Nghiên cứu xác định nồng độ hoạt chất một số thuốc giảm đau (ibuprofen, diclofenac, naproxen, bezafibrate) trong mẫu nước bằng phương pháp điện di mao quản

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

PHẠM MẠNH HÙNG

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ HOẠT CHẤT MỘT SỐ THUỐC
GIẢM ĐAU (IBUPROFEN, DICLOFENAC, NAPROXEN, BEZAFIBRATE)
TRONG MẪU NƢỚC BẰNG PHƢƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2015


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

PHẠM MẠNH HÙNG

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ HOẠT CHẤT MỘT SỐ THUỐC
GIẢM ĐAU (IBUPROFEN, DICLOFENAC, NAPROXEN, BEZAFIBRATE)
TRONG MẪU NƢỚC BẰNG PHƢƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN

Chuyên ngành: Hóa phân tích
Mã số: 60440118.

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: GS.TS PHẠM HÙNG VIỆT

Hà Nội – 2015


LỜI CẢM ƠN
Em xin chân thành cảm ơn GS.TS Phạm Hùng Việt đã giao đề tài, nhiệt tình
hƣớng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình thực hiện luận
văn.
Em xin chân thành cảm ơn TS. Dƣơng Hồng Anh cùng toàn thể các anh, em
trong nhóm điện di thuộc trung tâm CETASD đã giúp đỡ và hỗ trợ trong quá trình
thực hiện nghiên cứu này.
Em xin chân thành cảm ơn các Thầy cô trong Bộ môn Hóa Phân tích nói
riêng và trong khoa Hóa học nói chung đã dạy dỗ, chỉ bảo và động viên em trong
thời gian học tập tại trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội.
Em xin chân thành cảm ơn cán bộ trong Trung tâm Nghiên cứu Môi trƣờng
và Phát triển Bền vững – Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên tạo điều kiện trong
quá trình thực hiện nghiên cứu.
Luận văn này đƣợc thực hiện trong khuôn khổ đề tài: “Xác định đồng thời
nhiều thông số quan trọng trong các mẫu môi trường nước và trong các sản phẩm
chọn lọc của một số quá trình sinh - hóa trên cơ sở phát triển hệ thiết bị điện di
mao quản đa kênh loại xách tay” Mã số: 104.04-2013.70 thuộc Chƣơng trình
nghiên cứu khoa học cơ bản của Quỹ Phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia
(NAFOSTED). Vì vậy em xin trân trọng cảm ơn nguồn kinh phí của đề tài.
Cuối cùng em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn luôn bên cạnh
động viên, giúp đỡ em khi em đi học.
Hà Nội, tháng 12 năm 2015
Học viên

Phạm Mạnh Hùng

MỤC LỤC
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN .....................................................................................2
1.1

Tổng quan về các chất phân tích ...................................................................2

1.1.1

Tổng quan về thuốc chống viêm, giảm đau ............................................2

1.1.1.1

Khái niệm về thuốc chống viêm, giảm đau......................................2

1.1.1.2

Khái niệm thuốc chống viêm không steroid ....................................2

1.1.1.3

Giới thiệu về các chất phân tích (ibuprofen, diclofenac, naproxen,

bezafibrate)........................................................................................................3
1.1.2

Tình hình sản xuất và sử dụng các loại dƣợc phẩm................................5

1.1.3

Sự xuất hiện của các dƣợc phẩm trong môi trƣờng ................................6

1.1.4

Tác hại của dƣợc phẩm đến môi trƣờng .................................................8

1.1.5

Các phƣơng pháp xác định .....................................................................9

1.1.5.1

Phƣơng pháp sắc ký khí ...................................................................9

1.1.5.2

Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ..........................................9

1.1.5.3

Phƣơng pháp điện di mao quản (CE) .............................................10

1.2

Tổng quan về phƣơng pháp chiết pha rắn (SPE) ........................................12

1.3

Tổng quan về phƣơng pháp điện di mao quản ............................................13

1.3.1

Sơ lƣợc về phƣơng pháp điện di mao quản ..........................................13

1.3.2

Detector trong phƣơng pháp điện di mao quản ...................................15


1.3.3

Bơm mẫu trong điện di mao quản ........................................................16

1.3.4

Các thông số đánh giá trong phƣơng pháp điện di mao quản ..............17

1.3.5

Một số yếu tố ảnh hƣởng tới quá trình tách chất trong điện di mao

quản18
1.3.5.1

Pha động điện di............................................................................18

1.3.5.2

Điện thế tách .................................................................................19

1.3.5.3

Lƣợng mẫu đi vào mao quản ........................................................19

CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM..............................................................................20
2.2

Hóa chất và thiết bị ......................................................................................21

2.2.1

Hóa chất. ...............................................................................................21

2.2.2

Thiết bị ..................................................................................................21

2.2.2.1

Hệ thiết bị điện di mao quản 2 kênh sử dụng detector độ dẫn không

tiếp xúc ............................................................................................................21
2.2.2.2
2.3

Các thiết bị khác.............................................................................25

Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................................26

2.3.1

Chuẩn bị hóa chất .................................................................................26

2.3.2

Chuẩn bị mẫu ........................................................................................27

2.3.3

Khảo sát điều kiện chiết ........................................................................27

2.3.3.1

Khảo sát các loại cột C18 ..............................................................27

