Phân lập và thiết kế vector mang promoter liên quan đến quá trình phát triển phôi ở cây arabidopsis

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Nguyễn Hùng Mạnh

PHÂN LẬP VÀ THIẾT KẾ VECTOR MANG PROMOTER
LIÊN QUAN ĐẾN QUÁ TRÌNH PHÁT TRIỂN PHÔI
Ở CÂY ARABIDOPSIS

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

Hà Nội - 2015


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Nguyễn Hùng Mạnh

PHÂN LẬP VÀ THIẾT KẾ VECTOR MANG PROMOTER
LIÊN QUAN ĐẾN QUÁ TRÌNH PHÁT TRIỂN PHÔI
Ở CÂY ARABIDOPSIS

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Lê Hồng Điệp

Hà Nội - 2015

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn này, lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân
thành và sâu sắc tới TS. Lê Hồng Điệp đã tận tình hướng dẫn và dìu dắt tôi trong
suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn lãnh đạo trường Đại học Khoa học Tự nhiên Đại học Quốc gia Hà Nội và các thầy cô giáo trong trường đã giảng dạy và tạo
điều kiện cho tôi học tập và thực hiện luận văn.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến các thầy cô giáo phòng thí nghiệm Công
nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật, các thầy cô giáo và các anh chị trong bộ môn
Sinh lý thực vật và Hóa sinh, các thầy cô giáo trong khoa Sinh học, trường Đại học
Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội đã truyền dạy kiến thức và kĩ năng
cho tôi trong suốt quá trình học tập dưới mái trường Khoa học Tự nhiên, tạo điều
kiện thuận lợi để tôi có thể thực hiện tốt đề tài nghiên cứu của mình.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới bạn bè, đồng nghiệp cùng tập thể lớp
Sinh học thực nghiệm khóa 2012 - 2014, nhóm sinh viên trong phòng thí nghiệm,
những người đã luôn sát cánh bên tôi, giúp đỡ, động viên và góp ý cho tôi trong
suốt quá trình học tập và hoàn thành đề tài này.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 24 tháng 11 năm 2015
Học viên

Nguyễn Hùng Mạnh


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ................................................................................................................... 1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN ........................................................................................ 3
1.1. Giới thiệu về cây Arabidopsis ...........................................................................3
1.1.1. Nguồn gốc và vị trí phân loại ...........................................................................3

1.1.2. Sinh trưởng và phát triển .................................................................................3
1.1.3. Đặc điểm về di truyền ...................................................................................... 4
1.1.4. Giá trị của cây Arabidopsis .............................................................................5
1.2. Tổng quan về promoter ....................................................................................7
1.2.1. Khái niệm về promoter ..................................................................................... 7
1.2.2. Phân loại promoter ..........................................................................................9
1.2.3. Điều hòa gen ở sinh vật nhân chuẩn ..............................................................11
1.2.4. Ứng dụng promoter trong công nghệ gen thực vật .........................................15
1.3. Các gen ET ở thực vật .....................................................................................16
1.4. Sự phát sinh phôi hữu tính ............................................................................. 17
1.4.1. Phát sinh phôi ở thực vật ...............................................................................17
1.4.2. Phát triển phôi cây Arabidopsis..................................................................... 18
Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................21
2.1. Vật liệu nghiên cứu .........................................................................................21
2.1.1. Các thiết bị thí nghiệm ...................................................................................21
2.1.2. Hóa chất và môi trường .................................................................................21
2.1.3. Vi khuẩn .........................................................................................................21
2.1.4. PlasmidpJET1.2/blunt ....................................................................................21
2.1.5. Đối tượng nghiên cứu ....................................................................................22
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................................22
2.2.1. Trồng cây Arabidopsis in vitro ......................................................................22
2.2.2. Tách chiết ADN tổng số .................................................................................23
2.2.3. PCR với mồi đặc hiệu ....................................................................................25
2.2.4. Điện di trên gel agarose .................................................................................26
2.2.5. Gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng ..................................................... 26


2.2.6. Phân tích trình tự promoter ...........................................................................29
2.2.7. Tạo cây Arabidopsis chuyển gen ...................................................................29
2.2.8. Kiểm tra biểu hiện của gen gus ......................................................................30

Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................ 31
3.1. Gieo trồng Arabidopsis in vitro ......................................................................31
3.2. Phân tích trình tự promoter ET .....................................................................33
3.3. Tách chiết ADN tổng số .................................................................................. 35
3.4. Khuếch đại trình tự promoter ET ................................................................. 36
3.5. Tạo vector tái tổ hợp có chứa trình tự promoter ET ................................... 38
3.6. Tạo cây Arabidopsis chuyển gen mang promoter ET .................................. 39
3.6.1. Tạo vector tái tổ hợp pBI121-ET ...................................................................39
3.6.2. Colony PCR ....................................................................................................40
3.6.3. Đưa promoter ET vào cây .............................................................................. 41
3.7. Đánh giá cây Arabidopsis chuyển gen mang promoter ET ..........................41
KẾT LUẬN .............................................................................................................44
KIẾN NGHỊ ............................................................................................................44
TÀI LIỆU THAM KHẢO .....................................................................................45
PHỤ LỤC


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
STT

Tên viết tắt

Tên đầy đủ

1

ADN

Acid deoxyribonucleic

2

Amp

Ampicillin

3

ARN

Acid ribonucleic

4

ARN pol

ARN polymerase

5

B1

Thiamine

6

B3

Nicotinic acid

7

B6

Pyridoxine

8

Bp

Base pairs

9

CTAB

Cetyltrimethylammonium bromide

10

dNTP

Deoxyribonucleoside 5’ trisphosphates

11

E.coli

Escherichia coli

12

EDTA

Ethylenediaminetetraacetic acid

13

ET

Effector of transcription

14

Kb

Kilo base

15

LB

Lauria-Bertani

16

Mb

Mega base

17

MS

Murashige & Skoog, 1962

18

NaOAc

Sodium Acetate

19

NaOCl

Sodium hypochloride

20

PCR

Polymerase Chain Reaction

21

rARN

ribosomalARN

22

RNase

Ribonuclease

23

snARNs

Small nuclear ARN

24

SOC

Super Optimal broth with Catabolic repressor

25

tARN

transportARN

26

TE

Tris-EDTA

27

UV

Tia cực tím


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.1. Kết quả khử trùng và gieo hạt Arabidopsis in vitro ................................32
Bảng 3.2. Hàm lượng và độ tinh sạch các mẫu ADN tổng số .................................36

