Phân lập và thiết kế các vector mang gen điều khiển chịu hạn phục vụ công tác tạo giống cây chuyển ge

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
VIỆN DI TRUYỀN NÔNG NGHIỆP
***



Chương trình Trọng điểm Phát triển và Ứng dụng Công nghệ Sinh học
trong Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đến năm 2020


BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI

“Phân lập và thiết kế các vector mang gen điều khiển tính chịu
hạn phục vụ công tác tạo giống cây trồng chuyển gen”


Chủ nhiệm đề tài Cơ quan chủ nhiệm đề tài
(Ký tên) (Ký tên và đóng dấu)



TS. Phạm Xuân Hội




Ban chủ nhiệm chương trình Bộ Nông nghiệp và PTNT

8885


HÀ NỘI, 7/2011
NHỮNG TỪ VIẾT TẮT


ABA Abscisis acid
ABRE Yếu tố đáp ứng ABA
ATP Adenosin triphosphate
ADN Acid deoxyribonucleic
ARN Acid ribonucleic
APS Ammonium persulfate
AS Acetosyrigone
Amp Ampicilin
ATP Adenosine triphosphate
BAP 6-benzilaminopurina
bp Base pair (cặp bazơ)
cs Cộng sự
CTAB Cetyltrimethyl Amonium Bromide
CBF Các yếu tố C lặp lại
dNTP Deoxynucleoside triphosphate
ddNTP Dideoxynucleoside triphosphate
DRE Yếu tố đáp ứng hạn

DRE/CRT Yếu tố C lặp lại đáp ứng hạn
DREB Protein liên kết đáp ứng hạn
E.coli Escherichia coli
EDTA Ethylene diamine tetra-acetic acid
ERD Đáp ứng hạ
n sớm
ERF Nhân tố liên kết yếu tố đáp ứng hạn ethylen
EtBr Ethidium bromide
Rnase Ribonuclease
kb Kilo base
LB Luria – Bertani
MCS Vị trí đa điểm cắt
MS Môi trường cơ bản theo Murashinge và Skoog
NAA Naphthaleneacetic acid
NOS Nopaline Synthetase
OD Optical density
PCR Polymerase Chain Reaction
SDS Sodium Dodecyl Sulphate
TAE Tris-acetate- EDTA
T-ADN ADN chuyển
Ti-plasmid Plasmid gây khối u thực vật
Vir Vùng gây độc có khả năng tạo khối u
v/p vòng/ phút
2,4-D 2,4-Dichlorophenoxy acetic acid


DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Các gen tăng cường biểu hiện bởi stress hạn và mã hoá cho chuỗi
polypeptide của các protein có chức năng đã biết

8
Bảng 1.2. Các gen tăng cường biểu hiện trong điều kiện hạn nhưng chức năng
chưa xác định
10
Bảng 1.3. Các gen đã được nghiên cứu và chuyển vào lúa thành công
25
Bảng 1.4. Các dòng lúa chuyển gen kháng hạn đã được nghiên cứu
29
Bảng 2.1. Danh sách 60 giống lúa được khảo sát trong nghiên cứu
33
Bả
ng 2.2. Các chủng vi khuẩn và nấm men được thu thập và sử dụng trong đề tài
34
Bảng 2.3. Các vector và plasmid được sử dụng trong đề tài
34
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng gắn
41
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng tạo vector chuyển gen theo phương pháp
gateway
41
Bảng 3.1. Trình tự các cặp mồi sử dụng trong thí nghiệm nhân dòng gen
OsNAC1
56
Bảng 3.2. Trình tự các cặp mồi sử dụng nhân dòng gen OsNAC6
60
Bảng 3.3. Kết qu
ả khảo sát của 32 giống có khả năng hình thành callus trên 4 loại
môi trường MS có bổ sung các nồng độ 2,4 D (1,5 mg; 1,7 mg; 2 mg và 2,5 mg/l)
102
Bảng 3.4. Kết quả phân tích Anova hai nhân tố 3 lần lặp lại với mức ý nghĩa α

= 0,005 theo chương trình Microsoft Excel 2007 khả năng tạo callus của 32
giống lúa
103
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát khả năng tái sinh của 32 giống lúa trên các môi
trường có bổ sung BAP, kinetin và casein ở các nồng độ khác nhau
104
Bảng 3.6. Kết quả phân tích Anova hai nhân t
ố 3 lần lặp lại với mức ý nghĩa α =
0,005 theo chương trình Microsoft Excel 2007 khả năng tái sinh của 32 giống lúa
104
Bảng 3.7. Trình tự các mồi được sử dụng kiểm tra sự tồn tại của gen trong vi khuẩn
A. Tumefaciens
106
Bảng 3.8. Tóm tắt kết quả biến nạp vector chuyển gen vào vi khuẩn
Agrobacterium
106
Bảng 3.9. Kết quả số callus sống sót trên các môi trường chọn lọc lần I, II và
số callus có chồi tái sinh trên môi tr
ường tái sinh được biến nạp với các vector
chuyển gen khác nhau của giống lúa Chành Trụi.
110
Bảng 3.10. Kết quả phân tích sự tồn tại của gen quan tâm trong các cây lúa
Chành trụi chuyển gen
112
Bảng 3.11. Khả năng giữ nước và phục hồi của các dòng cây chuyển gen/ cây
đối chứng
113
Bảng 3.12. Một số chỉ tiêu sinh trưởng của cây chuyển gen và cây đối chứng
114
Bảng 3.13. Kết quả số callus sống sót trên các môi trường chọn lọc lần I, II và

số callus có chồi tái sinh trên môi trường tái sinh được biến nạp với các vector
chuyển gen khác nhau của giống lúa PB1
120
Bảng 3.14. Kết quả phân tích sự tồn tạ
i của gen quan tâm trong các cây lúa PB1
chuyển gen
122
Bảng 3.15. Số liệu trung bình về chỉ tiêu số lượng hoa/ nhánh hoa và chiều dài
cành hoa của cây chuyển gen và cây đối chứng
126
Bảng 3.16. Bảng tóm tắt số liệu hạt trên các lô thí nghiệm
127
Bảng 3.17. Bảng thống kê tỷ lệ phát triển hoa của cây chuyển gen so với cây
đối chứng
127
Bảng 3.18. Bảng điều tra số tỷ lệ sống sót của Arabidopsis sau 1 tuần ngừng
tướ
i nước
128
Bảng 3.19. Bảng điều tra số tỷ lệ sống sót của Arabidopsis sau 5 ngày tưới nước
có bổ sung muối

129


DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Sơ đồ minh hoạ cơ chế phân tử quá trình tham gia đáp ứng điều
kiện hạn của các gen ở thực vật
6

Hình 1.2: Mô hình quá trình phiên mã
11
Hình 1.3: Hệ thống điều khiển phiên mã của vùng ADN đặc hiệu và nhân tố
phiên mã điều khiển biểu hiện các gen chức năng tham gia phản ứng chống chịu
với điều kiện bất lợi ở Arabidopsis
12
Hình 1.4: Bản đồ Ti- plasmid dạ
ng octopin
21
Hình 1.5: Quá trình chuyển T-ADN vào tế bào thực vật
22
Hình 2.1: Sơ đồ sinh tổng hợp ADNc (A) và adapter (B) để tạo ra các ADNc có
chiều xác định