2.3.3.2

Khảo sát thành phần dung môi rửa giải .........................................27

2.3.3.3

Khảo sát thể tích dung môi rửa giải ..............................................28

2.3.3.4

Khảo sát thể tích nạp mẫu .............................................................28

2.3.4

Khảo sát điều kiện hóa học ...................................................................28

2.3.4.1

Khảo sát thành phần đệm điện di. ..................................................28


2.3.4.2

Khảo sát pH của pha động điện di..................................................28

2.3.4.3

Lựa chọn nồng độ chất bổ trợ HP-β-CD ........................................29

2.3.5

Khảo sát thông số thiết bị .....................................................................29

2.3.5.1

Khảo sát thời gian chuyển mẫu ......................................................29

2.3.5.2

Khảo sát thời gian đẩy mẫu vào mao quản ....................................29

2.3.5.3

Khảo sát vị trí van kim ...................................................................29

2.3.5.4

Khảo sát điều kiện áp thế ...............................................................29

Các thông số đánh giá độ tin cậy của phƣơng pháp phân tích ....................30

2.4

2.4.1

Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ) của phƣơng

pháp phân tích ....................................................................................................30
2.4.2

Độ chụm (độ lặp lại) của phƣơng pháp ................................................30

2.4.3

Độ đúng (độ thu hồi) của phƣơng pháp ................................................31

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .........................................................32
Khảo sát điều kiện làm giàu và tách chiết pha rắn ......................................32

3.1

3.1.1

Khảo sát loại cột C18 ............................................................................34

3.1.2

Khảo sát tỷ lệ thể tích của acetonitrile trong dung môi rửa giải ...........35

3.1.3

Khảo sát thể tích dung môi rửa giải ......................................................36

3.1.4

Khảo sát thể tích nạp mẫu đối với cột chiết. .........................................37

Khảo sát các điều kiện phân tích trên hệ điện di mao quản tự động xách

3.2
tay38

3.2.1

Khảo sát ảnh hƣởng của dung dịch đệm điện di ...................................38

3.2.1.1

Khảo sát nồng độ của dung dịch đệm điện di ...............................38

3.2.1.2

Khảo sát ảnh hƣởng pH của đệm ..................................................42

3.2.1.3

Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ chất bổ trợ HP-β-CD ................45


3.2.2

Khảo sát điều kiện dẫn lỏng..................................................................47

3.2.2.1

Khảo sát thời gian chuyển mẫu ......................................................48

3.2.2.2

Khảo sát thời gian đẩy mẫu............................................................50

3.2.2.3 Khảo sát vị trí van kim chia dòng.....................................................52
3.2.2.4 Khảo sát ảnh hƣởng của điều kiện áp thế .........................................54
3.3

Đánh giá phƣơng pháp phân tích .................................................................61

3.3.1

Đƣờng chuẩn, LOQ, LOD ....................................................................61

3.3.2

Đánh giá độ chụm (độ lặp lại) và độ đúng (độ thu hồi)........................66

3.4

3.3.2.1

Độ chụm .........................................................................................66

3.3.2.2

Độ đúng ..........................................................................................67

Phân tích mẫu thật ......................................................................................51

3.4.1

Kết quả phân tích mẫu thật trên hệ thiết bị CE ...................................53

3.4.2

So sánh kết quả giữa phƣơng pháp CE và phƣơng pháp HPLC ..........55

3.4.2.1

So sánh kết quả nồng độ ibuprofen giữa phƣơng pháp CE và

HPLC………………………………………………………………………..56
3.4.2.2

So sánh kết quả nồng độ của bezafibrate, diclofenac và naproxen

giữa phƣơng pháp CE và HPLC. ...................................................................58
KẾT LUẬN ..............................................................................................................60
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................62
PHỤ LỤC .................................................................................................................66


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1. 1 Thông tin chung của các chất phân tích .....................................................4
Bảng 1.2 Giá trị tiền thuốc sử dụng theo năm của ngƣời Việt Nam ...........................5
Bảng 3. 1. Điều kiện tối ƣu phân tích các loại thuốc giảm đau trên
HPLC…………33
Bảng 3. 2 Kết quả đƣờng chuẩn, LOD, LOQ của thiết bị HPLC .............................33
Bảng 3.3 Hiệu suất thu hồi của các chất ở các thể tích nạp mẫu ..............................37
Bảng 3.4 Độ phân giải của các chất ở các nồng đệm khác nhau ..............................41
Bảng 3.5 Độ phân giải của các chất ở các pH của đệm ............................................44
Bảng 3.6 Độ phân giải của các chất theo nồng độ HP- β- CD ..................................46
Bảng 3.7 Độ phân giải của các chất theo thời gian chuyển mẫu ..............................49
Bảng 3.8 Độ phân giải của các chất theo thời gian đẩy mẫu. ...................................51
Bảng 3. 9 Độ phân giải của các chất theo vị trí van kim ..........................................54
Bảng 3. 10 Độ phân giải của các chất theo điện thế .................................................56
Bảng 3.11 Các điều kiện tối ƣu phụ vụ phân tích dƣợc phẩm ..................................57
Bảng 3.12 Nồng độ của các chất trong các mẫu chuẩn.............................................61
Bảng 3.13 Đƣờng chuẩn, giới hạn phát hiện, giới hạn định lƣợng của các chất trong
dịch chiết ...................................................................................................................65
Bảng 3.14 Kết quả đánh giá độ lặp lại trên các nền mẫu của các chất ....................66
Bảng 3.15 Kết quả đánh giá độ đúng của các chất ...................................................50
Bảng 3.16 Tên một sô mẫu nƣớc thải dùng đê phân tích trên CE và HPLC ............51

