Nghiên cứu biểu hiện kháng nguyên hemagglutinin (HA) tái tổ hợp của virus cúm AH5H1 và đánh giá tinh sinh miễn dịch trên gà

1

MỞ ĐẦU
Virus cúm thể độc lực cao (Highly pathogenic avian influenza - HPAI)
H5N1 thuộc type A, họ Orthomyxoviridae, là chủng có khả năng gây tử vong cao
trên 50% gia cầm bị nhiễm. Dịch cúm gia cầm H5N1 đã xuất hiện ở nhiều quốc gia
châu Á, châu Âu, châu Phi và đang thực sự là mối đe dọa nghiêm trọng đối với toàn
cầu. Từ khi dịch cúm gia cầm H5N1 xuất hiện tới nay, thế giới đã có hơn 250 triệu
gia cầm bị tiêu hủy, gây thiệt hại nặng nề về kinh tế cho ngành chăn nuôi. Đặc biệt,
không chỉ gây bệnh trên gia cầm, virus cúm A/H5N1 còn có khả năng lây truyền từ
gia cầm sang người. Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế gới, từ tháng 01/2003 đến
tháng 12/2016 đã có 856 trường hợp mắc cúm A/H5N1, trong đó 452 trường hợp tử
vong, chiếm 52,8% (www.wpro.who.int/emerging_diseases/AvianInfluenza/en).
Với độc lực mạnh, khả năng đột biến lớn, số lượng các vật chủ không ngừng tăng
lên, virus H5N1 trở thành mối đe dọa về một đại dịch xảy ra trên toàn cầu. Do đó,
việc nghiên cứu tìm ra biện pháp dự phòng và điều trị virus cúm A/H5N1 là vô
cùng cấp bách.
Dịch cúm gia cầm A/H5N1 bùng phát tại Việt Nam vào cuối năm 2003 ở các
tỉnh phía Bắc, sau đó đã nhanh chóng lan tới hầu hết các tỉnh/thành trong cả nước
chỉ trong một thời gian ngắn, hàng triệu gia cầm bị chết và tiêu hủy gây thiệt hại rất
lớn về mặt kinh tế cho ngành chăn nuôi. Sử dụng vắc xin cho gia cầm được xem là
một trong những biện pháp hữu hiệu nhất để ngăn chặn sự lan truyền của virus cúm
và giảm thiểu những thiệt hại do virus cúm gây ra đối với ngành chăn nuôi. Hai loại
vắc xin thương mại đã được sử dụng rộng rãi trên thế giới để tiêm phòng cho gia
cầm là vắc xin bất hoạt và vắc xin sống nhược độc sử dụng vector virus làm dẫn
truyền. Cúm A/H5N1 vẫn là vấn đề có tính thời sự ở Việt Nam, tuy vắc xin phòng
cúm A/H5N1 đã được ứng dụng hơn 10 năm, nhưng hằng năm dịch bệnh vẫn xảy ra
và hiện nay có nguy cơ các phân type mới (H5N6, H5N2, H7N9) xâm nhập. Virus
cúm gia cầm biến đổi liên tục tạo nên những clade mới nên việc tiếp tục nghiên cứu
để có được công nghệ sản xuất vắc xin hiệu quả hơn, dễ tự động hóa hơn, cho phép

2

thích ứng nhanh với biến thể virus mới là hết sức cần thiết. Các nhà khoa học đang
nỗ lực nghiên cứu tạo ra các loại vắc xin khác như vắc xin dưới đơn vị, vắc xin
DNA, vắc xin sống nhược độc ... để đáp ứng yêu cầu phòng chống dịch cúm gia
cầm một cách triệt để. Việc nghiên cứu sản xuất kháng nguyên HA để tạo vắc xin
dưới đơn vị góp phần đa dạng hóa công nghệ sản xuất vắc xin; không phụ thuộc vào
nguồn cung cấp phôi trứng gà; cho phép phân biệt gia cầm tiêm vắc xin và gia cầm
nhiễm bệnh ngoài môi trường bằng giám sát huyết thanh; có thể sản xuất được trong
một thời gian ngắn, đáp ứng yêu cầu phòng chống dịch bệnh khi có biến chủng xảy
ra. Xuất phát từ yêu cầu và cơ sở khoa học trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên
cứu biểu hiện kháng nguyên hemagglutinin (HA) tái tổ hợp của virus cúm
A/H5N1 và đánh giá tính sinh miễn dịch trên gà” với các mục tiêu:
- Biểu hiện kháng nguyên HA tái tổ hợp của virus cúm A/H5N1.
- Đánh giá tính sinh miễn dịch trên gà của protein HA tái tổ hợp, làm cơ sở
để tạo vắc xin phòng cúm A/H5N1.
Nội dung nghiên cứu của đề tài
(1) Nghiên cứu biểu hiện kháng nguyên HA trong hệ biểu hiện E. coli BL21.
- Biểu hiện gen ha1, ha1-2 trong tế bào E. coli BL21.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố nhiệt độ, IPTG đến biểu hiện gen.
- Tinh chế và kiểm tra tính kháng nguyên của protein tái tổ hợp.
(2) Nghiên cứu biểu hiện kháng nguyên HA trong tế bào nấm men P. pastoris.
-

Nghiên cứu biểu hiện kháng nguyên HA dưới dạng dung hợp với Trx có vị
trí cắt của thrombin (T) và enterokinase (E) (Trx-TE-HA).

-

Nghiên cứu cải biến mã bộ ba và biểu hiện kháng nguyên HA1 trong nấm
men P. pastoris.

-

Nghiên cứu biểu hiện kháng nguyên HA dưới dạng dung hợp trx không có
trình tự cắt của enterokinase và thrombin.

(3) Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố lên quá trình biểu hiện protein HA tái
tổ hợp; lên men và thu hồi protein HA tái tổ hợp.
(4) Đánh giá tính sinh miễn dịch trên gà của protein HA tái tổ hợp.


3

Đóng góp mới của luận án
Luận án là công trình mới ở Việt Nam nghiên cứu biểu hiện kháng nguyên
HA tái tổ hợp của virus cúm A/H5N1 trong E. coli và nấm men P. pastoris, làm cơ
sở để tạo vắc xin phòng cúm A/H5N1. Từ các cấu trúc thiết kế biểu hiện gen khác
nhau, với nhiều chủng biểu hiện và điều kiện biểu hiện khác nhau chúng tôi đã
chọn được chủng nấm men P. pastoris SMD1168 biểu hiện TrxHA1. Sản lượng
HA được tổng hợp trong nồi lên men đạt 84 mg/l. Hiệu giá HI trung bình huyết
thanh gà sau 2 tuần gây miễn dịch nhắc lại với 100 g TrxHA1 tái tổ hợp qua
đường tiêm dưới da cổ đạt 7-7,2 log2, hiệu giá HI sau 2 tuần gây miễn dịch nhắc
lại bằng đường nhỏ mắt mũi đạt 6,6 - 7,0 log2. Hiệu giá HI huyết thanh gà gây
miễn dịch với protein HA tái tổ hợp tương đương với hiệu giá HI huyết thanh gà
tiêm vắc xin bất hoạt Re-1.


4

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TỔNG QUAN VỀ VIRUS CÚM A/H5N1
1.1.1. Cấu trúc virus cúm A
Virus cúm thuộc họ Orthomyxoviridae, gồm 3 type A, B, C trong đó virus
cúm type A có nhiều type huyết thanh khác nhau và chủ yếu gây bệnh cho người,
động vật như chim, gia cầm, lợn... Các hạt virus cúm A (virion) có hình cầu hoặc
hình khối đa diện, đường kính 80 -120 nm, đôi khi cũng có dạng hình sợi, khối
lượng phân tử khoảng 250 triệu Da (Hình 1.1A). Kết quả phân tích thành phần hóa
học của virion cho thấy RNA chiếm khoảng 0,8 - 1,1%, protein chiếm khoảng 70 74%; lipid 5 - 8% còn lại là carbonhydrate. Hạt virus có cấu tạo đơn giản gồm vỏ
(capsid), vỏ bọc ngoài (envelope) và lõi là RNA sợi đơn âm. Hệ gen virus cúm A, B có
8 sợi RNA âm (PA, PB1, PB2, HA, NA, M, NP và NS) tổng kích thước khoảng 9 kb
mã hóa cho 15 loại protein khác nhau (Hình 1.1B) (Palese, 2007; Amorij, 2008).