38
Hình 3.1: Kết quả điện di ARN trên gel agarose biến tính
52
Hình 3.2: Kết quả sinh tổng hợp sợi 1 và sợi 2 cDNA sử dụng sợi khuôn là mARN
của lúa Mộc tuyền (A) và Ngô tẻ vàng (B)
53
Hình 3.3: Kiểm tra nồng độ cDNA có chiều xác định trên đĩa agarose có bổ sung Etbr
53
Hình 3.4: Điện di kiể
m tra sản phẩm PCR với mồi đặc hiệu vector kiểm tra đại
diện kích thước thư viện sơ cấp ở lúa
54
Hình 3.5: Điện di kiểm tra sản phẩm PCR với mồi đặc hiệu vector kiểm tra đại
điện kích thước thư viện sơ cấp ở ngô
55
Hình 3.6: Kết quả chuẩn hóa thư viện sau khi khuếch đại ở các nồng độ pha loãng

theo thứ tự t
ừ 10
-3
đến 10
-7

55
Hình 3.7: Kết quả điện di sản phẩm nhân bản đoạn gen OsNAC1 bằng kỹ thuật
PCR “lồng” từ thư viện ADNc xử lý hạn.
56
Hình 3.8: Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1%
58
Hình 3.9: Trình tự nucleotide và amino acid gen OsNAC1
59
Hình 3.10: Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân bản gen OsNAC6 từ thư viện.
60
Hình 3.11: Kết quả điện di sản phẩm cắ
t giới hạn và sản phẩm PCR khuẩn lạc trên gel
agarose 1%
62
Hình 3.12: Trình tự nucleotide và axit amin dự đoán của gen OsNAC6
63
Hình 3.13: Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân bản gen OsDREB1A trên gel
agarose 1%
64
Hình 3.14: Kết quả điện di sản phẩm cắt giới hạn và sản phẩm PCR khuẩn lạc trên
gel agarose 1%
65
Hình 3.15: Trình tự nucleotide và axit amin dự đoán của gen OsDREB1A
66

Hình 3.16: Điện di sản phẩm nhân bản gen OsDREB2A
67
Hình 3.17: Ảnh điện di sản phẩm cắt giới hạn và sản phẩm PCR khuẩn lạc mang gen
OsDREB2A
68
Hình 3.18: Trình tự nucleotide và axit amin dự đoán của gen OsDREB2A
69
Hình 3.19: Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân bản gen ZmDREB2A trên gel
agarose 1%
70
Hình 3.20: Kết quả điện di sản phẩm cắt giới hạn bằ
ng BamHI trên gel
agarose 1%
74
Hình 3.21: Trình tự nucleotide và axit amin dự đoán của gen ZmDREB2A
72
Hình 3.22: Điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân bản gen OsDREB1A
73
Hình 3.23: Kiểm tra plasmid tái tổ hợp
74
Hình 3.24: Trình tự nucleotide và axit amin của gen OsAREB1A
74
Hình 3.25: Điện di kiển tra sản phẩm tách ADN tổng số của lúa Mộc Tuyền và
ngô nếp
75
Hình 3.26: Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân bản promoter từ ADN tổng số
của lúa và ngô trên gel agarose 1%
76
Hình 3.27: Sơ đồ thi
ết kế vector pBIG-Lip9

78
Hình 3.28: Một phần kết quả giải trình tự promoter Lip9 trong vector tái tổ hợp
pBIG-Lip9
79
Hình 3.29: Sơ đồ thiết kế “vector cho” pUC19-Ubiquitin
80
Hình 3.30: Một phần kết quả giải trình tự vector tái tổ hợp pUC19-Ubiquitin
81
Hình 3.31: Ảnh điện di sản phẩm cắt giới hạn và sản phẩm PCR khuẩn lạc mang gen
OsDREB1A
82
Hình 3.32: Kết quả giải trình tự gen OsDREBB1A trong vector biểu hiện
pGEX-4T
84
Hình 3.33:
Ảnh điện di trên gel SDS-PAGE protein tái tổ hợp OsDREB1A-GST 85
Hình 3.34: Điện di trên gel polyacrylamide 12% đánh giá khả năng bám của
protein OsDREB1A lên vùng ADN đặc hiệu của nhóm gen DREB.
86
Hình 3.35: Ảnh điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc mang gen OsNAC1
89
Hình 3.36: Kết quả giải trình tự gen OsNAC1 trong vector biểu hiện pGEX-4T
89
Hình3.37: Ảnh điện di trên gel SDS-PAGE protein tái tổ hợp OsNAC1-GST
90
Hình 3.38: Điện di trên gel polyacrylamide 12% đánh giá khả năng bám của
91

protein OsNAC1 lên vùng ADN đặc hiệu của nhóm gen NAC.
Hình 3.39: Một phần kết quả giải trình tự pUC19-Ubi mang gen mã hóa các

nhân tố phiên mã
93
Hình 3.40: Sơ đồ thiết kế vector biểu hiện gen pBCKH-Ubi mang gen điều khiển
chịu hạn
94
Hình 3.41: Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc trên gel agarose 1%
95
Hình 3.42: Một phần kết quả giải trình tự pBCKH-Ubi mang gen mã hóa các nhân
tố phiên mã
96
Hình 3.43: Kết quả điệ
n di sản phẩm PCR khuẩn lạc trên gel agarose 1%
98
Hình 3.44: Một phần kết quả giải trình tự pBIG-Lip9 mang gen mã hóa các nhân
tố phiên mã
99
Hình 3.45: Vector pCB301-35S
100
Hình 3.46: Kết quả kiểm tra các khuẩn lạc Agrobacterium được biến nạp
với các vector
107
Hình 3.47: Hình ảnh minh họa các bước chuyển gen vào giống lúa Chành Trụi
109
Hình 3.48: Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra sự có mặt của các gen điều
khiển trong các cây lúa Chành trụi chuyển gen.

111
Hình 3.49: Kết quả so sánh hiệu quả của các cách khử trùng hạt khác nhau
117
Hình 3.50: Kết quả so sánh callus trên các môi trường khác nhau.

118
Hình 3.51: Hình ảnh so sánh mức độ tái sinh của giống lúa PB1 trên các
loại môi trường
119
Hình 3.52: Kết quả so sánh quá trình tái sinh và phát triển của các callus và cây
tái sinh mang các promoter khác nhau
121
Hình 3.53: Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra sự có mặt của các gen điều
khiển trong các cây lúa PB1 chuyển gen
122
Hình 3.54: Hình ảnh minh họa kết quả chuy
ển gen vào cây Arabidopsis
123
Hình 3.55: Kết quả kiểm tra ARN tổng số và sản phẩm RT-PCR của cây
Arabidopsis chuyển gen
124
Hình 3.56: Biểu đồ so sánh chiều cao cây ở các giai đoạn lá khác nhau
125
Hình 3.57: Hình ảnh về sự hình thành hoa của cây Arabidopsis chuyển gen
125
Hình 3.58: Hình ảnh các cây Arabidopsis sau 1 tuần ngừng tưới nước
129
Hình 3.59: Hình ảnh các cây Arabidopsis sau 5 ngày tưới nước có bổ sung muối
130
Báo cáo kết quả khoa học Đề tài phân lập & thiết kế vector chuyển gen chịu hạn


