Sản xuất enzyme protease tái tổ hợp từ chủng bacillus sp

Sản xuất enzyme Protease tái tổ hợp
từ chủng Bacillus sp
I. Tổng quan về enzyme Protease và vi khuẩn Bacillus
1. Tổng quan về enzyme Protease
1.1. Giới thiệu chung
* Protease là nhóm enzyme thủy phân có khả năng cắt liên kết peptide (CO-NH)
trong phân tử polypeptide, protein và một số cơ chất khác tương tự thành các
amino acid tự do hoặc các peptide phân tử thấp.
* Phân loại:
**Dựa vào vị trí tác dụng cua protease lên các liên kết peptide trong phân tử
protein, người ta chia protease ra làm hai nhóm chính:
Endopeptidase (protease): chủ yếu phân giải các liên kết peptide nằm trong
phân tử protein tạo thành những đoạn peptide có trọng lượng phân tử nhỏ
(polypeptide mạch ngắn, peptone,..).
Exopeptidase (polypeptidase): chủ yếu phân cắt liên kết ở hai đầu mạch. Ví dụ:
nhóm cacboxylpeptidase và aminopeptidase phân giải liên kết peptide từ hai đầu
mạch polypeptide có nhóm cacboxyl và amin tự do
** Dựa vào thành phần amino acid và vùng pH tối ưu cho hoạt động của
protease, người ta chia protease thành các nhóm như sau:
_ Protease axit: pepsin, renin,... hoạt động ở vùng pH axit
_ Protease kiềm: trypsin, chymotrypsin,...hoạt động ở vùng pH kiềm, có nhiều
ở hệ enzym ruột non, tuyến tụy, nấm men.
_ Protease trung tính: amylase, papain,.. hoạt động ở vùng pH trung tính. Loại
protease này có rất nhiều ở các loài nấm mốc khác nhau. Ngoài nấm mốc ra
protease trung tính còn thấy ở vi khuẩn Bacillus
Tuy nhiên, việc tạo ra các loại protease axit, trung tính hay kiềm còn phụ thuộc
rất nhiều ở thành phần môi trường hoặc vào cơ chất mà chúng tác dụng.


**Dựa vào cơ chế thủy giải liên kết peptide liên quan tới cấu trúc đặc biệt của
trung tâm hoạt động. Protease được chia làm 4 nhóm nhỏ, tên các nhóm này

gồm tên của các axit amin quan trọng nhất có vai trò xúc tác trong trung tâm
hoạt động enzym:
- Serin-protease : là những protease có nhóm ( _OH) của serin trong trung tâm
hoạt động. Các serin_protease hoạt động ở vùng pH kiềm và có tính đặc hiệu
tương đối rộng. Tính đặc hiệu của chúng thể hiện về phía gốc axit amin chứa
nhóm ( _CO_ ) của liên kết peptide bị thủy phân. Nhóm (_OH_) có vai trò quan
trọng với hoạt động xúc tác của enzym.
-Cystein_protease : các enzym thuộc nhóm này có nhóm (_SH) của cystein
trong trung tâm hoạt động. Nhóm (_SH) này có vị trí đặc biệt trong trung tâm
hoạt động xúc tác của enzym vì nó có khả năng phản ứng cao, tham gia nhiều
biến đổi hoá học như oxy hóa, phosphoryl hóa,.... Các cystein_protease thường
hoạt động mạnh ở pH trung tính và có tính đặc hiệu rộng, chúng chỉ hoạt động
khi nhóm (_SH_) trong trung tâm hoạt động không bị bao vây.
- Aspartic-protease: là những protease chứa nhóm (_COOH) của axit aspartic
trong trung tâm hoạt động, đóng vai trò xúc tác trong trung tâm hoạt động của
enzym. Các aspartic_protease thường hoạt động mạnh ở pH axit. Chúng có tính
đặc hiệu đối với các axit amin vòng thơm hoặc axit amin kỵ nước ở 2 nhánh của
vòng thơm.
- Metallo-protease:là những protease trong trung tâm hoạt động của chúng có
các ion kim loại trực tiếp tham gia phản ứng. Các metallo_protease thường hoạt
động mạnh nhất ở vùng pH trung tính và có tính đặc hiệu về phía gốc axit amin
chứa nhóm (_NH_) của liên kết peptid. Chúng có thể tác dụng lên nhóm các
liên kết peptid chứa nhóm (_NH_) của các axit amin kỵ nước có kích thước lớn
hoặc liên kết peptid được tạo thành từ các axit amin có phân tử lượng thấp.
* Vai trò:
- Protease là một trong những enzyme quan trọng nhất trong công nghiệp, có tác
dụng xúc tác cho phản ứng phân giải protein, được sử dụng trong nhiều thế kỷ,
lĩnh vực sử dụng đầu tiên enzyme này là ngành sản xuất sữa.
- Trong cơ thể, các protease đảm nhiệm nhiều chức năng sinh lý như: hoạt hóa
zymogen, đông máu và phân hủy sợi fibrin của cục máu đông, giải phóng

hormon và các peptid có hoạt tính sinh học từ các tiền chất, vận chuyển protein
qua màng


- Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ
tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ
vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa...) và động vật
(gan, dạ dày bê...).
1.2.Đặc điểm và tính chất của Protease vi sinh vật
Trước hết hệ Protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều
enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó
tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất.
Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên Protease vi sinh vật
thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thủy phân triệt để và đa dạng.