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Vị trí của promoter ở sinh vât nhân sơ và sinh vật nhân chuẩn .................8
Hình 1.2. Biểu hiện của các gen ET khi phân tích bằng GenExpress ......................17
Hình 1.3. Các giai đoạn phát triển phôi ở thực vật .................................................18
Hình 1.4. Sự phát triển của phôi hạt Arabidopsis trồng trong phòng thí nghiệm ....19
Hình 1.5. Các giai đoạn phát triển phôi ở Arabidopsis ...........................................20
Hình 2.1. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR ..........................................................25
Hình 2.2. Sơ đồ vector tách dòng pJET1.2/blunt ..................................................... 27
Hình 3.1. Cây Arabidopsis 3 tuần tuổi trong điều kiện nuôi cấy in vitro ................ 33
Hình 3.2. Trình tự promoter ET ...............................................................................34
Hình 3.3. Phổ điện di ADN tổng số tách chiết từ cây Arabidopsis ......................... 36
Hình 3.4. Phổ điện di sản phẩm PCR promoter ET ................................................. 37
Hình 3.5. Khuẩn lạc E. coli trên môi trường LB đặc có 50µg/ml ............................38
Hình 3.6. Vector tái tổ hợp pBI121-ET trên cơ sở vector pBI121 .......................... 39
Hình 3.7. Phổ điện di sản phẩm colony - PCR ........................................................40
Hình 3.8. Phổ điện di kiểm tra cây Arabidopsis chuyển gen. ..................................42
Hình 3.9. Kết quả nhuộm X-gluc cây Arabidopsis 1 tuần tuổi ................................43

MỞ ĐẦU
Ngày nay, khoa học kĩ thuật phát triển vượt bậc gắn liền với đời sống con
người, hiện diện trong mọi lĩnh vực với mục đích nâng cao chất lượng cuộc sống.
Công nghệ sinh học ra đời đánh dấu bước tiến mới nhất trong nỗ lực lâu dài chinh
phục tự nhiên của con người, đặc biệt là sự phát triển của công nghệ sinh học hiện
đại trong nhiều năm gần đây. Sử dụng công nghệ ADN tái tổ hợp, các nhà khoa học
đang cố gắng tạo ra những cây trồng vật nuôi có năng suất và chất lượng cao, những
thực phẩm, dược phẩm phục vụ chữa bệnh cho con người. Hiện nay, công nghệ tế
bào và kĩ thuật chuyển gen đang rất phát triển ở Việt Nam. Việt Nam là một nước
nông nghiệp truyền thống, vì vậy việc phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học
được tập trung chủ yếu vào nông - lâm - ngư nghiệp, với mục đích đưa nền nông
nghiệp nước ta trở thành nền nông nghiệp hiện đại, ứng dụng khoa học kĩ thuật vào
sản xuất để tăng chất lượng, năng suất sản phẩm, đồng thời giảm thiểu sức lao động
của con người.
Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, mưa nhiều, khá thuận
lợi để nhiều loài động, thực vật tồn tại và phát triển. Theo các nhà khoa học thì Việt
Nam là quốc gia đứng thứ 16 trên thế giới về đa dạng sinh học, riêng ngành thực vật
bậc cao đã có khoảng 12000 loài thuộc hơn 2500 chi và 300 họ [12]. Trong đó có
rất nhiều loài có giá trị, đáp ứng được các nhu cầu khác nhau của con người như
lương thực thực phẩm, làm thuốc, cây cảnh,…
Trong công nghệ chuyển gen thực vật, việc thiết kế vector biểu hiện là một
khâu quan trọng và đóng góp rất lớn cho sự thành công của công nghệ này. Vì vậy
việc tìm kiếm, phân lập các promoter và các gen có giá trị có ý nghĩa vô cùng quan
trọng trong công tác nghiên cứu và chọn lọc giống. Để đạt được hiệu quả cao trong
công tác này người ta thường nghiên cứu trên những sinh vật mô hình, trong đó có
Arabidopsis.
Arabidopsis (Arabidopsis thaliana L.) mặc dù không có ý nghĩa gì về mặt
nông nghiệp, nhưng trong nghiên cứu nó đóng một vai trò rất quan trọng.
Arabidopsis đã được chọn như là một cây mô hình trong nghiên cứu thực vật và đã
được các nhà khoa học trên thế giới sử dụng từ lâu.

1


Arabidopsis có bộ gen nhỏ chỉ khoảng 125 Mb, đã hoàn toàn được giải trình
tự và công bố năm 2000. Chu kỳ sinh trưởng của Arabidopsis ngắn (khoảng 6-8
tuần), cho nhiều hạt và dễ dàng nuôi trồng trong một không gian hẹp và rất hiệu quả
trong việc sử dụng phương pháp chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium.
Sự hình thành và phát triển của hạt do nhiều yếu tố quy định trong đó có các
hormone thực vật như ABA, GA… những hormone này đều tham gia hoạt hóa
nhiều gen liên quan đến sự phát triển của hạt.
Từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Phân lập và thiết
kế vecter mang promoter liên quan đến quá trình phát triển phôi ở cây
Arabidopsis”, với các mục tiêu cụ thể như sau:
1. Thiết lập được nguồn mẫu cây Arabidopsis in vitro
2. Nhân dòng được trình tự promoter liên quan đến quá trình phát triển phôi
hạt của cây Arabidopsis.
3. Đã thiết kế được vector tái tổ hợp pBI121-ET có mang trình tự promoter
ET và tiến hành đưa vào cây Arabidopsis giống Columbia.
4. Bước đầu phân tích trình tự của promoter ET.

2


Chƣơng 1. TỔNG

QUAN

1.1. Giới thiệu về cây Arabidopsis
1.1.1. Nguồn gốc và vị trí phân loại

Arabidopsis (tên Latin Arabidopsis thaliana) là một loài thực vật có hoa nhỏ
thuộc họ Cải (Brassicaceae), bộ Brassicales [38].
Arabidopsis có nguồn gốc từ Châu Âu, Châu Á và Tây Bắc Châu Phi.
Arabidopsis lần đầu tiên được phát hiện năm 1577 ở dãy núi Harz bởi một bác sỹ
người Đức Johannes Thal (1542-1583) và đã được gọi là Pilosella siliquosa. Đến
năm 1841, danh pháp đã được đổi thành Arabidopsis thaliana bởi một nhà thực vật
học người Đức Gustav Heynhold để vinh danh Thal. Các loài Arabidopsis có thể
được tìm thấy trong tự nhiên hầu như ở khắp mọi nơi ở Bắc bán cầu. Arabidopsis đã
được tìm thấy ở mọi độ cao từ mực nước biển cho đến dãy núi cao Himalayas, từ
phía bắc Scandinavia đến Bắc Phi, bao gồm cả Cape Verde Islands tại vĩ độ 16. Nó
cũng được tìm thấy ở Bắc Mỹ, có thể là bắt nguồn từ Châu Âu [38].
1.1.2. Sinh trưởng và phát triển
Arabidopsis có chu kì sống tương đối ngắn khi so sánh với các loài thực vật
khác. Toàn bộ chu trình sống bao gồm sự nảy mầm của hạt, tạo thành cây hình hoa
thị, mọc thân chính, ra hoa và thời sinh trưởng đến khi hình thành hạt là khoảng 6
đến 8 tuần.
Arabidopsis có kích thước rất nhỏ, cây phát triển thành cụm hình hoa thị
đường kính 2-10 cm, hoa dài 2 mm, hạt khi trưởng thành đạt kích thước 0.5 mm về
chiều dài. Lá được bao phủ bởi lông đơn bào nhỏ gọi là trichomes thuận tiện cho
nghiên cứu hình thái và sự khác biệt của tế bào. Lá thật thứ nhất có trichomes chỉ ở
bề mặt trên của lá, trong khi các lá còn lại thì có ở cả mặt dưới. Số lượng lá hình
hoa thị được hình thành phụ thuộc vào kiểu gen và điều kiện môi trường cùng với
sự tương quan mạnh với thời gian từ lúc nảy mầm đến lúc bắt đầu ra hoa [38].
Hạt giống Arabidopsis nhỏ, có hình bầu dục. Hạt giống có thể nảy mầm một
cách dễ dàng, mặc dù hạt sau thu hoạch thì cần được xử lý lạnh một vài ngày và lưu
trữ bảo quản một thời gian để hạt có sức nảy mầm tốt nhất. Hạt thường yêu cầu ánh
sáng để nảy mầm.