155

Mục lục

MỞ ĐẦU 1
Chương 1. TỔNG QUAN 4
1.1. TÁC ĐỘNG CỦA HẠN HÁN ĐẾN SẢN XUẤT NÔNG NGHIỆP 4
1.2. CÁC GEN LIÊN QUAN ĐẾN CƠ CHẾ CHỐNG CHỊU HẠN CỦA THỰC VẬT 5
1.2.1. Các gen chức năng tham gia đáp ứng điều kiện hạn 7
1.2. 2. Các nhân tố phiên mã liên quan đến tính chịu hạn ở thực vật 11
1.3. THỰC VẬT CHUYỂN GEN VÀ MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP TẠO THỰC VẬT
CHUYỂN GEN 18
1.3.1. Khái niệm cây trồng biến đổi gen 18
1.3.2. Phương pháp tạo cây chuyển gen 19
1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TẠO GIỐNG LÚA CHUYỂN GEN CHỊU HẠN TRÊN
THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM 23
1.4.1. Tình hình nghiên cứu tạo giống lúa chuyển gen chịu hạn trên thế giới 23
1.4.2. Tình hình nghiên cứu tạo giống lúa chuyển gen chịu hạn ở Việt Nam 31
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 33
2.1. VẬT LIỆU 33
2.1.1. Mẫu thực vật 33
2.1.2. Các chủng nấm, vi khuẩn 34
2.2. PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 35
2.2.1. Tách chiết ADN và ARN tổng số 35
2.2.2. Tinh sạch ARN thông tin 36
2.2.3. Sinh tổng hợp cDNA và xây dựng thư viện cDNA Hybrid Zap 2.1 37
2.2.4. Phương pháp đánh giá thư viện cDNA 38
2.2.5. Phương pháp khuếch đại trình tự ADN (phản ứng chuỗi trùng hợp-PCR) 39
2.2.6. Tách dòng gen và tạo vector tái tổ hợp 40
2.2.7. Chuẩn bị tế bào vi khuẩn khả biến 42
2.2.8. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn bằng phương pháp sốc nhiệt 42
2.2.9. Tách và tinh sạch plasmid từ tế bào vi khuẩn E. coli 43
2.2.10. Giải trình tự gen tự động 44
2.2.11. Biểu hiện và tinh sạch protein tái tổ hợp trong tế bào vi khuẩn E. coli 45

2.2.12. Xác định khả năng liên kết đặc hiệu của protein tái tổ hợp với trình tự ADN đích 46
2.2.13. Nuôi cấy in-vitro ở lúa (theo Hiei và cs. 2008 có biến đổi) 46
2.2.14. Đánh giá sinh trưởng, phát triển và khả năng chịu hạn của lúa chuyển gen 47


Báo cáo kết quả khoa học Đề tài phân lập & thiết kế vector chuyển gen chịu hạn


156

2.2.15. Chuyển gen vào Arabidopsis thaliana 48
2.2.16. Đánh giá sinh trưởng và khả năng chịu hạn của Arabidopsis chuyển gen 49
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 51
3.1. THIẾT KẾ THƯ VIỆN cDNA CHỊU HẠN CỦA LÚA VÀ NGÔ 51
3.1.1. Tách ARN tổng số (ttARN) từ mô thực vật và tinh sạch ARN thông tin (mARN) 51
3.1.2. Sinh tổng hợp cDNA có chiều xác định 52
3.1.3. Xây dựng thư viện cDNA Hybrid Zap 2.1 54
3.2. PHÂN LẬP CÁC GEN MÃ HÓA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ LIÊN QUAN ĐỂN HẠN 56
3.2.1. Phân lập gen mã hóa nhân tố phiên mã OsNAC1 56
3.2.2. Phân lập gen mã hóa nhân tố phiên mã OsNAC6 60
3.2.3. Phân lập gen mã hóa nhân tố phiên mã OsDREB1A 63
3.2.4. Phân lập gen mã hóa nhân tố phiên mã OsDREB2A 66
3.2.5. Phân lập gen mã hóa nhân tố phiên mã ZmDREB2A 69
3.2.6. Phân lập gen mã hóa nhân tố phiên mã OsAREB1A 72
3.3. PHÂN LẬP CÁC PROMOTER TỪ ADN TỔNG SỐ CỦA LÚA VÀ NGÔ 75
3.3.1. Tách chiết ADN tổng số từ mẫu mô lúa và ngô 75
3.3.2. Phân lập các promoter Ubiquitin, Lip9 75
3.3.3. Ghép nối promoter vào các vector chuyển gen 78
3.4. XÁC ĐỊNH VÙNG ADN ĐẶC HIỆU (cis acting) CỦA CÁC NHÂN TỐ PHIÊN MÃ 81
3.4.1. Xác định khả năng liên kết đặc hiệu trình tự đích của nhóm nhân tố phiên mã DREB 81

3.4.2. Xác định khả năng liên kết đặc hiệu trình tự đích của nhóm nhân tố phiên mã NAC 87
3.5. THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MÃ HÓA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ 92
3.5.1. Thiết kế các vector chuyển gen pBCKH điều khiển bởi promoter Ubiquitin 92
3.5.2. Thiết kế hệ thống vector chuyển gen pBIG mang promoter Lip9 97
3.5.3. Thiết kế vector biểu hiện mang gen OsAREB1A 100
3.6. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG HOẠT ĐỘNG CỦA GEN ĐIỀU KHIỂN CHỊU HẠN TRONG
CÂY LÚA CHUYỂN GEN 101
3.6.1. Nghiên cứu khả năng tạo callus và tái sinh cây của tập đoàn các giống lúa Việt Nam 101
3.6.2. Tạo các chủng Agrobacterium tái tổ hợp mang gen mã hóa nhân tố phiên mã 105
3.6.3. Chuyển gen điều mã hóa nhân tố phiên mã liên quan đến tính chịu hạn vào lúa Chành trụi
và xác định sự có mặt của gen chuyển trong các cây lúa chuyển gen 108
3.6.4. Chuyển gen điều khiển tính chịu hạn vào lúa Pusa Basmati 1 thông qua Agrobaterium 115
3.7. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG HOẠT ĐỘNG CỦA GEN ĐIỀU KHIỂN CHỊU HẠN
OsAREB1A TRONG CÂY ARABIDOPSIS CHUYỂN GEN 122



Báo cáo kết quả khoa học Đề tài phân lập & thiết kế vector chuyển gen chịu hạn


157

3.7.1. Chuyển gen điều khiển tính chịu hạn OsAREB1A vào Arabidopsis thông qua Agrobaterium
và kiểm tra cây chuyển gen bằng phương pháp RT-PCR 122
3.7.2. Khả năng sinh trưởng của cây chuyển gen và cây đối chứng thông qua từng giai đoạn 124
3.7.3. Phân tích tổng hợp các kết quả thí nghiệm đánh giá mức độ biểu hiện của gen OsAREB1A
trong các cây Arabidopsis chuyển gen 127

Chương 4. TỔNG QUÁT HÓA VÀ ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ THU ĐƯỢC 131
4.1. KẾT QUẢ VỀ KHOA HỌC 131

4.2. KẾT QUẢ ĐÀO TẠO 137
4.3. KẾT QUẢ NỔI BẬT 139
4.4. TRÌNH ĐỘ CÔNG NGHỆ 139
4.5. KHẢ NĂNG ÁP DỤNG 139
4.6. TÌNH HÌNH SỬ DỤNG KINH PHÍ 140
4.7. DANH SÁCH CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ 140
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 142
KẾT LUẬN 142
ĐỀ NGHỊ 143
TÀI LIỆU THAM KHẢO 144
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 144
TÀI LIỆU TIẾNG ANH 145
TRANG WEB 154









