Tìm hiểu quy trình xét ngiệm viêm gan b bằng phương pháp ELISA

Tìm hiểu quy trình xét ngiệm viêm gan B bằng phương pháp ELISA

CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN VỀ BỆNH VIÊM GAN SIÊU VI B
1. Hepatitis B virus :
1.1 Lịch sử trong việc phát hiện virus viêm gan B :
Hepatitis B virus ( HBV ) là nguyên nhân gây ra bệnh viêm gan B.
Năm 1963 Blumberg đã phát hiện ra kháng nguyên Autralia
Năm 1967, phát hiện sự liên quan của kháng nguyên này trong viêm gan
kiểu B.
Năm 1970, phát hiện được hạt virus tòan vẹn ( virion và hạt Dane ).
Năm 1979, nhân dòng HBV DNA và xác định chuỗi mã nuclêiotid DNA
tòan phần.
Năm 1983, khuếch đại DNA virus bằng phương pháp PCR do Mullis
phát minh.
1.2 Phân loại Hepatitis B virus:
HBV là một lọai siêu vi DNA thuộc họ Hepadna – viridae .Tất cả thành
viên của họ Hepadnaviridae là các virus hướng gan và có bộ gen mạch kép.
Ngày nay, người ta biết gia đình của những virus giống virus viêm gan B
thuộc họ Hepadaeviridae gồm :
Virus viêm gan B người (human hepatitis B virus) : HBV

Bs: Hoàng Xuân Thế

1


Tìm hiểu quy trình xét ngiệm viêm gan B bằng phương pháp ELISA

Virus viêm gan Macmot - Sóc (Woochuck hepatitis virus) : WBV
Virus viêm gan B Vịt (Duck hepatitis B virus) : DHBV
HBV chỉ gây nhiễm cho loài linh trưởng bậc cao như hắc tinh tinh và

vượn. WHV không gây nhiễm cho các loaị gậm nhấm khác. DHBV có thể
gây nhiễm tự nhiên trong một số bầy vịt nuôi và đã được nhiễm truyền thưc
nghiệm vào ngỗng thành công.
1.2 Cấu trúc của HBV:
Virus nguyên vẹn (virion) có hình cầu hoặc hình sợi, đường kính 42
nm, virion hiệh rõ một cấu trúc hai vỏ:
Vỏ protein bên ngòai ( màng bao ) được tạo thành bởi các protein bề
mặt (HBsAg).
Vỏ protein bên trong là hạt lõi ( HBcAg) có đường kính 34 nm.Muốn
phát hiện kháng nguyên này phải phá vỡ hạt virus bằng dung môi lipit.
Kháng nguyên này thấy khi làm sinh thiết gan. Trong một số loại kháng
nguyên HBcAg còn có một loại kháng nguyên hòa tan có nguồn gốc từ
nuclêocapsid còn gọi là HBeAg.

Bs: Hoàng Xuân Thế

2


Tìm hiểu quy trình xét ngiệm viêm gan B bằng phương pháp ELISA

Hình 1 : Cấu trúc của HBV
1.2.1 Cấu trúc HBs:
là kháng nguyên bề mặt của HBV lưu hành trong huyết thanh người
nhiễm virus. Đa số là các hạt hình cầu đường kính 17 – 25 nm, thường có số
lượng khoảng 1013/ml. Các hạt hình sợi hoặc hình ống ít hơn, đường kính
thay đổi, có nồng độ khoảng 1011/ml hoặc 1µ/ml. Các sợi HBs chứa 3
polipeptid khác nhau : protein lớn nhất ( LHBs ), protein trung bình ( MHBs
), protein nhỏ ( SHBs ).SHBs là thành phần nhiều nhất trong tất cả 3 hạt
protein vỏ của HBV và MHBs ít nhất.

1.2.2 Cấu trúc HBc :
HBcAg là một protein được tổng hợp trong dịch bào tan tạo thành một
dimmer ổn định khi còn ở nồng độ thấp.

Bs: Hoàng Xuân Thế

3


Tìm hiểu quy trình xét ngiệm viêm gan B bằng phương pháp ELISA

Các HBc bao bộ gen HBV DNA dài 3.2kb qua đó men primerase ( pr )
của DNA polymerase gắn kết đồng hóa trị, protein kinase C và protein sốc
nhiệt hcs90 cũng được bao.
1.3.3 Cấu trúc của HBe :
Tất cả hepadnavirus đều có một dạng protein HBc bài tiết được gọi là
HBeAg (e : enigma ). Các hepadnavirus tạo HBeAg bằng phần đầu tận 5’
của khung đọc mở lõi, gọi là chuỗi mã tiền lõi. Chuỗi mã tiền lõi mã hoá
một vòng xoắn kỵ nước, là một tín hiệu bài tiết và giúp chuyển vị protein
HBe vào trong khoang lưới nội bào tương. Đột biến vùng tiền lõi sẽ không
sản xuất được HBeAg.
2. Bệnh viêm gan B:
2.1 Lịch sử phát triển viêm gan B trên thế giới :
Trên thế giới hàng năm có hơn 50 triệu người nhiễm HBV mới vf khảng
1 triệu người chết liên quan đsên các tác động của bệnh này. Trên thế giới,
HBV được chia làm 3 vùng dịch, ước tính có 45% dân số sống trong vùng
dịch địa phương cao, 43% dân số sống trong vùng dịch địa phương trung
bình, 12% dân số sống trong vùng dịch địa phương thấp. Hiện nay, do dân
số tăng nhanh, đến cuối năm 2000, số người mang HBV mạn được ước tính
khỏang 400 triệu người ( độ 5% dân số tòan cầu ). Phân bố tần suất nhiễm