3

Hạt cây Arabidopsis được gieo trên đĩa petri hoặc trong chậu đặt trong nhà
kính hoặc dưới ánh đèn huỳnh quang trong phòng thí nghiệm. Khoảng 3 tuần sau
khi gieo hạt, thân chính sẽ bắt đầu phát triển, tạo ra cụm hoa và sau đó là quả. Hoa
cấu tạo phía ngoài là bốn đài hoa, vòng xoắn bên trong có bốn cánh hoa màu trắng,
sáu nhị hoa mang phấn hoa và một nhụy trung tâm có hai lá noãn hình thành nên
quả. Arabidopsis là loài thực vật tự thụ phấn, cây trưởng thành đạt chiều cao 15-20
cm. Rễ có cấu trúc đơn giản, không cộng sinh với các vi khuẩn cố định đạm, tạo
điều kiện dễ dàng cho việc nghiên cứu môi trường tối ưu cho sinh trưởng [38,47].
1.1.3. Đặc điểm về di truyền
Arabidopsis là loài thực vật đầu tiên, và là sinh vật đa bào thứ ba sau
Caenorhabditis elegans và Drosophila melanogaster hoàn toàn được giải trình tự
gen [15,55,56].
Hệ gen của Arabidopsis có kích thước 125 Mb mã hóa cho khoảng 26000
gen trên 5 nhiễm sắc thể [2]. Theo một báo cáo khác của Hall và cộng sự [31] hệ
gen của Arabidopsis có kích thước khoảng 146 Mb mã hóa cho khoảng 25000 gen.
Kể từ khi hệ thống giải trình tự gen Arabidopsis được hoàn thành và công bố năm
2000 thì trình tự các gen ngày càng được nghiên cứu mở rộng, được bổ sung và
hoàn thiện. Các vùng gen của hệ gen đã được giải trình tự và phân tích khoảng 119
Mb. Trình tự hệ gen được phân tích bởi TIGR (The Institute for Genome Research)
v5 analysis (http:// www.tigr. Org/tdb/e2k1/ath1/ath1.shtml) [19,30].
Arabidopsis là loài thực vật có bộ gen nhỏ nhất, với ít trình tự lặp lại nhất so
với bất kỳ loài thực vật bậc cao nào được biết đến, tạo điều kiện cho rất nhiều
nghiên cứu phân tử dựa trên bản đồ tách dòng. Ngoài ra, Arabidopsis có thể dễ dàng
được chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, đó là điều kiện tiên
quyết cho nhiều thí nghiệm di truyền phân tử [51]. Arabidopsis được đề xuất làm
thực vật mô hình lần đầu tiên bởi Friedrich Laibach năm 1943. Mặc dù thực tế
Arabidopsis có rất nhiều đặc điểm thuận lợi cho phân tích di truyền học nhưng đã
không lập tức được sử dụng phổ biến.

4


1.1.4. Giá trị của cây Arabidopsis
Arabidopsis là thực vật mô hình rất hữu ích cho nghiên cứu di truyền học và
sinh học phân tử thực vật, bao gồm nghiên cứu bệnh lý học và sinh lý học, với
nhiều hiểu biết từ đó có thể áp dụng trực tiếp cho cây trồng.
Trong tất cả các loài thực vật có hoa, cây Arabidopsis được sử dụng nhiều
nhất làm đối tượng cho các nghiên cứu, hơn hẳn tất cả các loài khác từng được coi
là ứng cử viên đầy hứa hẹn để định hướng nghiên cứu thực vật trong tương lai. Chỉ
riêng năm 2008, đã có hơn 3500 tài liệu có liên quan đến Arabidopsis được thêm
vào cơ sở dữ liệu Pubmed. So với năm 1979, chỉ có 7 công bố về Arabidopsis và 65
công bố cho tất cả các năm trước cộng lại. Sự phát triển của việc nghiên cứu
Arabidopsis trong vòng 30 năm qua rất đáng chú ý, bổ ích, có tác dụng tạo nên một
bước tiến mới trong công nghệ sinh học thực vật [37]. Việc nâng cao vai trò của di
truyền học trong thời kỳ hội nhập cùng với sự sẵn có của các công cụ sinh học phân tử
đã dẫn đến việc các nhà thực vật học tập trung vào một sinh vật để phân tích chi tiết.
Arabidopsis mã hóa cho các gen cùng nguồn gốc của hầu hết các protein
được các sinh vật nhân thật sử dụng để duy trì tính toàn vẹn của bộ gen [55]. Sự lựa
chọn nghiên cứu Arabidopsis đã mang lại và hứa hẹn sẽ mang đến những hiểu biết
mới thú vị.
Arabidopsis có một số lượng đáng kể các đột biến đặc trưng, tuy nhiên việc
nghiên cứu tìm kiếm các đột biến mới cũng rất quan trọng. Hạt giống Arabidopsis
rất nhỏ là tương đối nhạy cảm với các chất gây đột biến hóa học, do đó, việc tìm
kiếm các đột biến thường xuyên được bắt đầu bằng cách gieo hàng ngàn hạt giống
xử lý với ethyl methane sulfonate (EMS). Đối với nhiều mục đích khác, hạt giống
đơn giản là có thể trồng trên đất, 16 hạt với mỗi chậu 9 cm, hoặc 250 với mỗi mặt
phẳng 25 cm x 50 cm, làm giảm nhu cầu về phương tiện vô trùng. Để lựa chọn
giống kháng thuốc hoặc thuốc diệt cỏ, hoặc để tạo thuận lợi cho sự hấp thu các hợp
chất hóa sinh, hạt giống được trồng trên môi trường thạch vô trùng trong đĩa petri

hoặc trong hộp nhựa cho phép sự phát triển nhiều hơn. Lá mầm xuất hiện sau 3
ngày, và lá thật đầu tiên sau 6 ngày. Tại thời điểm này, cây giống kháng thuốc cao
5mm, mọc lên từ khoảng 2000 hạt giống gieo trên mỗi đĩa 10 cm, có thể được xác

