Nghiên cứu ứng dụng công nghệ gen sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp của virus dengue các type sử dụng trong chẩn đoán sốt dengue sốt xuất huyết dengue

Bộ Khoa học và Công nghệ
Viện công nghệ sinh học

Báo cáo tổng kết khoa học và kỹ thuật Đề tài:

Đề tài KC.04-18

Nghiên cứu ứng dụng công nghệ gen
sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp của virus
Dengue các type sử dụng trong chẩn đoán
sốt Dengue/sốt xuất huyết Dengue

PGS.TS. Đinh Duy Kháng

6050
12/9/2006
Hà Nội, 3- 2006
Bản quyền 2006 thuộc Viện CNSH, Viện KH&CN Việt Nam


Lời cảm ơn
Tập thể cán khoa học thuộc đề tài
KC.04.18 xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành
và sâu sắc tới Bộ Khoa học Công nghệ, Ban
Chủ nhiệm Chơng trình KC.04, Bộ Tài
chính, Ban Lãnh Đạo Viện Công nghệ Sinh
học và Viện Vệ Sinh Dịch tễ Trung ơng đã
chỉ đạo sát sao và tạo mọi điều kiện thuận lợi
để đề tài hoàn thành nhiệm vụ.
Thay mặt tập thể Cán bộ Khoa học
thực hiện Đè tài KC.04-18.

PGS.TS. Đinh Duy Kháng

1


Mục lục
Tr.
A. thông tin về đề tài
A.1. Danh sách cán bộ thực hiện đề tài

I

A.2. trích lợc thuyết minh đề tài

II

B. Báo cáo chính
b.1. Danh mục các từ viết tắt

III

b.2. Cáo cáo toàn văn
Mở đầu

1

Chơng 1: Tổng quan tài liệu

3

1.1. Bệnh sốt Dengue và sốt xuất huyết Dengue

3

1.1.1. Biểu hiện lâm sàng

3

1.1.2. Tác nhân truyền bệnh

4

1.1.3. Tình hình dịch bệnh trên thế giới

5

1.1.4. Tình hình dịch bệnh ở Việt Nam

7

1.2. ViruS Dengue

8

1.2.1. Đặc điểm hình thái và cấu trúc

8

1.2.2. Hệ gen (Genome) của virus dengue

9

1.2.3. Chu trình nhân lên và cơ chế gây bệnh của virus Dengue

12

1.2.4. Đặc điểm kháng nguyên

13

1.2.5. Các kháng nguyên dùng trong chẩn đoán

15

1.3. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

17

1.3.1. Chẩn đoán huyết thanh học

17

1.3.2. Phân lập virus

19

1.3.3. Xác định typ huyết thanh của virus dengue

20

1.4. Dự phòng và kiểm soát bệnh

20

2


1.4.1. Phát triển vắc xin phòng sốt dengue/sốt xuất huyết dengue
Chơng 2: Đối tợng và phơng pháp nghiên cứu
2.1. Đối tợng và vật liệu

21
23
23

2.2.1. Đối tợng

23

2.2.2. Các sinh phẩm

23

2.2.2.1. Hệ tách dòng pCR2.1

24

2.2.2.2. Vector biểu hiện pET-TRX-FuS

25

2.2.2.3. Hệ biểu hiện Pichia pastoris

26

2.2.3. Hoá chất

28

2.2.4. Dung dịch và môi trờng

28

2.1. Máy móc thiết bị

40

2.3. Phơng pháp

41

2.3.1. Phơng pháp sản xuất kháng nguyên virus Dengue trên tế

41

bào muỗi Aedes albopictus dòng C6/ 36
2.3.2. Kỹ thuật huỳnh quang trực tiếp kiểm tra các tế bào nhiễm

43

virus Dengue
2.3.3. Phơng pháp tách chiết RNA tổng số

44

2.3.4. Phơng pháp khuếch đại gen mã hoá tiền kháng nguyên

44

màng (pre-M) và kháng nguyên vỏ (E) của cả 4 typ virus dngue
bằng phản ứng RT-PCR
2.3.5. Phơng pháp tạo dòng các đoạn gen đã khuếch đại

48

2.3.6. Phơng pháp biến nạp plasmid vào tế bào E. coli khả biến

48

bằng sốc nhiệt
2.3.7. Biến nạp vào tế bào P. pastoris bằng xung điện

49

2.3.8. Phơng pháp tách chiết plasmid từ E. coli

51

2.3.9. Phơng pháp tách chiết DNA genome từ tế bào P. pastoris

51

2.3.10. Phơng pháp cắt DNA bằng enzyme giới hạn

52

2.3.11. Phơng pháp điện di DNA trên gel agarose

53
3


2.3.12. Phơng pháp xác định trình tự axit nucleic

54

2.3.13. Phơng pháp chiết DNA từ gel agarose

55

2.3.14. Phơng pháp điện di protein trên gel polyacrylamide

56

2.3.15. Phơng pháp biểu hiện protein tái tổ hợp trong E. coli

57

chủng BL21

2.3.16. Phơng pháp biểu hiện protein tái tổ hợp trong Pichia

57

pastoris
2.3.17 . Tinh chế protein dung hợp bằng cột Probond Nikel

58

Resin
2.3.18. Sản xuất thioredoxin tái tổ hợp và kháng thể kháng

60

thioredoxin tái tổ hợp gắn peroxidase (HRP)
2.3.19. Phơng pháp Western blot

64

2.3.20. Phơng pháp Dot blot

64

2.3.21. Phơng pháp Elisa tóm bắt IgM (MAG-ELISA) hoặc tóm

65

bắt IgG (GAG-ELISA)
Chơng 3: Kết quả nghiên cứu và thảo luận
3.1. Nhân virus Dengue typ I (DEN-1), virus Dengue

67
67

typ II (DEN-2), virus Dengue typ III (DEN-3) và virus
Dengue typ IV (DEN-4) trong tế bào muỗi Aedes
albopictus dòng C6/36
3.1.1. Tuyển chọn các type virus Dengue phân lập từ năm 2001