HBV trên thế giới không đòng đều và được xếp loại từ dịch địa phương rất
cao ở trẻ em trong hầu hết các nước đang phát triển đến dịch địa phương

Bs: Hoàng Xuân Thế

4


Tìm hiểu quy trình xét ngiệm viêm gan B bằng phương pháp ELISA

thấp ở các nước phát triển, chủ yếu người lớn và một số yếu tố nguy cơ như
cách sống, chăm sóc y tế,…..
2.2 Dịch tễ học của nhiễm HBV :
2.2.1 Vùng dịch HBV địa phương cao :
Trong vùng dịch địa phương cao có 7 – 20% người nhiễm HBV mạn và
trong huyết thanh của đa số người lớn đã chứng tỏ có nhiễm virus trước đó.
Những vùng này gồm đa số các nước Châu Á, trong đó có Viêt Nam ( trừ
Nhật và Ấn Độ ), Châu Phi, hầu hết vùng Trung Đông, vùng châu thổ
Amazon Nam Mỹ, hầu hết các nhóm quần đảo Thái Bình Dương và một số
sắc dân địa phương khác như đan Ết – Ki – mô, thổ dân Châu Úc và dân
Maori.
Trong một số vùng dịch địa phương cao, tỉ lệ người mang HBV có thể từ
8% đến 25% và tần suất anti – HBs từ 60% đến 85%. ở vùng địa phương
cao, đa số nhiễm virus xảy ra ở trẻ em dưới 1 tuổi và trẻ nhỏ, và chỉ một ít
nhiễm ở tuổi lớn. Sự truyền nhiễm HBV thường xảy ra trong thời kỳ chu
sinh ( truyền nhiễm theo chiều dọc ) từ người mẹ nhiễm virus mạn đến con
cái, hoặc trong thời kỳ sau sinh ( truyền nhiễm theo chiều ngang ) từ người
mẹ bị nhiễm virus, anh chị em hoặc những cá nhân nhiễm virus mạn khác
trong hoặc ngoài gia đình. Những trẻ này còn khả năng nhiễm virus khi đến
tuổi trưởng thànhdo họat động tình dục.

2.2.2 Vùng dịch HBV địa phương trung bình :

Bs: Hoàng Xuân Thế

5


Tìm hiểu quy trình xét ngiệm viêm gan B bằng phương pháp ELISA

Trong vùng dịch địa phương trung bình, tàn suất của người nhiễm
HBsAg mạn từ 2 – 7% và 20 – 50% người lớn đã từng nhiễm HBV. Những
vùng này gồm Ấn Độ, một phần trung đông, và Nam Mỹ. Cách truyền bệnh
phức tạp hơn và truyền nhiễm xảy ra ở tất cả các nhóm tuổi ( trẻ sơ sinh, trẻ
em và người lớn ), nhưng thời kỳ nhiễm bệnh chủ yếu có lẽ xảy ra ở trẻ nhỏ,
tuổi thiếu niên và thanh niên. Trong các vùng này, nguy cơ cuộc sống trung
bình của những người nhiễm HBV được ước tính từ 20 – 60%. Những vùng
này bao gồm 43% dân số tòan cầu.
2.2.3 Vùng dịch HBV địa phương thấp :
Tần suất người mang HBV mạn dưới 2% và tần suất người lớn đã từng
nhiễm virus dưới 20%. Những vùng này bao gồm Mỹ, Canada, Tây Âu, Úc,
New Zealand. Nhiễm bệnh chủ yếu ở người lớn. Tuy nhiên, sự truyền bệnh
xảy ra thời kỳ chu sinh và thời thơ ấu cũng góp phần quan trong vào tần suất
người nhiễm HBV mạn.
Tại Tây Âu, tỷ lệ mới mắc hàng năm của viêm gan B cấp khỏang 5 trong
100 000 người. Tần suất của HBsAg có biên độ từ dưới 0.1% ở Bắc Âu và
từ 1 – 5% ở Nam Châu Âu.

Bs: Hoàng Xuân Thế

6


Tìm hiểu quy trình xét ngiệm viêm gan B bằng phương pháp ELISA

Hình 2 : Sơ đồ dịch tễ của HBsAg

2.3 Cách truyền và đường truyền nhiễm HBV :
2.3.1 Máu hoặc dịch cơ thể nhiễm HBV :
Truyền nhiễm virus chủ yếu là từ máu hoặc từ huyết thanh của những
người nhiễm HBV. Định lượng nồng độ HBV – DNA cho thấy độ 1010/ml ở
người HBeAg (+) và 101 – 107 ở người anti – Hbe (+). Dịch cơ thể có nguồn
gốc từ máu, như dịch màng phổi, màng bụng, chứa virus cao như nồng độ
virus trong máu. Tinh dịch và nước bọt cũng chứa HBV, nhưng nồng độ 10 3
lần thấp hơn trong huyết thanh. HBsAg và HBV – DNA được phát hiện ít

Bs: Hoàng Xuân Thế

7


Tìm hiểu quy trình xét ngiệm viêm gan B bằng phương pháp ELISA

hơn ở nước tiểu, phân và sữa, trừ khi các dịch này bị nhiễm máu. Nồng độ
virus thấp trong các dịch cơ thể cho thấy khả năng nhiễm bệnh thấp, trừ khi
tiếp xúc nhiều lần.
2.3.2 Lây nhiễm HBV qua tiếp xúc tình dục :
Tần suất nhiễm HBV ở người đồng tính rất cao, các yếu tố nguy cơ lớn
nhất gồm có giao hợp qua đường hậu môn và số lượng nhiều bạn tình, các
bệnh khác gây tổn thương hậu môn hoặc tổn thương niêm mạc. Những

người hành nghề mại dâm, nguy cơ nhiễm HBV thường tỉ lệ với số lường
người bạn tình và với tình trạng nhiễm giang mai. Các vết loét giang mai
giúp nhiễm hiệu quả hơn. HBV có thể là dấu ấn đại diện cho những bệnh
loét đường sinh dục mạn tính khác.
2.3.3 Truyền nhiễm HBV chu sinh :
Truyền nhiễm chu sinh từ người mẹ mang HBsAg mạn và người mẹ
viêm gan B cấp 3 trong tháng cuối của thai kỳ, hoăc 2 tháng đầu sau khi
sanh. Trẻ sinh ra từ người mẹ có HBsAg (+), HBeAg (+) có khảng 90%
nguy cơ nhễm HBV trong 9 tháng sau khi sanh và 90% trong số đó thành
người mang HBV.

2.4 Các đường truyền nhiễm HBV khác:
2.4.1 Vai trò của nước bọt trong truyền nhiễm HBV :

Bs: Hoàng Xuân Thế

8


Tìm hiểu quy trình xét ngiệm viêm gan B bằng phương pháp ELISA

Nước bọt có thể gây nhiễm nếu có máu nhiễm HBV, nhưng không
truyền nhiễm khi nước bọt nhiễm HBV được khí dung vào mũi, khi uống
nước, hay khi dùng bàn chải răng nhiễm HBV. Truyền nhiễm cũng có thể
qua vết cắn hay cùng nhai kẹo cao su. Hôn hít không truyền nhiễm HBv có ý
nghĩa, nhưng vẫn có thể truyền nhiễm khi bị cắn.
2.4.2 Vai trò của tinh dịch và dịch tiết âm đạo trong truyền nhiễm HBV:
Tinh dịch và tiết âm đạo, chứa một nồng độ virus giống với nồng độ
trong nước bọt, giữ một vai trò quan trọng trong nhiễm HBV.
2.4.3 Đường lây nhiễm HBV qua da :

Tai nạn kim tiêm làm truyền HBV qua da trực tiếp có thể xảy ra với kim
nhiễm máu, thảm thách máu,… Những vất liệu tíếp xúc với da hở, hoặc
màng niêm như mắt cũng có thể được xem lây nhiễm virus. Vì HBV khá ổn
định, sự truyền nhiễm qua các bề mặt môi trường tiếp xúc với màng niêm
mạc hoặc da bị tổn thương như kem đánh răng, chai sữa, đồ chơi, các dụng
cụ ăn, máy hô hấp nhân tạo, nội soi có thể xảy ra.
2.4.4 Côn trùng và truyền nhiễm HBV :
Vai trò của côn trùn trong truyền nhiễm HBV đã được nghĩ đến do dịch
tễ học của viêm gan B thường phân bố ở những nước nhiệt đới nghèo trùng
với sự phát triển của côn trùng. Truyền nhiễm HBV do côn trùng, nếu xảy
ra, do hai cách sau :
Truyền nhiễm chủ động :

Bs: Hoàng Xuân Thế

9


Tìm hiểu quy trình xét ngiệm viêm gan B bằng phương pháp ELISA

Khi virus sao chép trong côn trùng và truyền nhiễm qua qua vết cắn.
Tuy nhiên virus chỉ sao chép ở nhười và lòai linh trưởng lớn, không sao
chép ở côn trùng.
Truyền nhiễm thụ động :
Truyền nhiễm cơ học do HBV chuyển từ ruột lên miệng của côn trùng.
Cách truyền nhiễm này hiện chưa có bằng chứng. Nếu có cũng không hiệu
quả.
2.4.5 Nhiễm HBV trong bệnh viện :
Nhân viên chăm sóc sức khỏe có nguy cơ nhiễm hơn cộng đòng chung :
do phơi nhiễm thường xuyên với bệnh nhân nhiễm virus. Nhân viên y tế có

thể nhiễm HBV từ 2 đến 10 lần so với cộng đồng theo chứng minh của
Hadler
2.4.6 Truyền nhiễm HBV giữa anh em trong nhà :
Truyền nhiễm HBv giữa anh em trong nhà có thể xảy ra qua các tổn
thương da như chàm, chốc lở tiếp xúc với vật nhiễm máu như bàn chải đánh
răng, dao cạo râu,…
1. Diễn tiến tự nhiên của bệnh viêm gan siêu vi B :

Bs: Hoàng Xuân Thế

10


Tìm hiểu quy trình xét ngiệm viêm gan B bằng phương pháp ELISA

Xâm nhập cơ thể
Gây viêm cấp tính
Hoàn toàn hết bệnh
Gây viêm cấp tính

Mang siêu vi trong cơ thể
Viêm gan mạn thể tiềm ẩn

Viêm gan mạn thể hoạt động
Xơ gan
Chai gan
Ung thư gan

Hình 3 : Sơ đồ diễn tiến của virus viêm gan B
Sau khi xâm nhập vào cơ thể, siêu vi B gây ra những triệu chứng viêm

gan cấp tính. Những triệu chứng thay đổi khác nhau tùy theo độ tuổi của
người mắc bệnh.

Bs: Hoàng Xuân Thế

11


Tìm hiểu quy trình xét ngiệm viêm gan B bằng phương pháp ELISA

Bệnh có thể là rất nhẹ, như những cơn cảm cúm thông thường không
đáng kể, nhưng cũng có thể rất nặng, phải đươc theo dõi điều trị tại bệnh
viện.
Khi còn ít tuổi, cẳng hạn như trẻ em, hoặc các bé sơ sin, nếu bị nhiễm
bệnh thì những triệu chứng bệnh thường nhẹ nhiều so với người lớn. Tuy
nhiên, những trường hợp như vậy lại có nhiều nguy cơ chuyển sang mạn
tính.
Ngược lại, với những bệnh nhân lớn tuổi thì thường nặng nề hơn.
Nhưng đồng thời, nhờ có hệ miễn dịch hòan chỉnh hơn, bệnh nhân lón tuổi
thường vượt qua hẳn cơn bệnh mà không để lại di chứng gì. Có ít nhất 90%
bệnh nhân lớn tuổi sẽ hòan tòan hết bệnh.
Có thể mô tả hiện tương trên theo một cách cụ thể hơn. Nếu phản ứng
của cơ thể với siêu vi B càng mạnh mẽ, gay ra nhiều triệu chứng nặng thì
khả năng chiến thắng hòan tòan đối với căn bệnh này cao hơn. Ngược
lại,nếu phản ứng của cơ thể càng nhẹ nhàng, cho phép chúng tồn tại lâu
trong cơ thể, và do đó chuyển sang bệnh mạn tính.
Khi chuyển sang giai đoạn mạn tính, người bệnhcó thể chỉ mang siêu vi
ở dạng “ ngủ yên ”. Trạng thái này có thể kéo dài suốt đời, được gọi là người
lành mang siêu vi. Nhưng cũng có một số ít trường hợp có nguy cơ tái phát
trở lại. Một số bệnh nhân khác kéo dài căn bênh mạn tính và chuyển sang bị

xơ gan, chai gan, thậm chí có thể tiến đến ung thư gan.

Bs: Hoàng Xuân Thế

12


Tìm hiểu quy trình xét ngiệm viêm gan B bằng phương pháp ELISA

Diễn tiến của bệnh viêm gan siêu vi B phụ thuộc vào thể trạng của từng
bệnh nhân.

Hình 4 : Chu trình xâm nhập của virus viêm gan siêu vi B
4. Biểu hiện lâm sàng của bệnh viêm gan B :
4.1 Viêm gan B cấp tính :

Bs: Hoàng Xuân Thế

13


Tìm hiểu quy trình xét ngiệm viêm gan B bằng phương pháp ELISA

Sau khi xâm nhập vào cơ thể, siêu vi B sẽ tiến thẳng vào từng tế bào để
tíep tục sinh trưởng. Thời kỳ đầu, cơ thể chưa có bất cứ một phản ứng nào
trước sự xâm nhập của siêu vi, và chúng cũng chưa gây ra tác hại gì, được
gọi là thời kỳ ủ bệnh ( incunation period ). Tùy theo từng trường hợp cụ thể,
thời kỳ này có thể kéo dài từ 1 đến 4 tháng hoặc hơn nữa, trung bình là 2 đến
3 tháng. Khi lượng siêu vi xâm nhập cơ thể càng nhiều thì thời kỳ ủ bệnh
càng rút ngắn hơn, chẳng hạn như người bệnh được tiếp máu có nhiễm siêu

vi.
Trong trường hợp viêm gan siêu vi B dược gọi là lành tính, người bệnh
có rất ít triệu chứng, hoặc có những biểu hiện tương tự như một trường hợp
cảm thông thường,.. Sau đó bệnh dần dần dứt hẳn mà không cần điều trị. Vì
thế co rát nhiều người bị mắc bệnh và khỏi bệnh mà không hay biết, chỉ khi
nào có tiến hành xét nghiệm máu mới biết được. Hơn 50% người bị nhiễm
siêu vi B rơi vào trường hợp này.
Trong những trường hợp nặng nề hơn, bệnh nhân thường là đang khỏe
mạnh bỗng nhiên cảm thấy mệt mỏi, đau nhức tứ chi, cơ thể khó chịu, hơi
nóng sốt, mất sức, miệng nhạt đắng, buồn nôn, ăn mất ngon. Một số bệnh
nhân cảm thấy đau bụng ở phần trên , dưới xương sườn phải. Những triệu
chứng này có thể cùng xuất hiện, hoặc thay đổi ít nhiều theo từng trường
hợp bệnh. Một khi da trở nên vàng hoặc trở nên đậm màu, những triệu
chứng ba đầu sẽ giảm dần một cách nhanh chóng. Lúc này bệnh nhân cảm
thấy rất khỏe khoắn mặc dù da vẫn trở nên ngày một vàng hơn. Trạng thái
này thường kéo dài từ 1 đến 3 tháng. Theo ước tính có khỏang 40% người
nhiễm siêu vi B rơi vào trường hợp này.

Bs: Hoàng Xuân Thế

14


Tìm hiểu quy trình xét ngiệm viêm gan B bằng phương pháp ELISA

Nói tóm lại, mặc dù có thể có những triệu chứng bệnh nặng, nhẹ khác
nhau hoặc thậm chí không bộc lộ triệu chứng, nhưng nhình chung có đến
khỏang 90% bệnh nhân mắc bệnh viêm gan siêu vi B sẽ tự nhiên khỏi bệnh
mà không cần điều trị gì. Trong trường hợp này, người bệnh sau đó đều có
khả năng miễn nhiễm đối với siêu vi B cho đến suốt đời.

Trong số khỏang 10% số người mắc bệnh viêm gan siêu vi B kém may
mắn hơn còn lại, sẽ có thể rơi vào một trong các khả năng diễn tiến bệnh sau
đây:
Một số trường hợp bệnh có thể kéo dài qua nhiều năm, người cảm thấy
mệt mỏi và thường xuyên chịu đựng các triệu chứng của căn bênh trở thành
mạn tính.
Khỏang từ 0.1% đến 0.5% bệnh nhân có thể rơi vào trường hợp viêm
gan ác tính (fulminant hepatitis ), một tính trạng vô cùng nguy hiểm , còn
gọi là viêm gan tối cấp. Khỏang 80% số bệnh nhân viêm gan ác tính sẽ đi
đến tử vong nếu không được áp dụng kỹ thuật ghép gan (liver
transplantation ).
Nói tóm lại, sau khi qua khỏi giai đoạn viêm gan cấp tính do siêu vi B
gây ra, người bệnh có thể sẽ rơi vào một trong ba trường hợp :
Hòan tòan khỏi bênh
Khỏi bênh nhưng vẫn tiếp tục mang siêu vi trong cơ thể.
Chuyển sang viêm gan mạn tính.

Bs: Hoàng Xuân Thế

15


Tìm hiểu quy trình xét ngiệm viêm gan B bằng phương pháp ELISA

4.2 Viêm gan siêu vi mạn tính :
Khi cơ thể bị siêu vi B xâm nhập, phản ứng thông thường sẽ là sự nỗ lực
chống lại và tiêu diệt siêu vi. Mối tương quan giữa số lượng, khả năng tăng
trưởng của siêu vi với sự chống trả của hệ thống miễn nhiễm cơ thể sẽ quyết
định cán cân thắng bại.
Trong cuộc chiến đấu tự vệ, cơ thể sẽ tạo ra chất kháng thể chống siêu

vi B và huy động cả một hệ thống dây chuyền các bộ phận liên quan để tìm
cách loại trừ siêu vi này. Có thể nói, bênh nhân càng trẻ tuổi thì càng dễ
chuyển sang viêm gan B mạn tính. Điều may mắn là những người bị bệnh
viêm gan mạn tính không phải bao giờ cũng sẽ phát triển thành xơ gan (liver
fiborosis ) và chai gan. Nhìn chung, là những người bệnh càng lớn sẽ càng
có nguy cơ bị ung thư gan hơn so với người trẻ tuổi. Với độ tuổi từ 60 đến
69 tuổi, trong 100 người bệnh, sau 10 năm sẽ có khỏang 13 người bị ung
thư.
Thường thì trong giai đoạn đầu tiên của bệnh viêm gan mạn tính bệnh
nhân không
Có biểu hiện triệu chứng nào đáng kể. Trong thời gian này, siêu vi B
đang củng cố và tăng cường lực lượng. Chúng thường chỉ dùng các tế bào
viêm gan như những phương tiện và công cụ để tiếp tục tăng trưởng. Vì thế,
chỉ sau một thời gian ngắn, cơ thể bệnh nhân bắt đầu chứa đến hàng tỷ siêu
vi B. Nhưng ngay cả đến lúc ấy, vẫn hòan tòan chưa có một triệu chứng nào,
hoặc nếu có cũng chỉ rất mờ nhạt khó nhận biết. Ngay cả nếu như mang các
tế bào gan ra xét nghiệm dưới kính hiển vi, chúng cũng không có dấu hiệu bị

Bs: Hoàng Xuân Thế

16


Tìm hiểu quy trình xét ngiệm viêm gan B bằng phương pháp ELISA

sưng viêm hay tổn thương. Thời gian sinh trưởng này vẫn tiếp tục kéo dài
để chuẩn bị cho một cuộc tàn phá lá gan trong tương lai.
Thường thì thời gian âm ỉ này kéo dài, có thể là từ 15 đến 35 năm. Sau
đó, bệnh chuyển sang một giai đọan mới. Vào lúc này hệ thống miễn dịch ồ
ạt tấn công vào các tế bào gan nhiễm siêu vi và tiêu hủy đi hàng loạt các tế

bào này.
Ngoài những triệu chứng như vàng da, buồn nôn, mệt mỏi, đau bụng,…
Siêu vi B cũng có thể gây ra các triệu chứng do hiện tượng phức thể miễn
nhiễm. Bệnh nhân có thể sốt, nóng nhẹ, nổi ngứa, đau nhức khớp xương,
hoặc viêm những tĩnh mạch nhỏ, dẫn đến làm đau khớp và gây bệnh tật cho
nhiều hệ thống, cơ quan khác như tim, phổi, thận, hệ thống tiêu hóa, hệ thần
kinh và bắp thịt. Tuy nhiên những trường hơp ghê gớm này rất hiếm khi xảy
ra.
Trong trường hợp mà cơ thể đủ khả năng để kéo dài cuộc chiến đấu, gan
cũng sẽ bị chai đi và nguy cơ gây ung thư gia tăng nhanh. Bênh nhân càng
lớn tuổi thì nguy cơ bị ung thư gan càng cao hơn.

Bs: Hoàng Xuân Thế

17


Tìm hiểu quy trình xét ngiệm viêm gan B bằng phương pháp ELISA

CHƯƠNG II : ĐẠI CƯƠNG VỀ MIỄN DỊCH VÀ PHƯƠNG PHÁP
ELISA ( ENZIME LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY )
1. Các khái niệm trong miễn dịch :
1.1 Kháng nguyên (antigen) :
Tất cả những chất tự nhiên hoặc tổng hợp, được hệ thống miễn dịch nhận
biết được gọi là kháng nguyên.
1.2 Kháng thể (Immuno globin – Ig ) :
Là những nhân tố cơ thể tổng hợp ra dưới sự kích thích của kháng nguyên.
Mỗi kháng thể chỉ phản ứng đặc hiệu được với một kháng nguyên tương
ứng.
Kháng thể được hình thành từ 4 chuỗi polypeptit : 2 chuỗi nặng ( kí hiệu

H: heavy chain ), 2 chuỗi nhẹ ( L: light chain ). Thành phần chủ yếu gồm các
axit amin được định hình nhờ các cầu nối disulfur nội chuỗi và giữa hai
chuỗi năng và nhẹ.
Các Ig :
IgG : là một globulin miễn dịch có số lượng lớn nhất tỏng huyết thanh
của người. Nồng độ trung bình trong huyết thanh của người khỏe trưởng
thành : 10 – 14g/l. Phân tử IgG ở dạng monomer và bao gồm 4 lớp phụ IgG1,
IgG2, IgG3, IgG4. Trong đó IgG2 có thể đáp ứng lại các polysaccharide của vi
khuẩn, nhận biết virus và độc tố.

Bs: Hoàng Xuân Thế

18


Tìm hiểu quy trình xét ngiệm viêm gan B bằng phương pháp ELISA

Ig M : nồng độ trong huyết thanh người là 0.5 – 2.5g/l. Xuất hiện tiên
sau khi kích thích Ag. Ig M liên kết với Ag, hoạt hóa bổ thể, ngưng kết hồng
cầu.
Ig A : có trong các tuyến nhầy, ngăn chặn sự xâm nhập các vi sinh vật
vào cơ quan này. Nồng độ trong huyết tương : 2.5 – 3 mg/ml.
Ig D : có lượng rất ít so với các kháng thể khác của huyết thanh. Kháng
thể này nhạy cảm với protease và có khuynh hướng tự phân hủy nhanh.
Ig D : chiếm 0.3mg/l trong huyết thanh. Thường tham gia vào các phản
ứng viêm, phản ứng dị ứng và hiện tượng quá mẫn.
Những thành tựu về miễn dịch học trong nhưng năm gần đây đã cho
thấy là đứng trước sự xâm nhập của kháng nguyên, cơ thể vật chủ có hai
cách đáp ứng miễn dịch:
- Đáp ứng miễn dịch thể bằng cách tổng hợp những kháng thể hòa tan

trong huyết thanh. Loại kháng thể dịch thể hiện nay được nghiên cứu kỹ
nhất.
- Đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào, cũng bằng kháng thể đặc
hiệu, nhưng loại kháng thể này liên kết chặt chẽ trên mặt tế bào sản xuất ra
chúng mà không hòa tan trong huyết thanh. Cho nên sự kết hợp với kháng
nguyên được tiến hành cùng với tế bào ấy. người ta còn gọi những kháng thể
này là kháng thể cố định hay kháng thể tế bào. Sự hiểu biết về chúng còn
chưa rõ ràng.

Bs: Hoàng Xuân Thế

19


Tìm hiểu quy trình xét ngiệm viêm gan B bằng phương pháp ELISA

1.3 Kháng thể dịch thể:
Là tất cả những chất sinh học gíup sinh vất chống đỡ lại các yếu tố có hại
xâm nhập vào cơ thể. Nằm ngay trên bề mặt tế bào lympho T sản xuất ra
chúng.
1.4 Kháng thể cố định :
Cũng là nhũng chất sinh học giúp sinh vật chống đỡ lại các yếu tố có hai
xâm nhập vào cơ thể.cơ thể đáp ứng miễn dịch chr yếu bằng loại kháng thể
này. Hiện nay chưa có cách nào tách được những kháng thể cố định này ra
khỏi màng tế bào được. Do đó mà cấu trúc của chúng chưa được biết rõ.
2. Cơ chế kết hợp kháng nguyên – kháng thể:
Khi đem kháng thể kết hợp với kháng nguyên đặc hiệu tương ứng thì hai
thứ sẽ kết hợp với nhau, nhiều khi có thể thấy bằng mắt thường được duới
hình thức những hiện tượng như lên bông, kết tủa, ngưng kết. Sự kết hợp
kháng nguyên kháng thể hình thành một mạng lưới. Sự kết hợp ấy không

phải là một phản ứng hóa học qua những dây nối đồng hóa trị Có thể dễ
dàng tách rời kết hợp đó ra bằng nhiều phuơng pháp lý hóa. Chỉ cần thay đổi
pH môi trường thì kháng nguyên sẽ rời kháng thể.
Giữa kháng nguyên và kháng thể tương ứng, sự kết hợp xảy ra là nhờ ở
ba lực sau đây :
Lực hấp dẫn phân tử Van der Waals.
Lực hút tĩnh điện Coulomb giữa các hóa chức khác nhau.

Bs: Hoàng Xuân Thế

20


Tìm hiểu quy trình xét ngiệm viêm gan B bằng phương pháp ELISA

Lực liên kết của cầu nối hidro giữa các nhóm hydroxyl.
2.3 Kết quả của sự kết hợp kháng nguyên kháng thể:
Phản ứng kết hợp kháng nguyên kháng thể về cơ bản là một phản ứng
bảo vệ vì qua phản ứng này thường kháng nguyên mất các tính chất lý hóa
và sinh học của nó Nếu kháng nguyên là vi khuẩn thì kháng thể chống chúng
sẽ ngưng tụ chúng lại làm chúng không sinh sôi nảy nở được, làm chúng bị
dung giải bởi tác dụng của bổ thể hay làm chúng bị tiêu đi bởi các tế bào đại
thực. Nếu kháng nguyên là độc tố hay là bất kỳ một protein lạ nào khác thì
kháng thể sẽ kết tủa chúng lại làm chúng tác dụng độc và chất tủa cũng bị
tiêu đi. Nhờ vậy mà cơ thể sinh vật khôgn bị đe dọa, tính mạng không bị
nguy hiểm . Do mặt tốt đó mà đáp ứng miễn dịch đã được con người sử
dụng trong phòng bệnh cũng như trong điều trị dưới hình thức vacxin hay
huyết thanh trị liệu.
Mặt khác phản ứng kết hợp kháng nguyên kháng thể lại khởi phát lên
một loạt nhiều phản ứng khác nhau trong cơ thể như viêm,co thắt cơ

trơn,tăng sinh tế bào,..Những phản ứng sinh học này về cơ bản vẫn mang
tính chất bảo vệ, song về biểu hiện thì đôi khi quá mức, nó trở nên thành có
hại mà y học đang tìm cách chống lại. Những phản ứng ấy xảy ra là do kết
hợp kháng nguyên kháng thể đã giải phóng ra một số chất gọi là chất trung
gian có tác dụng sinh học. Những chất này thay đổi tùy theo là kháng thể
dịch thể hay kháng thể cố định.

Bs: Hoàng Xuân Thế

21


Tìm hiểu quy trình xét ngiệm viêm gan B bằng phương pháp ELISA

* Các chất trung gian của kháng thể dịch thể :
Kết hợp kháng nguyên với kháng thể dịch thể đã phóng thích ra một số
men tiêu protein như men diamin – oxydaza. Cho nên đã phóng thích một số
chất nằm sẵn trong một số tế bào vào trong cơ thể. Những chất đó là ;
Histamin
Serotoin
SRS – A (Slow Reacing Substance of Anaphylaxis )
Kinin tuyết tương
Heparin
* Các chất trung gian của kháng thể cố định:
Khi kháng nguyên gây đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào thi
kháng thể được sản xuẩt ra nhằm cố định trên mặt các tế bào lympho T. Nếu
những tế bào đã được mẫn cảm này gặp kháng nguyên lần sau thì phản ứng
kết hợp kháng nguyên kháng thể sẽ xảy ran gay trên bề mặt của những tế
bào ấy. Sự kết hợp cũng giải phóng ra một loạt những chất có họat tính sinh
học với cái tên chung là Lymphokin. Có thể kể một số chất chính sau đây :

LTF ( lymphoblastic transforming factor – chất chuyển dạng lympho
bào)
MIF ( Macrophage inhibitor Factor – yếu tố ức chế đại thực bào )

