Đi ̣nh lượng đồng thời acetaminophen, loratadin, dextromethophan HBr trong thuốc rhumenol flu 500 bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao và phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM

LIỄU THANH NHÀN

ĐINH
LƢỢNG ĐỒNG THỜI ACETAMINOPHEN, LORATADIN VÀ
̣
DEXTROMETHOPHAN HYDROBROMIT TRONG THUỐC
RHUMENOL FLU 500 BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU
NĂNG CAO VÀ PHƢƠNG PHÁP QUANG PHỔ HẤP THỤ PHÂN TỬ

Chuyên ngành : Hóa phân tích
Mã số: 60.44.01.18

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC VẬT CHẤT

Hƣớng dẫn khoa học : PGS.TS Mai Xuân Trƣờng

THÁI NGUYÊN - NĂM 2016

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này
là trung thực và chưa hề được sử dụng trong bấ t cứ mô ̣t công triǹ h nào .
Tôi xin cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này
đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ rõ

nguồn gốc.
Thái Nguyên, tháng 04 năm 2016
Xác nhận của giảng viên hƣớng dẫn

Tác giả luận văn

PGS. TS Mai Xuân Trƣờng

Liễu Thanh Nhàn

XÁC NHẬN CỦA KHOA HÓA HỌC

i
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình học tập và thực hiện luận văn, tác giả đã nhận được
nhiều sự quan tâm, động viên và giúp đỡ của các thầy giáo, cô giáo, bạn
bè và gia đình.
Tác giả bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:
Khoa Hóa ho ̣c , Phòng đào tạo - Trường Đại học Sư phạm - Đa ̣i ho ̣c Thái
Nguyên, các thầy cô giáo tham gia giảng dạy đã cung cấp những kiến thức giúp
tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Đặc biệt tác giả xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo PGS.TS Mai
Xuân Trường người đã tận tình hướng dẫn chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt quá
trình nghiên cứu, thực hiện và hoàn thành luận văn.
Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè những

người đã luôn bên tôi, động viên và khuyến khích tôi trong quá trình thực hiện
đề tài nghiên cứu của mình.
Với khố i lươ ̣ng công viê ̣c lớn , thời gian nghiên cứu có hạn, khả năng
nghiên cứu còn ha ̣n chế , chắc chắn luận văn không thể tránh khỏi những thiếu
sót. Tác giả rất mong nhận được các ý kiến đóng góp chân thành từ các thầy
giáo, cô giáo và bạn đọc.
Xin chân thành cảm ơn !
Thái Nguyên, tháng 04 năm 2016
Tác giả

Liễu Thanh Nhàn

ii
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




MỤC LỤC
Lời cam đoan ..................................................................................................... i
Lời cảm ơn ....................................................................................................... ii
Mục lục ........................................................................................................... iii
Danh mục các từ viết tắt của luận văn .............................................................. iv
Danh mục các bảng của luận văn ...................................................................... v
Danh mục các hình của luận văn ...................................................................... vi
MỞ ĐẦU ......................................................................................................... 1
Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................. 2
1.1. Tổng quan về acetaminophen, loratadin và dextromethophan HBr ....... 2
1.1.1. Acetaminophen ............................................................................... 2
1.1.2. Loratadin ......................................................................................... 4

1.1.3. Dextromethophan HBr .................................................................... 6
1.2. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)........................... 8
1.2.1. Nguyên tắc của phương pháp HPLC ............................................... 8
1.2.2. Các đại lượng đặc trưng của quá trình sắc ký .................................. 9
1.2.3. Hệ thống máy HPLC ..................................................................... 12
1.3. Kết quả xác định một số chất ..................................................... 12
1.3.1. Kết quả xác định một số chất theo phương pháp HPLC ................ 12
1.3.2. Kết quả xác định một số chất theo phương pháp quang phổ hấp
thụ phân tử .............................................................................................. 22
Chƣơng 2 THỰC NGHIỆM ......................................................................... 25
2.1. Nội dung nghiên cứu................................................................. 25
2.1.1. Phương pháp HPLC ...................................................................... 25
2.1.2. Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử ....................................... 25
2.2. Phương pháp nghiên cứu ........................................................... 26
2.2.1. Phương pháp nghiên cứ u lý thuyế t ................................................ 26

iii
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




2.2.2. Phương pháp thực nghiê ̣m ............................................................. 26
2.3. Đánh giá độ tin cậy của quy trình phân tích ................................ 27
2.3.1. Giới hạn phát hiện (LOD) ............................................................. 27
2.3.2. Giới hạn định lượng (LOQ) ........................................................... 27
2.3.3. Đánh giá độ tin cậy của phương pháp............................................ 27
2.3.4. Đánh giá kết quả phép phân tích theo thống kê ............................. 29
2.4. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất ..................................................... 29
2.4.1. Thiết bị.......................................................................................... 29

2.4.2. Dụng cụ......................................................................................... 29
2.4.3. Hóa chất ........................................................................................ 30
2.4.4. Chế phẩm Rhumenol Flu 500 ........................................................ 30
2.5. Chuẩn bị các dung môi để hòa tan mẫu