Bảng 3.17 Kết quả đo mẫu thật trên CE ...................................................................53
Bảng 3.18 Kết quả phân tích ibuprofen trong nƣớc thải trên CE và HPLC .............56


Bảng 3.19 Kết quả phân tích bezafibrate, diclofenac, naproxen trong nƣớc thải trên
CE và HPLC ..............................................................................................................58
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1 Cơ chế tác động của thuốc chống viêm giảm đau........................................3
Hình 1.2 Quá trình đào thải của dƣợc phẩm ra ngoài môi trƣờng ..............................7
Hình 1.3 Quá trình chiết pha rắn ...............................................................................13
Hình 1.4 Sơ đồ của một hệ điện di mao quản đơn giản ............................................14
Hình 1.5 Lớp điện kép và tốc độ di chuyển của các ion trong EOF .........................15
Hình 1.6 Sơ đồ cấu tạo detector C4D ........................................................................16
Hình 1.7 Các kĩ thuật bơm mẫu trong điện di mao quản ..........................................17
Hình 2.1 Hình ảnh tổng thể của thiết bị: bên ngoài và bên trong
vali………………22
Hình 2. 2 Vỏ ngoài và bố trí các bộ phận bên trong của cell detector C4D ..............23
Hình 2. 3 Sơ đồ hoạt động của hệ dẫn lỏng trong quá trình hút mẫu vào vòng mẫu 23
Hình 2. 4 Sơ đồ hoạt động của hệ dẫn lỏng trong quá trình hút mẫu vào vòng mẫu 24
Hình 2. 5 Sơ đồ hoạt động của hệ dẫn lỏng trong quá trình rửa interface ................24
Hình 2. 6 Sơ đồ hoạt động của hệ dẫn lỏng chuyển mẫu tới interface và đẩy mẫu
vào mao quản ............................................................................................................25
Hình 3.1 Sự phụ thuộc hệ số thu hồi của các chất theo từng loại cột chiết………...34
Hình 3.2 Sự phụ thuộc hệ số thu hồi của các chất vào tỷ lệ ACN ............................35
Hình 3.3 Sự phụ thuộc hệ số thu hồi của các chất và thể tích dung môi rửa giải .....36
Hình 3.4 Giản đồ đồ điện di của các chất ở nông độ đệm khác nhau. ......................40
Hình 3.5 Đồ thị diện tích pic của các chất ở các nồng độ đệm khác nhau. ..............41
Hình 3.6 Điện di đồ khảo sát ảnh hƣởng pH của đệm ............................................43

Hình 3.7 Đồ thị biểu thị diện tích pic của các chất ở các pH của đệm .....................44
Hình 3.8 Điện di đồ khảo sát ảnh hƣởng của HP-β-CD đến độ phân giải của các
chất ............................................................................................................................46
Hình 3.9 Sơ đồ hệ thống dẫn lỏng trên hệ thiết bị điện di mao quản xách tay hai
kênh tự động ..............................................................................................................47
Hình 3.10 Điện di đồ khảo sát ảnh hƣởng của thời gian chuyển mẫu ......................48
Hình 3.11 Đồ thị diện tích pic của các chất theo thời giản chuyển mẫu...................49
Hình 3.12 Điện di đồ khảo sát ảnh hƣởng của thời gian đẩy mẫu ............................50
Hình 3.13 Đồ thị diện tích pic của các chất theo thời gian đẩy mẫu ........................51
Hình 3.14 Điện di đồ khảo sát ảnh hƣởng của vị trí van kim đến diện tích pic của
các chất. .....................................................................................................................52
Hình 3.15 Đồ thị diện tích pic của các chất theo vị trí van kim................................53
Hình 3.16 Điện di đồ khảo sát ảnh hƣởng của điện thế áp đến diện tích pic và thời
gian di chuyển của các chất. ......................................................................................55
Hình 3.17 Đồ thị biểu thị diện tích pic của các chất theo điện thế ...........................56
Hình 3.18 Đƣờng chuẩn xác định nồng độ của Ibuprofen ........................................63
Hình 3.19 Đƣờng chuẩn xác định nồng độ của Bezafibrate .....................................63
Hình 3.20 Đƣờng chuẩn xác định nồng độ của Naproxen ........................................64
Hình 3.21 Đƣờng chuẩn xác định nồng độ của Diclofenac ......................................64
Hình 3.22 Điện di đồ đánh giá độ lặp, độ chụm của các chất trên các nền mẫu ......67
Hình 3.23 Điện di đồ đo mẫu thật .............................................................................55
Hình 3.24 Mối tƣơng quan kết quả nồng độ ibuprofen giữa HPLC và CE ..............57
Hình 4.1 Sắc đồ phân tích một số thuôc giảm đau trong mẫu SN3 trên HPLC……66
Hình 4.2 Điện dị đồ phân tích một số thuốc giảm đau trong mẫu SN3 trên CE .......66