Báo cáo kết quả khoa học Đề tài phân lập & thiết kế vector chuyển gen chịu hạn


1


MỞ ĐẦU
Các yếu tố bất lợi của môi trường hiện đang là những thách thức lớn cho mục tiêu

duy trì sự phát triển bền vững trong trong sản suất lương thực của loài người. Tình trạng
môi trường hiện nay ở Việt Nam cho thấy hạn và mặn là hai trong số những nhân tố quan
trọng nhất kìm hãm sự phát triển sản suất nông nghiệp. Lúa là một trong những cây trồng
quan trọng nhất trên thế giới với h
ơn 3 tỷ người tiêu dùng mỗi ngày. Ở Việt Nam, lúa là
cây lương thực quan trọng nhất, đóng góp hơn 60% tổng sản lượng lương thực của cả
nước và được gieo trồng với diện tích 5,7 triệu hecta - lớn nhất trong tất cả các loại cây
trồng. Tuy nhiên, 50% diện tích lúa đang được canh tác trong điều kiện môi trường bấp
bênh, rất dễ bị tác động bởi các yếu tố ngoại cảnh bấ
t lợi như hạn, mặn, lạnh…. Do đó,
việc nghiên cứu đặc tính các gen đáp ứng hạn và mặn cũng như việc đánh giá khả năng
áp dụng của chúng là một yêu cầu hết sức cấp thiết.
Sự gia tăng năng suất lúa có bước nhảy đột phá trong nửa thế kỷ qua, với sản
lượng tăng gấp đôi ở hầu hết các nơi trên thế gi
ới và thậm chí là gấp ba ở một số vùng
nhất định. Tuy nhiên tốc độ tăng năng suất lúa đã có hiện tượng bão hoà trong thập kỷ
qua, chủ yếu do sự thiếu vắng những công nghệ nhân giống mới, sự giảm sút tính đa dạng
di truyền các giống lúa, sự giảm sút năng suất lúa nghiêm trọng do xuất hiện ngày càng
nhiều côn trùng, bệnh dịch và các yếu tố bất lợi môi trường. Nế
u chỉ sử dụng các phương
pháp truyền thống, năng suất lúa gạo của Việt Nam không thể tăng quá 20 - 25% trong
vòng 10 năm tới, điều này không đáp ứng được tốc độ tăng dân số và nhu cầu xuất khẩu
của Việt Nam. Do đó, đã đến lúc chúng ta phải kết hợp phương thức chọn gi
ống truyền
thống với công nghệ sinh học để chọn giống một cách chính xác các giống lúa có các tính
trạng mong muốn như chống sâu bệnh, chịu điều kiện mặn và hạn…. Trong khi các
phương pháp chọn giống truyền thống vẫn là chỗ dựa chủ yếu thì các công cụ chọn giống
cây trồng sử dụng công nghệ sinh học hiện đại sẽ đóng vai trò quan trọng trong việc hiện
thực hóa mộ
t bước nhảy vọt trong cải tạo giống lúa.

Cách tiếp cận hướng nghiên cứu về stress thực vật trên thế giới hiện nay đang tập
trung vào việc phân lập và nghiên cứu đặc tính một tập hợp đầy đủ các gen liên quan đến
bất lợi môi trường và mối liên hệ giữa các bất lợi mặn, hạn và nhiệt độ. Hàng trăm gen
được cảm ứng trong các điều kiện bất lợ
i khác nhau và sản phẩm của các gen cảm ứng
Báo cáo kết quả khoa học Đề tài phân lập & thiết kế vector chuyển gen chịu hạn


2

với điều kiện bất lợi được chia làm hai nhóm: (1) nhóm các protein giúp thực vật chống
lại bất lợi của môi trường và (2) nhóm các protein làm nhiệm vụ điều hòa biểu hiện gen
và truyền tín hiệu trong quá trình đáp ứng điều kiện bất lợi. Các nhân tố phiên mã thuộc
nhóm thứ hai và là họ gen lớn. Gần đây, rất nhiều nghiên cứu về nhân tố phiên mã được
thực hiện trên cây mô hình Arabidopsis và các loài thực vật khác
đã chứng minh vai trò
quan trọng của chúng trong quá trình điều hòa phản ứng của thực vật trong các điều kiện
bất lợi môi trường.
Riêng về vấn đề chịu hạn, các giống cây trồng chịu hạn được sử dụng trong sản
xuất trước đây đều được lai tạo bằng các phương pháp chọn giống truyền thống. Hầu như
chưa có giống cây trồng chịu h
ạn nào được tạo ra bằng phương pháp Công nghệ Sinh
học. Hiện nay, hai định hướng chọn giống chịu hạn đang được các nhà khoa học đặc biệt
quan tâm sử dụng là chọn giống phân tử và chọn giống chuyển gen. Tính trạng chịu hạn
là tính trạng đa gen (với sự tham gia của hàng trăm gen khác nhau), vì vậy định hướng
chọn giống phân tử đang gặp khó khăn lớn trong việc quy tụ các tính trạ
ng, gen quan
trọng liên quan đến chịu hạn.
Gần đây, dựa trên những thành tựu của chương trình nghiên cứu chức năng hệ gen
thực vật cùng với sự phát triển các kỹ thuật microarray, proteomic , các nhà khoa học đã

phát hiện và chứng minh vai trò quan trọng của nhóm gen mã hóa nhân tố phiên mã
(Transcription factor) trong việc tăng cường tính chịu hạn ở thực vật. Nhóm gen mã hóa
nhân tố phiên mã mặc dù không tham gia trực tiếp vào phản ứng đáp ứng với đi
ều kiện
hạn ở thực vật nhưng sự biểu hiện của chúng lại có vai trò kích hoạt sự biểu hiện của rất
nhiều gen chức năng khác tham gia vào quá trình đáp ứng hạn, dẫn tới làm tăng cường
khả năng chịu hạn ở thực vật. Phát hiện này đã mở ra một hướng nghiên cứu rất mới cho
lĩnh vực chọn giống chuyển gen ở
thực vật, đó là chỉ cần chuyển 1 hay 1 vài gen mã hóa
nhân tố phiên mã thay vì vài trăm gen chức năng vào cây để tăng cường tính chống chịu
bất lợi môi trường của cây trồng. Chính vì lí do này mà các nghiên cứu phân lập, đặc tính
hoá các gen mã hóa nhân tố phiên mã liên quan đến tính chịu hạn đang trở thành định
hướng nghiên cứu đầy tiềm năng trong việc chọn tạo giống chịu hạn.
Xuất phát từ các luận điểm trên đề tài: “
Phân lập và thiết kế các vector mang gen
điều khiển tính chịu hạn phục vụ công tác tạo giống cây trồng chuyển gen” đã được tiến
hành nhằm tạo được các hệ vector mang gen mã hóa nhân tố phiên mã biểu hiện trong
Báo cáo kết quả khoa học Đề tài phân lập & thiết kế vector chuyển gen chịu hạn