5


định và chuyển vào đất, hoặc tiếp tục xử lý với ánh sáng UV hoặc các tác nhân gây
độc khác. Tiếp tục phát triển thêm nhiều lá hơn, phát triển lá hiện có, ADN trong lá
sẽ tăng tuyến tính cho đến khoảng 20-25 ngày sau khi nảy mầm [24], và lúc đó mỗi
cây sẽ nhanh chóng phát triển một thân chính, chiều cao lên đến 20cm, mà hoa và
cuối cùng là vỏ hạt sẽ xuất hiện vào khoảng 28 ngày. Sự tự thụ phấn là tự động,
nhưng cũng có thể dễ dàng thực hiện nhờ tác nhân bên ngoài bằng cách chuyển
phấn hoa cho nhụy hoa đã được loại bỏ bao phấn. Thông thường, việc lai cận huyết
tự động lặp đi lặp lại sẽ làm cho mỗi dòng Arabidopsis hoàn toàn đồng hợp tử. Chỉ
sau 6 tuần, có đến 5000 hạt giống được thu hoạch từ mỗi cây, và chu kì mới có thể
được bắt đầu. Sản lượng hạt giống cao làm cho nó có thể dùng để nhân dòng trong
lý thuyết mà khả năng sinh sản 99%, hầu như không giới hạn, hạt nhỏ có thể được
lưu trữ trong các bình hút ẩm ở nhiệt độ lạnh nếu cần thiết. Các đột biến ở thế hệ
đầu tiên phát sinh từ hạt M1 hoặc từ đoạn chèn T-ADN (T1) là gen lặn và không có
kiểu hình. Lai Menden các đột biến có thể được quan sát thấy ở các thế hệ con cháu
(M2 hoặc T2). Như vậy chỉ 8 tuần sau khi đột biến, một phần tư các thế hệ con cháu
M2 phát sinh từ một hạt giống sản xuất đột biến mang tính chất đồng hợp tử về kiểu
hình [32].
Arabidopsis có chu kì sống ngắn, kích thước cây nhỏ do đó hạn chế được
mức thấp nhất các yêu cầu về cơ sở vật chất và điều kiện sinh trưởng. Ngoài ra cây
Arabidopsis còn có khả năng sản sinh nhiều hạt trong mỗi thế hệ. Vì các tính năng
này mà ngay từ ban đầu Arabidopsis được xem là một sinh vật mô hình vì tính hữu
dụng của nó cho các thí nghiệm di truyền.
Friedrich Laibach là một trong những người tiên phong nghiên cứu về

Arabidopsis, ông đã mô tả chính xác số lượng nhiễm sắc thể trong nghiên cứu tiến
sĩ của ông. Năm 1943, trong một bài báo chuyên đề, Laibach đã cho thấy sự phù
hợp của Arabidopsis cho nghiên cứu di truyền học. Ông và học trò cũng nhấn mạnh
việc sử dụng các đột biến tự nhiên để phân tích sinh lý của cây như thời gian ra hoa
và sự ngủ của hạt, ông cũng bắt đầu thí nghiệm xử lý Arabidopsis với X-rays.
Arabidopsis đã được chọn làm thực vật mô hình đại diện cho khoảng
300.000 loài. Các sinh vật đa bào lớn mà chúng ta thấy xung quanh rất phong phú

6


và đa dạng, nhưng chúng gần gũi với nhau trong nguồn gốc tiến hóa, và có nhiều sự
tương tự trong sinh học tế bào cơ bản. Trong khi prokaryotes và eukaryotes cách
nhau hơn 3000 triệu năm tiến hóa, động vật có xương sống và côn trùng cách nhau
khoảng 700 triệu năm, cá và động vật có vú khoảng 450 triệu năm thì các loài khác
nhau của thực vật có hoa chỉ khoảng 150 triệu năm. Do mối quan hệ tiến hóa gần
gũi giữa tất cả các loài thực vật có hoa, chúng ta có thể một lần nữa có được cái
nhìn sâu sắc về các tế bào và sinh học phân tử của toàn bộ các sinh vật lớp này bằng
cách tập trung vào phân tích chi tiết chỉ một hoặc một vài loài. Trong số hàng trăm
ngàn loài thực vật có hoa, các nhà sinh học phân tử đã lựa chọn tập trung vào
Arabidopsis, một loài cải nhỏ có thể trồng trong nhà với số lượng lớn và sản xuất
hàng ngàn cây con mỗi thế hệ [16].
Hệ gen Arabidopsis có kích thước nhỏ và đã được giải trình tự hoàn toàn, bộ
nhiễm sắc thể lưỡng bội, dễ dàng cho việc phân tích các đột biến lặn, chuyển gen
hiệu quả bằng Agrobacterium tumefaciens. Những vi khuẩn này lây nhiễm rất nhiều
loại thực vật, thường thông qua các vết thương, và chuyển họ T-ADN một cách
ngẫu nhiên vào hệ gen của thực vật. Các T-ADN mã hóa cho hormone thực vật và
enzyme tổng hợp chất chuyển hóa nhất định được sử dụng cụ thể do vi khuẩn. Kết
quả của sự tăng trưởng của tế bào không kiểm soát được đã nuôi dưỡng các vi
khuẩn xâm nhập. Thay thế các gen độc của T-ADN bằng các gen mã hóa kháng thể

lựa chọn kháng thuốc hoặc thuốc trừ sâu, cộng với hầu như bất kỳ gen quan tâm,
làm cho Agrobacterium tumefaciens trở thành một công cụ hữu ích cho các kĩ thuật
di truyền.
1.2. Tổng quan về promoter
1.2.1. Khái niệm về promoter
Promoter là trình tự nucleotide cần thiết để ARN pol bám vào khởi động quá
trình phiên mã. Trình tự này nằm ngay trước vị trí (+1) ở các hệ gen của
prokaryotes (sinh vật nhân sơ). Trong khi đó, promoter ở hệ gen của eukaryotes
(sinh vật nhân chuẩn) thường được xem là gồm vị trí nhận biết bởi ARN pol và các
trình tự đặc biệt nhận biết bởi yếu tố phiên mã. Đó là do phiên mã trên gen của sinh

7


vật nhân sơ có thể xảy ra ngay khi một mình ARN pol bám vào promoter trong khi
điều này hầu như không xảy ra với các gen của sinh vật nhân chuẩn [6].
Trình tự cơ bản của promoter (core promoter) thường gồm các nucleotide ở
vị trí -10 đến vài nucleotide sau +1 đối với gen ở sinh vật nhân sơ hoặc gồm các
nucleotide ở vị trí -40 đến +20 đối với gen của sinh vật nhân chuẩn. Hầu hết trình tự
cơ bản ở gen sinh vật nhân sơ và nhân chuẩn đều có chứa một đoạn ngắn giàu A-T
gọi là hộp TATA. Hộp TATA thường ở vị trí -10 ở promoter sinh vật nhân sơ
nhưng phân bố ở vị trí -25 ở promoter sinh vật nhân chuẩn. Khi mà promoter chỉ có
trình tự cơ bản thì mức độ phiên mã xảy ra rất thấp, tuy nhiên sẽ tăng lên rất nhiều
khi có thêm trình tự nằm phía trước trình tự cơ bản. Trình tự thứ hai này thường
nằm ở vị trí -35 đối với gen sinh vật nhân sơ, hoặc vị trí -70 đến -90 ở gen sinh vật
nhân chuẩn [6].