Hình 4.3 Sắc đồ phân tích một số thuốc giảm đau trong mẫu SS1 trên HPLC ........67
Hình 4.4 Điện di đồ phân tích một số thuôc giảm đau trong mẫu SS1 trên CE .......67
Hình 4.5 Sắc đồ phân tích một số thuốc giảm đau trong mẫu TL1 trên HPLC ........68
Hình 4.6 Điện di đồ phân tích một số thuốc giảm đau trong mẫu TL1 trên CE .......68

Hình 4.7 Sắc đồ phân tích một số thuốc giảm đau trong mẫu TL2 trên HPLC ........69
Hình 4.8 Điện di đồ phân tích một số thuốc giảm đau trong mẫu TL2 trên CE ......69
Hình 4.9 Sắc đồ phân tích một số thuốc giảm đau trong mẫu TL3 trên HPLC ........70
Hình 4.10 Điện di đồ phân tích một số thuôc giảm đau trong mẫu TL3 trên CE .....70
Hình 4.11 Sắc đồ phân tích một số thuốc giảm đau trong mẫu YHN trên HPLC ....71
Hình 4.12 Điện di đồ phân tích một số thuốc giảm đau trong mẫu YHN trên CE ...71
Hình 4.13 Sắc đồ phân tích một số thuốc giảm đau trong mẫu TL4 trên HPLC ......72
Hình 4.14 Điện di đồ phân tích một số thuốc giảm đau trong mẫu TL4 trên CE .....72
Hình 4.15 Sắc đồ phân tích một số thuốc giảm đau trong mẫu KN1 trên HPLC .....73
Hình 4.16 Điện di đồ phân tích một số thuốc giảm đau trong mẫu KN1 trên CE ....73
Hình 4.17 Sắc đồ phân tích một số thuốc giảm đau trong mẫu TT1 trên HPLC ......74
Hình 4.18 Điện di đồ phân tích một số thuốc giảm đau trong mẫu TT1 trên CE .....74
Hình 4.19 Sắc đồ phân tích một số thuốc giảm đau trong mẫu NCT2 trên HPLC ...75
Hình 4.20 Điện di đồ phân tích một số thuốc giảm đau trong mẫu NCT2 trên CE ..75


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Tên viết tắt

Tên đầy đủ

ACN

Acetonitrile

BGE

Hệ đệm

C4D

Detectơ độ dẫn không tiếp xúc kết nối kiểu tụ điện

CE

Phƣơng pháp điện di mao quản

CZE

Điện di mao quản vùng

EOF

Dòng điện di thẩm thấu

GC

Sắc ký khí

His

Histidin

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

HP-β-CD

(2-Hydroxypropyl)-β-cyclodextrin

Leff

Chiều dài hiệu dụng của mao quản

Ltot

Tổng chiều dài mao quản

LOD

Giới hạn phát hiện

LOQ

Giới hạn định lƣợng

MEKC

Điện di mao quản điện động học Mixen

MS

Detetor khối phổ

NSAID

Thuốc chống viêm không steroid

%RSD

% độ lệch chuẩn tƣơng đối

SD

Độ lệch chuẩn

SDS

Chất hoạt động bề mặt

SPE

Chiết pha rắn

Tris

(hydroxymethyl) aminomethane

UPLC

Sắc ký lỏng siêu hiệu năng


MỞ ĐẦU
Hiện nay, bên cạnh những chất ô nhiễm cổ điển nhƣ các chất hữu cơ bền vững
(các thuốc trừ sâu, PCBs…) thì dƣ lƣợng dƣợc phẩm trong nƣớc cũng đang là vấn đề
nổi cộm về môi trƣờng. Nƣớc thải của những nhà máy sản xuất dƣợc phẩm, nƣớc thải
bệnh viện không đƣợc xử lý đúng cách xả ra môi trƣờng và sự đào thải dƣợc phẩm
qua quá trình sử dụng thuốc của con ngƣời là nguyên nhân chính gây ra sự xuất hiện

của dƣợc phẩm trong môi trƣờng nƣớc. Vấn đề này đã trở thành một mối lo về môi
trƣờng và sức khỏe của con ngƣời vì đây là những chất có hoạt tính sinh học nhất
định. Sự xuất hiện của chúng có thể ảnh hƣởng đến môi trƣờng sống, thay đổi đặc tính
của các loại vi sinh, sinh vật trong nƣớc. Trong đó thuốc giảm đau, chống viêm là một
trong những loại thuốc đƣợc sử dụng rộng rãi trong đời sống hằng ngày. Dƣ lƣợng của
chúng đã đƣợc tìm thấy trong môi trƣờng nƣớc ngày càng nhiều.
Việc xác định nồng độ của các dƣợc phẩm trong môi trƣờng thƣờng đƣợc thực
hiện bằng những phƣơng pháp nhƣ: sắc khí lỏng hiệu năng cao (HPLC), sắc kí khí
(GC) kết hợp với các detetor mảng diod (DAD), khối phổ (MS). Cùng với các phƣơng
pháp trên, phƣơng pháp điện di mao quản sử dụng detetor đo độ dẫn không tiếp xúc
(CE-C4D) là phƣơng pháp phân tích nhiều tiềm năng. Thiết bị CE – C4D có thể phát
triển với xu hƣớng tự động hóa, vận hành đơn giản, có thể phân tích đồng thời với chi
phí tƣơng đối thấp, phù hợp với nhu cầu và điều kiện thực tế tại Việt Nam. Xuất phát
từ tình hình thực tế trên, luân văn này đã xây dựng quy trình chiết và phân tích nồng
độ hoạt chất một số thuốc giảm đau (ibuprofen, diclofenac, naproxen, bezafibrate)
trong mẫu nƣớc bằng phƣơng pháp điện di mao quản sử dụng detetor độ dẫn không
tiếp xúc đã đƣợc phát triển và đánh giá.