67

đến năm 2005 tại miến Bắc, miền Trung và Tây Nguyên
3.2. Tách dòng và xác định trình tự đoạn gene Prem-

74

m và e của 4 type virus dengue
3.2.1. Tách RNA tổng số của tế bào muỗi C6/36
3.2.1.1. Kiểm tra RNA tách chiết bằng phơng pháp quang phổ

74
74

kế

4


3.1.1.2. Kiểm tra RNA tách chiết bằng phơng pháp điện di trên

74

gel agarose
3.2.2. Khuếch đại đoạn gene PreM và E bằng phơng pháp RT-

75

PCR
3.2.3. Gắn sản phẩm RT-PCR vào vector tách dòng pCR2.1

79

3.2.4. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E. coli

80

chủng INVF
3.2.5. Kết quả tách chiết và kiểm tra các plasmid tái tổ hợp từ E.

80

coli
3.2.6. Kết quả xác định trình tự
3.3. biểu hiện trong e. coli, tinh sạch, kiểm tra tính

82
91

đặc hiệu kháng nguyên domain 3 thuộc protein vỏ
của virus dengue các type

3.3.1. Thiết kế vector biểu hiện pET TRX FuS E3

91

3.3.1.1. Khuếch đại đoạn gen E3 bằng cặp mồi biểu hiện

92

3.3.1.2. Thiết kế plasmid tái tổ hợp pET-TRX-FuS-DxE3

93

3.3.2. Biểu hiện DxE3 trong E. coli

95

3.3.3. Tinh sạch kháng nguyên tái tổ hợp
3.3.4. Kiểm tra phản ứng của kháng nguyên tái tổ hợp với kháng thể
kháng kháng nguyên tự nhiên của virus Dengue bằng Western Blot
3.4. biểu hiện kháng nguyên màng và vỏ của virut

99

Dengue type 1, 2, 3, 4 trong hệ nấm men Pichia
pastoris
3.4.1. Thiết kế vector biểu hiện vùng gen preM E

99

3.4.1.1. Ghép nối hai nửa Dx3 và Dx5 thành đoạn Dx hoàn 103

chỉnh.
3.4.1.2. Khuếch đại đoạn Dx bằng cặp mồi biểu hiện

107

3.4.1.3. Gắn đoạn Dx vào vector pPICvà chọn dòng pPICDx

109
5


3.4.2. Biểu hiện gen mã hoá kháng nguyên preM-E (gen preM-env) 112
trong Pichia pastoris
3.4.3. Kiểm tra phản ứng của kháng nguyên DxME tái tổ hợp với 114
kháng thể kháng virus Dengue tự nhiên bằng Western Blot
3.5. Sử dụng protein tái tổ hợp để chế tạo kit 116
chẩn đoán SD/SXHD bằng kỹ thuật Dot blot và
Elisa
3.5.1. Thiết kế vector biểu hiện và tinh sạch Thioredoxin

117

3.5.2 Sản xuất bộ Kit chẩn đoán SD/SXHD bằng MAG-ELISA và 120
GAG-ELISA
3.5.3. Thử nghiệm chẩn đoán bằng kỹ thuật Dot Blot

122

3.5.4. Sản xuất thử nghiệm các bộ KIT phát hiện kháng thể kháng 123
virus dengue bằng dot blot

3.6. kết quả đào tạo

125

3.7. các công trình công bố

127

3.8. tóm lợc kết quả của đề tài theo hợp đồng và

129

thuyết minh đề tài
Kết luận và đề nghị

132

Tài liệu tham khảo

134

6


Danh sách cán bộ thực hiện đề tài kc.04-18*
Nghiên cứu ứng dụng công nghệ gen sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp
của virus Dengue các type sử dụng trong chẩn đoán
sốt Dengue/sốt xuất huyết Dengue
TT
1

2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28

Họ và tên
PGS. TS Đinh Duy Kháng

PGS. TS Trơng Nam Hải
TS. Phạm Thúy Hồng
TS. Lê Quang Huấn
CN Nguyễn Tiến Minh
CN Bạch Thị Nh Quỳnh
CN Nguyễn Thị Ngọc Diệp
CN Trịnh Quý Bôn
CN Dơng Hồng Quân
CN Phạm Minh Tuấn
CN Dơng Văn Cờng
CN Nguyễn Thị Sinh
ThS Bùi Hoàng Anh
ThS. Phùng Thu Nguyệt
CN Lê Thị Thu Hồng
CN Trần Thị Hờng
CN Nguyễn Hồng Thanh
CN Bùi Thanh Xuân
CN Trần Thị Thanh Huyền
GS. TS Trơng Uyên Ninh
TS. Lê Thị Quỳnh Mai
TS. Nguyễn Thị Hồng Hạnh
TS. Đỗ Thị Thoa
ThS Trơng Thừa Thắng
CN Nguyễn Thị Thu Thủy
TS. Nguyễn Xuân Quang
TS. Vũ Thị Tờng Vân
BS. Nguyễn Thị Hạnh

Cơ quan công tác
Viện Công nghệ Sinh học

Viện Công nghệ Sinh học
Viện Công nghệ Sinh học
Viện Công nghệ Sinh học
Viện Công nghệ Sinh học
Viện Công nghệ Sinh học
Viện Công nghệ Sinh học
Viện Công nghệ Sinh học
Viện Công nghệ Sinh học
Viện Công nghệ Sinh học
Viện Công nghệ Sinh học
Viện Công nghệ Sinh học
Viện Công nghệ Sinh học
Viện Công nghệ Sinh học
Viện Công nghệ Sinh học
Viện Công nghệ Sinh học
Viện Công nghệ Sinh học
Viện Công nghệ Sinh học
Viện Công nghệ Sinh học
Viện Vệ Sinh Dịch Tễ Trung ơng
Viện Vệ Sinh Dịch Tễ Trung ơng
Viện Vệ Sinh Dịch Tễ Trung ơng
Viện Vệ Sinh Dịch Tễ Trung ơng
Viện Vệ Sinh Dịch Tễ Trung ơng
Viện Vệ Sinh Dịch Tễ Trung ơng
Bệnh Viện Bạch Mai
Bệnh Viện Bạch Mai
Bệnh Viện Bạch Mai

* Chú thích: Một số tác giả đăng ký tham gia đề tài trong thuyết minh ban đầu
nhng vì điều kiện cụ thể và vì lý do cá nhân nên đã không tham gia đợc.

Ngợc lại, do yêu cầu của đề tài, một số cán bộ không có tên trong thuyết minh
nhng đã đợc mời tham gia đề tài.
7


trích lợc Thuyết minh đề tài
(Mục 1-9, 12, 14-17, 23)

I. Thông tin chung về đề tài
Tên đề tài
2. M số
Nghiên cứu ứng dụng công nghệ gen sản xuất
kháng nguyên tái tổ hợp của virut Dengue các typ sử KC.04.18
dụng trong chẩn đoán sốt Dengue và sốt xuất huyết
Dengue.
3. Thời gian thực hiện: 30 tháng.
(Từ tháng 09/2002 đến tháng 03/2005. )

5.

4. Cấp quản lý
Nhà nớc

Kinh phí
Tổng số: 2800 triệu đồng
Trong đó: - Từ Ngân sách SNKH: 2500 triệu đồng
- Tự có: 300 triệu đồng do viện CNSH hỗ trợ cha kể vốn đối ứng của
Viện bao gồm các thiết bị máy móc hiện đại khoảng 70 tỷ đồng.

6.

7

Thuộc Chơng trình: KH&CN trọng điểm cấp Nhà nớc giai đoạn 2001-2005
"Nghiên cứu khoa học và phát triển công nghệ sinh học", Mã số KC.04.
Chủ nhiệm đề tài

Họ và tên: Đinh Duy Kháng
Học hàm/học vị: TS
Chức vụ: Trởng phòng Vi sinh vật học phân tử, Viện Công nghệ sinh học
Điện thoại: CQ: 04 7563386
NR: 04 9870812
Fax: 04 8363144
Mobile: 0913087536
E-mail: ,
Địa chỉ cơ quan: 18, Đờng Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội
Địa chỉ nhà riêng: Số 106, Tổ 9, Phờng Thanh lơng, Quận Hai Bà Trng, Hà Nội

8

Cơ quan chủ trì đề tài

Tên tổ chức KH&CN: Viện Công nghệ Sinh học, Trung Tâm KHTN&CN Quốc gia
Điện thoại: 04 8362599
Fax: 04 8363144
E-mail:
Địa chỉ: 18, Đờng Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội

8

Nội dung KH&CN của đề tài
9

Mục tiêu của đề tài
1. Mục tiêu chung
Xây dựng đợc qui trình công nghệ sản xuất kháng nguyên virut Dengue tái tổ
hợp các typ I, II, III, IV.
Đánh giá độ nhậy, độ đặc hiệu và tính ổn định về chất lợng của các kháng
nguyên đã tạo ra.
2. Mục tiêu cụ thể
2.1. Tạo đợc chủng E. coli và nấm men P. pastoris tái tổ hợp dùng
trong sản xuất kháng nguyên virut Dengue các typ I, II, III, IV.
2.2. Sử dụng chủng tái tổ hợp để sản xuất đợc kháng nguyên virut
Dengue các typ I, II, III, IV đảm bảo tính đặc hiệu và ổn định về chất
lợng sử dụng trong chẩn đoán sốt Dengue/sốt xuất huyết Dengue.
2.3. Thử khả năng tạo đáp ứng miễn dịch phòng vệ của các kháng
nguyên tái tổ hợp để làm đề cho việc tạo ra vắc xin Dengue thử
nghiệm.
2.4. Đào tạo đội ngũ cán bộ chuyên sâu trong lĩnh vực công nghệ gen
vi sinh để có thể chủ động về khâu giống trong trong công nghệ sản
xuất các chế phẩm tái tổ hợp từ vi sinh vật.

12 Nội dung nghiên cứu (liệt kê và mô tả những nội dung cần nghiên cứu, nêu bật đợc
những nội dung mới và phù hợp để giải quyết vấn đề đặt ra, kể cả những dự kiến
hoạt động phối hợp để chuyển giao kết quả nghiên cứu đến ngời sử dụng)
Nghiên cứu qui trình công nghệ để tạo ra kháng nguyên tái tổ hợp dùng trong chẩn
đoán sốt Dengue/sốt xuất huyết Dengue bao gồm các khâu sau:

1.1. Tách dòng và xác định trình tự gen mã hóa kháng nguyên vỏ (kháng
nguyên E) của cả 4 type virut Dengue.

1.2. Thiết kế vector biểu hiện các gen đã tách dòng.
1.3. Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E. coli và P. pastoris.
1.4. Chọn lọc các dòng E. coli và P. pastoris tái tổ hợp mang gen mã hóa kháng nguyên
vỏ của virut dengue.
1.5. Nghiên cứu biểu hiện, thu nhận protein tái tổ hợp.

1.6. Nghiên cứu tối u hóa điều kiện biểu hiện của các chủng tái tổ hợp để
thu nhận lợng kháng nguyên tối đa.
1.7. Thiết lập một qui trình tách chiết, tinh chế thích hợp, có hiệu suất cao để thu nhận
protein tái tổ hợp đủ độ sạch ứng dụng trong việc chế tạo bộ sinh phẩm chẩn đoán sốt
Dengue/sốt xuất huyết Dengue.
1.8. ứng dụng các kỹ thuật miễn dịch để đánh giá tính đặc hiệu, độ nhạy của kháng
9


nguyên tái tổ hợp đã đợc tạo ra.
1.9. Xây dựng đợc qui trình công nghệ cho sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp của virut
Dengue các typ có đủ độ đặc hiệu, độ nhạy để chẩn đoán sốt Dengue và sốt xuất huyết
Dengue.
Qui trình tạo chủng vi sinh vật tái tổ hợp, ứng dụng trong sản xuất kháng nguyên tái
tổ hợp chẩn đoán sốt Dengue/sốt xuất huyết Dengue là hoàn toàn mới ở Việt Nam. Việc
nghiên cứu áp dụng qui trình công nghệ hiện đại thuộc lĩnh vực Công nghệ gen sẽ nâng
cao trình độ cán bộ, đào tạo đại học và sau đại học với kiến thức của công nghệ cao góp
phần nâng cao tiềm lực Khoa học Công nghệ thuộc lĩnh vực công nghệ sinh học, thực hiện
chủ trơng của Đảng và Nhà nớc là công nghiệp hóa, hiện đại hóa phải dựa vào nội lực là
chính.

14 Tiến độ thực hiện
TT

1

1

2

2

3

4

Các nội dung, công việc
thực hiện chủ yếu
(Các mốc đánh giá chủ yếu)
2
- Thiết kế các cặp mồi và xây
dựng kế hoạch tách dòng gen
mã hóa kháng nguyên vỏ của
virut Dengue các typ I, II, III,
IV.
- Nuôi cấy virut Dengue trên tế
bào muỗi C6/36 và nhân virut
Dengue trong não chuột ổ.

- Tách dòng và xác định trình
tự gen mã hóa kháng nguyên vỏ
(kháng nguyên E) của virut
Dengue các typ I, II, III, IV.

- Thiết kế vector biểu hiện
mang gen mã hóa kháng
nguyên E của virut Dengue các
typ I, II, III, IV để biểu hiện
trong E. coli và nấm men P.
pastoris.

- Biến nạp vector đã thiết kế
vào tế bào E. coli và nấm men

Sản phẩm
phải đạt
3
Các cặp mồi và qui
trình tách dòng gen
mã hóa kháng
nguyên vỏ của virut
Dengue.
Các chủng virut
Dengue thuộc typ
I, II, III, IV nhân
lên trong tế bào
muỗi và não chuột
ở
Gen mã hóa kháng
nguyên E của cả 4
type Dengue giải
trình tự và đăng kỹ
trong Ngân Hàng
Dữ liệu gen Quốc tế

Các vector tái tổ
hợp hoàn chỉnh
mang gen mã hóa
kháng nguyên E
của cả 4 typ virut
Dengue để biểu
hiện trong E. coli
và nấm men P.
pastoris.
- Chủng E. coli và
P. pastoris tái tổ

Thời
gian
(BĐ-KT)
4
09/2002

09/200210/2002

10/200203/2003

04/200306/2004

01/200408/2004

Ngời, cơ quan
thực hiện
5
Viện CNSH

Đinh Duy
Kháng, Nông
Văn Hải
Viện VSDT,
Nguyễn Hồng
Hạnh, Trơng
Uyên Ninh, Lê
Thị Quỳnh Mai,
Đỗ Thị Thoa
Viện CNSH,
Viện VSDT,
Lê Thị Quỳnh
Mai, Đinh Duy
Kháng, Lê
Quang Huấn
Viện CNSH,
Trơng Nam
Hải, Phan Văn
Chi, Lê Quang
Huấn, Lê
Thanh Hòa

Viện Công nghệ
Sinh học

10


5

P. pastoris. Sàng lọc các chủng
tái tổ hợp có khả năng tổng hợp
kháng nguyên E của virut
Dengue các typ I, II, III, IV.

hợp tạo ra kháng
nguyên E của virut
Dengue các typ.

- Nghiên cứu qui trình công
nghệ biểu hiện, tách chiết, tinh
chế kháng nguyên Dengue tái tổ
hợp các typ (mỗi loại 1000 ml).

- Kháng nguyên tái
tổ hợp của virut
Dengue các typ I,
II, III, IV có độ
nhạy, độ tinh khiết
và độ đặc hiệu cao.
- Kết luận về độ
sạch và độ đặc hiệu
của kháng nguyên

6

- Đánh giá kháng nguyên tái tổ
hợp và kháng thể chống kháng
nguyên tái tổ hợp bằng các kỹ
thuật miễn dịch.

6

- ứng dụng các protein tái tổ
hợp để tạo bộ sinh phẩm chẩn
đoán sốt Dengue/sốt xuất huyết
Dengue bằng MAC-ELISA và
GAC-ELISA và thử nghiệm
phát hiện kháng thể trong huyết
thanh bệnh nhân

Bộ sinh phẩm chẩn
đoán sốt
Dengue/sốt xuất
huyết Dengue bằng
MAC-ELISA và
GAC-ELISA

03/200410/2004

06/200411/2004

09/200403/2005

Đinh Duy
Kháng, Trơng
Nam Hải, Phan
Văn Chi, Lê
Quang Huấn
Viện Công nghệ

Sinh học, Phan
Văn Chi, Nông
Văn Hải, Lê
Thanh Hòa, Lê
Quang Huấn
Viện VSDT,
Nguyễn Hồng
Hạnh,
Trơng Uyên
Ninh, Đỗ thị
Thoa, Lê Thị
Quỳnh Mai
Viện VSDT,
Bệnh Viện Bạch
Mai
Nguyễn Hồng
Hạnh,
Trơng Uyên
Ninh, Đỗ thị
Thoa, Lê Thị
Quỳnh Mai,
Nguyễn Xuân
Quang

III. Kết quả của đề tài
15

Dạng kết quả dự kiến của đề tài
I

II

III

Mẫu (model, maket)

Quy trình công nghệ

Sơ đồ

Sản phẩm

Phơng pháp

Bảng số liệu

Vật liệu

Tiêu chuẩn

Báo cáo phân tích

Thiết bị, máy móc

Quy phạm

Tài liệu dự báo
Đề án, qui hoạch triển
khai
Luận chứng kinh tế-kỹ

thuật, nghiên cứu khả
thi

Dây chuyền công nghệ
Giống cây trồng
Giống gia súc

Chơng trình máy tính
11


Khác (các bài báo, đào
tạo NCS, SV,...)

16 Yêu cầu khoa học đối với sản phẩm tạo ra (dạng kết quả III)
T
T
1
1

Tên sản phẩm
2
Báo cáo phân tích
Các báo cáo và Hội thảo khoa học

2

Các bài báo

3

Đào tạo:
01 tiến sỹ
01 Thạc sỹ
08 cử nhân

4

Qui trình tạo chủng E. coli dùng
trong sản xuất kháng nguyên tái tổ
hợp chẩn đoán SD/SXHD đạt tiêu
chuẩn nh đã công bố (Srivastava
AK và cs,1995).
Qui trình tạo chủng nấm men P.
pastoris dùng trong sản xuất kháng
nguyên tái tổ hợp chẩn đoán
SD/SXHD đạt tiêu chuẩn nh đã
công bố (Sugrue RJ và cs, 1997).
Qui trình tách chiết và tinh chế
kháng nguyên Dengue tái tổ hợp từ
chủng E. coli cho cả 4 typ Dengue.
Qui trình tách chiết và tinh chế
kháng nguyên Dengue tái tổ hợp từ
nấm men P. pastoris cho cả 4 typ
Dengue.
Báo cáo tổng kết đề tài chung

5

6

7

8

17

T
T

Yêu cầu khoa học

Chú thích

3
Phân tích đánh giá chất lợng
các protein tái tổ hợp làm
nguyên liệu cho sản xuất bộ
sinh phẩm chẩn đoán sốt
Dengue/sốt xuất huyết Dengue.
Trong nớc: 9
Ngoài nớc: 2
Đảm bảo có trình độ chuyên
môn trong lĩnh vực công nghệ
gen, công nghệ protein. Nắm
vững các kỹ thuật về SHPT, hóa
sinh, miễn dịch để có thể ứng
dụng các kỹ thuật thuộc lĩnh
vực công nghệ sinh học vào
phục vụ sản xuất.

Qui trình tạo chủng E. coli đạt
10 mg/lit huyền dịch

4

Qui trình tạo chủng P. pastoris
đạt 20 mg/lit huyền dịch

Qui trình tách chiết và tinh chế
kháng nguyên đủ độ sạch và độ
đặc hiệu cao.
Qui trình tách chiết và tinh chế
kháng nguyên đủ độ sạch và độ
đặc hiệu cao.
Đợc HĐKH các cấp chấp nhận

Yêu cầu kỹ thuật, chỉ tiêu chất lợng đối với sản phẩm tạo ra (dạng kết quả I, II)

Tên sản phẩm
và chỉ tiêu chất lợng chủ yếu

Đơn
vị
đo

Mức chất lợng

Dự kiến
Số lợng
sản

phẩm

12


Cần

Mẫu tơng tự

tạo ra

đạt
Trong
nớc

1

2

Kháng nguyên tái tổ hợp của cả 4 typ
virut Dengue dùng trong chẩn đoán
SD/SXHD với hàm lợng protein tái tổ
hợp khoảng 100 àg/ml kháng nguyên.

3

4

5

Độ tinh
khiết,
độ đặc
hiệu

Chất
lợng
nh
của
CDC

Cha
có

Thế giới

6

Đã có

7

1000 ml
cho mỗi
typ
virut
Dengue
đủ để
tạo ra
100 bộ

Kit thử
nghiệm

V. Kinh phí thực hiện đề tài và nguồn kinh phí
(giải trình chi tiết xin xem phụ lục kèm theo)
Đơn vị tính: Triệu đồng

23 Kinh phí thực hiện đề tài phân theo các khoản chi
TT

Nguồn kinh phí

1

2
Tổng kinh phí

Tổng số

Trong đó
Thuê
khoán
chuyên
môn

Nguyên,vậ
t liệu, năng
lợng

Thiết bị,

máy móc

Xây dựng,
sửa chữa
nhỏ

Chi khác

3

4

5

6

7

8

2800

816

1642

208

50

84

2500

816

1550

0

50

84

300

0
0

92
0

208
0

0
0

0
0

Trong đó:

Ngân sách SNKH
Các nguồn vốn khác
- Tự có
- Khác (vốn huy
động, ...)

13


Nh÷ng tõ viÕt t¾t

Aa

Axit amin

Amp

Ampicillin

APS

Amonium persulphate

ADN

Axit deoxyribonucleic

ARN

Axit ribonucleic

Bp

CÆp base

BSA

Bovine Serum Albumin

CBB

Comassie Brillant Blue

D1, D2, D3, D4

Virus Dengue c¸c type 1, 2, 3, 4

Dx

Ký hiÖu dïng chung cho c¶ 4 type virus
Dengue

dNTP

deoxynucleotide

E

Envelope Protein

E.coli

Escherichia coli

EDTA

Acid

Env

Gen m· ho¸ kh¸ng nguyªn vá (envelope)

EtBr

Ethidium Bromite

GAG-ELISA

IgG Antibody Capture-Enzyme Linked
Immunosorbent Assay

HRp

Horse Raddish Peroxidase

Iptg

Isopropylthio-β-D-Galactosite

Kb

Kilo base

Kda, Da

Kilo Dalton, Dalton

Lb

M«i tr−êng Lauria Betani

MAC-ELISA

IgM Antibody Capture-Enzyme Linked
Immunosorbent Assay

14


PBS

Phosphate Buffered Saline

PCR

Polymerase Chain Reaction

PreM

Pre-membrane Protein

preM

Gen m· ho¸ Pre-membrane Protein

PRNT

Plaque Reduction Neutralization Test
(ph¶n øng trung hßa gi¶m m¶ng ho¹t tö)

PVDF

Polyvinyl-idene-difluoride

Sds

Sodium dodecyl sulphat

RT-PCR

Reverse Transcriptase Polymerase Chain
Reaction

Sds-page

Sodium dodecyl sulphat-Polyacrylamid
gel electrophoresis

SD/SXHD

Sèt dengue/sèt xuÊt huyÕt dengue

Tbs

Tris Buffered Saline

Temed

Tetramethylenediamine

Ttbs

Tween- Tris Buffered Saline

x-gal

5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D
galactopyranosite

15


Mở đầu
Sốt Dengue, Sốt xuất huyết Dengue và Hội chứng sốc Dengue là những
bệnh do virus Dengue gây nên đã đợc biết đến từ giữa thế kỷ 18 và hiện nay
đang là một vấn đề toàn cầu. Các trận dịch Dengue xuất hiện thờng xuyên trên
toàn thế giới mà phổ biến là ở những vùng nhiệt đới. Theo ớc tính đã có khoảng

hai tỷ ngời nằm trong vùng có dịch bệnh và khoảng hai mơi triệu ngời bị
nhiễm mỗi năm. Ngời chết vì bệnh chủ yếu là trẻ em trong độ tuổi 5 - 15. Hiện
nay cha có một loại vắc xin thơng phẩm nào để điều trị bệnh này.
Việt Nam nằm trong vùng lu hành mạnh mẽ của virus Dengue. Những
vụ dịch nghiêm trọng đầu tiên xảy ra ở cả hai miền Nam - Bắc vào những năm
1958 - 1960 và gần đây vẫn tiếp tục xuất hiện.
Kết quả giám sát dịch tễ học trong 10 năm qua cho thấy sốt xuất huyết
Dengue là một trong 10 bệnh truyền nhiễm có tỷ lệ mắc và tử vong cao ở Việt
Nam. Theo thống kê của Tổ chức Y Tế Thế Giới từ năm 1963 đến 1988 số ngời
mắc bệnh sốt xuất huyết Dengue và chết ở Việt Nam là lớn nhất so với các nớc
trong khu vực Đông Nam á và Tây Thái Bình Dơng.
Virus dengue thuộc họ Flaviridae, giống Flavivirus bao gồm 4 type huyết
thanh là dengue type 1, type 2, type 3 và type 4. Các virus thuộc nhóm này gây
bệnh ở động vật, ngời và truyền bệnh thông qua côn trùng chân khớp nên còn
gọi là Arbovirus. Hai loài muỗi A. aegypti và A. albopictus là vectơ truyền bệnh
SD/ SXHD chủ yếu [6, 11]. Genome virus là một sợi RNA đơn dơng, chứa một
khung đọc mở duy nhất mã hoá cho 3 protein cấu trúc và 7 protein không cấu
trúc [60].
Sốt Dengue/ Sốt xuất huyết Dengue thờng có những biểu hiện lâm sàng
giống các bệnh gây sốt và sốt xuất huyết thông thờng nên dễ dẫn đến những
chẩn đoán và điều trị sai lệch. Vì vậy việc nghiên cứu tìm ra phơng pháp phát
hiện nhanh, chính xác virus Dengue là hết sức cần thiết để giúp bác sĩ có phác đồ
điều trị thích hợp đối với bệnh nhân và đồng thời giúp các nhà dịch tễ học có
biện pháp khoanh vùng, hạn chế sự lây lan của dịch bệnh.
16


Việc xây dựng bộ KIT chẩn đoán nhanh virus Dengue và sản xuất vaccine
phòng bệnh là hết sức cần thiết. Trong đề tài này, chúng tôi đã tiến hành những
nghiên cứu cơ bản với những nội dung chính sau đây:

- Tách dòng và xác định trình tự các đoạn gene mã hóa cho các kháng
nguyên quan trọng nhất là kháng nguyên màng (PreM) và kháng
nguyên vỏ (E) của bốn type dengue.
- Thiết kế các vector biểu hiện vùng kháng nguyên màng và vỏ của bốn
type dengue.
- Biểu hiện và tinh sạch các protein tái tổ hợp.
- Đánh giá khả năng phản ứng đặc hiệu của các kháng nguyên tái tổ hợp
với kháng thể kháng virus dengue tự nhiên bằng các kỹ thuật ELISA,
Western blot và Dot blot.
- Sử dụng các kháng nguyên tái tổ hợp để tạo ra các Kit chẩn đoán sốt
dengue/sốt xuất huyết dengue.

17


Chơng I.
tổng quan tài liệu
1.1. Bệnh sốt Dengue và sốt xuất huyết Dengue
1.1.1. Biểu hiện lâm sàng
Sốt dengue/sốt xuất huyết dengue (SD/SXHD) đợc chia thành nhiều cấp độ
khác nhau tuỳ theo mức độ nặng của bệnh mà bệnh nhân có những biểu hiện
nh: sốt từ 38 đến 400C, kéo dài 2-7 ngày kèm theo các triệu chứng đau đầu, đau
cơ, buồn nôn, phát ban, có thể kèm theo rét tuy không thành cơn, choáng váng,
chóng mặt, xuất huyết dới da, xuất huyết niêm mạc, xuất huyết phủ tạng. ở thể
nặng bệnh nhân có thể bị sốc hay còn gọi là hội chứng sốc Dengue (HCSD,
DSS). HCSD xảy ra với trẻ em nhiều hơn ở ngời lớn, phổ biến nhất vào ngày sốt
thứ 4 đến thứ 6, ở bệnh nhân nặng có dấu hiệu suy tuần hoàn, đau bụng, bồn
chồn, vật vã, nếu không đợc can thiệp sớm bệnh nhân có thể bị tử vong sau từ
12 đến 24 giờ [10, 11].
Các triệu chứng của bệnh thờng rất đa dạng nhng lại không có tính chất

đặc trng. Do đó, không thể phân biệt đợc sự khác biệt về lâm sàng giữa các
bệnh nhân nhiễm các type virus dengue khác nhau. Mặt khác, các triệu chứng
này cũng tơng tự nh các triệu chứng gặp phải khi bị nhiễm các loại virus gây
bệnh khác nh cúm, sởi, viêm não v.v...[11].
Căn cứ theo biểu hiện lâm sàng của bệnh SD/SXHD có thể chia thành 3 cấp
độ sau đây :
+ Sốt dengue (SD): còn gọi là sốt dengue cổ điển, thờng có các triệu
chứng nh các bệnh nhiễm virus khác là: sốt từ 38- 400 C, đau mỏi cơ và các
khớp xơng, đau đầu vùng trán và thái dơng, rất ít gặp mảng xuất huyết dới
da, tỉ lệ tử vong thấp (khoảng 0.018%) [11].
+ Sốt xuất huyết dengue (SXHD): Sốt cấp tính cao, kéo dài 2-7 ngày kèm
theo nhức đầu, đau khớp cơ, xuất hiện mảng hoặc chấm xuất huyết dới da, niêm

18


mạc, xuất huyết nội tạng, hạ sốt do xuất huyết nhiều, có các biểu hiện nh chảy
máu mũi, chảy máu chân răng nhiều và kéo dài [6, 11].
+ Hội chứng sốc dengue (HCSD, DSS): Có các biểu hiện tợng tự nh
SXHD nhng còn kèm theo hiện tợng mạch đập nhanh, huyết áp tụt, da lạnh và
ớt. Khi sốc sâu, kéo dài có thể dẫn tới suy thận cấp, rối loạn tiêu hoá, ngừng
tim, xuất huyết nội tạng và tử vong sau 12-24 giờ [6, 11].
ở ngời mắc sốt dengue thờng thấy các đặc điểm nh: Hạch lympho sng,
đau toàn thân, lợng tiểu cầu ít giảm, giãn mạch ngoại vi, bạch cầu giảm,
hematocrit tăng nhẹ. Đối với trờng hợp mắc SXHD thì có thêm các đặc điểm
khác nữa nh: gan to, tiểu cầu giảm, hematocrit tăng hơn 20% so với bình
thờng, có biểu hiện vàng da, xuất huyết phủ tạng hệ tiêu hoá và ngoài tiêu hoá
nh não, màng não v.v... thể nặng có thể chuyển sang các giai đoạn khác nghiêm
trọng hơn nh SXHD thể não (hội chứng não cấp), SXHD thể suy gan cấp
v.v...[11].

1.1.2. Tác nhân truyền bệnh
Bệnh SD/SXHD lây qua đờng máu. Các nghiên cứu về trung gian truyền
bệnh đã xác định muỗi vằn Aedes aegypti (A. aegypti) là vector chủ yếu, ngoài ra
các loại muỗi khác nh Aedes albopictus, Aedes polynesiens cũng có thể truyền
bệnh SD/SXHD. Muỗi A. aegypti là loại muỗi sống ở trong nhà hoặc xung quanh
nhà. Chỉ có muỗi cái đốt ngời và đốt vào ban ngày, chủ yếu vào sáng sớm và
chiều tối [43]. Muỗi cái có thể truyền bệnh sau thời kỳ ủ bệnh 3 đến 10 ngày
hoặc có thể truyền bệnh ngay nếu đang hút máu bệnh nhân dở dang rồi đốt sang
ngời khác. Nơi đậu của muỗi là những chỗ tối tăm trong nhà nh: hốc tủ, gầm
giờng, gầm bàn, chỗ treo quần áo, chăn màn và những vật dụng khác. Một điểm
đáng lu ý là muỗi A. aegypti có khả năng truyền virus dengue qua lăng quăng
(bọ gậy), nghĩa là virus dengue có chu kỳ xuyên qua trứng. Đây cũng là một yếu
tố quan trọng trong công tác phòng chống bệnh, diệt muỗi trởng thành phải đi
đôi với diệt lăng quăng trong các vật chứa nớc. Điều này chính là cơ sở của
19


phơng pháp quản lý muỗi dựa và cộng đồng. Vòng đời của muỗi A. aegypti
đợc thể hiện ở hình 1.1.

Hình 1.1: Vòng đời của Muỗi
Sau khi bị nhiễm virus, muỗi sẽ bị nhiễm suốt đời. Muỗi cái có thể truyền
virus dengue cho trứng và trứng lại có khả năng tồn tại rất lâu trong điều kiện
khô hạn (có thể trên 1 năm), đây là một yếu tố khó khăn cho việc diệt muỗi [1].
Muỗi sinh sản vào mùa ma, ở những nơi chứa nớc nhân tạo (vũng nớc đọng,
chum, vại v.v).
Thời gian virus nhân lên trong hạch nớc bọt muỗi là từ 3 10 ngày tuỳ
theo nhiệt độ môi trờng. Muỗi cái có thể truyền dọc virus dengue sang thế hệ
sau tuy nhiên đờng truyền dọc này không có vai trò lớn trong cơ chế lây truyền

dengue sang ngời, ngời vẫn là vật chủ chính nhân virus dengue.

1.1.3. Tình hình dịch bệnh trên thế giới
So sánh hai bản đồ phân bố trên thế giới có thể nhận thấy rằng dịch
SD/SXHD có xu hớng lan rộng không những trong mỗi nớc mà còn ra nhiều
nớc khác (hình 1.2), hàng năm có sự gia tăng số nớc thông báo có dịch và số
trờng hợp mắc bệnh. Đông Nam á, Tây Thái Bình Dơng và Trung Mỹ đang là
vùng hoạt động mạnh của virus dengue và SD/SXHD. Theo thống kê của WHO
từ năm 1995 đến nay, mỗi năm có khoảng 50 triệu ngời bị nhiễm virus dengue
20


với khoảng 500.000 trờng hợp phải nhập viện do mắc SXHD, trong đó có
khoảng 12.000 trờng hợp tử vong, số trờng hợp tử vong có thể còn cao hơn
nếu nh bệnh nhân không đợc chẩn đoán và điều trị kịp thời. Đặc biệt vào
những tháng đầu năm 2004, tại Inđônêxia dịch SD/SXHD đã bùng phát mạnh với
tổng số trờng hợp bị nhiễm hơn 80.000, con số tử vong là hơn 1000 trờng hợp
[30].