A

B

Hình 1.1: Hình thái và cấu trúc virus cúm A
(Nguồn: WHO; Amorij, 2008)

Các đoạn PA, PB1, PB2 mã hóa các enzyme trong phức hợp polymerase
(RNA transcriptase) của virus, có độ dài ổn định và có tính bảo tồn cao. Phân đoạn
HA và NA (neuraminidase) mã hóa cho protein bề mặt của virus. Hai protein này có
tính kháng nguyên đặc trưng cho từng chủng virus cúm A. Đoạn NP mã hóa cho


5

nucleoprotein (NP) - thành phần của phức hệ phiên mã, chịu trách nhiệm vận
chuyển RNA giữa nhân và bào tương tế bào chủ. Phân đoạn M mã hóa cho protein
đệm - matrix protein của virus gồm hai tiểu phần M1 và M2 được tạo ra bởi những
khung đọc mở khác nhau của cùng một phân đoạn RNA. Protein M1 là một protein
nền, thành phần chính của virus có chức năng bao bọc RNA tạo nên phức hợp
ribonucleoprotein và tham gia vào quá trình “nảy chồi” của virus. Protein M2 là
chuỗi polypeptide ngắn, có khối lượng phân tử khoảng 11 kDa, protein M2 đâm
xuyên và nhô ra khỏi vỏ ngoài, chịu trách nhiệm tháo vỏ virus giải phóng hệ gen
virus vào bào tương tế bào chủ trong quá trình xâm nhiễm (Palese, 2007; Bouvier,
2008; Neumann, 2009).
Hiện nay, các nhà khoa học đã phát hiện ra 18 loại kháng nguyên HA (H1H18) và 11 loại kháng nguyên NA (N1-N11) (Tong, 2013). Trong lịch sử ghi nhận
chỉ phân type H1, H2, H3 và N1, N2 gây bệnh cho người. Gần đây phân type H5, H7,
H9 cũng gây bệnh cho người với mức độ nguy hiểm hơn (Li, 2015; Bui, 2016). Bệnh
dịch do chủng H5N1 gây ra có khả năng lây lan rất cao ở các động vật lông vũ, gây
chết hàng loạt ở chim và gia cầm (Webster, 2002; Schrauwen, 2014; Webster, 2014).
1.1.2. Chu trình tái bản của virus cúm A
Quá trình xâm nhiễm và nhân lên của virus xảy ra chủ yếu ở các tế bào biểu
mô đường hô hấp, đường tiêu hóa của cơ thể vật chủ (Nicholson, 2003; Palese,
2007; Neumann, 2009; de Graaf, 2014). Các giai đoạn của quá trình xâm nhiễm như
sau (Hình 1.2):
Giai đoạn 1 - giai đoạn hấp phụ: các hạt virus gắn với tế bào chủ thông qua
liên kết giữa các phân tử HA với các thụ thể có chứa nhóm sialic acid trên bề mặt tế
bào chủ. Virus cúm gia cầm gắn đặc hiệu với thụ thể sialic acid α 2-3 galactose
(SAα2-3Gal) còn virus cúm người gắn đặc hiệu với thụ thể sialic acid α 2-6
galactose (SAα2-6Gal) (de Graaf, 2014). Do có tính đặc hiệu với thụ thể nên virus
cúm gia cầm không thể dễ dàng lây nhiễm sang người và ngược lại, hình thành rào
cản loài, thu hẹp khả năng lây nhiễm của virus trên một hoặc một số vật chủ nhất


6

định. Ở một số động vật (như lợn, gà ...) có cả hai loại thụ thể nên có thể bị nhiễm
cả virus cúm gia cầm và virus cúm người (Schrauwen, 2014; Neumann, 2015).

Hình 1.2: Chu trình xâm nhiễm và sao chép của virus cúm A
(Nguồn: Neumann, 2009)

Trong cơ thể vật chủ cảm nhiễm, khả năng bám gắn và gây bệnh của virus
cúm còn tùy thuộc vào từng mô cơ quan. Nhìn chung, virus cúm A có tính thích
ứng lây nhiễm với biểu mô đường hô hấp và gây bệnh chủ yếu ở đường hô hấp (de
Graaf, 2014). Tuy nhiên, khả năng liên kết của virus cúm với tế bào chủ còn phụ
thuộc vào hoạt tính của neuraminidase vì trên niêm mạc đường hô hấp có một lớp
mucin bao phủ, tạo nên một hàng rào mà virus phải xuyên qua để gắn với tế bào.
Lớp mucin này chứa nhiều sialic acid hình thành một mạng lưới có tác dụng ngăn
cản virus bám vào bề mặt tế bào (Sanders, 2010). Nhờ hoạt tính sialidase phân cắt
các nhóm sialic acid mà neuraminidase giúp cho virus có thể tiếp cận với các tế bào
cảm nhiễm bên trong đường hô hấp.
Giai đoạn 2 - xâm nhập tế bào: virus xâm nhập vào tế bào chủ yếu bằng con
đường ẩm bào. Sau khi virus gắn vào tế bào, màng tế bào lõm lại hình thành túi bao
bọc virus. Túi này dần dần khép kín lại, sau đó tách khỏi màng tế bào tạo thành túi
nội bào (endosome). Để tránh bị phân hủy bởi môi trường pH thấp trong endosome,
protein M2 hoạt động mạnh, bơm ion H+ vào trong hạt virus.


7

Giai đoạn 3 - tháo vỏ virus: dòng chảy của các ion H+ từ lòng túi ẩm bào
vào hạt virus làm lớp protein nền M1 bị phá vỡ và tách khỏi phức hợp RNP. Hoạt
động của kênh ion H+ làm thay đổi cấu trúc không gian của HA và bộc lộ các
peptide chịu trách nhiệm hòa tan vỏ, nhờ đó vỏ của virus có thể dung hợp với màng

endosome và giải phóng các phức hợp RNP vào trong bào tương tế bào.
Giai đoạn 4 - tổng hợp RNA và protein virus: Phức hợp RNP được vận
chuyển vào nhân tế bào để phiên mã tạo mRNA. Phân tử mRNA được phiên mã
trong nhân từ các chuỗi RNA sợi đơn (-) của virus khi sử dụng mồi là đoạn 10-13
nucleotide cắt ra từ đầu 5’ của mRNA có gắn mũ của vật chủ, sau đó được gắn đuôi
polyA cũng lấy từ mRNA của tế bào chủ. Enzyme cắt mồi là endonuclease do virus
mang theo. mRNA mới hoàn thiện của virus ra khỏi nhân, vào bào tương để tiến
hành tổng hợp protein. Kết quả của quá trình phiên mã từ 8 đoạn RNA hệ gen tạo ra
được 15 phân tử protein.
Trong nhân tế bào, các RNA hệ gen của virus tổng hợp nên các sợi dương từ
khuôn là sợi âm của hệ gen virus, từ các sợi dương này chúng tổng hợp nên RNA hệ
gen của virus mới nhờ RNA - polymerase. Các sợi này không được adenine hóa
(gắn thêm các adenine) và gắn mũ ở đầu 5’ và 3’, chúng kết hợp với nucleoprotein
(NP) tạo thành phức hợp ribonucleoprotein hoàn chỉnh và được vận chuyển ra tế
bào chất. Đây là đặc điểm khác biệt so với các virus khác (quá trình này xảy ra
trong tế bào chất của vật chủ). Các protein PB1, PB2, PA, NP của virus sau khi
được tổng hợp sẽ được đưa vào nhân tế bào và kết hợp với RNA virus hình thành
các phức hợp RNP, sau đó các phức hợp lại được đưa trở lại bào tương. Các protein
khác (HA, NA, và M2) được glycosyl hóa ở mạng lưới nội chất và phức hệ Golgi
của tế bào.
Giai đoạn 5 - lắp ráp và giải phóng virus khỏi tế bào: sau khi trải qua cải
biến sau dịch mã, các protein HA, NA và M2 được đưa đến màng tế bào chủ và gắn
với lớp lipid kép. Khi mật độ các protein màng đủ lớn thì các phức hợp RNP và
protein M2 cũng tập hợp lại trên màng tế bào. Sau khi cả 8 phân đoạn RNA của hệ


8

gen và các thành phần khác được tập hợp đầy đủ thì các phức hợp RNP, protein vỏ
virus và protein nền M1 được lắp ráp lại với nhau để hình thành các hạt virus thế hệ

mới. Các virus mới hình thành được gắn vào màng tế bào bằng liên kết HA với
nhóm sialic acid màng tế bào. Các hạt virus sau đó được giải phóng theo cơ chế nảy
chồi khỏi màng tế bào nhờ tác dụng cắt nhóm axit sialic của neuraminidase.
1.1.3. Kháng nguyên của virus cúm A/H5N1
1.1.3.1. Kháng nguyên HA
HA là một kháng nguyên bề mặt quan trọng của virus cúm A do phân đoạn
gen ha mã hóa. Ở virus cúm A/H5N1 phân đoạn ha có kích thước 1776 bp, trong đó
vùng mã hóa cho protein H5 khoảng 1698 - 1710 bp tùy thuộc vào từng chủng virus
(Xiong, 2013; Nguyễn Thị Bích Nga, 2011). Về cấu tạo, phân tử HA có dạng
trimer, gồm 3 phân tử protein HA0 (Hình 1.3). Khối lượng của mỗi phân tử HA0 là
70 - 75 kDa. HA0 được chia thành hai tiểu đơn vị HA1 (36 kDa) và HA2 (27 kDa).
Vị trí liên
kết thụ thể