1


CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1

Tổng quan về các chất phân tích
1.1.1 Tổng quan về thuốc chống viêm, giảm đau
1.1.1.1
Khái niệm về thuốc chống viêm, giảm đau
Thuốc chống viêm, giảm đau là thuốc có tác dụng lên một khâu nào đó của quá

trình viêm hoặc làm ngƣng hẳn quá trình viêm.
Phân loại thuốc chống viêm, giảm đau: có nhiều cách phân loại theo tác dụng,
theo cách sử dụng hoặc theo các nhóm. Phân loại theo tác dụng có hai loại: tác dụng
toàn thân và tác dụng cục bộ. Trong đó, thuốc chống viêm không steroid (NSAID) là
một trong những loại thuốc có tác dụng toàn thân đƣợc sử dụng phổ biến từ lâu.
1.1.1.2

Khái niệm thuốc chống viêm không steroid

Thuốc chống viêm không steroid (NSAID): là loại thuốc có tác dụng hạ sốt,
giảm đau, chống viêm không có cấu trúc steroids. NSAID là thuốc giảm đau ngoại vi
và không có tác dụng gây nghiện. Những thuốc tiêu biểu của nhóm này gồm có
ibuprofen, diclofenac, naproxen và aspirin đã đƣợc sử dụng rộng rãi trong điều trị từ
lâu. Paracetamol (acetaminophen) có tác dụng chống viêm không đáng kể, nhƣng lại
có tác dụng hạ sốt và giảm đau rất tốt, nên đôi khi vẫn đƣợc xếp trong nhóm này.
Cơ chế chống viêm của thuốc NSAID: thuốc ức chế cyclooxygenase (COX) nên
ức chế tổng hợp prostaglandin (PG) và thromboxan. Có hai dạng COX, COX-1 cần
thiết để tổng hợp prostaglandin (bảo vệ niêm mạc dạ dày) và thromboxan cần thiết cho
tiểu cầu kết dính, và COX-2 tham gia tạo ra prostaglandin khi có viêm [17]. Các thuốc
chống viêm không chọn lọc ức chế cả hai loại COX-1 và COX-2, bao gồm ibuprofen,
naproxen, diclofenac, indometacin, piroxicam, ketoprofen. Các thuốc NSAID ức chế
chọn lọc COX-2 gồm có ketorolac, parecoxib, celecoxib, meloxicam, rofecoxib…

2


Tên Chất

Ibuprofen

Diclofenac

Naproxen

Bezafibrate

Hình 1.1 Cơ chế tác động của thuốc chống viêm giảm đau
1.1.1.3
Giới thiệu về các chất phân tích (ibuprofen, diclofenac,
naproxen, bezafibrate)
Các chất phân tích đều là thành phần chính trong các loại dƣợc phẩm đƣợc sử
dụng rộng rãi. Trong đó có ba chất thuộc nhóm thuốc chống viêm giảm đau NSAID và
một chất là dƣợc phẩm tác dụng điều chỉnh lipit. Các thông tin chung của bốn dƣợc
phẩm đƣợc trình bày trong bảng 1.1 [20, 21].

3


axit (RS)-2axit
axitchất
(+)-(S)-2Bảng 1. 1 Thông
tin2-(2-(2,6chung của các
phân tích
axit 2(4-(2dicloro phenyl
(6-metoxy
metylpropyl) amino) phenyl) naphtalen-2-yl) (4[16]phenoxy)-2Tên hóa học
metylpropanoic
phenyl)
axetic
propanoic

propanoic
Công thức
phân tử

C13H18O2

C14H11Cl2NO2

C14H14O3

206,28

296,15

230,26

4,41

4,18

4,80

C19H20ClNO4

Công thức
cấu tạo
Khối lƣợng
phân tử

361,82

(g/mol)
pKa

3,60

Tác dụng của các loại thuốc:
Thuốc ibuprofen có tác dụng kháng viêm, giảm đau trong các trƣờng hợp: đau
đầu, đau bụng kinh, đau răng, đau cơ, bong gân, viêm khớp dạng thấp, viêm xƣơng
khớp.
Thuốc diclofenac có tác dụng điều trị lâu dài triệu chứng thấp khớp mạn tính,
viêm đa khớp dạng thấp, viêm cứng khớp sống. Điều trị ngắn hạn triệu chứng cơn
kịch phát cấp tính ngoài khớp, viêm khớp vi tinh thể, hƣ khớp, đau lƣng, đau rễ thần
kinh trầm trọng, đau kinh tự phát.