...................................... 30

Chƣơng 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ........................... 32
3.1. Phương pháp HPLC .................................................................. 32
3.1.1. Xây dựng điều kiện để xác định đồng thời 3 chất ACE, LOR và
DEX........................................................................................................ 32
3.1.2. Đánh giá phương pháp định lượng ................................................ 35
3.1.3. Xác định ACE, LOR và DEX trong thuốc Rhumenol Flu 500 và
kiểm tra độ đúng bằng phương pháp thêm chuẩn .................................... 40
3.2. Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử .................................... 43
3.2.1 Khảo sát phổ hấp thụ phân tử của ACE, LOR và DEX ................... 43
3.2.2. Khảo sát sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của ACE, LOR và DEX
vào pH .................................................................................................... 44
3.2.3. Khảo sát sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của ACE, LOR và DEX
theo thời gian .......................................................................................... 44
3.2.4. Khảo sát sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của ACE, LOR và DEX
theo nhiệt độ ........................................................................................... 46

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




3.2.5. Khảo sát khoảng tuyến tính tuân theo định luật Bughe – Lambe –
Bia của ACE, LOR và DEX. Xác định chỉ số LOD và LOQ ...................... 47

3.2.6. Khảo sát và đánh giá độ tin cậy của phương pháp nghiên cứu trên
các mẫu tự pha ........................................................................................ 54
3.2.7. Xác định hàm lượng ACE , LOR và DEX trong thuốc Rhumenol
Flu 500 và đánh giá độ đúng của phép phân tích theo phươn g pháp thêm
chuẩn ...................................................................................................... 61
KẾT LUẬN ................................................................................................... 66
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 68

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT CỦA LUẬN VĂN

Tiếng Việt

Tiếng Anh

Viết tắt

Axetaminophen

Acetaminophen

ACE

Loratadin

Loratadine

LOR

Dextromethophan hydrobromit

Dextromethorphan hydrobromide

DEX

Giới hạn phát hiện

Limit Of Detection

LOD

Giới hạn định lượng

Limit Of Quantity

LOQ

Sai số tương đối

Relative Error

Độ lệch chuẩn

Standard Deviation

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu

High Performance Liquid

năng cao

Chromatography

iv
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN



RE
S hay SD
HPLC


DANH MỤC CÁC BẢNG CỦA LUẬN VĂN
Trang
Bảng 3.1. Giá trị các đại lượng đặc trưng ........................................................ 36
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát thời gian lưu ........................................................ 36
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát diện tích pic ......................................................... 37
Bảng 3.4. Mối tương quan giữa nồng độ và diện tích pic của ACE, LOR và DEX.... 38
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát độ lặp lại .............................................................. 39
Bảng 3.6. Kết quả khảo sát độ đúng ................................................................ 42
Bảng 3.7. Kết quả phân tích thuốc Rhumenol Flu 500 .................................... 44
Bảng 3.8. Độ hấp thụ quang của ACE, LOR và DEX ở các giá trị pH ............ 44
Bảng 3.9. Sự phu ̣ thuô ̣c độ hấp thụ quang của
ACE, LOR và DEX theo thời gian .. 45
Bảng3.10. Sự phu ̣ thuô ̣c độ hấp thụ quang của

ACE, LOR và DEX theo

nhiệt độ .................................................................................................. 46
Bảng 3.11. Độ hấp thụ quang của dung dịch ACE ở các giá trị nồng độ. ........ 48
Bảng 3.12. Kết quả xác đinh
̣ LOD và LOQ của ACE. .................................... 50
Bảng 3.13. Sự phu ̣ thuô ̣c đô ̣ hấ p thu ̣ quang của LOR theo nồng độ............... 51
Bảng 3.14. Kết quả tính LOD và LOQ của LOR ............................................ 52
Bảng 3.15. Sự phu ̣ thuô ̣c đô ̣ hấ p thu ̣ quang của DEX theo nồ ng độ ................ 53
Bảng 3.16. Kết quả tính LOD và LOQ của DEX. ........................................... 54
Bảng 3.17. Pha chế các dung dich
̣ hỗn hơ ̣p ACE và LOR ............................... 55
Bảng 3.18. Kế t quả tin
́ h nồ ng đô ,̣ sai số của ACE và LOR trong hỗn hơ ̣p ....... 55
Bảng 3.19. Pha chế các dung dich
̣ hỗn hơ ̣p ACE và DEX ............................... 56
Bảng 3.20. Kế t quả tin
́ h nồ ng đô ,̣ sai số của ACE và DEX trong hỗn hơ ̣p ...... 57
Bảng 3.21. Pha chế các dung dich
̣ hỗn hơ ̣p LOR và DEX............................... 58
Bảng 3.22. Kế t quả tin
́ h nồ ng đô ,̣ sai số của LOR và DEX trong hỗn hơ ̣p ...... 58
Bảng 3.23. Pha các dung dịch chuẩ n ACE, LOR, DEX và hỗn hơ ̣p ............... 59
Bảng 3.24. Kế t quả tính nồng độ, sai số của ACE, LOR và DEX .................. 60

v


Bảng 3.25. Kết quả tính nồng độ, sai số ACE, LOR và DEX trong mẫu thuốc

Rhumenol Flu 500 ................................................................................. 62
Bảng 3.26. Thành phần các dung dịch chuẩn ACE, LOR và DEX thêm vào
dung dịch mẫu thuốc Rhumenol Flu 500 ................................................. 64
Bảng 3.27. Kết quả xác định độ thu hồi của ACE, LOR và DEX trong mẫu
thuốc Rhumenol Flu 500 ......................................................................... 64