3

điều kiện hạn ở cây một lá mầm phục vụ công tác tạo giống cây trồng chuyển gen, trong đó
có các mục tiêu cụ thể như sau:
- Phân lập các gen mã hóa nhân tố phiên mã liên quan đến tính chịu hạn, các
promoter biểu hiện liên tục và trong điều kiện bất lợi môi trường ở cây trồng; thiết kế các
vector chuyển gen mang gen mã hóa nhân tố phiên mã liên quan đến tính chịu hạn biểu
hiện dưới sự điều khi
ển của promoter biểu hiện liên tục hoặc trong điều kiện bất lợi môi
trường nhằm tăng cường hiệu quả công tác tạo giống cây trồng chịu hạn theo định hướng

chuyển gen.
- Thử nghiệm hoạt động của các gen mã hóa nhân tố phiên mã liên quan đến chịu
hạn/ promoter biểu hiện liên tục hoặc trong điều kiện bất lợi môi trường trên cây mô hình
(lúa, Arabidopsis) để tìm ra vector có hoạt tính t
ăng cường tính chịu hạn phục vụ nghiên
cứu tạo giống cây trồng chuyển gen
















Báo cáo kết quả khoa học Đề tài phân lập & thiết kế vector chuyển gen chịu hạn


4


Chương 1. TỔNG QUAN

1.1. TÁC ĐỘNG CỦA HẠN HÁN ĐẾN SẢN XUẤT NÔNG NGHIỆP
Hạn hán là một trong những nguyên nhân chính làm giảm năng suất cây trồng và
làm cho sản lượng Nông nghiệp toàn cầu không ổn định. Hàng năm, các điều kiện bất lợi
của môi trường làm giảm 50% năng suất mùa màng, trong đó tính riêng hạn hán chiếm
tới 15%. Thậm chí ở một số nơi có mực nước ngầm thấp, có năm hạn làm giảm 100%
nă
ng suất mùa màng [31]
Tại Trung Quốc, hạn hán nghiêm trọng thường xuyên xảy ra ở các tỉnh miền
Bắc. Tính trạng hạn hán kéo dài từ cuối tháng 7/ 2009 đã ảnh hưởng nghiêm trọng vùng
trồng ngô lớn nhất Trung Quốc và có nguy cơ thu hẹp 60% diện tích trồng trọt. Đây là
trận hạn hán nghiêm trọng nhất quốc gia này trong vòng 60 năm qua và tác động lên
hầu hết các vùng sản xuất lúa mì trong lãnh thổ Cộng hòa Nhân dân Trung Hoa. Ngoài
việc phá hủy vụ mùa lúa mì, hạn hán còn gây ra tình trạng thiế
u nước cho ước tính
khoảng 2,31 triệu người và 2,57 triệu gia súc. Trong tám tỉnh chịu tác động, 20% đất
nông nghiệp và 35% tổng diện tích lúa mì đều bị ảnh hưởng. Đến tháng 2 năm 2011,
trận hạn hán ảnh hưởng lên diện tích 7,73 triệu hécta lúa mì vụ đông sắp được thu
hoạch. Theo Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc, thiệt hại vụ thu
hoạch lúa mì của Trung Quốc có khả năng là một yếu tố
đã làm tăng giá lúa mì trên
toàn thế giới vào đầu năm 2011 [105] .
Ấn Độ cũng đang phải đối mặt với đợt hạn hán nghiêm trọng nhất trong vòng 7 năm
qua. Hiện nay đã có hơn 1/3 số quận của Ấn Độ rơi vào tình trạng hạn hán. Thiếu hụt
lượng mưa cần thiết có thể khiến tăng trưởng kinh tế của quốc gia này giảm sút 1% trong
năm nay. Đợt hạn hán tồi t
ệ nhất trong lịch sử gần 20 năm qua tại Thái Lan vào năm 2002
đã đẩy quốc gia xuất khẩu gạo lớn nhất thế giới đối mặt với vụ mùa thất thu. Và theo thông
báo mới nhất của cơ quan ngăn ngừa và giảm thiểu thảm họa Thái Lan, 354 huyện thuộc
47 trên tổng số 77 tỉnh, thành của nước này nằm trong khu vực thảm họa hạn hán[105].
Ở Việt Nam, hạn hán xảy ra ngày càng kéo dài hơ

n trước và ảnh hưởng ngày càng
trầm trọng hơn đối với sản xuất nông nghiệp. Hạn hán năm 1962 ở Bắc và Bắc Trung Bộ
Báo cáo kết quả khoa học Đề tài phân lập & thiết kế vector chuyển gen chịu hạn


5

đã phá huỷ 370.000 ha hoa màu. Trận hạn hán 1982 đã tàn phá 180.000 ha cây màu ở
đồng bằng sông Cửu Long. Trong năm 1983, chúng ta đã mất 291.000 ha trồng lúa do
hạn hán. Vụ Đông Xuân năm 1992-1993, sản lượng lúa của đồng bằng sông Cửu Long
giảm 559.000 tấn. Năm 1993 khoảng 175.000 ha ở miền Trung bị hạn, trong đó 35.000
ha bị chết hoàn toàn, mất khoảng 150.000 tấn lương thực. Vụ hạn 1994-1995 ở Đăk Lắk
được xem là nặng nề nhất trong 50 năm g
ần đây, đã làm giảm doanh thu từ cây cà phê
khoảng 600 tỉ đồng. Trận hạn hán khác năm 1995-1996 ở Miền Bắc tàn phá hoa màu
khoảng 13.380 ha vùng Trung Du và 100.000 ha vùng đồng bằng sông Hồng. Đặc biệt,
hạn hán năm 1998 xảy trên toàn lãnh thổ việt Nam với tổng diện tích bị hạn hán là
734.284 ha, trong đó 276.656 ha ở đồng bằng sông Cửu Long. Trận hạn hán này đã ảnh
hưởng tới 3,8 triệu dân, gây thiệt hại khoảng 5.000 tỉ đồng VN [103]. Các tỉ
nh từ Khánh
Hoà đến Bình Thuận thường xuyên xảy ra hạn hán với tổng số diện tích hạn hán lên tới
300.000 ha. Tại Bình Thuận, năm 2004, hạn hán xảy ra trầm trọng khiến diện tích trồng
trọt giảm 30 - 50%. Đợt nắng nóng kéo dài cuối năm 2009 khiến ngành nông nghiệp các
tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long bị thiệt hại hàng trăm tỉ đồng. Tỉnh Kiên Giang có
khoảng 13.400 ha lúa bị ảnh hưởng, trong đó hơn 3.000 ha bị
mất trắng hoàn toàn, thiệt
hại gần 80 tỉ đồng. Thiệt hại nặng nhất là huyện Giá Rai, ước tính chỉ riêng huyện này đã
bị thiệt hại gần 50 tỉ đồng. [104]
Theo tính toán của Tổng cục Thủy lợi (CAO), thuộc Bộ Nông nghiệp và Phát triển
Nông thôn (04/ 2010), nếu tình hình khô hạn, thiếu nước ngọt như hiện nay tiếp tục kéo