2. Tổng quan nguồn thu nhận Protease từ vi khuẩn Bacillus
Nguồn enzyme từ vi sinh vật dần thay thế enzyme từ động vật và thực vật do
hàng loạt những ưu điểm về sinh lí vi sinh vật và về kĩ thuật sản xuất sau đây:
- Vi sinh vật có khả năng chuyển hóa một khối lượng cơ chất lớn hơn khối
lượng cơ thể chúng hàn ngàn lần sau một ngày đêm
- Enzyme thu nhận từ vi sinh vật có hoạt tính cao
- Vi sinh vật có thể sinh tổng hợp cùng một lúc nhiều loại enzyme khác nhau.
- Tốc độ sinh sản của vi sinh vật nhanh trong thời gian ngắn có thể thu được
lượng sinh khối vi sinh vật lớn, giúp trong một thời gian ngắn thu được một
lượng enzyme nhiều hoặc lượng các sản phẩm trao đổi chất cao
- Một đặc điểm riêng có của vi sinh vật đó là cơ thể nhỏ bé nên việc vận hành,
kiểm soát thiết bị lên men trong quá trình sản xuất đơn giản hơn rất nhiều.
- Vi sinh vật thích hợp cho sản xuất theo quy mô công nghiệp do trong sản suất,
quá trình sinh trưởng, phát triển và sinh tổng hợp hoàn toàn không phụ thuộc và
khí hậu bên ngoài

- Nguồn nguyên liệu dùng sản xuất enzyme theo quy mô công nghiệp rẻ tiền và
dễ kiếm, không chỉ có ý nghĩa về mặt kinh tế mà còn ý nghĩa về mặt môi trường
sống.


Lượng Protease sản xuất từ vi khuẩn được ước tính vào khoảng 500 tấn, chiếm
59% lượng enzyme được sử dụng.
Protease của động vật hay thực vật chỉ chứa một trong hai loại endopeptidase
hoặc exopeptidase, riêng vi khuẩn có khả năng sinh ra cả hai loại trên, do đó
Protease của vi khuẩn có tính đặc hiệu cơ chất cao. Chúng có khả năng phân
hủy tới 80% các liên kết peptide trong phân tử protein.
Các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh Protease là Bacillus subtilis,
B.mesentericus, B.thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi Clostridium.
Trong đó, B.subtilis S5 có khả năng tổng hợp Protease mạnh nhất. Các vi khuẩn
thường tổng hợp các Protease hoạt động thích hợp ở vùng pH trung tính và kiềm
yếu.
Các Protease trung tính của vi khuẩn hoạt động ở khoảng pH hẹp (pH 5-8) và
có khả năng chịu nhiệt thấp. Các Protease trung tính tạo ra dịch thủy phân
protein thực phẩm ít đắng hơn so với Protease động vật và tăng giá trị dinh
dưỡng. Chúng còn có khả năng ái lực cao đối với các acid amin ưa béo và thơm
và được sinh ra nhiều bởi B.subtilis, B.mesentericus, B. thermorpoteoliticus và
một số giống thuộc chi Clostridium.
Protease của Bacillus ưa kiềm có điểm đẳng điện bằng 11, khối lượng phân tử
từ 20.000-30.000dalton. Ổn định trong khoảng pH 6-12 và hoạt động trong
khoảng pH rộng 7-12.
2.4. Một số nghiên cứu về protease
2.4.1. Một số nghiên cứu về protease trên thế giới
Từ thế kỷ 18, nhà tự nhiên học Reomur (người Pháp) đã phát hiện trong dịch dạ
dày của chim ăn thịt có khả năng tiêu hóa thịt. Sau đó Schwann (1836) đã quan
sát được hoạt động phân giải protein của dịch vị và 30 năm sau mới tách được

enzym phân giải protein mà ngày nay gọi là pepsin.
Năm 1957, Corvisart tách được trypsin từ dịch tụy đó là protease đầu tiên ở
dạng chế phẩm nhưng chưa được tinh sạch. Brucke (1861) tách được pepsin từ
dịch dạ dày chó ở dạng tương đối tinh khiết. Danilevxki (1862) dùng phương
pháp hấp phụ trên colodion đã tách được trypsin với amylase tụy tạng. Phương
pháp nghiên cứu hấp phụ này có ý nghĩa lớn trong nghiên cứu tinh chế enzym