Hình 1.1. Vị trí của promoter ở sinh vât nhân sơ (Figure 4-27a) và sinh vật nhân
chuẩn (Figure 4-27b).
Promoter của gen ở sinh vật nhân chuẩn mã cho protein được nhận biết bởi

ARN pol II khi mà hầu hết các yếu tố phiên mã đã có mặt ở promoter. Phiên mã ở
sinh vật nhân chuẩn cũng đòi hỏi các trình tự tăng cường enhancer đặc thù cho từng

8


gen hoặc nhóm gen, có thể nằm phía trước, sau hoặc ngay trong gen để tăng cường
mức độ phiên mã trên promoter [6].
1.2.2. Phân loại promoter
1.2.2.1. Promoter không đặc hiệu
Promoter không đặc hiệu hay còn gọi là promoter cơ định (constitutive
promoter) tham gia điều khiển quá trình biểu hiện gen ở tất cả hoặc hầu như tất cả
các loại mô khác nhau trong tất cả hay hầu như mọi giai đoạn phát triển của sinh
vật. CaMV35S promoter điều khiển sự biểu hiện ARN 35S được phân lập từ virut
khảm súp lơ (cauliflower mosaic virus - CaMV) là một ví dụ điển hình của nhóm
promoter này. CaMV là một pararetrovirus của các thực vật thuộc họ cải. Hệ gen
của virus này là một phân tử ADN vòng sợ kép có kích thước 8 kb với ba quãng
ngắt là sợi đơn, hai bản phiên mã mARN chính (19S và 35S) và sáu khung đọc mở
được mã hóa bởi ADN. Sự phiên mã xảy ra từ tiểu nhiễm sắc thể vòng và không
tiếp hợp trong nhân của tế bào thực vật và ADN virion được tổng hợp trong tế bào
chất thông qua sự phiên mã ngược của mARN 35S. CaMV35S promoter là trình tự
có kích thước vào khoảng 350 bp nằm ở phía đầu của mARN 35S (-343 đến +8, với
vị trí Cap ở +1), trong đó có khoảng 250 bp gối lên 3% đoạn kết thúc của gen V1,
khung đọc mở cuối cùng trong 6 khung đọc mở lớn. Có 3 vùng trên promoter,
promoter trung tâm chứa hộp TATA (vị trí từ 46 đến +8) và hai vùng chính khác có
chức năng tăng cường. Vùng A (-90 đến -46) chủ yếu cần cho biểu hiện của rễ và
vùng B (-343 đến 90) cần cho biểu hiện ở lá [17,34,35]. Tiểu vùng của vùng B (B1
đến B5) có thể được nhận dạng dựa trên những tương tác khác biệt với những nhân
tố phiên mã khác nhau. Tuy nhiên, vùng B hoàn chỉnh cho phép biểu hiện đa dạng
hơn so với trường hợp kết hợp các tiểu vùng. Vai trò của các vùng khác nhau trên

CaMV35S promoter trong việc gây bệnh của CaMV mới được nghiên cứu trong
thời gian gần đây [49,57]. Các nghiên cứu cho thấy việc loại bỏ hộp TATA làm mất
khả năng gây nhiễm. Hai vùng tăng cường tách biệt liên quan đến khả năng gây
nhiễm đã được xác định là (-207 đến -150) và (-95 đến -56). Vùng tăng cường thậm
chí có thể hoạt động theo hướng ngược chiều [4].

9


1.2.2.2. Promoter đặc hiệu
Promoter đặc hiệu (specific promoter) là promoter với các yếu tố cis chuyên
biệt. Sự biểu hiện đặc hiệu là sự biểu hiện các sản phẩm của gen giới hạn ở một
hoặc một vài mô (hạn chế về không gian – spatial limitation) hoặc ở một hoặc vài
giai đoạn phát triển (đặc hiệu thời gian – temporal limitation). Cần nhấn mạnh rằng
không có một promoter hoàn toàn đặc hiệu: các promoter dường như hoạt động ở
một số mô, trong khi ở một số mô khác không hoặc chỉ hoạt động yếu. Hiện tượng
này được biết đến như là sự biểu hiện yếu. Promoter đặc hiệu mô (tissue specific
promoter): Các loại promoter đặc hiệu mô chỉ điều khiển biểu hiện gen ở những mô
nhất định, ví dụ promoter đặc hiệu rễ [22], promoter đặc hiệu bó mạch ở thực vật,
promoter đặc hiệu hoa. Thuộc nhóm promoter này có promoter điều khiển biểu hiện
gen mã hóa sucrose synthase. Sucrose synthase là một trong những enzyme quan
trọng tham gia vào mọi hoạt động sống của tế bào. Ở lúa, người ta đã phát hiện
được ba gen cùng mã hóa cho sucrose synthase (Rsuc1, Rsuc2, Rsuc3) [59]. Tuy
nhiên mức độ biểu hiện của các gen này ở các mô là khác nhau. Gen Rsuc2 không
có tính đặc hiệu mô cao. Gen Rsuc3 đặc hiệu cao ở hạt [36]. Chỉ có gen Rsuc1 biểu
hiện đặc hiệu ở bó mạch, rễ, mầm. Kích thước của gen Rsuc1 là 8167 bp, trong đó
kích thước của vùng 5’ tương đối lớn, chiếm khoảng 3 kb. Promoter của Rsuc1
chứa các trình tự đặc trưng của một promoter như hộp TATA, hộp CCAAT… và
các trình tự đặc hiệu, quyết định sự biểu hiện gen đặc hiệu bó mạch như hộp ASL,
hộp GAGA… [58].

1.2.2.3. Promoter cảm ứng
Là promoter cảm ứng với môi trường (environmentally inducible promoter).
Trong các điều kiện cực đoan (stress) như hạn, nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp, oxy
hóa cao, nồng độ muối quá cao… các gen chống chịu thường biểu hiện với tốc độ
rất nhanh. Vì vậy vấn đề khởi động sự phiên mã cũng như cấu trúc promoter của
chúng và các protein tham gia vào việc điều khiển biểu hiện gen thông qua việc
nhận biết và hoạt hóa quá trình khởi động phiên mã được đặc biệt quan tâm [4].

