Các bước sản xuất enzyme Protease tái tổ hợp từ chủng Bacillus sp Việt Nam biết trên genbank có một số trình tự mã hóa cho protein của một số loài trong chi Bacillus.

Công nghệ enzyme. GV: ThS. Trịnh Đình Khá.
ĐẶT VẤN ĐỀ
Ngày nay không ai có thể phủ nhận được tầm quan trọng của công nghệ
sinh học đối với nền kinh tế quốc dân nước ta nói riêng và thế giới nói chung.
Thế kỷ 21 được coi là thế kỷ của ngành công nghệ sinh học, được coi là
thời điểm lịch sử mà con tầu vũ trụ mang tên “công nghệ sinh học” đã rời
khỏi bệ phóng để bay đến tầm cao mới.
Đối với Việt Nam, theo xếp hạng của Biotechnologi Atlas, công nghệ
sinh học (CNSH) Việt Nam đứng ở nhóm giữa trong khu vực ASEAN nhưng
vẫn lạc hậu so với các nước Singapore, Thái Lan trong việc ứng dụng nghiên
cứu vào sản xuất, tạo ra các sản phẩm chủ lực… Rõ ràng, Việt Nam còn rất
nhiều việc phải làm để đưa các kết quả nghiên cứu “vượt” ra ngoài phòng thí
nghiệm. Việt Nam là nước nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm, rất thuận lợi cho sự
phát triển của sinh vật và đây được coi là một kho tàng vô giá về nguồn gen
trong tự nhiên và nguồn nguyên liệu để phát triển ngành công nghệ sinh học
nước nhà.
Công nghệ sinh học Việt Nam đang được coi là một hướng phát triển
mũi nhọn của đất nước. Trong đó có sự chú trọng đầu tư cho lĩnh vực công
nghệ enzyme. Trong đó công nghệ enzyme tái tổ hợp là một hướng đi mới.
Có rất nhiều loại enzyme tái tổ hợp đã được nghiên cứu để đưa vào ứng trong
thực tiễn. Protease là một trong những enzyme được ứng dụng rất nhiều trong
mọi lĩnh vực, trong đó, đặc biệt là công nghiệp thực phẩm Protease đã có
những đóng góp rất to lớn trong việc phục vụ, nâng cao đời sống của con
người. Vì vậy nhu cầu cải tiến tạo ra enzyme Protease tái tổ hợp mang những
đặc tính ưu việt hơn rất được quan tâm.
Xuất phát từ những thực tế trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu tìm hiểu
“ Các bước sản xuất enzyme Protease tái tổ hợp từ chủng Bacillus sp Việt Nam
biết trên genbank có một số trình tự mã hóa cho protein của một số loài trong
chi Bacillus. ”.
SV: Vũ Xuân Tạo K5 Công nghệ sinh học.

1
Công nghệ enzyme. GV: ThS. Trịnh Đình Khá.
Chương I. Tổng quan về enzyme Protease và vi
khuẩn Bacillus.
1.1. Tổng quan về enzyme Protease [2]
1.1.1 Giới thiệu chung
- Protease là các enzyme xúc tác sự thủy phân liên kết peptit (CO-NH)
trong phân tử protein và các cơ chất tương tự.
Nhiều Protease có khả năng liên kết este và vận chuyển acid amin.
Theo phân loại quốc tế các enzyme thuộc nhóm này chia thành 4 phân
nhóm phụ:
- Aminopeptidase: xúc tác sự thủy phân liên kết peptit ở đầu nitơ
của mạch polypeptit
- Cacboxypeptidase: xúc tác sự thủy phân liên kết peptit ở đầu
cacbon của mạch polypeptit. Cả hai phân nhóm enzyme trên đều là các exo –
peptidase.
- Dipeptihydrolase: Xúc tác sự thủy phân các liên kết dipepit.
- Proteinase: Xúc tác sự thủy phân các liên kết peptid nội mạch.
Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức
độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối
tượng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa...) và
động vật (gan, dạ dày bê...) [12]. Trong cơ thể, các Protease đảm nhiệm nhiều
chức nǎng sinh lý như: hoạt hóa zymogen, đông máu và phân hủy sợi fibrin
của cục máu đông, giải phóng hormon và các peptid có hoạt tính sinh học từ
SV: Vũ Xuân Tạo K5 Công nghệ sinh học.

2
Hình 1.1. Phản ứng thủy phân liên kết peptide
Công nghệ enzyme. GV: ThS. Trịnh Đình Khá.
các tiền chất, vận chuyển protein qua màng...[8]. Ngoài ra, các Protease có thể

hoạt động như các yếu tố phát triển của cả tế bào ác tính và tế bào bình
thường đó là tǎng sự phân chia tế bào, sinh tổng hợp ADN...[2]. So với
Protease động vật và thực vật, Protease vi sinh vật có những đặc điểm khác
biệt. Trước hết hệ Protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm
nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử
nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất.
Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên Protease vi sinh
vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thủy phân triệt để và đa
dạng.