cũng như protein. Sau đó hàng loạt các protease được nghiên cứu và tách ra ở
dạng chế phẩm như: chymotrypsin được Hommarsten tách ra vào năm 1872;
papain được Wurtz tách ra từ các phần khác nhau của cây đu đủ; bromelin được
Willstatter, Grassmann, Ambros tách ra từ các phần của cây dứa; cathepsin cua
mô động vật được Willstatter Bamann tách ra vào năm 1929.
Từ năm 1930 đến nay, sau khi Summer (1926) kết tinh được urease từ đậu
tương, các nhà khoa học đã kết tinh được hàng loạt các protease. Nhờ kết tinh
được enzym có độ tinh sạch cao nên người ta đã nghiên cứu được cấu trúc phân
tử, cấu trúc trung tâm hoạt động, tính chất hóa lý và tính đặc hiệu của các
protease.
Từ năm 1950 đến nay, nhờ sử dụng một số phương pháp mới để tinh chế protein
và enzym nên người ta đã tách được các dạng khác nhau của nhiều protease, ví
dụ như năm 1959 Ryle và Porter dùng phương pháp sắc ký trao đổi ion đã tách
được hai thành phần trong chế phẩm pepsin lợn là pepsin B và pepsin C.
Metrione Neves và Fruton (1966) dùng phương pháp lọc qua gel sephadex kết
hợp với sắc ký trao đổi ion đã thu được chế phẩm cathepsin đồng nhất,... Trong
những năm 1950 đến nay, các nhà khoa học đã tập trung nghiên cứu protease
VSV và đạt được một số thành tựu đáng kể như: năm 1950 Giintelberg và
Ottesen tách được protease kiềm từ Bac.subtilis, năm 1967 Danno và Yoshimura
tách được protease cua Asp.sydowi
2.4.2. Một số nghiên cứu về protease ở Việt Nam
Năm 1964, Nguyễn Lân Dũng, Đào Trọng Hùng và Ngô Khắc Truy nghiên cứu

sử dụng protease Asp.oryzae đã xác định rằng có thể sử dụng enzym này trong
chế biến nước mắm. Sau đó năm 1967, Nguyễn Lân Dũng và Phạm Văn Ty tiến
hành cấy trực tiếp một số chủng nấm mốc Aspergillus có khả năng tổng hợp
protease lên cá và giữ ở nhiệt độ 55°C trong 1_3 ngày, kết quả nghiên cứu cho
thấy thịt cá được thủy phân nhanh hơn [2].
Năm 1983, Phạm Thị Trân Châu công bố về "Một số đặc tính cơ bản và khả
năng phân giải các cơ chất khác nhau của protease ngoại bào của Bac.pumilus"
cho thấy từ môi trường nuôi cấy có thể thu được hai protease: một protease
kiềm hoạt động ở pH 10,7 và một protease trung tính hoạt động ở pH 7,0 nhạy
cảm với DFP và được gọi là serin_metallo protease. Kết quả nghiên cứu cho
thấy có thể sử dụng protease ngoại bào của Bac.pumỉlus trong chế biến cá đem
lại hiệu quả kinh tế cao ngoài ra có thể sử dụng enzym này trong chế biến
gluten, nhộng [7].


Năm 1991, Ngô Thị Mại, Nguyễn Thị Dự và cộng sự dùng protease Bac.subtilis
bổ sung vào quá trình thủy phân cá. Kết quả cho thấy khi bổ sung 0,3% chế
phẩm protease Bac.subtilis vào khối chượp ở nhiệt độ 50°C thời gian chế biến
nước mắm rút ngắn còn 10 ngày và 30_35 ngày trong điều kiện tự nhiên mùa hè
[2].
Năm 1996, Đặng Văn Hợp đã có công trình "Nghiên cứu cải tiến qui trình sản
xuất nước mắm ngắn ngày bằng enzym protease của nấm mốc Asp.orỵzae" cho
thấy lượng protease của nấm mốc Asp.oryzae thích hợp nhất là 3% so với khối
lượng cá, lượng rỉ đường là 1,2% so với chượp, nhiệt độ tối ưu để thủy phân là
49°C, thời gian 8 ngày, từ đó rút ngắn được thời gian chế biến nước mắm [19].
Năm 1997, Đặng Văn Hợp, Nguyễn Trọng Cẩn, Nguyễn Thị Hiền đã tiến hành
đề tài "Nghiên cứu chiết xuất và thu nhận chế phẩm protease từ canh trường
nuôi cấy nấm mốc Asp.oryzae-A4" cho thấy từ môi trường nuôi cấy Asp.oryzaeA4 theo phương pháp bề mặt và thu nhận chế phẩm protease từ canh trường
nuôi theo cách chiết rút bằng nước cất với tỉ lệ: canh trường/ nước cất là 1/4 rồi
kết tủa bằng muối (NHR 4R)R 2RSOR 4R với tỉ lệ: 3,5 dd(NHR 4R)R 2RSOR

4R bão hòa/ 1 dd chiết, thu được CPE protease có hoạt tính cao nhất [20].
Các nghiên cứu về protease trên thế giới nói chung và ở Việt nam nói riêng đã
mở ra một hướng đi mới cho việc nghiên cứu ứng dụng protease trong thực tiễn
cuộc sống.