chuyển gen là: Lá chưa trưởng thành và đoạn thân non từ 10 – 12
ngày tuổi:
Cắt các đoạn thân chứa mắt có chiều dài từ 1 – 1,5cm và cắm trên môi
trường MS đặc trong điều kiện thời gian chiếu sáng là 12h/ngày và nhiệt độ là
28 – 29
o
C
Sau 10 – 12 ngày cắt đoạn thân dài 1 – 1,5cm và mảnh lá non chưa trưởng
thành có S=2×2mm ta được vật liệu chuyển gen.
Vật liệu chuyển gen là lá mầm: