chuyển gen kháng sâu cry1ab và cry1b 1ab vào giống mía vn84 4137 (saccharum officinarum l ) bằng phương pháp sử dụng vi khuẩn agrobacterium tumefacien

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
KHOA SINH HỌC – CÔNG NGHỆ SINH HỌC

ĐỀ TÀI :
CHUYỂN GEN KHÁNG SÂU cry1Ab VÀ cry1B-1Ab VÀO GIỐNG
MÍA VN84 4137 (Saccharum officinarum L.) BẰNG PHƯƠNG
PHÁP SỬ DỤNG VI KHUẨN Agrobacterium tumefacien


MỤC LỤC
o……………………………………………………………………..46

2


I.

Mở đầu

- Ở Việt Nam, mía là một loại cây trồng mang lại giá tr ị kinh t ế, n ước ta có đ ặc đi ểm khí
hậu, cùng với khả năng thích ứng trên nhiều loại đất khác nhau nh ư đ ất than bùn, đ ất
hoàn toàn cát, đất chua mặn, đất đồi, khô hạn ít màu m ỡ… nên cây mía đ ược tr ồng
khắp các vùng miền trên cả nước. Do đó phát tri ển ngành mía đ ường đ ược xem là
chương trình khởi đầu để tiến hành công nghiệp hóa, hi ện đại hóa nông thôn, xóa đói
giảm nghèo.
Mặc dù ngành mía đường được chú trọng phát tri ển, nhưng hi ện nay người nông dân
đang phải đối mặt với rất nhiều khó khăn như: thiên tai lũ l ụt, h ạn hán sâu b ệnh…d ẫn
đến năng suất mía thấp, năm 2011 bình quân năng suất đạt khoảng 62 t ấn/ha trong
khi trên thế giới là 70,5 tấn/ha. Những nguyên nhân trên cùng v ới giá thu mua mía
thấp, không ổn định làm cho diện tích trồng mía trong nh ững năm g ần đây s ụt gi ảm,

năm 2002 diện tích trồng mía đạt 320.000 ha đến năm 2010 còn kho ảng 269.100 ha.
Những khó khăn trên làm sản lượng mía bị thi ếu hụt không đáp ứng đ ủ nguyên li ệu
cho ngành sản xuất đường, trong khi nhu cầu tiêu thụ đường ở n ước ta ngày càng gia
tăng, dự kiến năm 2020 là 2 triệu tấn đường/ năm.
Một trong những nguyên nhân quan trọng nhất dẫn đến gi ảm năng su ất, s ản l ượng
mía ở nước ta là do phá hoại của sâu bệnh, trong đó phổ biến là loài sâu đục thân thu ộc
bộ cánh phấn Lepidoptera, hàng năm ở nhiều nơi có thể gây thiệt hại đến 30% s ản
lượng. Mặc dù nhiều biện pháp khác nhau đã được áp dụng để phòng tr ừ các lo ại sâu
này như dùng lưới bắt sâu, bướm, dùng thuốc trừ sâu, thiên địch…nh ưng nh ững lo ại
côn trùng này thường khó kiểm soát do chúng di chuy ển và l ấy th ức ăn bên trong thân
mía. Do đó việc tạo ra các giống mía có khả năng kháng các loại sâu b ệnh là m ột nhu
cầu cấp thiết hiện nay.
Tuy nhiên việc áp dụng các phương pháp lai tạo gi ống truy ền th ống trên cây mía g ặp
nhiều khó khăn do cây mía có bộ gen phức tạp, gen quy đ ịnh tính ch ống ch ịu v ới sâu
bệnh ít, khả năng sinh sản hữu tính thấp làm cho chu kì chọn l ọc, t ạo gi ống di ễn ra
trong thời gian rất dài, có thể đến 10 năm.
Áp dụng công nghệ sinh học có thể khắc phục được những khó khăn trên b ằng cách
đưa các gen kháng sâu Bt vào bộ gen mía, tạo ra giống mía kháng sâu trong th ời gian
ngắn.
Mục đích nghiên cứu
3


Lý luận: khảo sát quy trình chuyển gen cry1Ab và cry1B-1Ab vào mô s ẹo mía thông
qua vi khuẩn A. tumefaciens, làm cơ sở cho việc ứng dụng chuyển gen nói chung vào cây
mía (Saccharum officinarum L.) thông qua vi khuẩn A. tumefaciens.
Thực tiễn: Tạo được các dòng mía mang gen kháng sâu cry1Ab và cry1B-cry1Ab b ằng
phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

4

II.

Tổng quan tài liệu

1. Danh pháp
Giới: Plantae
Giới phụ: Tracheobionta
Ngành: Magnoliophyta
Lớp: Liliopsida
Lớp phụ: Commelinidae
Bộ: Cyperales
Họ: Poaceae (Gramineae)
Chi: Saccharum
2. Nguồn gốc, lịch sử phát triển và phân bố của cây mía
2.1. Nguồn gốc và lịch sử phát triển.
Cây mía (saccharum spp) được thuần hóa được thuần hóa 8000 năm TCN ở đảo
Tân Gi Nê bởi những người làm vườn từ thời kì đồ đá mới, sau đó dần lan truy ền
đến Trung Quốc, Ấn Độ và các đảo ở Thái Bình Dương.
Từ Trung Quốc cây mía được trồng ở các nước phía Đông Nam nh ư: Philippin,
Nhật Bản, Indonesia; từ Ấn Độ mía được phát triển ra các n ước ở phía Tây nh ư:
Iran, Ai Cập, Tây Ban Nha, Ý.
Cây mía được trồng ở các nước Địa Trung Hải từ thế kỉ thứ XIII, Châu Mỹ tr ồng
mía muộn hơn vào thế kỉ XV. Trong lần thứ hai vượt bi ển sang Tân Th ế gi ới,
Christophe Colombus đã đưa giống mía đến trồng ở Châu Mỹ vào năm 1490 ở
Santo Domingo, sau đó đến Mexico (1502), Brazin (1533), Cuba (1650).
Đến thế kỉ thứ XVI đường mía là mặt hàng trao đổi gi ữa các n ước Nam Mỹ và th ị
trường Châu Âu.
2.2. Phân bố

Mía là cây nhiệt đới, phát triển tốt trong phạm vi t ừ 35 o vĩ tuyến Bắc đến 35 o vĩ
tuyến Nam, trên các loại đất từ cát đến sét nặng.
Việt Nam là nước nằm ở từ 8o đến 23o vĩ tuyến Bắc và có khí hậu nhiệt đới nóng
ẩm, lượng mưa cao, rất thích hợp với cây mía.
Bảng 1: Phân bố các vùng trồng mía ở Việt Nam
TT

Vùng sản xuất (tỉnh)

Diện tích

1

(ha)
Miền núi phía Bắc (Cao Bằng, Tuyên Quang, Sơn La, Hòa 13.876

2
3
4
5

Bình, Phú Thọ)
Bắc Trung bộ (Thanh Hóa, Hà Tĩnh, Quảng Bình)
Trung Trung Bộ (Quảng Ngãi, Bình Định, Phú Yên)
Tây Nguyên (Kon Tum, Gia Lai, Đắc Lăk, Đắc Nông)
Đông Nam Bộ (Đồng nai, Bình Dương, Bình Phước, Long An,

59.168
47.995
34.747

29.092

Tây Ninh)
5


6

Đồng bằng sông Cửu Long (Bến Tre, Trà Vinh, Sóc Trăng, 56.838
Tiền Giang, Hậu Giang, Đồng Tháp, Kiên Giang, Cà Mau)
Tổng cộng

242.413

3. Đặc tính thực vật học
a) Thân mía
- Thân cây mía cao trung bình 2-3 m, một số gi ống có thể cao 4-5m. Thân mía
được hình thành bởi nhiều đốt hợp lại. Chiều dài mỗi đốt từ 15-20 cm, trên m ỗi
đốt gồm có mắt mía (mắt mầm), đai sinh trưởng, đai rễ, sẹo lá…
o Thân mía có màu vàng, đỏ hồng
hoặc đỏ tím.
o Tuỳ theo từng giống mà lóng
mía có nhiều hình dạng khác
nhau như: Hình trụ, hình trống,
hình ống chỉ… Thân đơn độc,
không có cành nhánh, trừ một
số trường hợp bị sâu bệnh.
Hình 1: các dạng lóng mía
b) Rễ
- Rễ mía: Cây mía có 2 loại rễ là rễ sơ sinh và rễ thứ sinh.

+ Rễ sơ sinh (rễ hom): Mía được trồng

bằng thân (sinh

sản vô tính). Khi trồng, thân mía được

chặt thành từng

đoạn, mỗi đoạn có từ 2 đến 4 mắt

mầm

gọi là hom giống). Đai rễ ở các hom mía

đâm ra những

rễ đầu tiên nhỏ, mảnh, có màu trắng

hoặc màu trắng

ẩn

vàng

nhạt,

đó

là

rễ

sơ

(thường

sinh.

Đồng thời với sự ra rễ này, mầm mía cương lên, bắt đầu mọc và đâm lên kh ỏi
mặt đất.

Hình 2: các loại rễ và chồi
Cây mía con thời kỳ đầu sử dụng các chất dinh d ưỡng ch ứa trong hom gi ống, do
đó nhiệm vụ chính của lớp rễ này là bám đất và hút n ước cung cấp cho hom
mía.
+ Rễ thứ sinh (rễ vĩnh cửu): Tiếp sau rễ sơ sinh, lúc mầm mía đâm lên kh ỏi m ặt
đất, ở gốc của mầm mía (cây mía non) bắt đầu xuất hi ện những chi ếc r ễ vĩnh
cửu

đầu

tiên.

Loại rễ này to và trắng. Chức năng chủ yêu là hút n ước, dinh d ưỡng, cung c ấp
6


cho cây. Cây mía con dần dần thoát ly khỏi sự phụ thuộc vào chất dinh d ưỡng
dự trữ trong hom mía. Hom mía khô quắt lại, rễ sơ sinh cũng đồng thời h ết vai
trò của nó, teo dần rồi chết.

Các rễ thứ sinh dính trực tiếp với trục cây, phát tri ển cùng v ới s ự phát tri ển c ủa
cây để hoàn thành chức năng sinh lý của nó. Những rễ này cấu tạo ch ủ yêu là
chất xơ và được chia thành 3 lớp theo chức năng riêng của mỗi lớp.
Lớp bề mặt từ 0 - 30 cm của tầng đất canh tác, phân bố ch ủ y ếu là nh ững r ễ
nhỏ, có nhiều nhánh và đầu rễ mang lông hút, làm nhiệm vụ hấp th ụ các ch ất
dinh dưỡng (lớp này gọi là rễ hấp thụ).
Kế đên lớp 30 - 60 cm chủ yếu là các r ễ xiên. Loại r ễ này to h ơn các r ễ l ớp trên,
làm nhiệm vụ chống đỡ, giữ cho cây không bị đổ ngã.
Lớp rễ thứ sinh sau cùng là những rễ ăn sâu, chức năng chính là hút n ước nên
gọi là lớp hút nước. Tùy thuộc vào từng loại đất khác nhau, các r ễ này có khi ăn
rất sâu tới 5-6 m.
- Rễ phụ sinh: Loại rễ này thường đâm ra từ đai rễ ở các lóng mía dưới cùng c ủa
thân mía. Một số trường hợp khác do đặc tính của gi ống hoặc do đi ều ki ện c ủa
môi trường (chủ yếu là ẩm dộ) các rễ phụ sinh phát tri ển nhi ều t ừ các đai r ễ
trên thân mía làm ảnh hưởng xấu đến chất lượng mía nguyên li ệu. Do v ậy,
những giống mía hay ra rễ trên thân thường không được sản xuất tiếp nhận.
c) Lá
- Lá mía thuộc loại lá đơn gồm phiến lá và bẹ lá. Phi ến lá dài trung bình t ừ 1,01,5m có một gân chính tương đối lớn. Phiến lá có màu xanh th ẩm, m ặt trên có
nhiều lông nhỏ và cứng, hai bên mép có gai nhỏ. Bẹ lá r ộng, ôm kín thân mía,có
nhiều lông. Nối giữa bẹ và phiến lá là đai dày c ổ lá. Ngoài ra còn có lá thìa , tai
lá… Các đặc điểm của lá cũng khác nhau tuỳ vào giống mía.
d) Hoa và hạt mía
- Hoa mía (còn gọi là bông cờ):
+ Hoa mía có hình chiếc quạt mở. Khi mía kết thúc thời kỳ sinh tr ưởng
mầm hoa được hình thành ở điểm trên cùng của thân cây (đi ểm sinh
trưởng) và phát triển thành hoa (cây mía chuy ển sang giai đoạn sinh
thực). Hoa mía được bao bọc bởi chiếc lá cuối cùng c ủa bộ lá (lá c ụt), khi
đã được thoát ra ngoài, hoa xòe ra như m ột bông c ờ (nên g ọi là bông c ờ).
Cấu tạo của hoa mía gồm trục chính và các nhánh cấp 1, c ấp 2,... (còn g ọi
là gié và gié con) và trên những gié con là những hoa mía nh ỏ. M ỗi hoa

mía được bao bởi 2 mảnh vỏ, được tạo thành bởi hai l ớp màng trong và
màng ngoài. 
7


+ Tổ chức sinh sản của hoa: Hoa mía là loại hoa có tổ ch ức sinh s ản ngầm
(Hipogina) và cấu trúc đơn giản. Mỗi hoa bao gồm cả tính đực và tính cái,
với ba nhị đực, một tử cung và hai nhị cái. Khi hoa mía n ở, các bao ph ấn
nhị đực tung phấn, nhờ gió mà các nhị cái dễ dàng ti ếp nhận nh ững h ạt
phấn đó như đặc tính chung của các hòa thảo khác.
- Hạt mía:
Hạt mía trông như một chiếc vảy

khô,

nhẵn,

hình thoi, ở trong chứa albumin,

tinh bột và

một mầm nhỏ. Khi chín, hạt có

màu biến đổi

từ vàng sang màu hạt dẻ và không

bị nứt. Kích

thước của hạt khoảng 0,5 mm x

1,5

nặng từ 0,15 đến 0,25 mg. Trong

công tác lai

mm

và

tạo giống mới, lai hữu tính là một phương pháp được ứng dụng r ộng rãi và thu
được nhiều kết quả, do đó, sự ra hoa kết hạt của mía có ý
cực đối với mục đích này.

nghĩa r ất tích

Hình 3: hoa mía

Hình 4: Hạt mía.
4. Phân loại và giống mía VN84 4137
4.1 Phân loại
a) Các loài mía
Trong Saccharum có 5 loài mía gồm: 3 loài tr ồng trọt và 2 loài hoang d ại. Các
loài mía này phân biệt giữa chúng với nhau bằng các đặc điểm thực vật.
Theo Jeswiet, các loài mía trồng là :
- Loài Saccharum officinarum L, còn gọi là mía quí (noble cane): Loài mía này
trồng thích hợp ở các vùng khí hậu nhiệt đới. Ở nước ta hi ện nay còn gặp r ất
nhiều dạng của loài mía quí như mía voi, mía đỏ, mía tím (còn g ọi là mía tiên,
mía thuốc), Thanh Diệu, mía mưng,... mà bà con nông dân th ường tr ồng đ ể ăn

8


tươi, giải khát. Những đặc điểm chính là: cây to thịt mềm, ít x ơ, nhi ều n ước, t ỉ l ệ
đường cao. Cây có màu xanh, vàng, đỏ xẫm hoặc tím, không ho ặc r ất ít ra hoa. Ở
những nơi đất tốt, điều kiện khí hậu thuận lợi năng suất mía có th ể đ ạt r ất cao
mà ít có loài mía khác có thể đạt tới. Khả năng để gốc kém. Loài mía này không
mẫn cảm với bệnh than và một số bệnh khác. Tuy nhiên, nhìn chung kh ả năng
kháng sâu bệnh kém, nhất là các bệnh ở bộ rễ. Chính vì vậy, người ta đã áp dụng
phương pháp lai với những giống mía có sức chống chịu cao đối v ới sâu b ệnh đ ể
tìm các giống mía mới vừa có năng suất mía cao, giàu đường lại kháng sâu bệnh.

Hình 5: Loài Saccharum officinarum L.
- Saccharum barberi Jeswiet: Là loài mía có nguồn gốc từ vùng Bắc Ấn Đ ộ, thích
hợp với những điều kiện á nhiệt đới. Loài mía này nghèo đường h ơn loài
Saccharum officinarum, cây mía nhỏ, dóng hình tr ụ có màu xanh ho ặc tr ắng, x ơ
bã nhiều, bản lá hẹp, sức sống cao, kháng được nhiều loại sâu bệnh.

9


- Saccharum sinense Roxb.: Loài mía này còn được gọi là mía Trung Qu ốc. Ở các
tỉnh phía Bắc nước ta có nhiều
dạng của loài mía Saccharum
sinense, đó là các dạng mía Gie,
như Gie Tuyên Quang, Gie Lạng
Sơn,… Loài mía này thích hợp với
điều kiện khí hậu nhiệt đới và á
nhiệt đới. Sức sống mạnh, chín
sớm, tỷ lệ đường trung bình.

Thân mía nhỏ lóng hình ống chỉ,
vỏ có màu xanh ánh đồng, sáp
phủ dày. Lá mía hẹp, mềm, ra hoa
trung bình. Có khả năng chống
bệnh
gồm: bệnh mosaic, và mẫn cảm
với bệnh than, bệnh rượu.

Hình 6: Loài Saccharum sinense Roxb

Các loài mía hoang dại thuộc loại Saccharum khác là:
- Saccharum spontaneum L.: Loài này còn gọi là mía d ại c ủa vùng Tây Nam châu
Á. Đó là các loài lau, sậy... vẫn thường gặp ở nhi ều vùng trên kh ắp đ ất n ước ta.
Đặc điểm của loài S. spontaneum là cây thân nhỏ, vỏ c ứng, sức s ống kh ỏe, hàm
lượng đường ít, tỉ lệ xơ cao, ra hoa mạnh, thời gian ra hoa s ớm, khả năng thích
ứng rộng, ít bị sâu phá hại và có khả năng kháng nhi ều lo ại b ệnh nh ư mosaic,
gôm, bệnh thối rễ và một số bệnh khác nhưng lại mẫn cảm với bệnh than.

Hình 7: Loài Saccharum spontaneum L

10


- Saccharum robustum Brandes & Jeswiet: Đặc đi ểm c ủa loài mía này là thân to,
lóng dài, đường ít do Jeswiet phát hiện ở Tân Guine vào năm 1929. Loài mía S.
robustum có sức sống mạnh, đẻ nhiều và ra hoa. Thân c ứng nên ch ống đ ược gió
bão và sâu đục thân, nhưng kháng bệnh kém như các bệnh ở bộ lá và b ộ r ễ.
Theo Carassi thì loài mía này cùng với loài Erianthus maxinus đã tham gia vào s ự
phát triển của loài mía quí. Điều đó có thể chứng minh qua vi ệc nghiên c ứu hình
thái học và tế bào học các loài mía.

Hình 8: Loài Saccharum barberi Jeswiet
4.2. Giống mía VN84 4137
a. VN84 4137 (VN) là giống mía do viện nghiên cứu Mía Đ ường Bến Cát lai t ạo
năm 1984, Ja60-5 lai với đa giao, có năng suất khá, ch ất l ượng cao, chín trung
bình, thích ứng rộng. VN trồng nhiều ở các vùng Nam Trung bộ, Trung Trung b ộ,
Tây Nguyên, Đông Nam bộ, Tây Nam bộ, tuy nhiên tình tr ạng sâu b ệnh h ại phá
hoại lớn, do đó diện tích trồng VN ngày càng sụt giảm.
b. Đặc điểm hình thái: thân to trung bình, phát tri ển thẳng, lóng hình chùy ng ược,
vỏ màu xanh ẩn tím. Mắt mầm hình tròn hoặc hình hến tròn, không có rãnh
mầm. Phiến lá rộng trung bình, màu xanh đậm. Bẹ lá có nhi ều lông, màu ph ớt
tím, cổ lá hình sừng bò, lá thìa cong đều. Có m ột tai lá nhỏ. Lá đ ứng, dáng ng ọn
thẳng
c. Đặc điểm nông nghiệp: mọc mầm và đẻ nhánh mạnh, sớm, tập trung. T ỷ
lệ mọc mầm khá, sức đẻ nhánh cao, mật độ cây hữu hiệu cao. Tốc độ vươn
lóng khá. Khả năng tái sinh tốt, lưu gốc được nhiều năm. Chịu h ạn tốt. Ưa
thâm canh và khả năng thích ứng rộng. Giống mẫn cảm đối với sâu đ ục
thân 4 vạch, sâu đục thân mình tím và sâu đục thân mình hồng lớn.
11


d. Đặc điểm công nghiệp: Năng suất mía đạt trên 80 tấn/ha, ở vùng đ ất đ ủ ẩm có
thể đạt trên 100 tấn/ha. Trữ đường cao trên 11%. Hàm l ượng đường cao ở đ ầu
vụ, có thể đưa vào ép đầu vụ.

Hình 9: giống mía VN84 4137
5. Giai đoạn sinh trưởng
5.1. Giai đoạn nẩy mầm của cây mía
Được tính từ khi trồng đến khi mầm mọc khỏi mặt đất, chia 3 giai đo ạn: B ắt
đầu mọc (10% mọc), mọc rộ (>50% mọc), thời kỳ cuối (>80% m ọc). Quá trình

nẩy mầm là quá trình chuyển biến từ trạng thái ngủ của nốt r ễ, mầm sang
trạng thái hoạt động của cây con và rễ non, sinh sôi thêm nhiều thân mía mới.
5.2. Giai đoạn cây mía con
Bắt đầu từ khi cây có lá thật thứ nhất cho tới khi phần l ớn số cây trong ruộng có
5 lá thật. Rễ cây bắt đầu phát triển khi cây con có 2 lá thật.
Thời kì cây mía con ngoài phụ thuộc vào chất dinh d ưỡng thì cũng ph ụ thu ộc
vào đặc tính giống và các yếu tố ngoại cảnh như độ ẩm, nhiệt độ, đất, kĩ thuật
canh tác…Giống chín muộn, giống phát triển giai đoạn đầu chậm thường kéo dài
thời kỳ cây con so với giống chín sớm hoặc có đặc tính phát tri ển nhanh ở giai
đoạn đầu.
5.3. Giai đoạn mía nhảy bụi
Khi cây mía có 6 - 7 lá thật thì bắt đầu đẻ nhánh, khoảng 10 lá thật mía đẻ rộ,
sau đó giảm dần. Nhánh do những mầm ở phần gốc của cây mía nằm ở dưới
mặt đất nẩy mầm thành. Từ thân mẹ đẻ ra nhánh cấp 1 (cũng có thể gọi cây mẹ
là nhánh cấp 1 vì mía trồng bằng hom), nhánh cấp 1 đẻ ra nhánh cấp 2… và cứ
tiếp tục như vậy thành một bụi mía. Các yếu tố ảnh hưởng đến nhảy bụi của
bụi.
Yếu tố nội tại
Giống: Các giống khác nhau có khả năng đẻ nhánh khác nhau, thường mía dại >
mía trồng, mía Ấn Độ > nhiệt đới, giống cây bé > cây to. Giống được chia làm 3
loại : Đẻ nhiều, có thể đẻ tới 30 - 40 nhánh, giống đẻ trung bình đẻ từ 15 - 24
nhánh và đẻ ít từ 8 - 15 nhánh trên khóm mía.
12


Phẩm chất hom: Cây mẹ to mập có khả năng đẻ nhánh sớm và tập trung, cây
con khỏe hơn.
Yếu tố ngoại cảnh: nhiệt độ (26oC-30oC là nhiệt độ thích hợp), độ ẩm (75%85% mía đẻ khỏe, sớm, gọn), ánh sáng, kĩ thuật chăm sóc…
5.4. Giai đoạn mía vươn lóng
Trong điều kiện bình thường, 4 tháng sau khi trồng thời kỳ đẻ nhánh hoàn

thành. Rễ phát triển, mầm vươn cao. Phiến lá, bẹ lá dài ra theo sau là lóng mía
cũng dài ra. Thời kỳ vươn cao bắt đầu từ khi mía có lóng tới khi ngừng sinh
trưởng.
5.5. Giai đoạn mía chín
Bước vào thời kỳ làm lóng là đã bắt đầu tích lũy đường nhưng với hàm lượng
không đáng kể và chủ yếu là đường không kết tinh (đường khử). Lượng đường
saccaro tích lũy trong thân tăng dần theo tuổi cây.
Khi mía có nhiều tháng và thời tiết thích hợp cho sự tích lũy đường thì hàm
lượng đường trong thân đạt tới mức tối đa và chủ yếu là đường kết tinh
(C12H22O11) lúc này gọi là thời kỳ chín công nghi ệp.
Khi đạt mức tối đa, tùy giống và điều kiện thời tiết, lượng đường này có thể
giữ lại khoảng 15 ngày đến 2 tháng. Sau đó bắt đầu giảm dần do bị hô hấp
hoặc tái sinh trở lại, thường gọi là mía quá lứa hoặc quá chín.
6. Điều kiện sinh thái
6.1. Nhiệt độ:
Mỗi giống mía thường cần một lượng nhiệt nhất định trong suốt cả cuộc đời của
nó (từ khi trồng đến khi mía chín và thu hoạch). Ở m ỗi th ời kỳ sinh tr ưởng mía
cần những khoảng nhiệt độ thích hợp riêng. Nhi ệt độ ảnh hưởng đến quang
hợp, vận chuyển và quá trình tích lũy đường. Nhiệt độ biến đổi trong khoảng 30
- 40°C, tốc độ quang hợp của cây mía về cơ bản không thay đ ổi. Tuy nhiên, v ới
nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp đều làm gi ảm tốc độ quang h ợp. V ới n ồng đ ộ
CO2 thích hợp, ở nhiệt độ 34°C quang hợp đạt mức cao nhất.
Đối với cây mía, từ lúc trồng hom giống xuống đất cho đến khi thu hoạch, người
ta có thể chia ra làm bốn thời kỳ như sau:
- Thời kỳ trồng, mía có thể nảy mầm ở nhiệt độ 15°C, nhưng tốc độ nảy mầm sẽ
tăng lên và tập trung hơn theo độ tăng của nhi ệt độ. Tốt nh ất là trong kho ảng
từ 20 - 25°C.
- Thời kỳ mía đẻ nhánh, nhiệt độ cần từ 20 - 25°C.
- Thời kỳ mía làm lóng vươn dài cần nhiệt độ trung bình trên 23°C và thích h ợp
nhất là từ 30 - 32°C.

- Thời kỳ mía chín, nhiệt độ cần thấp dưới 20°C và biên độ nhi ệt l ớn gi ữa ngày
và đêm để giúp cho quá trình chuyển hóa và tích lũy đường được tốt.
13


6.2. Ánh sáng:
Cùng với nhiệt độ, ánh sáng có vai trò quan trọng trong hoạt động sinh lý c ủa
cây trồng. Cây mía là cây trồng có bộ lá xanh l ớn, kh ả năng tích lũy ch ất khô cao.
Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, cây mía cần c ường đ ộ, ánh sáng
mạnh. Khi cường độ và ánh sáng tăng, hoạt động quang hợp ở bộ lá cũng tăng
lên, thiếu ánh sáng, mía phát triển yếu, lóng cây, hàm l ượng đ ường trên mía
thấp, cây dễ bị sâu, bệnh tấn công. Trong suốt cuộc đời, cây mía c ần kho ảng
2.000 – 3.000 giờ chiếu sáng, tối thiểu cũng phải từ 1.200 giờ trở lên.
6.3. Độ ẩm trong đất:
Mặc dù là cây trồng cạn, mía rất cần nước. Trong thân cây mía ch ứa trên 70%
khối lượng là nước. Do đó, nước đối với đời sống cây mía là không th ể thi ếu
được. Nước tham gia quá trình quang hợp tổng hợp chất khô, nước là môi tr ường
hòa tan các chất dinh dưỡng, nhờ đó mà cây có thể hấp th ụ được. N ước giúp cho
hom mía nảy mầm, cho cây đẻ nhánh, phát tri ển vươn dài và tích lũy đ ường. Ở
những vùng đất cao, đồi gò, khô hạn thì vai trò của nước càng tr ở nên quan
trọng hơn. Ngoài lượng mưa tự nhiên, để cho cây mía có th ể phát tri ển t ốt,
người ta cần tưới vào các tháng mùa khô hạn. Ngược lại, mía cũng là cây r ất s ợ
nước, ở những đất bị úng ngập và khả năng thoát nước kém, cây mía sinh
trưởng và phát triển khó khăn.
- Thời kỳ nảy mầm và đẻ nhánh, mía cần độ ẩm trong đất khoảng 65%.
- Thời kỳ làm dóng vươm dài mía cần nhi ều nước nhầt, chi ếm t ừ 50 - 60% nhu
cầu nước của quá trình sinh trưởng, độ ẩm trong đất cần từ 75 - 80%.
- Thời kỳ mía chín, tích lũy đường, mía cần độ ẩm trong đất dưới 70% đ ể cho
quá trình sinh hóa tiến triển được thuận lợi.
6.4 Đất đai:

Cây mía có thể trồng trên nhiều loại đất khác nhau nh ư: đ ất thấp chua phèn
(Tây Nam Bộ), đất cao, đất đồi gò (Đông Nam Bộ, Trung du B ắc Bộ, Nam Trung
Bộ,...). Tuy nhiên, cần xác định đất đai là yếu tố quan trọng hàng đ ầu đ ối v ới s ự
sinh trưởng và phát triển của cây trồng. Đất thích hợp nhất cho cây mía là
những loại đất xốp, sâu, độ phì nhiêu cao, gi ữ ẩm t ốt và dễ thoát n ước (đất phù
sa bồi ven các sông rạch, đất vồng, đất cồn). Độ pH thích hợp cho mía phát tri ển
tốt từ 5,5 - 7,5. Thực tế đã chứng minh, nếu trồng mía trên nh ững loại đ ất kém
kể cả về hóa tính và lý tính thì không thể có năng suất cao, ph ẩm chất t ốt, dù
rằng đó là những giống mía thật tốt. Cây mía sống được và phát tri ển ph ụ thu ộc
rất nhiều vào các đặc tính hóa, lý, của đất. Những loại đất sét nặng, nén chặt,
chua, mặn, hoặc bị úng ngập, thoát nước kém... Không ch ỉ ảnh h ưởng đ ến s ự
14


phát triển của bộ rễ, đến sự hấp thụ dinh dưỡng, không khí và các quá trình
sinh trưởng và phát triển của cây trồng mà còn gây tr ở ngại cho công vi ệc tr ồng
trọt, chăm sóc, thu hoạch,... Đối với những loại đất có độ phì nhiêu kém, đ ể cây
mía phát triển tốt, cần phải được bón phân đầy đủ, cân đối và phải tưới cho mía
vào các tháng của mùa khô hạn.
7. Nghiên cứu nuôi cấy mô mía
7.1. Nghiên cứu tạo mô sẹo
Vật liệu: các loại mô phân sinh như lá non.
Nhiều loại Auxin khác nhau như: 2,4-D, IBA, NAA đã đ ược th ử nghi ệm trên
nhiều giống mía thì 2,4-D khi sử dụng riêng lẻ thì cho k ết qu ả t ốt nh ất đ ể kích
thích hình thành mô sẹo có khả năng sinh phôi, t ỷ lệ mẫu t ạo mô s ẹo cao nh ất
đạt được 100%.
• Trên 2 giống mía: HSF-243 và HSF-245 ở Pakistan, nghiên cứu sự ảnh
hưởng của 2,4-D và sự kết hợp giữa 2,4-D với BAP cho sự tạo mô sẹo
Kết quả: 3mg/l 2,4-D cho sự tạo mô sẹo tốt nhất; còn sự kết hợp gi ữa
2,4-D và BAP cho tỷ lệ mô sẹo thấp hơn 80%(HSF-243) và 85% (HSF•

245).
Ở giống mía Nayana: ảnh hưởng sự tạo mô sẹo của 2,4-D, IBA, NAA
(Behera và Sahoo năm 2009)
Kết quả: 2,5mg/l 2,4-D cho tỷ lệ tạo mô sẹo là 100%; 2,5mg/l NAA ch ỉ là
30% và sau khi cấy truyền mô sẹo không còn khẳ năng tái sinh; IBA

•

không có khả năng kích thích sự phát sinh mô sẹo.
Ở giống mía 1sd-16 ở Bangladesh: ảnh hưởng tạo mô sẹo 2,4-D, NAA
Kết quả: 3mg/l 2,4-D là 91%; NAA với các nồng độ khác nhau đều cho mô

sẹo dưới 40%.
7.2. Nghiên cứu tạo chồi từ mô sẹo
Nghiên cứu ở 2 giống mía 1sd-16 và 1sd-28 ở Bangladesh (Karim và c ộng s ự
2002).
Kết quả:
• Tỷ lệ mẫu tạo chồi ở 1mg/l kinetin là 42%, 1mg/l BAP là 60% cho th ấy
•

khi sử dụng cytokinin riêng lẻ thì cho tỷ lệ chồi thấp.
Sự kết 1mg/l BAP và 0,5mg/l IBA cho tỷ lệ mẫu chồi cao nh ất là 92%
(1sd-28) và 100% (1sd-16). Sự kết hợp 1mg/l BAP và 0,5mg/l NAA cũng
cho tỷ lệ mẫu tạo chồi cao xấp xỉ như trên với 89% (1sd-28) và 95%
(1sd-16). Cho thấy sự kết hợp của BAP ở nồng độ cao hơn v ới IBA/NAA

có khả năng kích thích chồi cao nhất.
7.3. Nghiên cứu tạo rễ cho chồi mía in vitro
15

Kết quả của nhiều nghiên cứu cho thấy NAA khi được sử dụng riêng rẽ có tác
dụng kích thích sự tạo rễ là tốt nhất.
Trên giống mía Nayana ở Ấn Độ: 2,5mg/l NAA cho kết quả tốt nhất với số rễ/
mẫu là 13,4±1,5; chiều dài trung bình của rễ 4,0±0,94cm.
8. Sâu hại mía
- Các loại sâu đục thân hại mía phân bố ở hầu hết các vùng trồng mía ở n ước ta,
gây thiệt hại rất lớn đến năng suất có thể đến 30% sản lượng.
- Trong các loài sâu gây hại có 3 loài gây hại quan tr ọng nh ất, xu ất hi ện h ầu h ết ở
các vùng trồng là sâu đục thân 4 vạch, sâu đục thân mình tím và sâu đ ục thân
mình hồng lớn
- Mỗi loài sâu có mức độ gây hại và triêu chứng bệnh khác nhau trên cây mía, tuy
nhiên cây mía nhiễm sâu thường có các đặc điểm đi ển hình: khi mía ở th ời kì
cây non, sâu đục vào gây hiện tượng héo nõn; đối với mía ở th ời kí có lóng, sâu
xâm nhập vào thân cây, đốt mía bị sâu đục dễ bị gãy đổ khi có gió to, đ ồng th ời
bệnh thối đỏ dễ phát triển thong qua vết đục này.

Hình 10: Trứng và sâu non sâu đục thân bốn vạch Chilo sacchariphagus Bojer

Hình 11: Nhộng và trưởng thành sâu đục thân bốn vạch Chilo sacchariphagus Bojer

Hình 12: Trứng và sâu non đục thân mình tím Phragmataecia castaneae Hŭbner

16


Hình 13: Nhộng và trưởng thanh sâu đục thân mình tím Phragmataecia
castaneae Hŭbner

Hình 14: Trứng và sâu non sâu sâu đục thân mình hồng lớn (cú mèo) Sesamia sp.

Hình 15: Nhộng và trưởng thành sâu đục thân mình hồng lớn (cú mèo) Sesamia sp.
9. Phương pháp tạo dòng
Mục đích: Nhằm thu được một lượng lớn bản sao của một trình tự DNA xác định.
Tiến trình thực hiện bao gòm các bước:
- Chọn và xử lí vector: vector là một DNA, thường có dạng vòng, mang nhi ều
đặc tính có khả năng xâm nhập vào tế bào vi khuẩn và m ượn bộ máy t ế bào
vi khuẩn để tạo ra nhiều bản sao khác giống hệt vector ban đầu. sau khi lựa
chọn phù hợp, thực hiện xử lí bằng cắt vector ở một vị trí xác định v ới một
enzym giới hạn, sau đó hai đầu chỗ nối được xử lí để chúng không t ự nối
với nhau trở lại.
- Xử lí DNA cần tạo dòng: hai đầu của đoạn DNA được xử lí phù h ợp v ới 2
đầu chỗ nối cắt của vector.
- Tạo vector tái tổ hợp: vector và DNA cần tạo dòng sẽ được trộn chung theo
một tỉ lệ nhất định với sự hiện diện của ligase, sẽ nối vector và DNA t ạo
thành vector tái tổ hợp.
- Chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào chủ: nhằm sử dụng tế bào chủ sao chép
lượng lớn bản sao vector tái tổ hợp.
- Có 2 loại tế bào chủ thông dụng là: tế bào vi khuẩn (thường là E.coli), t ế bào
eucaryote.
17


- Chọn lọc dòng vi khuẩn có chứa vector tái tổ hợp cần tìm.
10. Phương pháp chuyển AND plasmid vào tế bào vi khuẩn
Plasmid được chuyển vào vi khuẩn E. coli để thu nhận nhiều bản sao sau đó chuy ển
plasmid này vào vi khuẩn A. tumefacient tạo chủng vi khu ẩn mang cấu trúc gen bi ến
nạp. Có 2 phương pháp phổ biến để chuyển gen plasmid vào vi khuẩn:
+ Phương pháp xung điện

+ Phương pháp sốc nhiệt
• Phương pháp xung điện : là phương pháp hiệu quả nhất để chuyển
gen ngoại lai vào tế bào vi khuẩn
- Sử dụng sốc điện để tạo những lỗ trên màng tế bào vi khuẩn. Những lỗ
này phải đủ lớn để phân tử DNA có thể vào trong tế bào.
- Sự hồi phục của vi khuẩn phụ thuộc vào sự tái sắp xếp màng cho phép tế
bào tồn tại sau khi bị sốc nhiệt .
- Sự thành công của phương pháp phụ thuộc vào vi ệc đi ều chỉnh độ mạnh
của điện trường và độ dài xung.
Những thông số được điều chỉnh dựa trên thông số của đi ện tr ường và
điện trở trên máy tạo xung
Độ tạo xung bị ảnh hưởng lớn bởi độ ion của dung dịch chứa DNA vào vi
khuẩn.
• Phương pháp sốc nhiệt : Là phương pháp nhanh và đơn gi ản đ ể
chuyển gen plasmid vào tế bào vi khuẩn
- Phụ thuộc vào sự tổn thương của màng khi bị sốc nhiệt kết hợp v ới s ự
tác động của ion hóa trị 2 dẫn đến sự thay đổi tính lưu động của màng t ế
bào.
- Phương pháp này cho phép tạo 102- 103 tế bào bi ến nạp trên mỗi ug
DNA.
- Phương pháp này thấp hơn phương pháp xung đi ện nhưng nó đ ơn gi ản
hơn không đòi hỏi thiết bị đặc biệt.
11. Ti-plasmid
Ti-plasmid được tìm thấy trong tất cả các dòng A.tumefaciens gây đ ộc. Kích th ước
khoảng 200-800kb, dạng vòng xoắn kép, đóng vai trò quy ết định trong s ự chuy ển
gene của vi khuẩn A.tumefaciens vào tế bào thực vật. Trong Ti-plasmid có 2 vùng
quan trọng là: vùng T-DNA, và vùng gây độc (vir gene).
T-DNA là vùng được chuyển vào tế bào thực vật, kích thước từ 10-30kb. Được gi ới
hạn bởi 2 vùng bờ trái và bờ phải. Các vùng này gồm một trình tự lặp lại của 25bp
là trình tự nhận biết cho việc cắt T-DNA. Mang hai loại gen: thứ nhất là những gen

gây độc mã hóa cho các enzym liên quan đến sự tổng hợp nhiều auxin và cytokinin
dẫn đến sự hình thành khối u ở thực vật; thứ 2 là các gen liên quan đến sự tổng
18


hợp opine được tạo thành từ sự kết hợp giữa amino acid và đường thực vật, chúng
là nguồn cung cấp nitrogen và carbon chuyên biệt cho vi khuẩn.
Vùng gen vir là vùng gồm những trình tự mã hóa cho các protein cần thiết cho sự
tổng hợp, vận chuyển và hợp nhất các vùng T-DNA vào tế bào chủ. Kích thước
khoảng 20-40kb gồm 6 operon quan trọng là VirA, VirB,VirC, VirD, VirE,VirG, và 2
operon khác ít quan trọng hơn là VirF, VirH.
VirA và VirG là 2 vùng quan trọng nhất, có vai trò kích hoạt hoạt động của các vùng
Vir khác, các protein VirA và VirG luôn hiện diện trong tế bào vi khuẩn
• VirA mã hóa cho protein VirA nằm trên màng tế bào vi khuẩn, protein này
nhận biết sự hiện diện của các hợp chất phenol và những phân tử đường
•

do tế bào tổn thương của thực vật tiết ra.
VirG mã hóa cho protein G có vai trò như một yếu tố phiên mã, giúp hoạt
hóa hay gia tăng cho sự phiên mã của gen Vir trên Ti-plasmid giúp cho

•

quá trình biến nạp gen diễn ra.
VirD1 và VirD2 mã hóa cho protein có chức năng nhận bi ết cho đoạn DNA
nằm giữa bờ phải và bờ trái của T-DNA sau đó cắt và tạo đoạn DNA
chuỗi đơn. Protein VirD1 có vai trò hướng đoạn T-DNA mạch đơn vào
nhân, VirD2 gắn vào đầu 5’ bảo vệ nó khỏi bị cắt bởi exonuclease. Khi
vào nhân tế bào thực vật, protein VirD2 giúp T-DNA hòa nhập vào bộ gen

•

tế bào thực vật
VirE2 mã hóa cho protein E2, các protein này liên kết v ới phức h ợp ssTDNA-VirD2 để bảo vệ phức hợp khỏi các nucleasa, đồng thời giúp định

•

hướng và vận chuyển phức hợp vào nhân thực vật
VirB mã hóa cho protein giúp vận chuyển mạch đơn T-DNA ra khỏi màng

tế bào vi khuẩn
12 . Cơ chế chuyển T-DNA từ vi khuẩn A.tumafaciens sang tế bào thực vật
Trong tự nhiên A.tumafaciens chỉ có thể gây bệnh trên các vùng bị tổn thương ở
thực vật, vì khi đó tế bào sẽ tiết ra các hợp chất phenol, một số loại đường đơn
đồng thời làm cho môi trường có tính acid, đây là những tín hiệu giúp hoạt hóa
protein VirA trên màng tế bào vi khuẩn, khởi đầu cho quá trình biến nạp T-DNA
vào tế bào thực vật
Các hợp chất phenol có vai trò quan trọng nhất khi hiện diện ở nòng độ thấp (10 7

M) sẽ giúp thu hút chủng A.tumefaciens gây độc, còn ở nồng độ cao (10-5-10-4M)

giúp hoạt hóa các gen vir thông qua hệ thống VirA/VirG.
T-DNA được loại bỏ các gen gây độc tổng hợp auxin, cytokinin, opine và thay th ế
bởi các gen mong muốn biểu hiện trong thực vật như gen kháng sâu bệnh, chậm
19


chín trái… Đồng thời khi biến nạp với vi khuẩn A.tumefaciens chỉ một số ít tế bào
nhận được sự hòa nhập bền vững gen mong muốn vào bộ gen nhân. Do đó cần
thiết phải cấu trúc thêm các gen chọn lọc và gen chỉ thị trong cấu trúc đồng

chuyển với gen mong muốn trên T-DNA.
Gen chọn lọc sử dung để chọn lọc thể chuyển gen, mã hóa một protein cho phép
những tế bào chuyển gen có khả năng phát triển trên môi trường có những hợp
chất độc với tế bào không chuyển gen. Gen chọn lọc có thể mã hóa 1 enzym gi ải
độc giúp phân hủy tác nhân chọn lọc, hoặc mã hóa cho 1 enzym không hạy c ảm vớ
sự ức chế của tác nhân chọn lọc, enzym này sẽ thay thế cho enzym đã bị biến đổi
trong thể chuyển gen
Những gen chọn lọc thường sử dụng: nptII, hpt, bar…
 Gen bar
Nó được phân lập từ vi khuẩn steptomyces hygroscopicus mã hóa cho
enzym phosphinothricin acetyl transferase có khả năng phosphoryl hóa và
làm mất hoạt tính của phosphinothricin, đây là một loại thuốc diệt cỏ được
bổ sung vào môi trường để sàng lọc thê chuyển gen.
phosphinothricin ức chế enzym glutamine synthetase trong t ế bào thực vật
làm gián đoạn quá trình chuyển hóa amonia dẫn đến tích lũy chất này và
gây độc cho tế bào.
 Gen chỉ thị
Mã hóa sản phẩm thấy được dùng để phát hiện thể chuyển gen
Ví dụ: gus, luc, gfp…

13.

Chuyển gen kháng sâu Bt vào mía
Có 2 nhóm phương pháp chính:
• Phương pháp chuyển gen trực tiếp: dùng súng bắn gen, xung điện, sử
•

dụng hóa chất, vi sợi…
Phương pháp chuyển gen gián tiếp được sử dụng phổ bi ến hơn đó là

sử dụng vi khuẩn A. tumefaciens.
14. Tổng quan về vi khuẩn A. tumefaciens
Phân loại
Giới

: Bacterium

Ngành

: Proteobacteria

Lớp

: Alpha Proteobacteria

Bộ

: Rhizobiales

Họ

: Rhizobiaceae

Loài

: Agrobacterium
20


15. . Độc tố của Bt

Bt là 1 loại thuốc trừ sâu được tạo bởi vi khuẩ Bacillus thuringiensis, là 1 lo ại v
khuẩn Gram dương có khả năng tạo bào tử tồn tại trên nhi ều n ơi: đất, cây, xác
chết sâu bọ… Trong quá trình hình thành bào t ử, Bt t ạo 1 hay nhi ều th ể vùi, b ản
chất là các tinh thể protein có độc đối với nhiều sâu bọ khác nhau.
Cuối những năm 1970, đầu những năm 1980 dựa trên những ứng d ụng c ủa kỹ
thuật sinh học phân tử mới để nghiên cứu Bt người ta ch ứng minh đ ược thu ốc
trừ sâu có độc tính trừ sâu của Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki (HD1) là do
2 loại tinh thể gồm 4 loại protein : Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac, Cry2Aa.
Những gen tạo các tinh thể độc được phân lập và chuy ển vào thực vật, t ừ đó ra
đời những cây trồng Bt có khả năng kháng nhiều loại sâu khác nhau.
16. Các phương pháp sinh học phân tử dùng trong phân tích thể chuyển gen
a. Phương pháp PCR
PCR là phương pháp kiểm tra sự hiện diện của gen bi ến nạp trong cây
chuyển gen, phương pháp này sử dụng những cặp mồi chuyên bi ệt để
tạo ra các sản phẩm có kích thước đặc hiệu, có thể quan sát trên gel đi ện
di dưới tia UV
PCR là phương pháp đơn giản, ít tốn thời gian, tuy nhiên do hi ện t ượng
dương tính giả do nhiễm DNA ngoại lai rất dễ xảy ra.
Nguyên tắc chung
Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng h ợp DNA m ới từ m ạch
khuôn đều cần mồi chuyên biệt. mồi là đoạn DNA ngắn có khẳ năng bắt
cặp chuyên biệt với một đầu của mạch khuôn, DNA polymerase sẽ nói
dài mồi để tạo thành DNA mới.
Quy trình:
Bước 1: giai đoạn biến tính, giai đoạn này cần nhi ệt độ cao hơn
Tm của phân tử, thường là 94oc-96oc trong vòng 30s-1 phút
Bước 2: giai đoạn lai. Nhiệt độ trong khoang 40 oC-70oC, cho phép
các mồi bắt cặp với nhau.
Bước 3:giai đoang kéo dài mạch DNA. Nhiệt độ là 72 oC. thời gian
tùy thuộc vào độ dài trình tự cần khuếch đại, thường t ừ 30snhiều phút.

Đây là sự khuếch đại theo cấp số nhân, sau 30 chu kì sẽ có
106 so với số lượng bản mẫu ban đầu.
b. Kiểm tra sự biểu hiện của protein tái tổ hợp bằng que thử nhanh
Phương pháp que thử nhanh, là một thử nghiệm miễn dịch dựa trên sự
gắn kết đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, phản ứng gi ữa kháng
nguyên và kháng thể xảy ra trên màng nitrocellulose k ỵ n ước hoặc màng
cellulose acetate.
21


Cấu trúc của que thử nhanh thông thường:
1. Sample pad- nơi nạp mẫu.
2. Conjugate pad- nơi chứa các kháng thể đặc trưng v ới mục tiêu, có gắn
với các chất phát màu.
3. Reaction membrane- nơi xảy ra phản ứng kháng nguyên kháng thể
4. Wick pad: vùng có tính hút nước để kéo mẫu qua vùng ph ản ứng
bằng lực mao dẫn.
Nguyên tắc:
• Mẫu nạp vào vùng nạp mẫu, lực mao dẫn sẽ hút dung d ịch ch ứa mẫu
•

qua vùng conjugate pad.
Tại đây, nếu mẫu chứa phân tử đích thì phân tử đích sẽ gắn với

•

kháng thể
Dung dịch chứa thành phần trên sẽ đi qua vùng ph ản ứng, t ại v ạch

•

test line (có chứa kháng thể) sẽ gắn với phân tử đích (nếu có),
Còn ở vạch control line kháng thể sẽ bắt gi ữ kháng thể c ủa vùng

•

conjugate pad
Kết quả: nếu có phân tử đích thì 2 vạch đều phát sáng, ngược lại thì
chỉ có vạch control line phát màu.

22


III.

Vật liệu

Giống mía VN84-4137 được cung cấp bởi Trung tâm Nghiên c ứu và Phát tri ển Mía
Đường, xã Phú An, huyện Bến Cát, tỉnh Bình Dương .
Hai chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang vector plasmid dùng đ ể
chuyển gen như sau:
+ Plasmid pCRY1B-1Ab có kích thước khoảng 17kb, vùng T-DNA mang cấu
trúc biểu hiện gen kháng sâu Pubi/cry1B-cry1Ab/Tnos (cry1B-cry1Ab: gen lai tổng hợp) và cấu trúc biểu hiện gen kháng PPT dùng để chọn l ọc
P70S/bar/V35S.
+ Plasmid pCAMBIA3301-cry1Ab, đã được biến nạp và gi ữ trong E. coli, có
kích thước 15,6kb, vùng T-DNA mang cấu trúc bi ểu hi ện gen kháng sâu Pubi1/cry1Ab/Tnos và cấu trúc biểu hiện gen kháng PPT dùng để chọn lọc
P35S/bar/V35S.
3.1 Môi trường
Môi trường nuôi cấy thực vật bao gồm các thành phần đ ược phối hợp
cụ thể theo các mục đích nuôi cấy khác nhau như sau: các khoáng của

môi trường MS (Murashige-Skoog, 1962); các vitamin của môi trường MS
hoặc B5 (Gamborg, 1968); casein 0,5 g/l; đường succrose 30 g/l; agar 10
g/l; chất điều hòa sinh trưởng 6- Benzyladenine (BA), α-Naphthalene acetic
acid (NAA) và 2,4-dichlorophenoxy acetic acid (2,4- D). pH của môi trường
được điều chỉnh ở 5,8.
3.1.1Môi trường nuôi cấy vi khuẩn
Môi trường LB dùng nuôi cấy và giữ giống E.coli và Agrobacterium tumefaciens.
Môi trường AB dùng để chuyển gen.
Môi trường nuôi cấy thực vật: khoáng cơ bản MS, Vitamin MS, vitamin B 5 ,
casein, đường 30g/l, pH 5,8, agar 9 g/l. Chất đi ều hòa sinh tr ưởng BA, NAA, 2,4D.
3.1.2 Các hóa chất khác:
- Khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin MS trong môi tr ường c ấy mô: theo công
thức của Murashige và skoog, 1962.
- Vitamin B5: theo công thức của Gamborg, 1968.
- Chất điều hòa sinh trưởng thực vật :
23


+ Nhóm Auxin: NAA (1- Naphthaleneacetic acid), 2,4-D ( 2,4 Dichlorophenoxyacetic acid).
+ Nhóm Cytokinin: BAP ( 6- Benzylaminopurine).
-

Tách chiết DNA từ thực vật:
NaCl 5M
Tris HCl 1M
EDTA 0.5M
Isopropanol
Phenol/ Chloroform 1:1

-

β Mercaptoethanol
SDS 10%
Potassium acetate
RNAse
Ethanol 80%

Trong phản ứng PCR:
+ dNTPs (ATP, CTP, GTP, TTP)
+ Dung dịch đệm PCR 10X (100 mM Tris –HCl, pH 8,3 at 25 0 C; 500 mM
+
+
+
+

KCl; 15 mM MgCl2 ; 0,01% gelatin)
Mồi xuôi (Primer F) và mồi ngược (primer R)
Mẫu DNA thực vật
Taq Polymerase.
Nước cất vô trùng

- Hóa mô GUS:
+ Dung dịch stock X- gluc 0,02M: 70 mg X-gluc, 2ml DMSO; 8ml n ước c ất
vô trùng.
+ Dung dịch X-gluc nhuộm mẫu: 5ml stock X-gluc, 10ml dung d ịch đ ệm
Na2HPO4 (pH 7), 4ml EDTA 0,25 M( pH 7), 1ml triton –X 100 10%.
Điện di trên gel agarose:
+ Agarose
+ Ethidium bromide 10 mg/ml.
+ Dung dịch đệm TAE ( 10X stock) tris base 242 g/l, glacial acetic acid

57,1 ml, EDTA 0,5M pH 8 100ml, nước lên thể tích 1 lít.
- Trong thí nghiệm chuyển gen:
+ Phosphinothricin (PPT): pha trong nước cất, lọc vô trùng, n ồng độ
stock 2,5 mg/ml dùng để chọn lọc đối gen bar.
+ Kanamycin: nồng độ stock 10mg/ml, pha trong nước cất, l ọc vô trùng.
Sử dụng cho chọn lọc vi khuẩn A. tumefaciens mang plasmid chuyển
gen.
+ Rifamicin: stock 10mg/ml , pha trong nước cất và lọc vô trùng. S ử
dụng cho chọn lọc vi khuẩn A. tumefaciens mang hepler plasmid.
+ Acetosyringone: 2mg/ml hòa tan trong cồn, thêm nước cất, l ọc vô
trùng.

24


+ Cefotaxime: 500 mg/ml pha trong nước cất , lọc vô trùng, dùng di ệt
khuẩn.
- Ly trích Protein từ lá:
Hepes/ KOH pH 7,5 : 50 mM.
EDTA 1 Mm
Potassium acetate: 10mM.
Magnessium acetate: 5mM
β- mercaptoethanol: 30 mM.
PMSF: 2mM.
Thử nghiệm tính kháng thuốc diệt cỏ của cây chuyển gen:
Thuốc diệt cỏ Basta: có thành phần DL- Phosphinothricin ( glufosinate
ammonium) 200 g/l.
IV. Phương pháp
Nội dung 1: Xây dựng hệ thống tái sinh cây con hoàn chỉnh invitro từ mô s ẹo
của giống mía VN

Các thí nghiệm được bố trí theo một trình tự nhất định t ừ kh ảo sát t ạo mô
sẹo đến tái sinh và tạo rễ.
1.1. Khảo sát ảnh hưởng của 2,4- D lên quá trình t ạo mô sẹo từ lá non
Mục tiêu: Xác định nồng độ 2,4- D thích hợp nhất đ ể c ảm ứng t ạo mô
sẹo từ lá mía non, nhằm tạo nguồn vật liệu cho thí nghiệm chuyển gen.
Phương pháp thực hiện:
- Cách khử trùng mẫu cấy: cây mía trồng ngoài vườn ươm khoảng 3 tháng
tuổi được cắt lấy phần ngọn làm nguồn vật liệu vô mẫu. Ngọn mía đ ược
tách bỏ những lớp lá xanh bên ngoài và cắt thành những đoạn ngắn, gi ữ l ại
phần non. Các đoạn mía khử trùng bằng cồn 70 %, phần lõi bên trong c ắt
thành mảnh lá có kích thước 1x 0,5 cm và đặt lên môi trường.
- Môi trường nuôi cấy gồm: Khoáng đa lượng MS, Vi l ượng MS , casein 0,5g/l,
đường 30g/l, agar 10g/l, bổ sung 2,4-D với nồng độ như sau: 0; 1;2;3;4 mg/l.
- Có 5 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức gồm 10 mẫu trên đĩa petri ch ứa 50 ml
môi trường, lặp lại 3 lần.
- Điều kiện nuôi cấy: mẫu được nuôi ở điều kiện tối, nhi ệt độ 26± 2 0C cấy
chuyền sang môi trường mới 2 tuần/ lần.
- Chỉ tiêu theo dõi: tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo, màu sắc, trạng thái.
1.2 Khảo sát môi trường tái sinh:
Mục tiêu: xác định nồng độ chất điều hòa tăng tr ưởng BAP và NAA đ ể kích
thích quá trình tái sinh chồi invitro từ mô sẹo mía:
Phương pháp thực hiện:
Mô sẹo được tái sinh chồi trên môi trường MS có bổ sung vitamin B 5 và chất
điều hòa sinh trưởng theo bảng sau:
Môi trường
TS0
Nồng
độ 0

TS1

0,2

TS2
0,5

TS3
1

TS4
0,2

TS5
0,5

TS6
1

NAA( mg/l)
25