Peptid
dung hợp

Vỏ virus

Hình 1.3: Mô hình cấu trúc bậc 3 và bậc 4 của hemagglutinin
(Nguồn: Amorij, 2008)

Tiểu phần HA1 kết thúc bằng nhóm amino, chứa một số vị trí gắn gốc
đường, vị trí gắn thụ thể trên tế bào chủ và vị trí quyết định kháng nguyên (Amorij,
2008). Phần lớn cấu trúc bậc hai của HA1 là các phiến β cuộn xoắn lại tạo thành
vùng hình cầu của phân tử HA. Tiểu phần HA2 kết thúc bằng nhóm carboxyl, chứa


9

phần xuyên màng và peptit dung hợp màng. Cấu trúc bậc hai của HA2 là các đoạn
xoắn  kết hợp với nhau tạo thành vùng dạng sợi, gắn với vỏ virus. Cấu trúc HA0
được bền vững nhờ cầu nối disulfide giữa tiểu phần HA1 và HA2. Protein HA được
tổng hợp dưới dạng polypeptide HA0 ở mạng lưới nội chất, tại đây chúng tập hợp
lại thành dạng trimer. Sau đó, chúng được vận chuyển tới bề mặt tế bào thông qua
bộ máy Golgi. Tại bề mặt tế bào các enzym protease của tế bào chủ phân cắt HA0
thành HA1 và HA2 (Sriwilaijaroen, 2012).
Vùng nối giữa HA1 và HA2 có chứa một hoặc một số amino acid kiềm tính
chính là vùng phân cắt hai tiểu đơn vị của protein HA0 dưới tác dụng của protease.
Trình tự amino acid vùng phân cắt HA có vai trò quyết định độc lực của virus
(Velkov, 2013). Ở các chủng virus, điển hình là H5N1 thể độc lực cao, chuỗi amino
acid kiềm tính trên vùng phân cắt HA được nhận biết bởi các protease nội bào phổ
biến, giúp virus có thể lây nhiễm và tái bản ở nhiều mô cơ quan khác nhau trong cơ
thể vật chủ và gây nên các triệu chứng toàn thân nặng nề (Perdue, 2000; Luczo,
2015). Ngược lại, vị trí phân cắt giữa hai tiểu phần HA1, HA2 ở các chủng virus thể
độc lực thấp chỉ có 1 amino acid kiềm là Arg và một số amino acid kiềm ở vị trí -3
hoặc - 4 nên chỉ chịu tác dụng của các protease ngoại bào (trypsin-like). Do đó,
virus H5N1 thể độc lực thấp chỉ có thể nhân lên ở các mô cơ quan có các enzym
này như ở đường tiêu hóa và đường hô hấp (Steinhauer, 1999; Gambotto, 2008).
Có khoảng 400 phân tử HA trên bề mặt capsid của một virus. HA có vai trò
quan trọng trong quá trình nhận diện, gắn vào tế bào chủ và khởi động quá trình
xâm nhiễm của virus vào tế bào chủ (Bender, 1999). Sự xâm nhiễm của virus được
khởi đầu bằng sự kết hợp đặc hiệu giữa HA của virus với thụ thể trên bề mặt tế bào
vật chủ, sau đó vỏ virus hòa với màng tế bào và giải phóng RNA hệ gen vào tế bào
vật chủ. Quá trình kết hợp phụ thuộc vào sự phù hợp cấu hình không gian của thụ
thể chứa sialic acid của tế bào đích với vị trí gắn với thụ thể này trên phân tử HA
của virus cúm, quyết định sự xâm nhiễm dễ dàng của virus ở các loài vật chủ khác.
Vị trí amino acid 226 (aa226) của tiểu đơn vị HA1 được xác định là vị trí quyết
định phù hợp gắn HA với thụ thể đặc hiệu của nó. Ở hầu hết các chủng virus cúm A

10

lưu hành trong tự nhiên vị trí này là glycine, thích ứng với thụ thể Gal α-2,3 sialic
acid (chứa sialic acid liên kết với nhóm hydroxyl (4-OH) của galactose ở góc
quay α-2,3) của tế bào biểu mô đường hô hấp của chim và gia cầm (vật chủ tự nhiên
của virus cúm A) (Gamblin, 2010). Ngoài ra, một số vị trí amino acid khác như
glutamine 222, glycine 224, hay cấu trúc SGVSS và NGQSGR cũng có sự liên quan
chặt chẽ đến khả năng thích ứng với thụ thể chứa sialic acid bề mặt màng tế bào chủ
(Schrauwen, 2014; Luczo, 2015).
1.1.3.2. Kháng nguyên NA
Neuraminidase (sialidase), một enzyme có bản chất là glycoprotein được gắn
trên bề mặt capsid của virus cúm A. Gen mã hóa cho protein NA có chiều dài thay
đổi theo từng phân type virus cúm A. Ở virus cúm H5N1, gen na có kích thước thay
đổi trong khoảng 1350–1410 bp (Baigent, 2001; Wagner, 2002; Keawcharoen,
2005; Nguyễn Thị Bích Nga, 2011; Xiong, 2013). NA có khối lượng phân tử
khoảng 53 kDa, có cấu trúc hình nấm, bao gồm một đầu chứa 4 tiểu đơn vị và có
đoạn peptide kị nước cắm sâu vào vỏ virus, 4 tiểu đơn vị tạo thành trung tâm hoạt
động của enzyme. NA còn chứa một chuỗi polypeptide đơn hướng về phía đối diện
với kháng nguyên HA. Chuỗi này gồm 6 amino acid có tính bảo thủ cao, chứa các
amino acid ưa nước (Castrucci, 1993; Shtyrya, 2009).
Enzyme NA cắt đứt liên kết giữa gốc sialic acid của màng tế bào nhiễm với
phân tử carbohydrate của protein HA, giải phóng hạt virus ra khỏi màng tế bào
nhiễm, đẩy nhanh sự lây nhiễm của virus trong cơ thể vật chủ và ngăn cản sự tập
hợp của các hạt virus mới trên màng tế bào. Mặt khác, NA tham gia vào phân cắt
liên kết này trong giai đoạn “hòa màng”, đẩy nhanh quá trình “cởi áo” (uncoating)
giải phóng hệ gen của virus vào trong bào tương tế bào nhiễm, giúp cho quá trình
nhân lên của virus diễn ra nhanh hơn (Wagner, 2002). Ngoài ra, NA còn phân cắt
các liên kết glycoside, giải phóng neuraminic acid làm tan, loãng màng nhầy bề mặt
biểu mô đường hô hấp tạo điều kiện cho virus nhanh chóng tiếp cận tế bào biểu mô

và thoát khỏi các chất ức chế không đặc hiệu. Cùng với vai trò của kháng nguyên
HA, cả 3 khâu tác động trên của NA đều tham gia làm gia tăng độc lực gây bệnh


11

của virus cúm A ở cơ thể vật chủ. Do đó, NA là đích tác động của các thuốc hóa
dược ức chế virus không đặc hiệu hiện nay, ví dụ Oseltamivir (biệt dược là Tamiflu)
phong tỏa enzyme NA, ngăn cản sự giải phóng hạt virus mới khỏi các tế bào đích,
bảo vệ cơ thể (Aoki, 2007).
NA là một kháng nguyên bề mặt của virus, tham gia kích thích hệ thống
miễn dịch của cơ thể chủ, sinh ra kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên NA của các
chủng virus đương nhiễm (Kilbourne, 2004; Rockman, 2013). Tương tự kháng
nguyên HA, hàm lượng kháng nguyên NA trên bề mặt virus khá lớn, tỷ lệ HA:NA
là 4:1. Nghiên cứu ảnh hưởng của kháng nguyên này trong vắc xin phòng cúm trên
mô hình chuột thực nghiệm cho thấy NA không có khả năng bảo hộ hoàn toàn cơ
thể chống lại virus cúm nhưng lại có khả năng hạn chế hữu hiệu sự phát triển của
virus. Vì vậy, kháng nguyên NA được sử dụng như một nhân tố bổ trợ giúp tăng
khả năng bảo vệ của vắc xin (Kilbourne, 2004; Doyle, 2013; Eichelberger, 2015).
1.1.3.3. Kháng nguyên M2
Phân đoạn M có kích thước 1027 bp, mã hóa cho protein nền M1 của virus
và protein kênh ion M2. Hai protein này được mã hóa bởi những khung đọc mở
khác nhau của phân đoạn M. Các phân tử M1 liên kết với nhau thành một lớp kín
lót trong vỏ lipit kép, cùng với HA, NA và M2 hình thành nên vỏ capsid bao bọc
các phức hợp RNP. M2 là một protein xuyên màng bao gồm 97 amino acid với 3
vùng: vùng đầu N gồm 24 amino acid, nằm ở phía ngoài màng; vùng xuyên màng
gồm 19 amino acid; vùng nằm ở phía bào tương gồm 54 amino acid. Khối lượng
phân tử M2 khoảng 15 kDa. Chức năng của protein M2 là tạo kênh ion H+ cần thiết
cho khả năng lây nhiễm của virus ( Holsinger, 1994; Huang, 2008; Wang, 2011). Sự
hình thành nên kênh ion có vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhiễm của virus,

tạo điều kiện để virus phá vỡ vỏ endosome, giải phóng RNP vào bào tương tế bào
chủ. Protein M2 là đích của các thuốc kháng virus dòng adamantane (gồm
amantadine và rimantadine). Các thuốc này gắn với protein M2 làm protein mất
chức năng hình thành kênh ion, do đó ngăn chặn quá trình giải phóng RNP vào bào
tương tế bào nhiễm (Arinaminpathy, 2008). Tuy nhiên, một số đột biến thay thế