4


Thuốc naproxen tác dụng điều trị các bệnh về xƣơng khớp: viêm cột sống dính
khớp, thoái hoá xƣơng - khớp, viêm khớp dạng thấp, đau bụng kinh, nhức đầu bao
gồm cả chứng đau nửa đầu, đau sau phẫu thuật, đau do tổn thƣơng phần mềm, gút cấp,
sốt.
Thuốc bezafibrate có tác dụng điều trị tăng cholesterol máu, tăng triglyceride
máu, tăng lipid máu loại III và máu kết hợp.
1.1.2 Tình hình sản xuất và sử dụng các loại dược phẩm
Trong thập kỷ gần đây, với sự phát triển mạnh mẽ của y học thì việc sử dụng
dƣợc phẩm cho con ngƣời và vật nuôi cũng ngày càng phát triển. Khoảng 100.000
dƣợc phẩm khác nhau đƣợc sản xuất mỗi năm nhƣng các dữ liệu cụ thể về quá trình sử
dụng trên toàn cầu của chúng còn chƣa đƣợc ghi nhận [13]. Đặc biệt là quá trình tiêu
thụ của từng loại lại khác nhau đáng kể ở từng nƣớc khác nhau. Có những dƣợc phẩm

đƣợc mua bán theo đơn nhƣng có những dƣợc phẩm có thể mua dễ dàng ở các nhà
thuốc mà không cần đơn chỉ định của bác sĩ. Chính vì vậy khó có thể xác định đƣợc số
lƣợng tiêu thụ của các dƣợc phẩm ở mỗi nƣớc. Theo thống kê dữ liệu ở các nƣớc châu
Âu sản lƣợng các thuốc chống viêm, giảm đau nhƣ ibuprofen ở Đức năm 2001 có sản
lƣợng 344,89 tấn, ở Anh ibuprofen năm 2000 đạt sản lƣợng 162,3 tấn. Ngoài ra còn
các loại thuốc khác nhƣ diclofenac ở Đức sản lƣợng 85 tấn trong năm 2001,
bezafibrate ở Ý có sản lƣợng 7,6 tấn [10]. Bên cạnh đó còn nhiều loại chƣa đƣợc
thống kê đầy đủ. Ngay cả ở Việt Nam theo thống kê của cục quản lý dƣợc, giá trị tiền
thuốc sử dụng của ngƣời Việt tăng dần theo năm nhƣ trong bảng 1.2.

Bảng 1.2 Giá trị tiền thuốc sử dụng theo năm của người Việt Nam

5


Bình quân tiền

Tổng trị giá tiền thuốc

Trị giá SX

Trị giá thuốc

sử dụng

trong nƣớc

nhập khẩu

(1.000USD)

(1.000USD)

(1.000USD)

2005

817.396

395.157

650.180

9,85

2006

956.353

475.403

710.000

11,23

2007

1.136.353

600.630

810.711

13,39

2008

1.425.657

715.435

923.288

16,45

2009

1.696.135

831.205

1.170.828

19,77

2010

1.913.661

919.039

1.252.572

22,25

Năm

thuốc đầu
ngƣời
(USD)

Theo Cục Quản lý Dƣợc Việt Nam thì sự phát triển của thị trƣờng dƣợc Việt
Nam tiếp tục tăng trƣởng đến năm 2011 thị trƣờng tiếp tục tăng từ 17-19% và đạt 2 tỷ
USD [1].
1.1.3 Sự xuất hiện của các dược phẩm trong môi trường
Cùng sự phát triển của ngành dƣợc, dƣ lƣợng dƣợc phẩm đƣợc phát hiện trong
môi trƣờng ngày càng tăng. Dƣợc phẩm có thể xâm nhập vào môi trƣờng qua nhiều
con đƣờng khác nhau nhƣ hình 1.2.
6


Hình 1.2 Quá trình đào thải của dược phẩm ra ngoài môi trường
Sau khi con ngƣời sử dụng, dƣợc phẩm đƣợc bài tiết qua thông qua phân
hoặc nƣớc tiểu và theo con đƣờng đó xâm nhập vào nƣớc thải. Trong quá trình xử lý
nƣớc thải dƣợc phẩm ít bị biến đổi hoặc bị loại bỏ và từ đó đƣợc chuyển ra môi trƣờng
nƣớc sông hồ. Bên cạnh đó, việc sử dụng thuốc thú y cũng tƣơng tự nhƣ ở con ngƣời.
Động vật cũng bài tiết dƣợc phẩm qua phân và nƣớc tiểu. Khi sử dụng sản phẩm từ
7