dài sẽ ảnh hưởng tới năng suất của khoả
ng 26.000 ha lúa đông xuân ở các vùng Trung du,
Đồng bằng Bắc bộ và khoảng 100.000 ha ở Nam bộ. Cũng theo Cục Thuỷ lợi, Bộ Nông
nghiệp và phát triển nông thôn, nắng nóng, khô hạn kéo dài tại các tỉnh Nam Trung Bộ và
Tây Nguyên đã làm hơn một triệu người thiếu nước sinh hoạt. Sơ bộ, tổng thiệt hại do
hạn hán tại 2 khu vực này đã lên tới 1.258 tỷ đồng.
1.2. CÁC GEN LIÊN QUAN ĐẾN CƠ CHẾ CHỐNG CHỊU HẠN CỦA TH
ỰC VẬT
Điều kiện bất lợi môi trường gây ra hàng loạt các thay đổi về hình thái, sinh lý,
sinh hoá và phân tử, ảnh hưởng bất lợi cho sinh trưởng và phát triển của thực vật. Trong
các điều kiện bất lợi môi trường, hạn là một trong những yếu tố quan trọng nhất, đặc biệt
trong bối cảnh thay đổi khí hậu toàn cầu. Thực vật phải tạo ra hàng loạt các thay đổi về
mặ
t sinh lý để tồn tại và thích nghi với điều kiện hạn hán như: đóng khí khổng, giảm hô
hấp và quang hợp, giảm thể tích nước trong các mô, chậm quá trình sinh trưởng. Ở mức
Báo cáo kết quả khoa học Đề tài phân lập & thiết kế vector chuyển gen chịu hạn


6

độ phân tử, điều kiện hạn sẽ làm cho thực vật gia tăng mức độ biểu hiện và tích luỹ của
các gen/ protein chống chịu stress [79, 94].
Ở Arabidopsis, các protein kinase, nhân tố phiên mã (transcription factor),
phosphatase, protease, protein biểu hiện trong giai đoạn muộn của phôi (late
embryogenesis abundant - LEA), protein sinh tổng hợp Abscisic acid (ABA), các protein
sinh tổng hợp đường (proline, mannitol, sorbitol) và hàng loạt các protein chức năng khác
đã được phân lập, nghiên cứu đặc tính và chứng minh tham gia vào quá trình chịu hạn ở
thực vật [66].

Hình 1.1. Sơ đồ minh hoạ cơ chế phân tử quá trình tham gia đáp ứng điều kiện hạn

của các gen ở thực vật
Các protein tham gia vào quá trình chống hạn của thực vật được phân thành hai
nhóm: (1) nhóm protein chức năng trực tiếp tham gia đáp ứng điều kiện hạn (ABA, LEA,
proline, mannitol, sorbitol ); (2) nhóm protein điều khiển sự biểu hiện của các gen chức
Báo cáo kết quả khoa học Đề tài phân lập & thiết kế vector chuyển gen chịu hạn


7

năng liên quan đến tính chịu hạn (nhân tố phiên mã, kinase ). Các nhân tố phiên mã bám
vào trình tự ADN đặc hiệu trên vùng khởi động gen của các gen chức năng tham gia vào
tính chịu hạn và hoạt hóa sự biểu hiện của các gen này và kết quả là tăng cường tính chịu
hạn ở thực vật. Các nghiên cứu về gen đã chứng minh vùng khởi động gen của nhiều gen
chức năng chứa một hoặc nhiều trình tự ADN đặc hiệu là đi
ểm bám của một nhân tố phiên
mã. Điều này chứng tỏ một nhân tố phiên mã có thể hoạt hóa biểu hiện của nhiều gen chức
năng. Các nghiên cứu biểu hiện gen đã chứng minh nhiều nhân tố phiên mã biểu hiện mạnh
trong điều kiện hạn, chứng tỏ nhóm protein này đóng vai trò quan trọng trong cơ chế điều
hòa và biểu hiện của các gen tăng cường tính kháng hạn ở thực vậ
t [79, 94].
1.2.1. Các gen chức năng tham gia đáp ứng điều kiện hạn
Các gen liên quan đến các quá trình chuyển hoá
Sự thay đổi chuyển hoá sơ cấp trong cơ thể là một cách đáp ứng thông thường với
điều kiện stress ở thực vật. Ví dụ, một cDNA mã hoá cho enzyme glyceraldehyde-3-
phosphate dehydrogenase được phân lập từ cây C. plantagineum (bảng 1) tăng cường
biểu hiện khi bị xử lý trong điều kiện hạn và xử lý ABA [89]. Tuy nhiên các mức độ
tăng
cường biểu hiện của enzyme có liên quan với các yếu tố stress môi trường ở thực vật,
phản ánh sự gia tăng nhu cầu về năng lượng. Các protease có thể cũng là một nhân tố
quan trọng của các quá trình chuyển hoá trong điều kiện stress. Chúng góp phần làm

ngừng việc sử dụng các protein thừa và phân hủy các chuỗi peptit trong các túi chứa, qua
đó giải phóng các axit amin tự do để sử dụng cho việc tổng hợp số l
ượng lớn các protein
mới (bảng 1.1 và 1.2, [37]).
Các gen tham gia quá trình biến đổi tính thấm của tế bào
Thực vật có thể giữ được thế nước (giúp duy trì dòng chảy của nước trong cây)
trong điều kiện khô hạn nhẹ bằng cách biến đổi tính thấm của tế bào, quá trình này bao
gồm việc tận dụng các phân tử đường hay các giải pháp tương thích khác [20]. Cả các
kênh dẫn nước và ion đều có vai trò quan trọng như nhau trong việc điều hòa dòng chả
y
của nước và sự liên hệ giữa các kênh này với điều kiện stress hạn đã được khẳng định qua
việc phân lập, biểu hiện các gen mã hóa cho protein của các kênh này trong việc đáp ứng
sự khô hạn. Phân tử cDNA 7a từ cây đậu Hà Lan (bảng 1.2, [37]) mã hóa một chuỗi
peptit với các điểm đặc trưng của các kênh dẫn ion, trong khi phân tử cDNA RD28 từ cây
A.thaliana (bảng 1.1, [37]) và có thể là cả phân tử aDNA H2-5 từ cây C. plantagineum
đều mã hóa cho protein của các kênh d
ẫn nước [30].
Báo cáo kết quả khoa học Đề tài phân lập & thiết kế vector chuyển gen chịu hạn


8

Bảng 1.1: Các gen tăng cường biểu hiện bởi stress hạn và mã hoá cho chuỗi polypeptide của
các protein có chức năng đã biết (J.Ingram và D. Bartels)
cDNA Nguồn gốc Protein được mã hóa