12

amino acid trên protein M2 của virus H5N1 gây ra hiện tượng kháng adanmatane
như: L261/F; V27/A/I/G; A30/S/T; S31N...(Cheung, 2006; Wang, 2013).
1.1.4. Các phương thức biến đổi kháng nguyên của virus cúm A
1.1.4.1. Hiện tượng lệch kháng nguyên
Lệch kháng nguyên là các đột biến điểm xảy ra ở các phân đoạn gen/hệ gen
của virus. Virus cúm A kí sinh nội bào bắt buộc, không có cơ chế đọc và sửa bản
sao trong quá trình phiên mã và sao chép ở nhân tế bào chủ. Sự thiếu hụt enzyme
sửa chữa dẫn đến các enzyme sao chép phụ thuộc RNA có thể thêm, làm mất hoặc
thay thế một hay nhiều nucleotide trong phân tử RNA chuỗi đơn mới của virus.
Hiện tượng này thường xảy ra ở các phân đoạn HA và NA, gây ra một hoặc một số
thay đổi sau: (1) tạo ra các bộ mã tổng hợp các amino acid mới; (2) làm thay đổi cấu
trúc dẫn đến thay đổi đặc tính của protein đó; (3) làm tăng mức độ glycosyl hóa
trong cấu trúc chuỗi polypeptide kháng nguyên; (4) tạo ra một biến thể virus mới có
độc tính và tính kháng nguyên mới trở thành chủng được chọn lọc trong quần thể do
chúng có khả năng nhiễm vào vật chủ chưa miễn dịch. Tần suất xảy ra đột biến
điểm rất cao, cứ 10.000 nucleotide (tương ứng với độ dài của RNA hệ gen của virus
cúm A) thì có 1 nucleotide bị đột biến (Webster, 1998). Như vậy, gần như mỗi hạt
virus mới được sinh ra đều chứa đựng ít nhất một đột biến điểm trong hệ gen của nó
và các đột biến này được tích lũy qua nhiều thế hệ virus và sẽ làm xuất hiện phân
type mới có những đặc tính kháng nguyên mới (Webster, 1998; Macken, 2006;
Chen, 2008). Trên phân tử HA của virus cúm A/H5N1 có 3 vị trí kháng nguyên

thường xuyên bị đột biến tạo nên các kháng nguyên mới, giúp virus thoát khỏi hệ
miễn dịch của vật chủ đó là các đột biến ở vị trí amino acid 136-141; vị trí amino
acid 152-153 và vị trí amino acid 124-129 (Smirnov, 2004; Hanson, 2016). Hiện
tượng lệch kháng nguyên là nguyên nhân gây ra các đợt dịch nhỏ, tản phát.
1.1.4.2. Hiện tượng trộn kháng nguyên
Hiện tượng trộn kháng nguyên xảy ra khi hai hay nhiều chủng virus cúm A
khác nhau, với nhiều đoạn RNA khác biệt nhau về mặt di truyền cùng lúc xâm


13

nhiễm vào một cơ thể vật chủ. Các phân đoạn gen của virus hoán vị với nhau. Kết
quả là tạo ra biến chủng virus mới có thể lây nhiễm vào vật chủ mới mà bố mẹ
chúng không có khả năng gây nhiễm hoặc gia tăng độc lực gây bệnh. Do đó, trộn
kháng nguyên được coi là nguyên nhân gây ra các đại dịch cúm (Macken, 2006;
Chen, 2008). Các virus HPAI H5N1 ở khu vực Đông Nam Á đều có gen HA và
NA có nguồn gốc từ chủng gốc Gs/Gd/1/96 trong khi 6 gen còn lại được lấy từ các
nguồn khác nhau do hiện tượng trao đổi và tích hợp các phân đoạn gen. Chính
hiện tượng trộn kháng nguyên này đã tạo virus H5N1 gây ra đại dịch ở người năm
1997 và tiếp sau đó các dịch cúm gia cầm năm 2001 và 2002 (Chen, 2008).
Năm 1997, ở Hồng Kông virus cúm A/H5N1 lây trực tiếp từ gà sang người
đã giết chết 6 trên tổng số 18 người bị nhiễm. Virus này tiếp tục lan truyền sang
ngỗng ở miền Nam Trung Quốc và thay thế ngay các kiểu gen khác gây bệnh ở gà
nhưng không gây bệnh ở vịt. Năm 2001, 6 kiểu gen đã được xác định là A, B, C,
D, E và X0. Các kiểu gen này đều giống nhau về đột biến xóa 5 amino acid (vị trí
80-84) của protein NS1, ngoại trừ kiểu gen chủng Gs/Gd/1/96 và kiểu gen X0.
Năm 2002, có 8 kiểu gen mới xuất hiện là V, W, X1, X2, X3, Y, Z và Z +, trong
khi các chủng A, C, D và E không thấy nữa. Kiểu gen HPAI H5N1 trong giai đoạn
này mang đột biến mất 5 amino acid của NS1 và đột biến mất 20 amino acid (4968) trên vùng thân của NA. Đến năm 2003, thêm 3 kiểu hình chính nữa là Y, Z + và
V được phát hiện. Kiểu gen G được hình thành do sự trao đổi và tích hợp giữa

kiểu gen Z và W năm 2004. Trong số các kiểu gen đã xuất hiện, kiểu gen Z chiếm
ưu thế ở khu vực Đông Nam Á trong suốt giai đoạn từ 2003 đến nay (Chen, 2006).
1.1.4.3. Hiện tượng glycosyl hóa
Glycosyl hóa là sự gắn kết một chuỗi carbonhydrate vào amino acid
asparagine (N) ở một số vị trí nhất định trong chuỗi polypeptide HA hay NA, hay
một số polypeptide khác của virus cúm. Thông thường chuỗi carbohydrate được gắn
tại vị trí asparagine có motif N-X-S/T (N = asparagine; X = amino acid bất kì, trừ
proline; S/T = Serine hoặc Threonine) (Tate, 2014). Nếu hiện tượng lệch kháng


14

nguyên dẫn đến hình thành bộ ba mã hóa asparagine sẽ tạo điều kiện cho hiện tượng
glycosyl hóa xảy ra khi tổng hợp chuỗi polypeptide HA hay NA. Điều này dẫn đến
làm thay đổi đặc tính kháng nguyên của HA và NA, giúp cho virus thoát khỏi tác
động miễn dịch bảo hộ của cơ thể chủ, điều hoà sự nhân lên của virus (Baigent,
2001; Wanga, 2009; Gamblin, 2010; Hervé, 2015).
Phân tích protein HA các chủng HPAI H5N1 cho thấy mỗi chủng virus chỉ
có 5-7 vị trí có khả năng glycosyl hóa tùy theo từng chủng virus. Motif 10-NNST
xuất hiện ở tất cả các chủng H5N1, tuy nhiên asparagin tại vị trí 10 không có khả
năng glycosyl hóa. Tương tự như vậy, protein HA ở một số chủng virus mặc dù có
motif 154 - NNTY hoặc 273 - NCST nhưng các motif này cũng được xác định là
không có khả năng glycosyl hóa. Có 6 vị trí asparagine có khả năng glycosyl hóa ở
các vị trí 11 (motif NSTE), 23 (motif NVTV), 165 (motif NNTN), 286 (motif
NSSM), 484 (motif NGTY), và 543 (motif NGSL). Tuy nhiên do đột biến, một số
chủng còn lại 5 vị trí glycosyl (Blake, 2009). Nghiên cứu đặc điểm phân tử gen ha
của virus cúm A/H5N1 lưu hành ở miền Bắc Việt Nam (2008-2009) cho thấy một
số chủng xuất hiện đột biến N286S nên motif NSSM chuyển thành SSSM và mất
khả năng glycosyl hóa ở vị trí này. Bên cạnh đó xuất hiện một số chủng đột biến
N166S tạo ra motif 166 - NTQS có khả năng glycosyl hóa. Những chủng virus này

có 2 vị trí N-glycosil hóa liên tiếp ở amino acid 165 và 166 trên protein HA
(Nguyễn Nam Thắng, 2012).
Các nghiên cứu cho thấy đặc điểm glycosyl hóa protein HA liên quan chặt
chẽ đến khả năng xâm nhiễm, khả năng bám gắn và đặc điểm kháng nguyên của
virus cúm. Người ta thấy rằng, nếu gắn thêm gốc carbonhydrate vào gần vị trí phân
cắt tiểu đơn vị HA1, HA2 của protein HA thì gốc carbonhydrate có thể ngăn cản sự
tiếp xúc với protease. Do đó protein HA không phân cắt sẽ làm virus mất khả năng
xâm nhiễm tế bào. Nếu gốc carbonhydrate nằm gần vị trí gắn thụ thể thì các đột
biến này ảnh hưởng trực tiếp tới quá trình nhân lên và giải phóng virus. Nguyên
nhân là do gốc carbonhydrate tham gia điều chỉnh ái lực bám gắn và kiểm soát tính
đặc hiệu thụ thể (Deshpande, 1987; de Vries, 2010).


15

Hiện tượng “lệch kháng nguyên” và “glycosyl hóa” xảy ra liên tục theo thời
gian, còn hiện tượng “trộn kháng nguyên” có thể xảy ra với tất cả các chủng của
virus cúm A khi cùng nhiễm vào một tế bào ở tất cả các loài vật chủ khác nhau. Đây
cũng chính là vấn đề đáng lo ngại của virus cúm A/H5N1 hiện nay. Mặc dù virus
này chưa có sự thích nghi lây nhiễm dễ dàng ở người, nhưng nó có khả năng gây
bệnh cho người. Hơn nữa, rất có thể virus cúm A/H5N1 tái tổ hợp gen HA hay NA
hoặc cả hai gen của các chủng virus cúm A đã thích nghi ở người để tạo ra một biến
chủng virus mới thích ứng lây nhiễm dễ dàng ở người, gây ra nguy cơ của một đại
dịch cúm mới (Hilleman, 2002; Watanabe, 2012).

1.2. NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VẮC XIN PHÒNG CÚM A/H5N1
1.2.1. Nghiên cứu vắc xin phòng cúm A/H5N1 cho gia cầm trên thế giới
1.2.1.1. Vắc xin bất hoạt truyền thống
Hai dạng vắc xin thương mại đã được sử dụng để chủng ngừa cho gia cầm
chống lại sự lây nhiễm của virus cúm A/H5N1 là vắc xin bất hoạt sản xuất theo

phương pháp truyền thống và vắc xin thế hệ mới hay vắc xin công nghệ gen (Chen,
2009). Theo phương pháp truyền thống, vắc xin được sản xuất bằng toàn bộ hạt
virus thuộc một phân type của virus cúm gia cầm nuôi cấy trên phôi trứng gà. Virus
được tạo thành trong phôi gà bị bất hoạt bằng hóa chất như -propiolactone hoặc
formaline (Wong, 2013). Vắc xin được chia làm 2 loại dựa vào chủng virus sử dụng
sản xuất vắc xin: vắc xin bất hoạt đồng chủng và vắc xin bất hoạt dị chủng. Vắc xin
bất hoạt đồng chủng được sản xuất từ chủng virus có HA và NA giống với chủng
virus gây bệnh trên thực địa. Vắc xin bất hoạt dị chủng có HA giống với chủng
virus trên thực địa, nhưng có NA dị chủng. Vắc xin Nobilis Influenza H5 - vắc xin
bất hoạt nhũ dầu (Hà Lan), chủng vắc xin là phân type H5N2, dòng
A/chicken/Mexico/232/94 được sử dụng phòng dịch cúm A/H5N1 ở nhiều nước có
dịch cúm gia cầm lưu hành (Swayne, 2006). Vắc xin bất hoạt H5N2 (Trung Quốc)
được tạo ra bằng cách nuôi cấy chủng A/Turkey/England/N28/73(H5N2) trên phôi
gà, thu hoạch dịch phôi, bất hoạt bằng formaldehyde, nhũ hóa với chất bổ trợ (Qiao,


16

2006). Vắc xin này được sử dụng để phòng bệnh cúm do virus phân type H5 gây ra
trên gia cầm. Vắc xin này được gây miễn dịch bằng đường tiêm 2 đến 3 lần và tạo
được miễn dịch vào thời điểm 14 ngày sau khi tiêm vắc xin (Swayne, 2006). Sử
dụng vắc xin bất hoạt thường an toàn và có hiệu quả, vắc xin dị chủng có thể cho
phép phân biệt những cá thể bị nhiễm bệnh với những cá thể được tiêm phòng. Tuy
nhiên vắc xin bất hoạt không ổn định, cần phải tiêm nhắc lại (2 đến 3 liều), không
tiện lợi trong sử dụng (gây miễn dịch bằng đường tiêm). Trong giai đoạn 1997 2005, vắc xin bất hoạt dị chủng (vắc xin bất hoạt H5N2, H5N3, H5N9) đã được sử
dụng để phòng cúm A/H5N1 thể độc lực cao cho gia cầm ở các quốc gia có dịch lưu
hành. Sau năm 2005, nhóm vắc xin thế hệ mới bao gồm các loại vắc xin được tạo ra
bằng công nghệ DNA tái tổ hợp và kỹ thuật di truyền ngược được sử dụng để thay
thế các vắc xin bất hoạt truyền thống trong phòng chống dịch cúm gia cầm H5N1
(Chen, 2009).

1.2.1.2. Vắc xin phòng cúm A/H5N1 tạo ra bằng công nghệ gen
Vắc xin thế hệ mới là các loại vắc xin được tạo ra bằng công nghệ tái tổ hợp
DNA và kỹ thuật di truyền ngược được sử dụng để thay thế các vắc xin bất hoạt
truyền thống. Trong nhóm vắc xin thế hệ mới có nhiều loại vắc xin cúm A/H5N1
được tạo ra gần đây đã được thử nghiệm và sử dụng có hiệu quả như: vắc xin H5N1
có hệ thống dẫn truyền của adenovirus; vắc xin vector dẫn truyền virus đậu chim
Trovac-AIV-H5; vắc xin vector dẫn truyền virus Newcastle; vắc xin tái tổ hợp dưới
đơn vị; vắc xin tạo ra bằng phương pháp di truyền ngược.
Vắc xin phòng cúm A/H5N1 sử dụng vector virus dẫn truyền
Virus đậu gia cầm fowlpox là một thành viên của họ Poxviridae, hệ gen là
DNA sợi kép có kích thước lớn, gây bệnh ở một số loài gia cầm (Weli, 2011).
Fowlpox tái tổ hợp đã được sử dụng thành công làm vector biểu hiện gen mã hóa
cho kháng nguyên của một số virus gây bệnh nhằm phát triển vắc xin phòng bệnh
cho gia cầm (Boyle, 1993; Paoletti, 1996). Vector dẫn truyền virus đậu gà có khả
năng mang gen mã hóa HA, NA và tổng hợp protein này trong tế bào chủ mà virus
nhiễm. Các kháng nguyên này kích thích đáp ứng miễn dịch dịch thể và miễn dịch


17

qua trung gian tế bào chống lại virus cúm A/H5N1 (Swayne, 2000a; Bublot, 2006).
Vắc xin tái tổ hợp sử dụng virus đậu gia cầm làm vector dẫn truyền mang gen mã
hóa HA, NA từ chủng H5N1 (rFPF-HA-NA) bắt đầu phát triển vào năm 1999, sau
khi phát hiện chủng H5N1 độc lực cao A/goose/Guangdong/1/96 (Qiao, 2003). Vắc
xin được chế tạo bằng cách nuôi cấy virus mang gen mã hóa HA, NA của virus cúm
A/H5N1 trên tế bào phôi gà, thu hoạch virus, bổ sung chất ổn định, đông khô tạo
thành sản phẩm cuối cùng. Vắc xin được tiêm một mũi cho gà một ngày tuổi, gà tạo
đáp ứng miễn dịch vào thời điểm 7 ngày sau khi gây miễn dịch và có khả năng bảo
vệ gà ít nhất 20 tuần (Bublot, 2006; Qiao, 2006; Qiao, 2009). Trong giai đoạn 2005
- 2008, khoảng 615 triệu liều vắc xin rFPF-HA-NA được sử dụng phòng dịch cúm