DANH MỤC CÁC HÌNH CỦA LUẬN VĂN

Trang
Hình 3.1. Sắc ký đồ của ACE (500 µg/mL) ................................................. 33
Hình 3.2. Sắc ký đồ của LOR (5 µg/mL)...................................................... 33
Hình 3.3. Sắc ký đồ của DEX (15 µg/mL) ................................................... 34
Hình 3.4. Sắc ký đồ của DEX (1), ACE (2) và LOR (3)............................... 35
Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích
pic của ACE ................................................................................................. 38
Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích
pic của LOR ................................................................................................. 39
Hình 3.7. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích
pic của DEX ................................................................................................. 39
Hình 3.8. Phổ hấp thụ của các dung dịch chuẩn ACE, LOR và DEX ............... 43
Hình 3.9. Sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của ACE, LOR và DEX theo thời gian... 45
Hình 3.10. Sự phu ̣ thuô ̣c đô ̣ hấ p thu ̣ quang của ACE , LOR và DEX theo
nhiê ̣t đô .........................................................................................................
47
̣
Hình 3.11. Phổ hấp thụ quang của ACE ở các nồng độ 0,1  50,0 g/mL.... 48
Hình 3.12. Đường hồi quy tuyến tính biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thụ
quang A vào nồ ng đô ̣ của ACE .................................................................... 49
Hình 3.13. Phổ hấp thụ quang của LOR ở các nồng độ 0,1  50,0 g/mL... 50

Hình 3.14. Đường hồi quy tuyến tính biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thụ
quang A vào nồng độ LOR .......................................................................... 51
Hình 3.15. Phổ hấp thụ quang của DEX ở các nồng độ 0,1  50,0 g/mL ... 52
Hình 3.16. Đường hồi quy tuyến tính biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thụ
quang A vào nồ ng đô ̣ DEX ........................................................................... 53

vi


MỞ ĐẦU
Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của khoa học kỹ thuật, ngành
công nghệ dược phẩm cũng phát triển một cách nhanh chóng. Các nhà sản xuất
dược phẩm đã áp dụng nhiều phương thức sản xuất và chế biến tiên tiến để
tổng hợp ra nhiều loại dược phẩm có tính năng vượt trội. Nhiều loại thuốc hỗn
hợp như cảm cúm, hạ sốt, nhức đầu, ho… với những thành phần khác nhau
ngày càng được sản xuất và sử dụng rộng rãi ở nước ta. Việc định lượng các
hoạt chất trong các loại thuốc hỗn hợp theo tiêu chuẩn nhà sản xuất là rất quan
trọng vì chỉ cần thay đổi một lượng nhỏ thành phần hoạt tính của thuốc cũng có
thể ảnh hưởng đến sức khỏe của hàng nghìn, hàng triệu người sử dụng thuốc.
Do đó việc đánh giá đúng chất lượng sản phẩm một cách nhanh chóng, chính
xác, an toàn và hiệu quả thì công tác kiểm nghiệm để xác định các thành phần
của thuốc bằng các phương pháp hiện đại có độ chính xác cao ngày càng được
quan tâm. Nhiều phương pháp có độ lặp và độ chính xác cao đã được ứng
dụng. Sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và quang phổ
hấp thụ phân tử (UV-Vis) kết hợp với kỹ thuật tính toán và ứng dụng phần
mềm máy tính đã bước đầu được nghiên cứu và cho nhiều ưu điểm như độ
nhạy, độ lặp, độ chính xác, độ tin cậy của phép phân tích, phân tích nhanh, tiện
lợi [3], [5].
Xuấ t phát từ những lý do trên chúng tôi chọn đề tài : "Đinh
̣ lượng đồ ng

thời acetaminophen, loratadin, dextromethophan HBr trong thuốc Rhumenol
Flu 500 bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao và phương pháp
quang phổ hấp thụ phân tử”.

1


Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về acetaminophen, loratadin và dextromethophan HBr
1.1.1. Acetaminophen
1.1.1.1. Giới thiệu chung
- Tên tiếng Anh: Acetaminophen (tên khác: Paracetamol).
- Công thức phân tử: C8H9O2N.
- Khối lượng mol phân tử: 151,17 (g/mol).
- Công thức cấu tạo:

- Tên IUPAC: N-(4-hydroxyphenyl) acetamit hoặc p-hydroxy acetanilit
hoặc 4-hydroxy acetanilit[1].
1.1.1.2. Tính chất
- Acetaminophen là chất bột kết tinh màu trắng, không mùi, vị đắng nhẹ.
- Khối lượng riêng: 1,263 g/cm 3 .
- Nhiệt độ nóng chảy: 169 0 C.
- Trong môi trường axit, acetaminophen hấp thụ quang cực đại tại bước
sóng 245nm, trong môi trường kiềm, acetaminophen hấp thụ cực đại tại bước
sóng 257 nm.
- Phổ hấp thụ hồng ngoại của acetaminophen có các đỉnh đặc trưng ở các
số sóng 1506, 1657, 1623, 1227 và 1612 cm-1.
- Tính chất hóa học của acetaminophen do nhóm

-OH, nhóm chức

acetamit và tính chất của nhân thơm quyết định. Sự có mặt của 2 nhóm hydroxyl
và acetamit làm cho nhân benzen được hoạt hóa có thể phản ứng được với các
hợp chất thơm có ái lực electron. Sự liên kết giữa nhóm acetamit, hydroxyl với