10


1.2.3. Điều hòa gen ở sinh vật nhân chuẩn
Hoạt động của gen chịu sự kiểm soát của những cơ chế, ta gọi đó là sự điều
hòa gen. Những hệ thống điều hòa của các sinh vật nhân sơ và sinh vật nhân chuẩn
có phần nào khác nhau. Nguyên lý chung của sự điều hòa là sự tổng hợp của một
mARN nào đó xảy ra khi sản phẩm của gen là cần thiết và nó bị kìm hãm khi sản
phẩm này là không cần thiết, gọi là cơ chế điều hòa mở - đóng. Ở các sinh vật nhân
chuẩn thì sự đóng hoàn toàn của một gen là hết sức phổ biến [10].
Tế bào sinh vật nhân chuẩn gồm có hai kiểu phổ biến là những đơn bào sống
tự do như nấm men, tảo và những tế bào ở trong mô có tổ chức. Nhóm sau khác với
nhóm trước và khác với sinh vật nhân sơ ở chỗ môi trường của các tế bào trong mô
thường không có biến đổi lớn theo thời gian. Khi đã biệt hóa, các tế bào ổn định và
sản sinh ra những chất nhất định hoặc với tốc độ không đổi hoặc phản ứng thích
hợp với những thay đổi của môi trường như hormone và sự thay đổi nhiệt độ.
Những sinh vật nhân chuẩn đơn bào sống tự do và các sinh vật nhân sơ thì chung
các đặc điểm điều hòa nhất định mặc dù tổ chức hệ gen khác nhau. Nói chung, sự
điều hòa hoạt động gen ở sinh vật nhân chuẩn có một số điểm sai khác đáng chú ý
so với sinh vật nhân sơ. Thứ nhất, ở sinh vật nhân chuẩn thường chỉ có kiểu
polypeptide đơn được dịch mã từ một phân tử mARN hoàn chỉnh, mARN đa gen
chỉ có ở sinh vật nhân sơ, do vậy mà những kiểu operon bắt gặp ở sinh vật nhân sơ

không tìm thấy ở sinh vật nhân chuẩn. Thứ hai, ADN của các sinh vật nhân chuẩn
liên kết với các histon tạo thành chất nhiễm sắc và với nhiều protein phi histon, chỉ
có một phần nhỏ là ADN trần, khác với ở sinh vật nhân sơ, một vài protein có mặt
trong nhiễm sắc thể cuộn gập nhưng hầu hết lại là tự do. Vì vậy mà những yếu tố
điều hòa có thể tác động trực tiếp lên ADN sinh vật nhân sơ lại không thể xảy ra
trên sinh vật nhân chuẩn. Thứ ba, một phần đáng kể ADN của sinh vật nhân chuẩn
bao gồm những đoạn ngắn nucleotide được lặp lại hàng trăm đến hàng triệu lần,
một số ít đoạn đoạn được lặp lại nối tiếp nhưng đa số các đoạn lặp lại là không nối
tiếp (phân tán). Trong khi đó sinh vật nhân sơ chỉ chứa một vài đoạn lặp lại không
kể các gen rARN, tARN và một vài đoạn nhất định của các gen khởi đầu. Thứ tư,
một phần lớn các đoạn base ở sinh vật nhân chuẩn không được dịch mã, gọi là các

11


intron. Thứ năm, các sinh vật nhân chuẩn có những cơ chế nhằm sắp xếp lại các
đoạn ADN nhất định theo một cách có kiểm soát và để làm tăng số lượng bản sao
của các gen đặc trưng khi cần thiết, điều này thì ít có ở sinh vật nhân sơ. Thứ sáu,
mối tương quan giữa các base và các acid amine thường không đồng tuyến tính ở
sinh vật nhân chuẩn, các intron có mặt ở hầu hết các gen và ARN thì thường phải
được biến đổi trước khi bắt đầu dịch mã. Thứ bảy là ở sinh vật nhân chuẩn ARN
được tổng hợp trong nhân và phải vận chuyển qua màng nhân ra tế bào chất để sử
dụng và điều này thì không xảy ra ở sinh vật nhân sơ [10].
Điều hòa biểu hiện gen ở sinh vật nhân chuẩn là quá trình điều hòa phiên mã
và điều hòa dịch mã với các bước cơ bản như sau:
1. Tổng hợp ARN tiền thân
2. Cải biến sau phiên mã
3. Phân giải mARN
4. Tổng hợp protein
5. Cải biến sau dịch mã

6. Hướng đích và vận chuyển
7. Phân giải protein
Điều hòa phiên mã
ARN pol xúc tác cho quá trình phiên mã nhưng sự hoạt động của enzyme
này chịu sự phụ thuộc của một số nhân tố khác, trong đó có một số loại protein đặc
biệt gọi là nhân tố phiên mã, thuật ngữ tiếng Anh là “transcription factor” (TF).
Hoạt động của ARN pol gắn liền với trạng thái của promoter, là kết quả của sự
tương tác trực tiếp giữa các loại TF khác nhau. Có một số TF khi tương tác với
promoter thì đóng vai trò thúc đẩy, một số khác thì lại có tác dụng kìm hãm sự hoạt
động của polymerase. Cũng có nhiều promoter gắn liền với các vùng ADN hoặc có
tác dụng thúc đẩy quá trình phiên mã gọi là yếu tố tăng cường, hoặc có tác dụng
kìm hãm quá trình phiêm mã gọi là yếu tố kìm hãm. Yếu tố tăng cường có thể nằm
ngay trước promoter hoặc nằm cách hàng ngàn base về phía trước hoặc phía sau
promoter mà vẫn thực hiện được chức năng của mình, còn yếu tố kìm hãm dù nằm
cách xa promoter thì vẫn gây tác dụng. Các TF cũng có thể tương tác với các yếu tố

12


tăng cường, do vậy ta có thể coi tác động của TF đến ARN pol là khâu đầu tiên
trong quá trình điều hòa phiên mã [10,11].
Ở sinh vật nhân chuẩn có tới 3 loại ARN pol. ARN pol II xúc tác cho quá
trình tổng hợp mARN. Hoạt động của ARN pol II chịu sự tác động của hai nhóm
nhân tố phiên mã: các nhân tố phiên mã chung, liên quan đến hầu hết các gen của
ARN pol II theo kiểu tác động lên hộp TATA hoặc với các nhân tố khác hay lên
chính ARN pol, và các nhân tố phiên mã gen đặc hiệu - chúng bám vào các trình tự
base đặc hiệu như kiểu hộp GC hoặc hộp CAAT có trong promoter của động vật có
vú, hoặc vào các yếu tố tăng cường. ARN pol II nhận biết các vùng điều hòa hoạt
động cis gồm một promoter và một hoặc nhiều enhancer, promoter chứa vị trí mở
đầu và hộp TATA, các enhancer thì nằm cách xa gen đích đôi khi được gọi là vị trí