Báo cáo kết quả khoa học Đề tài phân lập & thiết kế vector chuyển gen chịu hạn

9

Các gen tham gia biến đổi cấu trúc
Các nhà khoa học đã chứng minh điều kiện stress hạn là nguyên nhân gây ra sự
biến đổi trong thành phần hóa học, đặc điểm sinh lý của thành tế bào và những sự thay
đổi này có thể liên quan đến các gen mã hóa cho enzyme sinh tổng hợp
S-adenosylmethionine (bảng 1.1, [37]). Trong điều kiện bình thường, việc tăng cường
biểu hiện các gen sinh tổng hợp S-adenosyl-L-methionine có liên quan đến các vùng
đang diễn ra sự hóa gỗ [69]. Do đó, việc tăng cường bi
ểu hiện trong các mô chịu điều
kiện stress hạn có thể dẫn đến việc hóa gỗ của thành tế bào. Quá trình kéo dài tế bào bị
dừng lại dưới điều kiện stress hạn kéo dài liên tục và ngay sau đó các quá trình hóa gỗ
được khởi động [66].
Espartero và cộng sự đã chứng minh được ở nấm sự thiếu nước có thể gây ra hiện
tượng đồng cảm ứng phiên mã enzyme sinh tổng hợp S-adenosyl-L- methionine với các
enzyme khác nh
ư enzyme thủy phân S-adenosyl-L-homocystein hay một enzyme chuyển
hóa methyl cần thiết cho việc tạo thành tế bào [37].
Các gen tham gia quá trình phá hủy và khôi phục
Các gen cảm ứng với điều kiện hạn mã hóa cho các protein có trình tự tương đồng
với các enzyme phân hủy protein đã được phân lập từ P. sativum (bảng 1.2, [37]) và
A. thaliana (bảng 1.1 và 1.2 [14, 76]). Một trong những chức năng của các enzyme này là
phá hủy các protein bị mất chức năng do tác động của điều kiện hạn [37]. Trong giai
đ
oạn đầu của quá trình bị hạn hán, A. Thaliana tăng cường tổng hợp các phân tử ARN
thông tin mã hóa cho các protein ubiquitin có hoạt tính mạnh. Một protein dung hợp
trong nhóm này có hoạt tính ubiquitin được phát hiện trong quá trình dung giải protein và
sự gia tăng này có thể tương đồng với việc phân hủy protein đã xảy ra vì quá trình gắn
ubiquitin có vai trò xác định protein cho quá trình phân hủy

Sản phẩm của gen cảm ứng điều kiện hạn được phân lập bằng phương pháp sàng
lọc biệ
t hóa có trình tự tương đồng với các protein shock nhiệt. Các gen mã hóa cho các
protein này có thể là các chaperonin, có liên quan đến việc sửa chữa protein thông qua sự
trợ giúp các phân tử protein khác để phục hồi cấu trúc tự nhiên của protein sau khi bị phá
hủy hay gấp nếp sai trong quá trình bị hạn. Các protein shock nhiệt có khối lượng phân tử
nhỏ (bảng 1.2; [27]) cũng có thể là các chaperonin.

Báo cáo kết quả khoa học Đề tài phân lập & thiết kế vector chuyển gen chịu hạn


10

Bảng 1.2. Các gen tăng cường biểu hiện trong điều kiện hạn nhưng chức năng chưa xác
định (J.Ingram và D. Bartels)

Các gen liên quan đến việc loại bỏ độc tố
Các enzyme liên quan đến việc loại bỏ độc tố trung gian trong các quá trình
chuyển hóa hiếu khí như khử hóa glutathione, bẻ gẫy liên kết superoxide tăng cường biểu
hiện trong quá trình đáp ứng lại stress hạn chứng tỏ chúng có vai trò quan trọng trong các
quá trình chống chịu [60]. Việc giảm lượng nước ở lá và đóng khí khổng dẫn đến việc
giảm lượng CO
2
[77]. Sự gia tăng hoạt động hô hấp sáng trong quá trình hạn hán cũng
đồng thời xảy ra do có sự tăng cường các hoạt động oxi hóa glycolate, dẫn đến việc tạo ra
Báo cáo kết quả khoa học Đề tài phân lập & thiết kế vector chuyển gen chịu hạn


11

các phân tử H
2
O
2
[60]. Điều này có thể giải thích tại sao các gen mã hóa cho các enzyme
có hoạt tính loại bỏ độc tố như ascorbate peroxidase (bảng 1; [96]) và superoxide
dismutase (bảng 1.1; [71, 89]) lại tăng cường biểu hiện trong quá trình đáp ứng hạn hán.
1.2. 2. Các nhân tố phiên mã liên quan đến tính chịu hạn ở thực vật
Dòng chảy di truyền từ ADN đến protein trải qua quá trình rất quan trọng là quá
trình phiên mã. Các nhân tố phiên mã bám vào trình tự ADN đặc hiệu trên vùng khởi
động gen của các gen chức năng và điều hòa biểu hiệ
n các gen này.
Nhóm gen mã hóa các nhân tố phiên mã chiếm khoảng 8 - 10% trong mỗi hệ gen
và đóng vai trò quan trọng trong mọi hoạt động của sự sống như quá trình sinh trưởng,
phát triển và chống chịu với bất lợi môi trường Ở lúa, hơn 2600 gen mã hóa nhân tố
phiên mã đã được phân lập và phân chia thành các nhóm, họ và siêu họ dựa theo trình tự
nucleotide và chức năng. Rất nhiều gen mã hóa nhân tố phiên mã liên quan đến chịu hạn
đã được nghiên cứu chức năng ở mức độ
phân tử.


Hình 1.2: Mô hình quá trình phiên mã
Đặc điểm đặc trưng của các nhân tố phiên mã là có hai vùng hoạt động (domain):
(1) vùng hoạt hoá các protein chức năng (activation domain) và (2) vùng liên kết
(binding domain) với các trật tự ADN đặc hiệu (cis-acting element) trên vùng khởi động
gen (promoter). Các nhân tố phiên mã điều hòa biểu hiện các gen chức năng tăng cường
tính chịu hạn phân loại dựa vào trật tự ADN đặc hiệu mà chúng liên kết. Vùng khởi động
gen của hầu hết các gen liên quan đến tính ch
ịu hạn thường chứa một hoặc nhiều trật tự
ADN đặc hiệu phổ biến là ABRE (ABA responsive element - yếu tố đáp ứng ABA) và

Báo cáo kết quả khoa học Đề tài phân lập & thiết kế vector chuyển gen chịu hạn


12

DRE/CRT (Dehydration responsive element/C repeat - yếu tố/đoạn C lặp lại đáp ứng
hạn), NAC, MYB với chức năng tương ứng là điểm bám của các nhân tố phiên mã biểu
hiện phụ thuộc và không phụ thuộc vào nồng độ ABA (hình 1.3).

Hình 1.3: Hệ thống điều khiển phiên mã của vùng ADN đặc hiệu và nhân tố phiên mã điều khiển
biểu hiện các gen chức năng tham gia phản ứng chống chịu với điều kiện bất lợi ở Arabidopsis
Các nhân tố phiên mã biểu hiện không phụ thuộc ABA
Nhóm nhân tố NAC
Các nhân tố phiên mã họ NAC chứa một trình tự đồng nhất (được phát hiện lần đầu
tiên ở Arabidopsis) gọi là vùng hoạt động NAC ở đầu N-tận cùng. Đây là một họ gen đặc
trưng của thực vật, có vai trò quan trọng trong việc xác định mô phân sinh đỉnh chồi [81],
biệt hóa các cơ quan rễ, hoa trong sinh trưởng phát triển thực vật [16, 47], phản ứng vớ
i
điều kiện bị tổn thương và tác nhân gây hại tấn công [15, 28], tăng cường tính chịu hạn, mặn
và các điều kiện bất lợi thời tiết [
64]. Có ít nhất khoảng 100 gen thuộc họ NAC trong hệ gen
của Arabidopsis và 75 gen trong hệ gen lúa đã được phân lập nhưng chỉ một số ít gen trong
số này được nghiên cứu chức năng [68]. Phần lớn protein của các gen thuộc họ NAC có
Báo cáo kết quả khoa học Đề tài phân lập & thiết kế vector chuyển gen chịu hạn


13

chứa một vùng liên kết ADN ở tận cùng đầu N có độ bảo thủ cao, một trình tự tín hiệu định
vị nhân và một vùng tận cùng đầu C biến đổi [46].