1.1.2 Đặc điểm và tính chất của Protease vi sinh vật [5]
Các công trình nghiên cứu Protease vi sinh vật ngày càng nhiều. Các
kết quả nghiên cứu cho thấy ngay cả các Protease của cùng một loài vi sinh
vật cũng có thể khác nhau về
nhiều tính chất. Căn cứ vào cơ
chất phản ứng, pH hoạt động
thích hợp,… các nhà khoa học đã
phân loại các Protease vi sinh vật
thành bốn nhóm như sau:
P-xerin; P-thiol; P-kim loại;
P-acid
SV: Vũ Xuân Tạo K5 Công nghệ sinh học.

3
Hình 1.3. Cấu trúc tinh thể của Tripsin
(1 Protease xerin tiêu biểu)
Hình 1.2. Cấu trúc không gian enzyme Protease
Công nghệ enzyme. GV: ThS. Trịnh Đình Khá.
Một số tác giả khác chia Protease ra ba nhóm, dựa vào hoạt động pH của
chúng bao gồm: Protease-acid; Protease trung tính; Protease kiềm.

Trong bốn Protease kể trên, các Protease-xerin và Protease-thiol có khả
năng phân giải liên kết este và liên kết amide của các dẫn xuất acid của aa.
Ngược lại các Protease kim loại, Protease acid thường không có hoạt tính
esterase của các dẫn suất của aa. Nhiều Protease ngoại bào của vi sinh vật đã
được nghiên cứu tương đối kỹ về cấu tạo phân tử, một số tính chất hóa lý và
cơ chế tác dụng. Kết quả nghiên cứu cho thấy trọng lượng phân tử của các
enzyme này tương đối bé, nhất là các P-xerin.
Các P-xerin có trọng lượng phân tử thấp vào khoảng 20.000 – 27.000
Dalton. Tuy nhiên, cũng có một số P-xerin có trọng lượng phân tử lớn hơn
như các enzyme của Pelicillium cyoneo-fulvum (44.000), Asp, oryzae OUT
5038 (52.000). Trọng lượng phân tử của các Protease kim loại lớn hơn so với
P-xerin (vào khoảng 33.800 - 48.400). Protease tiol và nhiều Protease-acid
cũng có trọng lượng phân tử vào khoảng 30.000-40.000 Dalton.
Có thể tóm tắt những đặc tính của các nhóm Proteinase này ở bảng 1.1
Bảng 1.1 Một số tính chất của Protease (P) vi sinh vật
Nhóm Nguồn E Chất kìm
hãm
Đặc
điểm
TTHĐ
pH tối
thích
P
Xerin
Bac.subtilis
Bac.pumilus
Str.griseus
Str.fradiae
Art hrobacter B22
Asp.oryzae

Asp.flavus
Asp.sojae
E.coli
DFP
+
Xerin Kiềm
P-tiol Streplococcus Indoaxeta-mit -SH 7,5
SV: Vũ Xuân Tạo K5 Công nghệ sinh học.

4
Công nghệ enzyme. GV: ThS. Trịnh Đình Khá.
Clostridium histoly-ticum Ps.cloromer-
curbenzoat
7,0
P kim
loại
Bac.subtilus
Bac.subtilus NRRL B3411
Bac. Subtilisamy
Losaccarilicis
Bac. Megaterium
Psuedomonasaeruginoa
Atreptomeces naraensis
Asp. Oryzae
Acremonium kiliense
Clostridiumhisttolytium
EDTA
++
1,10octa-
fenantrolin

Kim loại
hóa trị
hai
Trung
tính
P Acid Asp.niger
Asp.Awamori
Sailoi,penicillium
Janthinellum
Rhizopus chinensis
Mucor pucillus
Endothia parasilica
Dizoaxetil
Dlnorlox-
inmetil este
COOH Acid
1.1.3. Cấu trúc trung tâm hoạt động (TTHĐ) của Protease [5]
Trong TTHĐ của Protease vi sinh vật ngoài gốc acid amin đặc trưng cho
từng nhóm còn có một số gốc acid amin khác. Các kết quả nghiên cứu chung
về TTHĐ của một số Protease vi sinh vật cho phép rút ra một số nhận xét
chung như sau:
- TTHĐ của Protease đủ lớn và bao gồm một số gốc aa và trong một số
trường hợp còn có cả cofactơ kim loại.
+ Các Protease kim loại có TTHĐ lớn hơn vào khoảng 21
0
A, có thể
phân biệt thành sáu phần dưới TTHĐ (subsite), mỗi phần dưới TTHĐ tương
ứng với mỗi gốc aa trong phân tử cơ chất.
SV: Vũ Xuân Tạo K5 Công nghệ sinh học.