2


vòng benzen làm giảm tính bazơ của nhóm amit và làm tăng tính axit của nhóm
hydroxyl.
1.1.1.3. Dược lý cơ chế tác dụng
Acetaminophen là chất chuyển hóa có hoạt tính của phenacetin, thuộc
nhóm thuốc giảm đau hạ sốt. Acetaminophen làm giảm đau bằng cách làm tǎng
ngưỡng đau. Thuốc làm hạ sốt thông qua tác động trên trung khu điều nhiệt của
não.
Acetaminophen được dùng để làm giảm tạm thời sốt, nhức và đau do cảm
lạnh thông thường và các nhiễm virus khác. Thuốc cũng được dùng để giảm đau
đầu, đau lưng, đau rǎng, nhức cơ ... Acetaminophen làm giảm đau trong viêm
khớp nhẹ nhưng không có tác dụng trên tình trạng viêm, đỏ và sưng khớp. Gần
đây thuốc được cho là có hiệu quả ngang với thuốc chống viêm không steroit
trong làm giảm đau khớp gối do viêm xương khớp...
1.1.1.4. Một số phương pháp đã được áp dụng để định lượng
acetaminophen
• Phƣơng pháp đo quang
Nguyên tắc: Dựa vào khả năng hấp thụ tử ngoại của phân tử acetaminophen
trong metanol hấp thụ quang cực đại tại bước sóng 245 nm và trong môi trường
kiềm hấp thụ quang cực đại tại bước sóng 257 nm. Tính kết quả dựa vào giá trị
độ hấp thụ quang đo được và độ hấp thụ riêng hoặc so sánh với chất chuẩn.
• Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Dựa vào khả năng phân bố khác nhau của acetaminophen trên pha tĩnh và
pha động, quá trình sắc ký sẽ thực hiện được.
Theo dược điển Việt Nam IV, định lượng acetaminophen sử dụng:

Cột

thép không gỉ (250 mm x 4,6 mm; 5 µm).
Pha động: hỗn hợp gồm 375 thể tích dung dịch dinatri hydrophotphat 1,79%,
375 thể tích dung dịch natri dihydrophotphat 0,78% và 250 thể tích metanol có
chứa 0,46% của dung dịch tetra-butylamoni hydroxit 40%.
Tốc độ dòng 1,5 mL/phút.
3


Nhiệt độ cột: 350C.
Thể tích tiêm mẫu 20 µL.
Dectector UV, bước sóng hấp thụ 245 nm[1].
1.1.2. Loratadin
1.1.2.1. Giới thiệu chung
- Tên tiếng Anh: Loratadine.
- Công thức phân tử: C22H23ClN2O2.
- Khối lượng mol phân tử: 382,88 (g/mol).
- Công thức cấu tạo:

- Tên IUPAC: Ethyl4-(8-chloro-5,6-dihydro-11H-benzo [5,6] cyclohepta
[1,2-b] pyridin-11-ylidene) piperidine-1-carboxylate.
1.1.2.2. Tính chất
- Loratadin là tinh thể màu trắng hay trắng ngà.
- Nhiệt độ nóng chảy: 132-137 0 C.
- Độ tan trong nước: thực tế không tan trong nước, tan trong các dung môi

axeton, metanol, tuluen ở bất kì tỉ lệ nào.
1.1.2.3. Dược lý cơ chế tác dụng
Loratadin là thuốc kháng histamin 3 vòng có tác dụng kéo dài đối kháng
có chọn lọc trên thực thể H1 ngoại biên và không có tác dụng làm dịu trên thần
kinh trung ương. Loratadin thuộc nhóm đối kháng thực thể H1 thế hệ thứ hai
(không an thần). Loratadin có tác dụng làm nhẹ bớt triệu chứng của viêm mũi và
viêm kiết mạc dị ứng do giải phóng histamin.
Loratadin có tác dụng chống ngứa và nổi mày đay liên quan tới histamin.
Tuy nhiên, loratadin không có tác dụng bảo vệ hoặc trợ giúp lâm sàng đối với

4


trường hợp giải phóng histamin nặng như choáng phản vệ. Trong trường hợp đó
điều trị chủ yếu là dùng adrenarin và corticostroit. Thuốc kháng histamin không
có vai trò trong điều trị hen. Những thuốc đối kháng histamin H1 thế hệ thứ hai
(không an thần) như: terfenadin, astmizol, loratadin không phân bố vào não, khi
dùng thuốc với liều thông thường. Loratadin không có tác dụng an thần, ngược
lại với tác dụng phụ an thần của các kháng histamin thế hệ thứ nhất. Để điều trị
viêm mũi dị ứng và mày đay, loratadin có tác dụng nhanh hơn astemizol và có
tác dụng như azatadin, cetirizin, clopheninamin, clemastin, terfenadin và
mequitazin. Loratadin có tần suất tác dụng phụ, đặc biệt đối với hệ thần kinh
trung ương, thấp hơn những kháng histamin thuộc thế hệ thứ hai khác.
Vì vậy, dùng loratadin ngày một lần có tác dụng nhanh, đặc biệt không có
tác dụng an thần, là thuốc lựa chọn đầu tiên để trị viêm mũi dị ứng và mày đay
dị ứng.
Những thuốc chứa histamin không có tác dụng chữa nguyên nhân mà chỉ
trợ giúp làm nhẹ bớt triệu chứng, bệnh viêm mũi dị ứng có thể là bệnh mãn tĩnh
và tái diễn; để điều trị thành công thường phải dùng các kháng histamin lâu dài,
ngắt quãng và sử dụng thêm những thuốc khác như glucocorticoit dùng theo