A/H5N1 tại Trung Quốc (Chen, 2009).
Vắc xin tái tổ hợp sử dụng virus đậu gia cầm làm vector dẫn truyền có một
số ưu điểm như: (i) chỉ cần tiêm cho gà từ 1 ngày đến 1 tuần tuổi là đủ, không phải
tiêm nhắc lại; (ii) có thể phân biệt được gia cầm được tiêm vắc xin và gia cầm bị
bệnh tự nhiên bằng huyết thanh học (trong trường hợp sử dụng TrovacAIV-H5);
(iii) không có các phản ứng phụ gây ra bởi tá chất (Bublot, 2007). Tuy nhiên, vắc
xin tái tổ hợp fowlpox có một số hạn chế như hiệu quả miễn dịch giảm rõ rệt nếu gà
bị nhiễm fowlpox. Ngoài ra, virus fowlpox chỉ có thể xâm nhiễm gà, khả năng sao
chép rất kém hoặc hoàn toàn không sao chép trong tế bào loài khác. Do đó, vắc xin
tái tổ hợp fowlpox bị giới hạn về loài (Swayne, 2000b).
Vắc xin tái tổ hợp NDV - H5 (vắc xin phòng cúm A/H5N1 sử dụng virus
Newcastle làm vector dẫn truyền; rLH5-1) phòng cúm gia cầm H5N1 được tạo ra
lần đầu tiên vào năm 2005. Kết quả khảo nghiệm hiệu lực của vắc xin trên gà cho
thấy vắc xin tái tổ hợp rLH5 có khả năng tạo đáp ứng miễn dịch và bảo hộ gà khỏi
virus cúm gia cầm type phụ H5 và bệnh Newcastle (Veits, 2006; Wang, 2007;
Nayak, 2009; Lardinois, 2012). Năm 2006, vắc xin rLH5-1 được Trung Quốc cấp
phép sử dụng như là vắc xin nhị giá phòng bệnh cúm A/H5N1 và bệnh Newcastle
cho gà. Giai đoạn 2006-2007, khoảng 4 tỷ liều vắc xin rLH5-1 được sử dụng ở
Trung Quốc. Năm 2008, vắc xin rLH5-5 (gen ha lấy từ chủng A/duck/Anhui/1/06)


18

được sử dụng để thay thế cho vắc xin rLH5-1 (Chen, 2009). Vắc xin rLH5 sử dụng
cho gà một ngày tuổi và gây miễn dịch một lần. Gà gây dịch bằng đường uống hoặc
nhỏ mắt mũi và có khả năng bảo hộ trong vòng 18-20 tuần. Ngoài ra rNDV được xem
là vắc xin có triển vọng áp dụng cho các động vật ngoài gia cầm (Ge, 2007; Wang,
2007). Mặc dù vắc xin sử dụng chủng nhược độc, nhưng cũng đã có một số cảnh báo
ban đầu về tính an toàn của loại vắc xin này (Zhang, 2010).
Vắc xin bất hoạt tạo ra bằng kỹ thuật di truyền ngược

Di truyền ngược là một công nghệ mới đã được ứng dụng để tạo ra virus
RNA sống trong phòng thí nghiệm từ các gen virus độc lập. Dựa trên công nghệ này
nhiều chủng vắc xin cúm A/H5N1 được tạo ra để sản xuất vắc xin (Neumann,
2003). Tian và cộng sự, 2005 đã tạo ra chủng nhược độc H5N1 mang hai gen mã
hóa HA, NA lấy từ chủng A/goose/Guangdong/1/96, 6 gen khung còn lại (mã hóa
protein M, NS, NP, PA, PB1 và PB2) từ chủng A/Puerto Rico/8/34 (H1N1), đây là
chủng thích ứng tốt trên phôi gà nên được sử dụng làm bộ khung của chủng vắc
xin. Để giảm độc tính, trình tự amino acid kiềm vùng phân cắt HA
RERRRKKRGLF được thay bằng RETRGLF (Tian, 2005). Virus tái tổ hợp có đặc
điểm kháng nguyên bề mặt giống với chủng hoang dại A/goose/GD/1/96 (H5N1),
chủng nhược độc tạo ra có tên là Re-1. Vắc xin Re-1 sau đó được sử dụng phổ biến
để phòng cúm H5N1 cho gia cầm ở Trung Quốc và xuất khẩu sang một số nước có
dịch cúm A/H5N1 như Indonesia, Ai Cập, Việt Nam...Cùng với sự xuất hiện các
clade mới, chủng Re-1 (A/goose/Guangdong/1/96) lần lượt được thay thế bởi các
chủng Re-4 (A/chicken/Shanxi/2/2006 clade 7) giai đoạn 2006-2007, Re-5
(A/duck/Anhui/1/2006,

clade

2.3.4)

giai

đoạn

2008-2012,

Re-6

(A/duck/Guangdong/ S1322/2010, clade2.3.2) từ năm 2012 đến nay (Lee, 2014).

Phần lớn vắc xin phòng cúm A/H5N1 cho gia cầm hiện nay là loại vắc xin
bất hoạt sản xuất từ các chủng vắc xin nhược độc được tạo ra bằng kỹ thuật di
truyền ngược. Đây được xem là bước đột phá trong công nghệ sản xuất vắc xin cúm
A/H5N1 cho gia cầm (Tian, 2005). Vắc xin tạo ra bằng kỹ thuật di truyền ngược có
một số ưu điểm là chủng virus tạo ra có độc lực thấp, có khả năng gây đáp ứng miễn


19

dịch bảo hộ cao và có thể dễ dàng thay đổi kháng nguyên của virus để đối phó với
vụ dịch mới. Tuy nhiên có một số nhân tố gây trở ngại cho việc tạo vắc xin bằng kỹ
thuật này đó là: (1) quy trình tạo chủng virus nhược độc phức tạp, tốn kém, đòi hỏi
trang thiết bị kỹ thuật hiện đại; (2) cần nhiều phôi trứng gà cho quá trình sản xuất
vắc xin. Hiện nay, các nhà khoa học đang cố gắng nghiên cứu, đánh giá, thử nghiệm
loại vắc xin khác như vắc xin dưới đơn vị, vắc xin DNA, vắc xin sống nhược độc
đáp ứng nhanh nhất nhu cầu phòng cúm gia cầm một cách triệt để, hiệu quả, dễ sử
dụng, ít tốn kém nhất.
1.2.1.3. Nghiên cứu sản xuất kháng nguyên HA tạo vắc xin phòng cúm
Nhiều nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên HA trong các hệ biểu
hiện khác nhau như: hệ biểu hiện prokaryote (Văn Thị Như Ngọc, 2007; Xie, 2009;
Sączyńska, 2014), hệ biểu hiện nấm men (Saelens, 1999; Athmaram, 2011) hệ biểu
hiện baculovirus/tế bào côn trùng (Treanor, 2001; Lin, 2008; Cornelissen, 2010;
Nwe, 2006), hệ biểu hiện thực vật (Redkiewicz, 2014), biểu hiện HA bằng hạt
tương tự virus (Virus-like particle - VLP) (Bright, 2007; Kang, 2009). Saelens và
cộng sự đã biểu hiện gen ha từ chủng virus cúm A/H3N2 trong nấm men P.
pastoris, protein tổ hợp có khả năng sinh đáp ứng miễn dịch và khả năng bảo vệ
chuột khi công độc với liều 10 x LD50 chủng cúm A/H3N2 (Saelens, 1999). Gen ha
từ chủng virus cúm A/California/04/2009 H1N1 được biểu hiện trong P. pastoris
GS115 dưới dạng tích hợp nhiều bản copy gen ha vào genome nấm men. Số lượng
bản copy gen ngoại lai trong genome P. pastoris GS115 làm tăng đáng kể hiệu quả

biểu hiện gen ha (Athmaram, 2011). Kháng nguyên H5 tái tổ hợp từ chủng virus
cúm A/Hong Kong/156/97/H5N1 và A/Hong Kong/483/97/H5N1 biểu hiện trong
hệ bacculovirus/tế bào côn trùng đảm bảo tính an toàn và tính sinh miễn dịch trên
người

tình

nguyện

(Treanor,

2001).

Tiểu

phần

HA1

của

chủng

A/goose/Guangdong/97 (H5N1) biểu hiện trong hệ bacculovirus/tế bào côn trùng
đạt hiệu suất 68 mg/l. Với liều gây miễn dịch 50 µg HA1 trên chuột lang, hiệu giá
HI và hiệu giá kháng thể trung hòa sau 2 tuần gây miễn dịch lần 2 đạt 1:160 (Nwe,
2006). HA5 dạng monomer, dimer và trimer được biểu hiện thành công trong hệ