phân gia súc để làm nông nghiệp cũng là con đƣờng để dƣợc phẩm xâm nhập vào môi
trƣờng. Ngoài ra, nƣớc thải của các nhà máy sản xuất dƣợc phẩm và nƣớc thải của các
bệnh viện không đƣợc xử lý đúng cách thải ra môi trƣờng sông hồ cũng chính là con
đƣờng giúp dƣợc phẩm xâm nhập vào môi trƣờng [6].
Với những con đƣờng khác nhau và cách xử lý không đúng dẫn đến sự ô nhiễm
dƣợc phẩm trong môi trƣờng nƣớc sông, hồ, đất và ở một số trƣờng hợp đặc biệt còn
phát hiện một số dƣợc phẩm nhƣ methaqualon và thuốc kháng sinh với các nhóm
penicillin, thuốc chống viêm trong nƣớc uống [9, 17, 25]. Trong số những dƣợc phẩm
phát hiện nhiều trong môi trƣờng nƣớc có những dƣợc phẩm thuộc nhóm thuốc chống
viêm giảm đau.
1.1.4 Tác hại của dược phẩm đến môi trường
Tác hại của diclofenac đã đƣợc đề cập ảnh hƣởng đến sự suy giảm của các cá
thể kền kền ở Ấn Độ [18, 19]. Một nghiên cứu tại vƣờn quốc gia Keoladeo, Ấn Độ số
lƣợng cá thể kền kền giảm 95% năm 2003. Theo báo cáo diclofenac ở dạng thuốc thú
y đƣợc sử dụng trên động vật, gia súc nuôi. Những con kền kền ăn thịt những gia súc
có sử dụng diclofenac sẽ bị nhiễm độc dần dần, do chúng không có enzym để phá vỡ
diclofenac. Diclofenac làm cho những con kền kền có triệu chứng suy thận. Ngoài ra
đã có những báo cáo khi tiếp xúc lâu dài với diclofenac sẽ ảnh hƣởng đến thận của
một số loại sinh vật nhƣ cá [24], chuột [17].
Tác giả Yohana M cùng cộng sự đã nghiên cứu tác dụng của bezafibrate ảnh
hƣởng khả năng sinh dục và sinh tinh của cá ngựa vằn. Cá ngựa vằn trƣởng thành đã
đƣợc tiếp xúc với bezafibrate qua đƣờng miệng trong 21 ngày. Máu và bộ phận sinh
dục đƣợc thu thập để đánh giá hypocholesterol. Kết quả cho thấy sự suy giảm tinh
hoàn. Nghiên cứu thấy đƣợc bezafibrate tạo ra một tác nhân là hypocholesterol ở cá
ngựa vằn đực trƣởng thành. Nó là nguyên nhân gây ra sự rối loạn nội tiết ảnh hƣởng
đến sinh tinh [26].

8

Đồng thời có nghiên cứu đánh giá rủi ro môi trƣờng bằng phƣơng pháp kiểm
tra Daphania trên tảo và cá. Nghiên cứu đã đánh giá độc tính của ibuprofen,
diclofenac, naproxen đối môi trƣờng sống của tảo. Tác giả đã chỉ ra ibuprofen,
diclofenac có khả năng gây nguy hại cho môi trƣờng và đã phát hiện ra có những hiệu
ứng kết hợp của các loại dƣợc phẩm gây ảnh hƣởng đến môi trƣờng nƣớc [7, 8].
1.1.5 Các phương pháp xác định
1.1.5.1
Phương pháp sắc ký khí
Sắc kí khí là phƣơng pháp tách trong đó pha động là chất khí (đƣợc gọi là khí
mang) và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn hoặc chất lỏng phủ trên bề mặt chất mang
trơ dạng rắn hay phủ đều trên thành phía trong của cột [2]. Mẫu phân tích đƣợc
chuyển lên cột tách dƣới dạng chất khí. Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phân tích
đƣợc phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh. Trong hỗn hợp các chất phân tích, do
cấu trúc phân tử và tính chất lý hóa của các chất khác nhau nên khả năng tƣơng tác
của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau. Vì vậy chúng di chuyển khác nhau và
tách ra khỏi nhau.
Phƣơng pháp sắc ký khí khối phổ đầu dò thời gian bay (GCxGC-TOF_MS)
đƣợc tác giả Petr Lacina sử dụng kết hợp cùng quá trình làm giàu chiết pha rắn (SPE)
sử dụng cột Oasis HLB cartridges (3 mL, 60 mg) để xác định 10 loại dƣợc phẩm trong
nhóm thuốc chống viêm, giảm đau trong mẫu nƣớc thải và nƣớc mặt. Giới hạn phát
hiện của phƣơng pháp đạt đƣợc của các dƣợc phẩm từ 0,18-5 ng/L [14].
1.1.5.2

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Sắc ký lỏng là quá trình xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn và pha
động là chất lỏng (sắc ký lỏng - rắn). Mẫu phân tích đƣợc chuyển lên cột tách dƣới
dạng dung dịch. Giống nhƣ trong sắc ký khí, sự tách chất trong sắc khí lỏng cũng dựa
trên sự tƣơng tác khác nhau các chất phân tích giữa pha động và pha tĩnh [2]. Đã có rất
nhiều công trình nghiên cứu của các tác giả khác nhau sử dụng phƣơng pháp này, có