đường hít và kéo dài.
Có thể kết hợp loratadin với pseudoephedrin hydroclorit để làm nhẹ bớt
triệu chứng ngạt mũi trong điều trị viêm mũi dị ứng có kèm ngạt mũi.
1.1.2.4. Một số phương pháp đã được áp dụng để định lượng loratadin
• Phƣơng pháp quang phổ tử ngoại đạo hàm
Tác giả Nguyễn Minh Trí và cộng sự đã định lượng đồng thời loratadin và
pseudoephedrin sunfat bằng phương pháp phổ tử ngoại đạo hàm. Kết quả cho
khoảng tuyến tính 0,015-0,035 mg/mL với loratadin và 0,025-0,84 mg/mL với
pseudoefedrin, độ chính xác tương ứng cho hai chất là 99,46% (RSP=0,72%) và
100,6% ( RSP=0,58%) [11].

5


• Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC)
Dựa vào khả năng phân bố khác nhau của loratadin trên pha tĩnh và pha
động, quá trình sắc ký sẽ thực hiện được.
Định lượng loratadin sử dụng:
Cột LC 18 (250 mm x 4,6 mm; 5 µm).
Pha động: Metanol-nước (tỉ lệ 85:15 về thể tích).
Nhiệt độ cột: 25-35o C.
Tốc độ dòng 0,8 mL/phút.
Thể tích tiêm mẫu 10 µL.
Dectector UV, bước sóng hấp thụ 254 nm [9].
1.1.3. Dextromethophan HBr
1.1.3.1. Giới thiệu chung
- Tên tiếng Anh: Dextromethorphan hydrobromide.
- Công thức phân tử: C18H25NO.HBr.H2O.
- Khối lượng mol phân tử: 370,3 (g/mol).
- Công thức cấu tạo:

.HBr.H2O
- Tên IUPAC: (+) - 3-methoxy-17-methyl-9α, 13α, 14α- morphinan

[1].

1.1.3.2. Tính chất
- Dextromethophan HBr là chất bột kết tinh gần như trắng, không mùi.
- Nhiệt độ nóng chảy: 125 0 C.
- Độ tan: dễ tan trong metanol 96%, ít tan trong nước.
1.1.3.3. Dược lý cơ chế tác dụng
Dextromethophan HBr là thuốc giảm ho có tác dụng lên trung tâm ho ở
hành não. Mặc dù cấu trúc hóa học có liên quan đến mocphin, nhưng

6


dextromethophan HBr không có tác dụng giảm đau và nói chung rất ít tác dụng
an thần.
Dextromethophan HBr được dùng giảm ho nhất thời do kích thích nhẹ ở
phế quản và họng như cảm lạnh thông thường hoặc hít phải các chất kích thích.
Thuốc không có tác dụng long đờm.
Với liều điều trị, tác dụng chống ho của thuốc kéo dài được 5-6 giờ. Độc
tính thấp, nhưng với liều rất cao có thể gây ức chế hệ thần kinh trung ương.
1.1.3.4. Một số phương pháp đã được áp dụng để định lượng
Dextromethophan HBr
• Phƣơng pháp phổ hấp thụ phân tử UV-Vis sử dụng thuật toán
Kalman
Tác giả Mai Xuân Trường đã định lượng đồng thời dextromethophan HBr,
clopheniamin maleat và guaifenesin trong thuốc methophan bằng phương pháp

đo quang với điều kiện: môi trường HCl 0,1M; thời gian đo quang sau khi pha
chế là 30 phút; nhiệt độ 300C 10C; bước sóng khảo sát 210280nm với max của
dextromethophan HBr là 278nm; max của clopheniamin maleat là 264nm và max
của guaifenesin là 273nm. Đã xác định đồng thời dextromethophan HBr,
clopheniramin maleat và guaifenesin trong các mẫu pha chế và trong thuốc
methophan, các kết quả cho thấy phương pháp xác định có độ đúng và độ chính
xác cao với độ thu hồi trung bình của dextromethophan HBr là 98,8%, độ thu hồi
của trung bình của clopheniamin maleat là 100,1% và độ thu hồi trung bình của
guaifenesin là 101,3% [14].
• Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Dựa vào khả năng phân bố khác nhau của dextromethophan HBr trên pha
tĩnh và pha động, quá trình sắc ký sẽ thực hiện được.
Theo dược điển Việt Nam IV, định lượng dextromethophan HBr sử dụng:
Cột C18 (250 mm x 4,6 mm; 5 µm).