20

biểu hiện bacculovirus/tế bào côn trùng với hiệu suất 20 mg/l. Kháng nguyên tái tổ
hợp này có khả năng sinh đáp ứng miễn dịch và bảo hộ trên gà với liều gây miễn
dịch 20 µg HA5 (Lin, 2008). So với các hệ biểu hiện khác như: hệ biểu hiện vi
khuẩn, hệ biểu hiện nấm men, các thao tác đối với baculovirus và tế bào côn trùng
khó khăn hơn, giá thành sản xuất protein HA tái tổ hợp cũng cao hơn nên hệ biểu
hiện này chủ yếu được sử dụng nghiên cứu tạo vắc xin sử dụng cho người.
Sản xuất kháng nguyên HA bằng công nghệ hạt tương tự virus (VLP) là một
hướng nghiên cứu mới đầy triển vọng đang được triển khai nghiên cứu tại nhiều
phòng thí nghiệm, nhằm thay thế các công nghệ sản xuất vắc xin truyền thống.
Nhiều công bố gần đây trên mô hình động vật thực nghiệm cho thấy vắc xin cúm
sản xuất bằng công nghệ VLP cho đáp ứng miễn dịch phòng vệ tốt, an toàn
(Mahmood, 2008; Hu, 2012; Pushko, 2015). Chuột gây miễn dịch với VLP mang
protein HA và M1 chủng A/Udorn 72 (H3N2) có khả năng bảo hộ khi công cường
độc liều 5xLD50 (chủng H3N2 A/Hong Kong/68), hiệu giá kháng thể trung bình ở
nhóm tiêm VLP tương đương với nhóm gây nhiễm bằng virus sống (Galarza, 2005).
VLP cấu trúc từ HA, NA, M1 chủng A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) kích thích tạo
đáp ứng miễn dịch bảo hộ trên dòng chuột BALB/c và ức chế sự nhân lên của virus
khi công cường độc (Pusko, 2015). VLP biểu hiện M1 và HA chủng A/PR/8/34 có
mức độ bảo hộ tương đương nhau, chống lại virus đồng chủng và dị chủng
A/PR/8/34, A/WSN/33. Tuy nhiên, số lượng virus đồng chủng (A/PR/8/34) trong
phổi thấp hơn 100 lần so với dị chủng (Quan, 2009). VLP mang kháng nguyên HA
cúm A/H5N1 đã được nghiên cứu và thử nghiệm. Dòng chuột BALB/c gây miễn
bằng VLP mang gen ha, na từ chủng A/Viet Nam/1203/2004 (clade 1) và
A/Indonesia/05/2005 (clade 2) có khả năng tạo đáp ứng miễn dịch dịch thể, miễn
dịch trung gian qua tế bào và bảo hộ khi thử thách với chủng H5N1 clade 1 và clade
2 (Bright, 2008). Với liều gây miễn dịch 0,3 μg HA VLP (chủng A/Viet
Nam/1203/2004) bằng đường nhỏ mũi, chuột có khả năng bảo hộ khi thử thách với
virus đồng chủng ở liều cao sau 30 tuần gây miễn dịch (Kang, 2009). Mặc dù các
kết quả nghiên cứu thu được rất khả quan, nhưng đến thời điểm này chưa có vắc xin

21

thương mại VLP phòng cúm được công bố. Đây là một hướng nghiên cứu mới đầy
triển vọng, đang được triển khai nghiên cứu và thử nghiệm tại nhiều phòng thí
nghiệm tiên tiến và các công ty dược phẩm hàng đầu trên thế giới (Crevar, 2008;
Shimizu 2013; Nguyễn Thị Hoa, 2015).
1.2.2. Tình hình nghiên cứu vắc xin phòng cúm A/H5N1 trong nước
1.2.2.1. Tình hình dịch cúm A/H5N1 ở Việt Nam
Dịch cúm gia cầm A/H5N1 bùng phát tại Việt Nam vào cuối năm 2003 ở các
tỉnh phía Bắc, sau đó nhanh chóng lan tới hầu hết các tỉnh/thành trong cả nước chỉ
trong một thời gian ngắn. Đây là lần đầu tiên dịch cúm gia cầm A/H5N1 xảy ra tại
Việt Nam và có tới hàng chục triệu gia cầm bị tiêu hủy, gây thiệt hại nặng nề đến
nền kinh tế quốc dân. Có thể phân chia thành các đợt dịch lớn sau
()
Đợt thứ nhất từ tháng 12/2003 đến 30/3/2004, dịch cúm xảy ra ở các tỉnh Hà
Tây, Long An và Tiền Giang. Dịch bệnh lây lan rất nhanh, chỉ trong vòng hai tháng
đã xuất hiện ở 57/64 thành trong cả nước. Tổng số gà và thủy cầm mắc bệnh, chết
và thiêu hủy hơn 43,9 triệu con, chiếm 17% tổng đàn gia cầm. Trong đó, gà chiếm
30,4 triệu con, thuỷ cầm 13,5 triệu con. Ngoài ra, có ít nhất 14,8 triệu chim cút và
các loại khác bị chết hoặc tiêu huỷ. Đặc biệt, có 3 người được xác định nhiễm virus
cúm A/H5N1 và cả 3 đã tử vong trong đợt dịch này.
Đợt dịch thứ 2 từ tháng 4 đến tháng 11/2004: dịch bệnh tái phát tại 17 tỉnh,
thời gian cao điểm nhất là trong tháng 7, sau đó giảm dần đến tháng 11/2004 chỉ
còn một điểm phát dịch. Tổng số gia cầm tiêu hủy được thống kê trong vụ dịch này
là 84.078 con. Trong đó, có gần 56.000 gà; 8.132 vịt; và 19.950 con chim cút. Và đã
có tới 27 người mắc bệnh virus cúm A/H5N1, trong đó có 9 ca tử vong.
Đợt 3 từ tháng 12/2004 cho đến tháng 15/12/2005: dịch cúm gà xảy ra trên
36 tỉnh thành trong cả nước. Số gia cầm bị tiêu hủy được Cục Thú y thống kê là

1,846 triệu con (gồm 470.000 gà, 825.000 thủy cầm và 551.000 chim cút). Vào
những tháng cuối năm 2005, dịch cúm gia cầm xảy ra trong tháng 10/2005 lan


22

nhanh trong gần 40 tỉnh thành và giảm dần trong tháng 12/2005. Mặc dù, chương
trình tiêm chủng rộng rãi được áp dụng trong cả nước suốt thời gian sau đó, nhưng
đến cuối năm 2006 dịch cúm gia cầm A/H5N1 đã tái bùng phát ở Cà Mau, sau đó
lan sang các tỉnh Bạc Liêu, Hậu Giang, Vĩnh Long và Cần Thơ. Trong năm 2007
dịch xảy ra trên 16 tỉnh, thành trong cả nước.
Giai đoạn 2008 - 2012, trung bình mỗi năm có khoảng 118 xã tại 58 huyện
thuộc 25 tỉnh có dịch. Số gia cầm bị chết và tiêu hủy hơn 212 ngàn con, chủ yếu là
vịt chiếm 72,30%, gà chiếm 25,03% và ngan 2,67% (Nguyễn Ngọc Tiến, 2013).
Hiện nay, dịch cúm gia cầm A/H5N1 thường xảy ra nhỏ lẻ ở các địa phương. Kết
quả giám sát lưu hành virus cúm gia cầm A/H5N1 cho thấy, tại các chợ buôn bán
gia cầm sống có tỷ lệ lưu hành virus cúm A/H5N1 khá cao. Nghiên cứu giám sát
chủ động trên 1280 mẫu thu thập từ gia cầm sống tại các chợ buôn bán, giết mổ gia
cầm ở 3 khu vực: miền Bắc (Hà Nội, Quảng Ninh), miền Trung (Nha Trang) và
miền Nam (Long An), trong khoảng thời gian 2012 - 2015 cho thấy tỷ lệ dương tính
với phân type virus cúm A/H5 là 7,1%, trong đó cúm A/H5N1 là 4,4%, cúm
A/H5N6 là 2,6% (Nguyễn Lê Khánh Hằng, 2016).
Trong quá trình tiến hóa, virus cúm A/H5N1 ở Việt Nam xuất hiện các clade
chủ yếu sau: Giai đoạn 2003 - 2005: khi dịch cúm gia cầm H5N1 mới xuất hiện vào
cuối năm 2003, clade 1 lưu hành phổ biến ở các địa phương trong cả nước. Trong
năm 2006, chương trình tiêm chủng vắc xin cho gia cầm (vắc xin Re-1) được triển
khai rộng khắp cả nước nên không xuất hiện các vụ dịch. Giai đoạn 2007 - 2009,
clade 2.3.4 phân dòng Phúc Kiến (Trung Quốc) về sau tiến hóa thành các clade
2.3.4.1, 2.3.4.2, 2.3.4.3 xuất hiện và lưu hành chủ yếu ở các tỉnh phía Bắc, sau năm
2010 không ghi nhận sự xuất hiện của clade 2.3.4 (Nguyễn Nam Thắng, 2012).

Clade 1 và clade 1.1 lưu hành phổ biến ở tỉnh phía Nam và Đồng bằng sông Cửu
Long. Vắc xin Re-1 (chủng vắc xin clade 0), Re-5 (chủng vắc xin clade 2.3.4) nhập
khẩu từ Trung Quốc được sử dụng để tiêm phòng cho gia cầm. Cũng trong giai
đoạn này, lần đầu tiên phát hiện clade 7 ở cửa khẩu Lạng Sơn (Le TH, 2014).