Bs: Hoàng Xuân Thế

22


Tìm hiểu quy trình xét ngiệm viêm gan B bằng phương pháp ELISA

MAF ( Macrophage Aciivator Factor – yếu tố hoạt hóa đại thực bào )
3. Kỹ thuật miễn dịch enzim:
Cơ sở của kỹ thuật này là: hóa học tổ chức có thể phát hiện một số enzim
ở mức độ tế bào bằng nhứng kỹ thuật nhuộm đặc hiệu.
Cho đến nay, có 3 ký thuật miễn dịch enzim :
Kỹ thuật hiện gắn men trực tiếp lên protein, là kỹ thuật phổ biến nhất,
tương đối dễ làm và sẽ được nói kỹ trong phần dưới.
Kỹ thuật dùng kháng thể chống men gồm kỹ thuật kháng thể hỗn hợp và
kháng thể lai
Kỹ thuật dùng cả men trực tiếp lẫn kháng thể chống men, còn được gọi
là kỹ thuật khuếch đại kháng thể.
3.1 Kỹ thuật gắn men trực tiếp :
3.1.1. Kỹ thuật trực tiếp :
rong đó người ta dùng kháng thể ( hoặc kháng nguyên ) đã được đánh dấu
bằng enzim, cho tác động lên tiêu bản có kháng nguyên tương ứng (hoặc
kháng thể ), đã được dùng để phát hiện những kết hợp kháng nguyên kháng
thể trong các sinh thiết thận, gan, da,.. những kháng nguyên virut cũng đã
được phát hiện bằng kỹ thuật này

Bs: Hoàng Xuân Thế

23


Tìm hiểu quy trình xét ngiệm viêm gan B bằng phương pháp ELISA

3.1.2. Kỹ thuật gắn gián tiếp như trong miễn dịch hùynh quang, để sự hình
thành kết hợp kháng nguyên kháng thể trước rồi mới cho tác dụng của một
kháng chống kháng thể tương ứng đã được gắn enzim sẵn. Loại kỹ thụât này
có đọ nhậy cao hơn và được dùng rộng rãi hơn.
3.2. Kỹ thuật dùng kháng thể chống men:
Người ta đã tạo nên những kháng thể chống men mà không làm mất hoạt
tính của men. Hiện nay hay dùng là kháng thể peroxxydase. Kỹ thụật này có
ưu điểm là tránh được trạng đánh dấu quá dưới mức, làm hỏng kháng thể
trong quá trình gắn, hay hỏng liên kết khi trữ lâu. Nó có độ nhậy cao hơn kỹ
thuật gắn trực tiếp vì khả năng thâm nhập của kháng thể mạnh hơn là kháng
thể có gắn men. Có hai loại kỹ thuật này :
3.2.1. Kỹ thuật kháng thể hỗn hơp hay kỹ thuât cầu nối :
Trong kỹ thuật này người ta dùng hai loại kháng thể của cùng một giống
vật : kháng thể chống kháng nguyên định tìm và kháng thể chống enzim
đánh dấu. Sau đó, nối hai kháng thể ấy với nhau bằng một kháng thể thứ ba
là kháng thể chống globulin miễn dịch của giống vật sản xuẩt ra loại trực
tiếp và loại gián tiếp được.
3.2.2. Kỹ thuật kháng thể lai:
Kỹ thuật này ít tốn thời gian hơn, song phải dùng loại kháng thể đặc biệt,
kháng thể có thể vừa kết hợp với men vừa kết hợp với kháng nguyên đặc
hiệu.

Bs: Hoàng Xuân Thế

24


Tìm hiểu quy trình xét ngiệm viêm gan B bằng phương pháp ELISA

Loại kháng thể này khó làm nên còn ít được dùng.
3.3. Kỹ thuật khuếch đại kháng thể :
Trong kỹ thuật này, người ta dùng cả kỹ thuật gắn men trực tiếp lẫn
kháng thể chống men để tạo nên một hiện tượng khuếch đại làm cho phản
ứng có độ nhậy cao. Trong kỹ thuật ấy, tổ chúc hay tế bào có chứa globulin
miễn dịch đã có gắn peroxydase, Sau lại ủ tiếp với kháng thể chống globulin
gloperoxydase. Cuối cùng mới đem nhuộm đặc hiệu
4. ELISA ( ezime linked immunosorbent assay ) dùng phát hiện các dấu ấn
HBV :
Thử nghiệm HBsAg – elisa là thử nghiệm trực tiếp không cạnh tranh để
xã định kháng nguyên bề mặt HBV, bằng cách dùng anti – HBs đơn dòng là
kháng thể gắn bản để phủ các lỗ cảu phiếu nhựa, và kháng thể anti – HBs
lấy từ huyết thanh cộng gộp với men peroxidase.
Mẫu cần xét nghiệm được ủ với kháng thể gắn bản trong lỗ nhựa. Sau
khi rửa lỗ nhựa để loại bỏ các chất không gắn, cho thêm cộng gộp kháng thể
- men và lúc đó sẽ xảy ra các phản ứng giữa cộng gộp kháng thể - men này
với phức hợp kháng thể - kháng nguyên đã hình thành trong lần rửa thứ nhất.
Sau khi phản ứng kết thúc và rửa lân thứ hai, tiến hành ủ tiếp với dung dịch
cơ bản của men và chất hiệu màu. Nếu mẫu xét nghiệm dương màu sẽ hiện
ra.

Bs: Hoàng Xuân Thế

25