7


Pha động: natri docusate 0,007M và amoni nitrat 0,007M trong hỗn hợp
axetonitril: nước (tỉ lệ 70:30 về thể tích). Điều chỉnh đến pH=3,4 bằng axit axetic
băng (Merk).
Tốc độ dòng 1 mL/phút.
Thể tích tiêm mẫu 20 µL.
Dectector UV, bước sóng hấp thụ 280 nm.
1.2. Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
HPLC là chữ viết tắt của 4 chữ cái đầu bằng tiếng Anh của phương pháp
sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography), trước
kia gọi là sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography).
Phương pháp này ra đời từ những năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và
cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển. Phương pháp này ngày càng được sử

dụng rộng rãi và phổ biến vì nhiều lý do: có độ nhạy cao, khả năng định lượng
tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt.
1.2.1. Nguyên tắc của phƣơng pháp HPLC
Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp tách một hỗn hợp chất
lỏng dựa trên sự phân bố chúng giữa hai pha, một pha đứng yên gọi là pha
tĩnh, một pha di chuyển gọi là pha động. Do ái lực hấp thụ và giải hấp thụ
khác nhau của các hợp phần có trong mẫu phân tích với pha tĩnh và pha
động mà chúng di chuyển dọc theo pha tĩnh (cột sắc ký) tốc độ khác nhau
nên lần lượt đi ra khỏi cột.
1.2.1.1. Pha tĩnh
Pha tĩnh là chất nhồi cột để làm nhiệm vụ tách 1 hỗn hợp chất phân tích.
Nó là những chất rắn, xốp, kích thước hạt rất nhỏ, đường kính cỡ hạt từ
3÷10  m, diện tích bề mặt thường từ 50÷500 m2/g.
- Trơ và bền vững với các điều kiện của môi trường sắc ký.
- Có khả năng tách chọn lọc một hỗn hợp chất tan nhất định trong điều
kiện sắc ký nhất định.

8


- Tính chất bề mặt phải ổn định (đặc biệt là đặc trưng xốp của nó).
- Cân bằng động học của sự tách phải xảy ra nhanh và lặp lại tốt.
- Cỡ hạt phải tương đối đồng nhất
1.2.1.2. Pha động
Pha động là dung môi dùng để rửa giải chất tan (chất cần phân tích) ra
khỏi cột tách để thực hiện quá trình sắc ký. Đây là một yếu tố rất linh động và dễ
dàng thay đổi. Nó có thể là một dung môi hoặc hỗn hợp nhiều dung môi trộn lẫn
với nhau theo những tỉ lệ nhất định. Nó có thể là dung dịch hoặc các muối có
chứa các chất đệm, chất tạo phức... Nói chung mỗi loại sắc ký sẽ có các hệ dung
môi rửa giải riêng để có được hiệu quả phân tách tốt nhất.

- Không hòa tan hay làm mòn pha tĩnh.
- Hòa tan được chất cần phân tích.
- Bền vững theo thời gian.
- Có độ tinh khiết cao.
- Phải nhanh đạt các cân bằng trong sắc ký.
- Có độ nhớt thấp để tránh áp suất dội lại cao.
- Phù hợp với các loại detector dùng để phát hiện các chất phân tích.
- Có tính kinh tế và không khan hiếm.
1.2.2. Các đại lƣợng đặc trƣng của quá trình sắc ký
1.2.2.1. Thời gian lưu
Thời gian lưu của một chất là thời gian tính từ lúc tiêm mẫu vào cột đến
khi chất đó ra khỏi cột đạt giá trị nồng độ cực đại và cho ra pic trên sắc ký đồ.

t R, = t R - t 0
Trong đó:
tR : thời gian lưu trữ của một chất.
t’R: thời gian lưu thực (thời gian lưu hiệu chỉnh).
t0 : thời gian chết (thời gian không lưu trữ).

9


1.2.2.2. Hệ số phân bố
Trong quá trình sắc ký luôn có sự phân bố của chất tan giữa pha động và
pha tĩnh. Sự phân bố này đặc trưng bởi cân bằng phân bố với hệ số phân bố được
tính theo công thức sau:
K=
Trong đó:
K: hệ số phân bố
CS, CM: nồng độ của chất phân tích tương ứng trong pha tĩnh và pha động

ở thời điểm cân bằng.
1.2.2.3. Hệ số dung lượng
Hệ số dung lượng của một chất cho biết khả năng phân bố của chất đó
trong hai pha động với sức chứa cột tức là tỷ số giữa lượng chất tan trong pha
tĩnh và lượng chất tan trong pha động ở trong thời điểm cân bằng.
K’=
Trong đó :
K’: hệ số dung lượng
Nếu K’ nhỏ thì tR cũng nhỏ và sự tách kém. Nếu K’ lớn thì pic bị doãng.
Trong thực tế K’ từ 1 - 5 là tối ưu.
1.2.2.4. Hệ số chọn lọc
Hai chất chỉ được tách ra khi chúng có giá trị α khác nhau, hệ số chọn lọc
cho biết hiệu quả tách của hệ thống sắc ký.
α=

=

=

=

Trong đó:
α: hệ số chọn lọc
Thường phân tích trong điều kiện  trong khoảng 1,5 đến 2.