23

Clade 2.3.2 xuất hiện từ năm 2005 đến 2007, sau đó biến mất. Năm 2010
xuất hiện clade mới 2.3.2.1 thay thế cho nhánh virus cũ 2.3.4 (Okamatsu, 2013),
clade này sau đó tiến hóa, phát triển thành clade 2.3.2.1a, 2.3.2.1b. Gia cầm tiêm
phòng vắc xin cúm gia cầm thuộc clade 1 không bảo hộ được với virus cúm
A/H5N1 clade 2.3.2.1 (Nguyễn Ngọc Tiến, 2011). Ở khu vực phía Nam clade 1.1
tiến hóa thành các clade 1.1.1 và 1.1.2. Giai đoạn 2011- 2014, clade 2.3.2.1 tiếp tục
gây bệnh ở các tỉnh miền Bắc, miền Trung và Tây Nguyên, cụ thể: clade 2.3.2.1a
xuất hiện ở hầu khắp các tỉnh miền Bắc, miền Trung, Tây Nguyên và Đông Nam
Bộ. Vắc xin Re-5 vẫn còn bảo hộ đối với clade 2.3.2.1a. Clade 2.3.2.1b xuất hiện ở
một số tỉnh miền Bắc, năm 2013 không ghi nhận sự xuất hiện của clade này. Vắc
xin Re-5 không bảo hộ được với virus cúm A/H5N1 clade 2.3.2.1b. Clade 2.3.2.1c
xuất hiện năm 2012, gây bệnh khắp các tỉnh miền Bắc, Bắc Trung bộ và duyên hải
miền Trung, gây bệnh và làm chết nhiều vịt, ngan. Hiện nay clade 2.3.2.1a, c lưu
hành khắp cả nước vắc xin đang sử dụng có hiệu lực bảo hộ thấp đối với clade
2.3.2.1c. Ở miền Nam chủ yếu lưu hành các clade 1.1.1, 1.1.2, vắc xin Re-1, Re-5
vẫn còn hiệu quả đối với nhánh virus này (Le TH, 2014; Le, 2015; Cuong, 2016;
Nguyễn Lê Khánh Hằng 2016).
1.2.2.2. Nghiên cứu sản xuất vắc xin phòng cúm gia cầm H5N1 ở Việt Nam
Từ năm 2003, khi dịch cúm gia cầm xuất hiện ở Việt Nam, Nhà nước đã có
chủ trương nhập khẩu vắc xin để phòng chống dịch cúm gia cầm. Chi phí cho việc
này lên đến hàng trăm tỷ đồng mỗi năm, có những thời điểm dịch cúm gia cầm diễn
biến rất phức tạp nên việc nhập khẩu vắc xin phòng cúm gia cầm đã gặp không ít

khó khăn. Để chủ động hơn trong việc cung cấp vắc xin phòng cúm A/H5N1 cho
gia cầm, một số đơn vị nghiên cứu trong nước tiến hành các nghiên cứu để hướng
tới việc tự sản xuất vắc xin. Năm 2005, Viện Công nghệ sinh học đã tiếp nhận
chủng vắc xin NIBRG-14 từ Viện Quốc gia về Tiêu chuẩn và Kiểm định sinh học,
Vương Quốc Anh. Đây là chủng virus được tạo bằng công nghệ di truyền ngược, tái
tổ hợp trên cơ sở 6 gen làm nền của chủng gốc A/PR/8/34 với các gen ha (H5) đã bị
đột biến mất hẳn 4 amino acid RRRL và đột biến thay thế 3 amino acid tại vùng gây


24

độc) và na (N1) có nguồn gốc từ chủng virus cúm H5N1 phân lập từ bệnh nhân Việt
Nam (A/Vietnam/1194/2004(H5N1)). Chủng này đã được Tổ chức Y tế thế giới
công nhận về độ an toàn và khuyến cáo là một trong các chủng dùng cho sản xuất
vắc xin trên thế giới (Lê Trần Bình, 2009). Trên cơ sở đề tài: “Đánh giá chất lượng
vắc xin phòng bệnh cúm A/H5N1 cho gia cầm được sản xuất tại Việt Nam bằng
chủng NIBRG-14” do Viện Công nghệ sinh học chủ trì thực hiện, Công ty Thuốc
thú y Trung ương đã thực hiện dự án: “Sản xuất thử nghiệm vắc xin cúm A/H5N1
nhũ dầu để phòng bệnh cho gia cầm”. Vắc xin được sản xuất dùng công nghệ nuôi
cấy virus trên phôi gà 10-11 ngày tuổi, bất hoạt bằng formalin. Đánh giá hiệu lực
vắc xin cúm gia cầm H5N1 (chủng NIBRG-14) cho thấy sau khi gây miễn dịch lần
2 khoảng 3 tuần, hiệu giá HI đạt 6,2-6,7 log2. Vắc xin Navet-Vifluvac dựa trên
chủng NIBRG-14 chỉ bảo vệ gia cầm chống lại clade 1 và clade 2.3.2.1a, mà không
bảo hộ gia cầm khi công cường độc với clade 2.3.2.1b (Trần Xuân Hạnh, 2012).
Nghiên cứu của tác giả Lê Thanh Hòa và cộng sự đã tạo được chủng virus tái tổ hợp
giữa LasoTa và H5N1. Chủng tái tổ hợp có đáp ứng miễn dịch với cúm A/H5N1 và
virus Newcastle ở quy mô phòng thí nghiệm với hiệu giá HI đạt từ 4log2 đến 7log2
(Lê Thanh Hoà, 2011).
Để có thể đáp ứng nhanh nhu cầu về vắc xin cúm gia cầm và phát triển thêm
các loại vắc xin mới tiên tiến hơn, hiệu quả và dễ sử dụng hơn, một số nghiên cứu

biểu hiện gen mã hóa cho kháng nguyên HA trong thực vật đang được tiến hành ở
một số phòng thí nghiệm. Việc nghiên cứu gen ha đã thành công trên cây thuốc lá,
đậu tương và bèo tấm. Tuy nhiên, các kết quả nghiên cứu cho thấy khả năng sinh đáp
ứng miễn dịch trên động vật khi ăn thực vật chuyển gen này còn ở mức thấp. Huyết
thanh gà ăn bèo tấm Lemma bibba và Lemna minor chuyển gen H5 có chứa kháng
thể kháng H5 với hiệu giá HI 2-3log2 (Lê Văn Sơn, 2009; Lê Huy Hàm, 2011).
Cùng với việc nghiên cứu vắc xin phòng cúm A/H5N1 cho gia cầm, các
nghiên cứu sản xuất vắc xin cúm A/H5N1 cho người được triển khai tại Viện Vệ
sinh Dịch tễ Trung ương, Viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế, Viện Pasteur TP Hồ Chí
Minh. Nguyễn Thu Vân và cộng sự đã nghiên cứu thành công quy trình công nghệ


25

sản xuất vắc xin cúm A/H5N1 (FLUVAC) trên tế bào thận khỉ tiên phát ở quy mô
phòng thí nghiệm từ chủng di truyền ngược rgH5N1. Vắc xin đã được tiến hành thử
nghiệm lâm sàng trên người ở giai đoạn 3 (Nguyễn Thị Thu Vân, 2007). Nghiên
cứu sản xuất vắc xin cúm A/H5N1 cho người trên trứng gà có phôi từ chủng
NIBRG-14 cũng được tiến hành tại viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế (Nguyễn Thị
Minh Hiền, 2009; Dương Hữu Thái, 2013; Nguyễn Thị Lan Phương, 2015). Một số
nghiên cứu sản xuất kháng nguyên HA bằng hệ biểu hiện baculovirus và công nghệ
hạt tương tự virus đã được tiến hành ở một số phòng thí nghiệm (Nguyễn Thị Hoa,
2015; Phạm Thanh Hồng, 2015).
1.3. HỆ BIỂU HIỆN VI KHUẨN E. COLI VÀ NẤM MEN P. PASTORIS
1.3.1. Hệ biểu hiện E. coli
E. coli thuộc loại vi khuẩn Gram âm, có khả năng sinh sản nhanh với tốc độ
cao trên những môi trường nuôi cấy đơn giản và điều đặc biệt là chúng có khả
năng thu nhận rất nhiều các yếu tố di truyền vận động từ môi trường ngoài như
plasmid, phage,…. Các yếu tố này có thể tồn tại và tái bản nhiều lần trong tế
bào E. coli. Vì vậy, E. coli đã được cải biến để sử dụng như một vật chủ hữu

hiệu trong kỹ thuật tách dòng cũng như trong việc biểu hiện gen. Nhiều nghiên
cứu cho thấy, hiệu suất tổng hợp đạt được là rất cao đối với nhiều loại protein ngoại
lai trong tế bào E. coli bằng các plasmid được thiết kế phù hợp. Các plasmid được
chọn thường chứa promoter mạnh, được điều khiển chặt chẽ trong quá trình tổng
hợp protein ngoại lai. Ngoài ra, plasmid phải có số lượng bản sao lớn và tồn tại ổn
định trong tế bào chủ (Gopal, 2013).
Bên cạnh những đặc điểm có lợi cho quá trình biểu hiện gen ngoại lai, hệ
biểu hiện E. coli còn tồn tại một số khó khăn sau: (1) một số protein quan tâm được
tạo ra không chứa metionin hoặc formyl metionin ở tận cùng đầu N làm mất một số
tính chất quan trọng của phân tử protein; (2) một số protein có nguồn gốc từ
eukaryot không được biểu hiện tốt trong E. coli là do các phân tử protein này sau
khi được tạo ra sẽ tiếp tục được glycosyl hóa, phosphoryl hóa, ... mà tế bào E. coli