Hình 1.2. Bản đồ phân bố SD/SXHD thập niên 90, năm 2001 và năm 2005.
Vùng biểu thị bằng màu hồng nhạt là nơi có SD/SXHD; Màu hồng là nơi có
SD/SXHD cộng với HCSD. Màu vàng là vùng có lu hành của muỗi A.
aegypti; Màu đỏ là vùng có lu hành của muỗi A. aegypti cùng với dịch
SD/SXHD.

21


Virus Dengue lần đầu tiên đợc Sabin A.B. phân lập đợc từ những binh
lính ở Calcutta, New Guinea và Hawaii năm 1943. Các virus phân lập ở ấn độ,

Hawaii và 1 chủng ở New Guinea có kháng nguyên giống nhau đợc gọi là DEN1. Ba chủng virus còn lại ở New Guinea có kháng nguyên khác với chủng trên,
đợc gọi là DEN-2. Sau đó 2 typ huyết thanh khác có chứa các quyết định kháng
nguyên khác DEN-1 và DEN-2 đợc xác định là DEN-3 và DEN-4 đợc Hammon
W. McD. tìm ra từ bệnh nhân mắc sốt xuất huyết ở Manila vào năm 1956 [1, 4,
45]. Cho tới nay, đã có rất nhiều mẫu virus Dengue thuộc cả 4 typ huyết thanh
đợc phân lập ở nhiều nơi trên thế giới (Hình 1.3.)

1.1.4. Tình hình dịch bệnh ở Việt Nam
ở Việt Nam, vụ SD/SXHD đầu tiên xảy ra ở miền Bắc vào năm 1958. Sau đó xảy
ra một số vụ dịch lớn nh vụ dịch năm 1978 với 393.725 ngời, gây tử vong 1449
ngời. Trong 5 năm gần đây, số trờng hợp mắc bệnh trung bình mỗi năm đợc
thông báo là 100 ngàn và có khoảng 200 ngời bị tử vong [11]. ở

22


nớc ta, bệnh SD/SXHD lu hành rộng rãi ở vùng Châu thổ Sông Hồng, Sông
Cửu Long và vùng duyên hải miền Trung.
ở miền Bắc, dịch bệnh thờng phát triển mạnh nhất vào khoảng từ tháng 6

đến tháng 11, sau đó bị gián đoạn do mùa đông lạnh. Còn ở các tỉnh phía Nam,
dịch có thể xảy ra quanh năm, đặc biệt khu vực đồng bằng sông Cửu Long
thờng là điểm nóng của các đợt dịch sốt xuất huyết [8, 9, 10]. Theo Viện
Pasteur TP H Chí Minh, số trờng hợp SD/ SXHD trong năm 2002 là 21.908,
cho đến giữa tháng 6 năm 2003 dịch SD/ SXHD đã có mặt tại 61/61 tỉnh thành
với gần 9.300 ngời mắc bệnh trong đó đã có 22 tử vong. Từ đầu năm đến giữa
tháng 6/2004, cả nớc đã có trên 16.600 trờng hợp mắc bệnh (tăng 79,6% so
với cùng kỳ năm trớc), riêng ở 20 tỉnh thành phía nam đã có 20 trờng hợp bị tử
vong. Theo thống kê của WHO, trong vòng 30 năm (1960 - 1989) Việt Nam đã
có hơn một triệu ca mắc DHF trong tổng số hai triệu ca của 8 nớc Đông Nam á

[1, 4].

1.2. ViruS Dengue
1.2.1. Đặc điểm hình thái và cấu trúc
Virus dengue thuộc họ Flaviridae, giống Flavivirus bao gồm 4 type huyết
thanh là Dengue1, Dengue2, Dengue3, Dengue4. Virus dengue hình khối cầu có
đờng kính khoảng 40-50 nm, chứa một sợi RNA đơn-dơng (khoảng 10200
nucleotide). Cũng nh các Flavivirus khác virus dengue có một lớp vỏ
(envelope) bản chất là glycoprotein-lipit bao quanh màng protein, lớp vỏ này bắt
nguồn từ màng tế bào vật chủ (hình 1.3). Ngoài ra nucleocapsid có cấu trúc đối
xứng 20 mặt. Hạt virus có hệ số lắng khoảng 175S đến 215S. Tỷ trọng xác định
bằng ly tâm gradien sacaroza khoảng 1,19 g/cm3. Tỷ lệ này có thể thay đổi đôi
chút do các kỹ thuật tinh chế [1, 6].

23


Hình 1.4. Cấu trúc của hạt virus Dengue. Các protein quan trọng của virus
bao gồm: Protein vỏ (E.Protein), Protein màng (M. Protein), Protein lõi (C.
Protein). Bên trong hạt virus là sợi ARN đơn dơng (Positive strand RNA)
chứa các gen của virus theo trình tự đợc mô hình hóa phía dới.

1.2.2. Hệ gen (Genome) của virus dengue
Virus Dengue có hệ gen của Flavivirus điển hình. Genome là một sợi
RNA đơn, dơng có chiều dài xấp xỉ 10200 ribonucleotit. Hệ gen chứa một
khung đọc mở mã hoá cho một chuỗi polyprotein duy nhất. Chuỗi này sau đó sẽ
đợc phân cắt bởi các enzyme của tế bào vật chủ và các enzyme của virus thành
10 phân tử protein chức năng, bao gồm 3 protein cấu trúc và 7 protein phi cấu
trúc. Genome của virus Dengue có cấu trúc phân bố của các gen theo thứ tự nh
sau: 5-C-preM-E-NS1-NS2a-NS2b-NS3-NS4a-NS4b-NS5-3 (hình 1.5).

24