10


1.2.2.5. Số đĩa lý thuyết và chiều cao đĩa lý thuyết
Hiệu lực cột thường biểu thị qua hai thông số: Số đĩa lý thuyết (N) hoặc

chiều cao đĩa lý thuyết (H).
Số đĩa lý thuyết N được tính theo các công thức:
N = 16×

hoặc N = 5,54×

Trong đó:
W: chiều rộng pic ở đáy pic.
W1/2: chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao của pic.
Chiều cao của đĩa lý thuyết được tính theo công thức:
H=

L
N

Trong đó:
L: chiều cao cột sắc ký.
Với một điều kiện sắc ký nhất định, chiều cao đĩa lý thuyết (H) và số đĩa
lý thuyết (N) là hằng định đối với mỗi chất phân tích. (Trong thực tế N nằm
trong khoảng 2500 đến 5500).
1.2.2.5. Độ phân giải
Độ phân giải là đại lượng biểu thị độ tách của các chất ra khỏi nhau trong
điều kiện sắc ký đã cho. Độ phân giải của hai pic cạnh tranh được tính theo 1
trong 3 công thức sau:
=

;

hoặc

=

=

×

Trong đó:
RS: là độ phân giải.
tRA, tRB: thời gian lưu tương ứng của chất A, chất B.
W1/2(A), W1/2(B): Chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao pic của chất A, chất B.
WA, WB: Chiều rộng pic ở đáy pic.
α: Hệ số chọn lọc.

11


1.2.3. Hệ thống máy HPLC
Hệ thống máy HPLC có các bộ phận chính sau:
1. Bình chứa dung môi (pha động).

5. Cột tách (pha tĩnh).

2. Bộ khử khí.

6. Detector.

3. Bơm cao áp.

7. Máy ghi tín hiệu hoặc máy vi tính.

4. Bộ tiêm mẫu.

8. Máy in.

Hình 1.1. Hình ảnh máy HPLC
1.3. Kết quả xác định một số chất theo phƣơng pháp HPLC và phƣơng
pháp quang phổ hấp thụ phân tử
1.3.1. Kết quả xác định một số chất theo phƣơng pháp HPLC
Trên thế giới nói chung và ở nước ta nói riêng, phương pháp HPLC được
ứng dụng nhiều trong phân tích các chế phẩm về dược cũng như hỗn hợp các
chất vô cơ, hữu cơ. Các kết quả đều cho thấy phương pháp có độ tin cậy cao.
Năm 2003, M.M Mabrouk và cộng sự đã định lượng loratadin và
pseudoephedrin sunfat trong dược phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng pha đảo
RP-LC và quang phổ đạo hàm. Đây là phương pháp có độ nhạy cao, đơn giản và
chính xác để xác định thuốc chống dị ứng loratadin và thuốc thông mũi
pseudoephedrin sunfat. Phương pháp tách loratadin và pseudoephedrin sunfat
trên cột BondaPak C18 bằng cách sử dụng pha động là hỗn hợp metanol: H2O:

12


axit photphoric: amoni dihydrophotphat (tỷ lệ 220: 300: 2: 3g theo V / V / V /
W), 60 và 40% axetonitril, tốc độ dòng 2 mL/phút với bước sóng phát hiện là
247 nm. Các đồ thị hiệu chuẩn tuyến tính trong khoảng 5-100 μg/mL cho
loratadin và 120-1200 μg/mL cho pseudoephedrin sunfat, giới hạn phát hiện là
0,5 μg/mL và 60 μg/mL tương ứng cho loratadin và pseudoephedrin sunfat.
Phương pháp này đã được áp dụng thành công cho việc xác định đồng thời
loratadin và pseudoephedrin sunfat cũng như riêng loratadin trong các dạng bào
chế dược phẩm khác nhau [26].
Năm 2005, tác giả Thái Duy Thìn và cộng sự đã sử dụng phương pháp

HPLC:
-

Nghiên cứu định lượng acetaminophen, ibuprofen bằng phương

pháp HPLC với điều kiện: Cột Richrosorb RP18 (250mm x 4mm; 10μm), pha
động là hỗn hợp axetonitril và dung dịch axit photphoric 0,1% (tỉ lệ 60: 40 về
thể tích), tốc độ dòng là 1 mL/phút, detector UV đặt ở bước sóng 214 nm, thể
tích tiêm mẫu 20 μL. Kết quả thu được: sai số tương đối của ibuprofen và
acetaminophen là 0,81% và 1,03%; độ thu hồi của ibuprofen và acetaminophen
là 98,4% và 98% [15].
-

Định lượng acetaminophen, axit mefenamic bằng phương pháp

HPLC với điều kiện: Cột Lichrosorb RP18 (250 mm x 4,6 mm; 10 μm). Pha
động là hỗn hợp axetonitril- nước- tetrahydrofuran (tỉ lệ 3:8:9 về thể tích). Tốc
độ dòng là 1 mL/phút. Detector UV đặt ở bước sóng 279 nm. Thể tích tiêm mẫu
20 μL. Kết quả thu được: sai số tương đối của acetaminophen, axit mefenamic
là 0,51% và 1,42%; độ thu hồi của acetaminophen, axit mefenamic là 98,16%
và 99,16% [15].
-

Định lượng acetaminophen, cafein bằng phương pháp HPLC với

điều kiện: Cột Lichrosorb RP18 (250mm x 4,6mm; 10μm). Pha động là hỗn hợp
metanol- nước (tỉ lệ 35:65 về thể tích). Tốc độ dòng là 1 mL/phút. Detector UV
đặt ở bước sóng 279 nm. Thể tích tiêm mẫu 20 μL. Kết quả thu được: sai số

13

tương đối của acetaminophen, cafein là 0,54% và 1,07%; độ thu hồi của
acetaminophen, cafein là 98,8% và 99,5% [15].
-