5
Công nghệ enzyme. GV: ThS. Trịnh Đình Khá.
+ Đối với các Protease acid, theo nhiều nghiên cứu cấu trúc TTHĐ của
các tinh thể Protease acid của Phizopus chinenis và Endothia parasilica đã cho
thấy phân tử các Protease này gồm có hai hạt, giữa chúng có khe hở vào
khoảng 20
0
A. Khe hở này là phần xúc tác của các E, các gốc Asp-35 và Asp-
215 xếp đối diện nhau trong khe ấy.
- Đối với các Protease không chứa cysteine, TTHĐ của chúng có tính
mềm dẻo hơn vì cấu trúc không gian của chúng không được giữ vững bởi các
cầu disulphide.
Mặc dù TTHĐ của các Protease vi sinh vật có khác nhau nhưng các
enzyme này đều xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết peptide theo cùng
một cơ chế chung như sau:
Trong đó: E: enzyme, S: cơ chất, enzyme - S: Phức chất enzym- cơ
chất, P
1
: Là sản phẩm đầu tiên của phản ứng, P
2
: Là sản phẩm thứ hai của
phản ứng.
1.2. Nguồn thu nhận Protease [8]
- Enzyme là protein được sinh vật tổng hợp trong tế bào và là chất tham
gia xúc tác cho mọi phản ứng sinh học. Chính vì thế, mọi sinh vật đều được
xem là nguồn thu nhận để sản xuất enzyme. Nhưng vẫn chủ yếu là ba nguồn
chính: Động vật, thực vật và vi sinh vật.
- Protease phân bố ở thực vật, động vật, vi sinh vật. Tuy nhiên nguồn
enzyme ở vi sinh vật phong phú nhất, có ở hầu hết các vi sinh vật như vi
khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn… có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu

thích hợp nhất để sản xuất enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghệ và đời
sống [8].
SV: Vũ Xuân Tạo K5 Công nghệ sinh học.

6
E + S enzyme – S enzyme – S + P
1
enzyme + P
2
Hình 1.4 Cơ chế xúc tác TTHĐ Enxyme
Công nghệ enzyme. GV: ThS. Trịnh Đình Khá.
- Enzyme Protease từ nguồn động vật và thực vật được loài người khai
thác và ứng dụng hàng ngàn năm để sản xuất và phục vụ trong cuộc sống.
Nhưng hiện nay lượng enzyme thu nhận từ thực vật và động vật được thay thế
dần bằng enzyme vi sinh vật. enzyme thu nhận từ các nguồn này thường rất
khó và hiệu quả kinh tế không cao. Nguồn enzyme từ vi sinh vật dần dần thay
thế enzyme từ động vật và thực vật do hàng loạt những ưu điểm về sinh lý vi
sinh vật và về kỹ thuật sản xuất được liệt kê như sau:
+ Vi sinh vật có khả năng chuyển hóa một khối lượng cơ chất lớn hơn
khối lượng cơ thể chúng hàng ngàn lần sau một ngày đêm.
+ Enzyme thu nhận từ vi sinh vật có hoạt tính cao.
+ Tốc độ sinh sản của vi sinh vật mạnh, trong thời gian ngắn có thể thu
được lượng sinh khối vi sinh vật rất lớn, giúp trong một thời gian ngắn thu
được một lượng enzyme nhiều hoặc lượng các sản phẩm trao đổi chất cao.
+ Một đặc điểm riêng có của vi sinh vật đó là cơ thể nhỏ bé nên việc
vận hành, kiểm soát thiết bị lên men trong quá trình sản xuất đơn giản hơn rất
nhiều.
+ Vi sinh vật là giới sinh vật thích hợp cho sản xuất theo quy mô công
nghiệp:
Trong sản xuất, quá trình sinh trưởng, phát triển và sinh tổng hợp

enzyme của vi sinh vật hoàn toàn không phụ thuộc vào khí hậu bên ngoài.
Trong khi đó, sản xuất enzyme từ nguồn thực vật và động vật không thể đưa
vào quy mô công nghiệp được.
+ Nguồn nguyên liệu dùng sản xuất enzyme theo quy mô công nghiệp
rẽ tiền và dễ kiếm, không chỉ có ý nghĩa về mặt kinh tế mà còn có ý nghĩa rất
lớn về mặt môi trường sống. vi sinh vật không đòi hỏi quá khắc khe những
yếu tố dinh dưỡng của môi trường, nhất là những vi sinh vật tổng hợp enzyne.
Chính vì thế enzyme được sản xuất từ vi sinh vật thường rẻ tiền hơn enzyme
từ các nguồn khác.
SV: Vũ Xuân Tạo K5 Công nghệ sinh học.

7