Trật tự ADN đặc hiệu NACRS bao gồm 62 nucleotide, lần đầu tiên được phát hiện
trên vùng khởi động gen ERD1 (early responsive to dehydration-1) liên quan đến tính
kháng hạn ở thực vật. Các nhà khoa học đã tìm thấy nhân tố phiên mã thuộc họ NAC
bám vào trật tự ADN đặc hiệu NACRS (14bp CACTAAATTGTCAC và trình tự lõi
CATGTG giống MYC) trên vùng khởi động gen của các gen tăng cường tính kháng hạn,
làm cho các gen này biểu hiện mạnh và kết quả là cây chuyển gen có tính kháng rất cao
với điều kiện hạn. Các phân tích microarray về sự liên quan giữa biểu hiện của các gen
mã hóa nhân tố phiên mã thuộc nhóm NAC với biểu hiện của các gen liên quan đến tính
kháng hạn cũng đã chứng minh khi các gen mã hóa nhân tố phiên mã biểu hiện trong cây
chuyển gen đã hoạt hoá sự biểu hiện của nhiề
u gen chức năng sinh ra trong điều kiện hạn
[85]. Từ nghiên cứu về khả năng điều hòa biểu hiện các gen chức năng liên quan đến hạn
của nhóm gen NAC trên Arabidopsis, nhóm nghiên cứu của giáo sư Lizhong Xiong
(Trung tâm Quốc gia về nghiên cứu gen thực vật Trung Quốc) đã phân lập gen OsNAC1
và chuyển vào lúa. Cây lúa chuyển gen tăng cường tính chịu hạn, mặn. Kết qủa phân tích
microarray cho thấy gen ngoại sinh OsNAC1 đã hoạ
t hóa hàng loạt gen chức năng liên
quan đến tính chịu hạn. Kết quả thử nghiệm trên đồng ruộng cho thấy các cây lúa chuyển
gen OsNAC1 cho năng suất cao hơn 22-34% so với các cây đối chứng ở điều kiện hạn
[46]. Tương tự, nhóm nghiên cứu của giáo sư Shinozaki đã phân lập và nghiên cứu đặc
tính gen OsNAC6. Kết quả nghiên cứu cho thấy các cây lúa chuyển gen tăng cường tính
chịu hạn, mặn và lạnh. Đặ
c biệt, ngoài việc tăng cường tính chống chịu với bất lợi thời
tiết, cây lúa chuyển gen OsNAC6 còn tăng cường tính kháng bệnh bạc lá so với cây đối
chứng [63]. Tiếp theo, gen OsNAC5 cũng được chứng minh là có liên quan đến tính
chống chịu với điều kiện bất lợi của môi trường. Gen OsNAC5 định vị ở nhân và biểu
hiện mạnh trong điều kiện hạn, mặn, l
ạnh và xử lý ABA [102]. Trong một nghiên cứu
khác, đặc tính phân tử của 8 gen nhóm NAC ở lúa (được đặt tên từ OsNAC1 đến
OsNAC8) đã được công bố. Các gen OsNAC1, OsNAC2, OsNAC5 và OsNAC6 đã được

nghiên cứu chi tiết chức năng. Biểu hiện gen OsNAC6 trong cây lúa chuyển gen làm cây
sinh trưởng còi cọc, năng suất thấp, tăng cường tính chịu hạn và kháng bệnh bạc lá; trong
khi biểu hiện của các gen OsNAC1, OsNAC2, OsNAC5 trong cây lúa chuyển gen giúp
cây tăng cường tính chịu hạn, mặn mà không làm ảnh hưởng đến sinh tr
ưởng và phát
triển của cây [83]. Gần đây, gen OsNAC10 đã được phân lập và nghiên cứu đặc tính. Cây
Báo cáo kết quả khoa học Đề tài phân lập & thiết kế vector chuyển gen chịu hạn


14

lúa chuyển gen OsNAC10 tăng cường tính chịu hạn, mặn, đồng thời tăng năng suất từ
25% tới 45% trong điều kiện hạn [50].
Nhóm nhân tố DREB2
Hai gen DREB2A và DREB2B chỉ biểu hiện trong điều kiện hạn và hoạt hoá các
gen chức năng tham gia vào tính chịu hạn của thực vật. Tuy nhiên, biểu hiện của các gen
DREB2A và DREB2B không làm tăng tính kháng hạn của các cây Arabidopsis chuyển
gen, điề
u này chứng tỏ nhóm gen này cần quá trình sửa đổi sau phiên mã ví dụ như qua
quá trình phosphoryl hóa để chuyển protein sang dạng hoạt hoá [47]. Gen DREB2A được
thay đổi cấu trúc để loại bỏ 30 axit amin tương ứng với trật tự từ 136 đến 165 để tạo ra
dạng DREB2ACA. Kết quả, sự biểu hiện của gen DREB2ACA giúp cây chuyển gen
Arabidopsis tăng cường đáng kể tính chịu hạn. Các phân tích sử dụng kỹ thuật ADN
microarray và Northern blot
đã chứng minh là gen DREB2ACA điều khiển sự biểu hiện
của rất nhiều gen chức năng tham gia vào tính kháng hạn ở thực vật [63]. Gen
ZmDREB2A cũng đã được phân lập và nghiên cứu đặc tính chi tiết ở ngô. Không giống
như gen DREB2A của Arabidopsis, gen ZmDREB2A tạo ra hai dạng phiên mã và qua
phân tích RT- PCR thì chỉ có dạng phiên mã có hoạt tính sinh ra đáng kể trong điều kiện
hạn. Ngoài ra, thí nghiệm phân tích hoạt hoá phiên mã (transactivation assay) ở tế bào

tr
ần Arabidopsis đã chứng tỏ ZmDREB2A có hoạt tính hoạt hoá quá trình phiên mã mạnh
hơn nhiều DREB2A. Điều này chứng tỏ quá trình sửa đổi sau dịch mã là không cần thiết
trong việc tạo ra protein hoạt tính trong trường hợp gen ZmDREB2A. Sự biểu hiện liên
tục của ZmDREB2A làm tăng đáng kể khả năng chịu hạn của các cây chuyển gen. Kết
quả này cho thấy có sự khác nhau về cơ chế
điều khiển tính chịu hạn trong cùng nhóm
gen giữa cây mô hình hai lá mầm (Arabidopsis) và cây một lá mầm [95].
Gần đây, gen mã hóa nhân tố phiên mã liên quan đến chịu hạn mới ở lúa
OsRap2.4A/DBF1 biểu hiện mạnh trong điều kiện hạn được phân lập bằng phương pháp
one hybrid sử dụng mồi là 4 đoạn ADN lặp lại, mỗi đoạn gồm 50 nucleotide chứa trật tự
ADN đặc hiệu DRE định vị sau h
ộp TATA trên promoter JRC2606 (Glutamate
dehydrogenase-like proteins). Thí nghiệm phân tích dịch chuyển băng (band shift assay)
đã chứng minh OsRap2.4A bám rất đặc hiệu trật tự DRE trên promoter JRC2606. Gen
OsRap2.4A được chuyển vào lúa và Arabidopsis, phân tích Northern blot đã chứng minh
biểu hiện mạnh của gen ngoại sinh OsRap2.4A ức chế sự biểu hiện của gen đích. Phân
tích tính chống chịu với điều kiện hạn ở cây Arabidopsis và lúa chuyển gen đã cho kết