Định lượng acetaminophen, quinin sunfat bằng phương pháp

HPLC với điều kiện: Cột Lichrosorb RP18 (250mm x 4,6mm; 5μm). Pha động
là hỗn hợp metanol- axit axetic- dietylamin (tỉ lệ 650:350:1 về thể tích). Tốc
độ dòng là 1 mL/phút. Detector UV đặt ở bước sóng 235 nm. Thể tích tiêm
mẫu 20 μL. Kết quả thu được: sai số tương đối của acetaminophen, quinin
sunfat là 1,16% và 1,887%; độ thu hồi của acetaminophen, quinin sunfat là
99,0% và 99,3% [15].
-

Định

lượng

acetaminophen,

phenylpropaolamin

HCl,

clorphenylamin maleat bằng phương pháp HPLC với điều kiện: Cột C 18
(250mm x 4,6mm; 5μm). Pha động là hỗn hợp nước- axetonitril- trietylamin (tỉ
lệ 968:30:2 về thể tích). Tốc độ dòng là 1,2 mL/phút. Detector UV đặt ở bước
sóng 216 nm đo phenylpropaolamin HCl và clorphenylamin maleat 244 nm đo

acetaminophen. Thể tích tiêm mẫu 20 μL. Nhiệt độ cột ở nhiệt độ phòng. Kết
quả thu được: sai số tương đối của acetaminophen, phenylpropaolamin HCl và
clophenylamin maleat là 0,47% và 0,67% và 1,19%; độ thu hồi dao động từ
99,61% đến 100,65% [15].
-

Định

lượng

acetaminophen,

ephedrin

HCl,

theophyllin,

phenobarbital bằng phương pháp HPLC với điều kiện: Cột lichrosorb RP18
(250mm x 4mm; 10μm). Pha động là hỗn hợp metanol-dung dịch đệm photphat
pH 3,5 (tỉ lệ 38:62 về thể tích). Tốc độ dòng là 1,0 mL/phút. Detector UV đặt ở
bước sóng 240 nm. Thể tích tiêm mẫu 20 μL. Kết quả thu được với diện tích
pic, độ lặp lại và độ đúng nằm trong giới hạn cho phép [15].
-

Định lượng acetaminophen, bromhexin HCl, pseudoephedry HCl,

clorpheniramin maleat và cafein bằng phương pháp HPLC với điều kiện: Cột
lichrosorb Si60 (250mm x 4mm; 5μm). Pha động là hỗn hợp metanol-dung dịch
đệm amoninitrat pH 9,5 (tỉ lệ 45:6 về thể tích). Tốc độ dòng là 1,5 mL/phút khi

đo pseudoephedry HCl, clorpheniramin maleat; 1,0 mL/phút khi đo cafein và
14


bromhexin HCl; 1,0 mL/phút khi đo acetaminophen. Detector UV đặt ở bước
sóng

257

nm

với

pseudoephedry

HCl,

clorpheniramin

maleat

và

acetaminophen; 298 nm với cafein và bromhexin HCl. Thể tích tiêm mẫu 20
μL. Kết quả thu được với diện tích pic, độ lặp lại và độ đúng nằm trong giới hạn
cho phép [15].
Năm 2007, Dina T. El-Sherbinya đã định lượng đồng thời loratadin và
desloratadin trong các chế phẩm dược sử dụng phương sắc ký lỏng hiệu năng
cao. Việc tách 2 chất này được thực hiện với bước sóng phát hiện ở 247 nm, tốc
độ dòng là 1 mL/phút, pha động gồm sodium dodecyl sunfat 0,1 M, 1% octanol,

10% n-propanol và 0,3% trietylamin trong axit photphoric 0,02M

pH 3,0.

Phương pháp này tách tốt loratadin và desloratadin trong dược phẩm với hệ số
phân giải là 3,85. Phương pháp này đòi hỏi thời gian xử lý mẫu nhanh (10 phút),
độ lặp lại của phương pháp RSD <2,0% [18].
Năm 2009, bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), tác giả
Fegade và cộng sự đã định lượng đồng thời acetaminophen và piroxicam trong
thuốc viên. Sử dụng cột Eurosphere-100 C18 (250mm x 4,6 mm; 5 μm) với pha
động là hỗn hợp metanol: nước (tỉ lệ 70:30 về thể tích). Tốc độ dòng 1,0
mL/phút và bước sóng đo quang ở 227 nm. Thời gian lưu của piroxicam và
acetaminophen tương ứng là 2,52 và 5,48 phút. Phương pháp này đã có độ chính
xác, độ tuyến tính, độ tin cậy, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng theo tiêu
chuẩn ICH và USP. Các nghiên cứu khảo nghiệm cho thấy độ thu hồi
acetaminophen và piroxicam trong phạm vi 99÷101% thu được ở các nồng độ
khác nhau. Phương pháp này được áp dụng thành công với việc xác định xác
định đồng thời cả hai chất trong phòng thí nghiệm cũng như trong dược phẩm
thương mại [19].
Năm 2011, Ulavapalli và cộng sự đã định lượng thành công
psuedoephedrin, fexofenadin và loratadin trong dược phẩm bằng phương pháp
sắc ký lỏng hiệu năng cao. Việc tách các chất được thực hiện bằng cách sử dụng
cột C18 (150mm x 4,6 mm; 5μm), nhiệt độ cột 35° C với pha động gồm kênh A
15