hoạt hóa ngược dòng (upstream activation site). Nghiên cứu ở sinh vật nhân chuẩn
bậc cao, bao gồm cả động vật có vú cho thấy rằng ARN pol II hoạt động được là do
sự trợ giúp của ít nhất 6 nhân tố phiên mã chung được ký hiệu là TF II A, B, D, E, F
và H (TF II = TF for pol II), trong đó TF II D đã được nghiên cứu kĩ nhất, gồm
nhiều tiểu phần polypeptide, trong đó quan trọng nhất là loại protein có khả năng
bám vào hộp TATA, viết tắt là TBP (TATA box binding protein). TBP bám vào
hộp TATA và kéo theo các phần còn lại theo nó. ARN polymerase II cùng với tất cả
các nhân tố phiên mã trên tạo thành phức hệ khởi đầu phiên mã [10].
ARN pol I xúc tác cho quá trình tổng hợp rARN. Các gen rARN mang những
đoạn lặp kế tiếp trên một hoặc nhiều nhiễm sắc thể. ARN pol I phiên mã một bản phiên
mã sơ cấp, sau đó bẻ gãy thành hai tiểu đơn vị 28s và 5,8s. Phức hợp tiền khởi đầu
phiên mã ở các promoter của ARN pol I đơn giản hơn nhiều so với của ARN pol II,
bao gồm pol I và hai nhân tố phiên mã có tên là SL1 và UBF (upstream binding factor)
có chức năng bám ở phía trước. Bản thân pol I và SL1 không thể tự bám vào promoter
được, UBF bám vào một nhân tố kiểm soát nằm ở phía trước là UCE (upstream control
element) của promoter rARN. Nhờ vậy mà SL1 gắn được vào phức hệ, làm cho pol I
bám được chặt hơn và tạo ra phức hệ tiền khởi đầu phiên mã.
ARN pol III phiên mã các tARN và các ARN nhỏ khác (5s rARN, snARNs).
Giống như promoter của ARN pol I, promoter của ARN pol III cũng không có hộp TATA.

13


Sau khi được phiên mã, phân tử tiền thân mARN ở sinh vật nhân chuẩn phải
trải qua ba thay đổi cơ bản trước khi được dùng làm khuôn để tổng hợp protein.
Trước tiên, mARN được gắn đuôi poly A vào đầu 3’, gắn mũ m7G vào đầu 5’ và cắt
nối intron-exon thành phân tử mARN hoàn chỉnh. Phản ứng methyl hóa tạo cấu trúc
mũ giúp cho ribosome nhận biết được phân tử mARN và bám vào nó. Cấu trúc mũ
còn giúp bảo vệ đầu 5’ của mARN không bị phân cắt bởi exonuclease.
Phản ứng gắn đuôi polyA (~200A) vào các phân tử mARN ở sinh vật nhân

chuẩn xảy ra trong nhân tế bào, khi bị chuyển ra tế bào chất thì đuôi này bị ngắn
dần, tuy nhiên trong thực tế không phát hiện được đuôi polyA nào ngắn hơn 30 A.
Do đó đuôi poly A ngắn nhất để phân tử mARN không bị phân hủy có thể là 30 A.
Đặc biệt để đảm bảo độ bền vững của đuôi, các nucleotide còn được thêm vào. Nói
chung việc thay đổi độ dài đuôi poly A được kiểm soát rất chặt chẽ.
Các mARN sinh vật nhân chuẩn khá bền vững. Các mARN kém bền do
chúng mang các đoạn nucleotide đặc biệt tại đầu 3’ kích thích sự phân hủy mARN.
Khi đoạn nucleotide giàu A và U ở vùng 3’ không dịch mã của phân tử mARN kém
bền được ghép vào một số phân tử mARN bền vững khác thì những phân tử này trở
nên kém bền do đuôi poly A bị cắt ngắn rất nhanh. Như vậy đoạn nucleotide giàu
AU kích thích sự phân hủy mARN thông qua việc giảm độ dài đuôi poly A. Ngoài
ra, một số mARN có chứa vị trí đặc hiệu ở đầu 3’ được nhận biết bởi endonuclease.
Thông thường, các protein giữ vai trò chủ đạo kiểm soát quá trình phiên mã
cũng như dịch mã, tuy nhiên hoạt động của một số gen lại được điều khiển bởi các
ARN có kích thước nhỏ 21-27 nucleotide được hình thành khi số lượng mARN của
gen đích tăng quá mức trong tế bào gọi là miARN, miARN sẽ tạo phức phân cắt
mARN hoặc ức chế ribosome tổng hợp protein.
Điều hòa dịch mã
Ở sinh vật nhân sơ, số lần dịch mã của hầu hết các phân tử mARN đều giống
nhau, chỉ có sự thay đổi nhỏ từ gen này tới gen khác. Ở sinh vật nhân chuẩn, sự dịch
mã đôi khi được điều hòa gồm các kiểu kiểm soát một phân tử mARN không được
dịch mã khi chưa nhận được tín hiệu, điều hòa thời gian sống của một phân tử
mARN nhất định, điều hòa tốc độ tổng hợp toàn bộ protein.

14


1.2.4. Ứng dụng promoter trong công nghệ gen thực vật
Promoter đóng vai trò quan trọng trong quá trình chuyển gen nói chung và
chuyển gen ở thực vật nói riêng. Việc chuyển nạp gen ở các giống cây có ý nghĩa

kinh tế thường rất khó vì vậy, cần phải thử nghiệm tiềm năng biểu hiện của gen chỉ
thị chọn lọc với các promoter khác nhau. Nhiều promoter được dùng trong chuyển
gen thực vật đã được nghiên cứu và sử dụng có hiệu quả. Promoter 35s của virus
khảm CaMV hoặc FiMV và promoter NOS thường được sử dụng. Promoter 35S có
tiềm năng cao và thường được sử dụng nhiều trong các thiết kế vetor chuyển gen.
Các promoter cảm ứng có vai trò đối với quá trình biểu hiện các gen chuyển
nạp trong những điều kiện cảm ứng như các gen chống lại quá trình oxi hóa giúp
cho cây chống lại các stress hiếu khí hay các gen kháng kháng sinh tạo ra do nhiệt
độ để chọn các đột biến trong việc tạo ra tín hiệu ở chu trình chuyển hoá các chất
dưới tác dụng của nhiệt. Một số các promoter cảm ứng khác cũng được nghiên cứu
promoter sốc nóng [11], chuỗi khởi động cảm ứng nitrate từ gen nitrite reductase
[12] và các promoter cảm ứng hormone.
Do các mối quan tâm ngày càng nhiều về việc sử dụng thực vật như là hệ
thống mẫu để phát triển sinh học phân tử, nhiều gen và các chuỗi khởi động liên
quan được mô tả. Các gen này được thể hiện trong các loại mô hay trong các giai
đoạn phát triển khác nhau của cây như các gen thể hiện ở hạt phấn [9], ở hoa [59], ở
rễ [26] và ở thân [17].
Các nghiên cứu về gen ubiquitin ở thực yật đã phát hiện ra một số lượng lớn
các nhóm promoter có sự biểu hiện mạnh ở thực vật. Polyubiquitin promoter được
phân lập và xác định đặc tính từ cây ngô, cây thuốc lá, cây hướng dương , khoai
tây, cà chua, lúa, mía đường và đậu tương. Đa số các promoter này điều khiển ở
mức độ cao hơn so với promoter CaMV35S trong quá trình biểu hiện ở các loài
thực yật chuyển gen. Do gen Ubiquitin được biểu hiện ở hầu hết các mô thực vật
trong điều kiện tự nhiên, nên promoter ubiquitin đã được sử dụng để biểu hiện gen
trong các loại thực vật chuyển gen đặc biệt là giữa các loài gần gũi. Sự biểu hiện
mạnh của promoter ubiquitin được chi phối bởi sự xuất hiện của các đoạn intron,
những đoạn chủ yếu định vị trong vùng 5’ không dịch mã của gen ubiquitin [41],

15

[55]. Các đoạn intron gần với bộ 3 khởi đầu dịch mã là những nhân tố cis quan
trọng, là nguyên nhân gây ra sự tăng cường gián tiếp có liên quan đến intron
(intron-mediate enhancement - IME) của quá trình biểu hiện gen ở thực vật [19].
Ngày nay Ubiquitin promoter và actin promoter của lúa thường được sử dụng để
biểu hiện gen ở cây một lá mầm [43]. Trong đó, Ubiquitin promoter được thử
nghiệm trong quá trình điều khiển biểu hiện gen ở cây ngô, lúa, đậu tương...[32],
[41], [46].
1.3. Các gen ET ở thực vật
Các gen ET được phát hiện ngẫu nhiên khi các nhà nghiên cứu thực hiện việc
sàng lọc những nhân tố phiên mã liên quan đến điều hòa phát triển của phôi. Các
nghiên cứu độc lập đối với thư viện cDNA đặc hiệu cho phát triển của hạt đã dẫn tới
tìm ra gen ET ở cây lúa mạch (Hordeum vulgare), cải dầu (Brassica napus) và ở
đậu răng ngựa (Vicia faba). Các gen ET đều có những vùng lặp lại mã hóa cho các
axit amin tương tự nhau. Trong những thí nghiệm trên, các nhà nghiên cứu đã dùng
đầu dò là các oligonucleotide có chứa các trình tự đặc biệt của promoter (yếu tố
cis), bao gồm yếu tố đáp ứng gibberellin GARE (Gibberellic Acid Response
Element), trình tự napA có trong promoter cải dầu [66]. Điều này cho thấy, các gen
ET được biểu hiện trong quá trình phát triển của phôi /hạt. Khi tìm kiếm rộng hơn
trên các cơ sở dữ liệu, các nhà nghiên cứu đã thấy rằng họ gen ET xuất hiện ở cả
thực vật 1 lá mầm và 2 lá mầm [61].
Những khảo sát trên hệ gen của cây Arabidopsis đã phát hiện ra một học
gồm có 3 gen ET. Gen ET thứ ba tương đối ngắn, chỉ vào khoảng 600 bp và thiếu
một số vùng lặp lại, trong khi các gen thứ nhất và thứ hai đều có 4 vùng lặp lại
tương tự nhau. Gen ET thứ nhất nằm trên nhiễm sắc thể số 4, các gen thứ hai và thứ
ba lại năm trên cùng nhiễm sắc thể số 5 [66]. Phân tích trên cơ sở dữ liệu
GenExpress [62] đã cho thấy các gen thứ nhất và thứ hai có mức độ biểu hiện tương
tự nhau ở thân, lá và rễ nhưng sự biểu hiện tăng lên ở các đỉnh sinh trưởng của thân
và rễ. Sự biểu hiện của hai gen này tăng mạnh trong quá trình phát triển phôi /hạt,
đặc biệt là ở giai đoạn sinh trưởng của hạt phấn (Hình 1.5). Vì vậy những promoter

điều khiển của các gen thứ nhất (ET1) và thứ hai (ET2) cũng sẽ có hoạt tính mạnh ở
quá trình phát triển phôi/hạt

16


Hình 1.2. Biểu hiện của các gen ET khi phân tích bằng GenExpress
1.4. Sự phát sinh phôi hữu tính
1.4.1. Phát sinh phôi ở thực vật
Sự phát sinh phôi ở thực vật bắt đầu từ hợp tử và đi qua các giai đoạn phát
triển với các đặc trưng riêng cho từng giai đoạn. Mặc dù có nhiều biến đổi hình thái
đáng kể diễn ra sau khi hạt nảy mầm thì giai đoạn phôi vẫn là giai đoạn quan trọng
nhất bởi chính trong thời gian này đỉnh sinh trưởng và thân - rễ được chuyên biệt
hóa. Do mức độ tiến hóa khác nhau nên sự phát sinh phôi ở thực vật hạt kín và thực
vật hạt trần không giống nhau.
Các giai đoạn của sự phát triển phôi
Sự phát triển của phôi có thể được chia ra thành hai bước chính sau đây:
Sự phát sinh phôi sensu stricto
Ở thực vật hạt kín, sự phát triển bắt đầu bằng giai đoạn hợp tử và kết thúc ở giai
đoạn lá mầm. Sự phát triển có thể được chia ra làm các chuỗi nhiều sự kiện khác
nhau, được mô tả thành ba sự kiện chính:
 Sự phân chia bất đối xứng của họp tử, từ đó phân chia ra một tế bào đỉnh nhỏ
và một tế bào nền lớn.
 Sự phát triển ở hình thái chuyên biệt, diễn ra ở phôi hình cầu.
 Chuyển tiếp sang giai đoạn lá mầm cùng lúc đó có sự khởi phát mầm rễ ở
thực vật hai lá mầm, theo sau là mầm chồi.

17

Chuỗi phát triển của phôi ở thực vật hạt trần có thể chia thành ba giai đoạn:
 Tiền phôi: tất cả các giai đoạn trước khi có sự kéo dài của dây treo.
 Phôi sớm: tất cả các giai đoạn sau khi có sự kéo dài của dây treo cho tới
trước khi hình thành đỉnh sinh trưởng rễ.
 Phôi muộn: sự phát triển mô học mạnh mê, bao gồm việc thiết lập đỉnh sinh
trưởng rễ và chồi.

Hình 1.3. Các giai đoạn phát triển phôi ở thực vật
1.4.2. Phát triển phôi cây Arabidopsis
Sự phát triển phôi ở cây Arabidopsis cũng trải qua các giai đoạn phát triển
tương tự như ở thực vật nói chung. Các phôi sớm được bắt đầu thông qua một quá
trình thụ tinh kép duy nhất trong thực vật có hoa. Trong Arabidopsis thaliana, sự
thụ tinh bao gồm sự kết hợp giữa một tế bào đơn bội tinh trùng của phấn hoa và một
tế bào đơn bội trứng của túi phôi dẫn đến hình thành hợp tử lưỡng bội và sau đó là
phôi. Sự thụ tinh thứ hai mà một tế bào tinh trùng đơn bội kết hợp với một tế bào
lưỡng bội tạo hợp bào nội nhũ tam bội và sau đó các tế bào nội nhũ trưởng thành.
Sau khi thụ tinh, hợp tử phân chia không đối xứng tạo nên hai tế bào có kích
thước khác nhau, tế bào nhỏ ở đỉnh và tế bào lớn ở đáy. Tế bào đỉnh chứa nội chất
được cô đặc lại, đó cùng là nơi chứa nhiều enzym của các hoạt động tổng hợp. Tế
bào đỉnh nguyên phân 3 lần, tạo thành 8 tế bào. Tại giai đoạn này đã có sự phân biệt
chức năng của các vùng.

18