thể kể đến nhƣ:
9


Phƣơng pháp HPLC sử dụng detector mảng diod (DAD) kết hợp cùng với quá
trình làm giàu chiết pha rắn (SPE) đã xác định sự có mặt của diclofenac trong các mẫu
nƣớc thải tại các nhà máy xử lý nƣớc thải tại Rio de Janeiro, Brazil [11].
Trong một nghiên cứu khác, tác giả Jones-Joseph sử dụng phƣơng pháp HPLC
với detector quang phổ hấp thụ phân tử UV-Vis kết hợp cùng với quá trình làm giàu
SPE để xác định 19 loại dƣợc phẩm khác nhau nhƣ: ibuprofen, bezafibrate, naproxen,
diclofenac, warfarin, flurbiprofen, indomethacin, ketoprofen, axit meclofenamic,
paracetmon… Giới hạn phát hiện (LOD) của các chất từ 0,02 mg/L - 0,25 mg/L, cụ
thể nhƣ sau: diclofenac 0,15 mg/L, naproxen 0,01 mg/L, bezafibrate 0,06 mg/L,
ibuprofen 0,13 mg/L [6].
Trong nghiên cứu sử dụng phƣơng pháp HPLC–MS cũng đƣợc tác giả Werner
Ahrer sử dụng để xác định một dƣợc phẩm nhƣ naproxen, bezafibrate, diclofenac,
ibuprofen, paracetamon, penicillin, … LOD của các chất ở trong khoảng 0,05 - 1
mg/L. Nếu kết hợp cùng với quá trình làm giàu SPE thì giới hạn phát hiện của các
chất có thể hạ xuống 1 ng/L [5].
Tác giả M. Jos´e G´omez đã sử dụng phƣơng pháp HPLC-MS-MS kết hợp với
quá trình làm giàu SPE với cột Oasis HLB ở pH 7 để xác định 16 loại dƣợc phẩm
trong nƣớc thải bệnh viện nhƣ các loại thuốc giảm đau, chống viêm (ibuprofen,
naproxen, diclofenac, ketorolac, acetaminophen), thuốc chống trầm cảm (fluxetine và
paroxetine), thuốc kháng sinh (trimethoprim, metronidazole)… Phƣơng pháp có hệ số
thu hồi của dƣợc phẩm cao hơn 75%. Giới hạn phát hiện của phƣơng pháp từ 7 ng/mL
đến 47 ng/mL với độ lệch chuẩn tƣơng đối RSD từ 0,3% tới 4,9% [12].
1.1.5.3

Phương pháp điện di mao quản (CE)

Điện di mao quản là một kỹ thuật tách chất phân tích là các ion hoặc các chất
không ion nhƣng có mối liên hệ chặt chẽ với các ion trong một ống mao quản hẹp
chứa đầy dung dịch đệm, đặt trong điện trƣờng; do độ linh động điện di của các ion
khác nhau, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau [2]. Bằng cách
10


sử dụng các kỹ thuật CE nhƣ điện di mao quản điện động học Mixen (MEKC) hoặc
điện di mao quản vùng (CZE) đã có 1 số tác giả xác định hàm lƣợng dƣợc phẩm trong
môi trƣờng nƣớc.
Một nghiên cứu đã sử dụng phƣơng pháp điện di mao quản MEKC của tác giả
Vincent J. Drover và cộng sự. Phƣơng pháp đã xác định đƣợc 12 loại thuốc bao gồm:
ibuprofen, diclofenac, naproxen, bezafibrate, gemfibrozil, ofloxacin, norfloxacin,
carbamazepine,

primidone,

sulphamethazine,

sulphadimethoxine

và

sulphamethoxazole. Phƣơng pháp sử dụng đệm amoni hidrophotphat 10mM, pH 11,5;
SDS 69mM, sunfat β-CD 6 mg/mL và isopropanol 8,5% v/v, điều kiện áp thế là
+30kV, chiều dài hiệu dụng của mao quản là 48,5 cm và đƣờng kính là 50 μm.
Phƣơng pháp kết hợp cùng với quá trình làm giàu SPE có giới hạn phát hiện LOD của
các chất từ 4 đến 30 μg/L. SPE đƣợc thực hiện bằng cách dùng cột Strata-X 200 mg
thể tích 3 mL. Hiệu suất thu hồi của các dƣợc phẩm trong quá trình làm giàu từ 8299% [9].
Phƣơng pháp CZE đƣợc tác giả Rawi Ramautar Govert và cộng sự phát triển để

xác định một số loại dƣợc phẩm. Phƣơng pháp sử dụng kết hợp SPE-CE-UV xác định
naproxen với quá trình làm giàu bằng cột C18. Nếu không kết hợp với SPE phƣơng
pháp có giới hạn phát hiện 0,2 μg/L. Nếu kết hợp với SPE thì phƣơng pháp đƣợc có
thể phát hiện ở nồng độ 10 ng/mL. Hiệu suất thu hồi lớn hơn 80% [22].
Một nghiên cứu của tác giả Alba Maci Francesc và cộng sự đã kết hợp SPE
cùng với CE để xác định naproxen bằng detector UV. Với cột trong quá trình SPE là
cột C18 LiChrolut

500 mg của

Merck. Hệ đệm 20 mM amoni axetat trong

metanol/nƣớc (70:30 v/v). Với sự kết hợp cùng SPE giới hạn phát hiện của naproxen
có thể xuống 10 ng/L [15].
Phƣơng pháp CE còn đƣợc tác giả Ngee Mien Quek áp dụng để xác định 13
loại dƣợc phẩm với detector C4D. Phƣơng pháp CE- C4D sử dụng hệ đệm 9 mM
Tris/5 mM axit lactic pH 8,0 có bổ sung thêm các chất nhƣ 5% n-propanol; 0,025% γ11


CD; 0,075% hydroxyl-β-CD và 0,15% dimetyl-β-CD. Phƣơng pháp có giới hạn phát
hiện của các chất từ 61-1676 μg/L với độ lệch chuẩn tƣơng đối của thời gian di
chuyển và diện tích pic dƣới 2 và 6%. Giới hạn phát hiện của 1 số chất nhƣ sau
ibuprofen 68 μg/L, naproxen 257 μg/L, diclofenac 144 μg/L [21].
Tổng quan về phƣơng pháp chiết pha rắn (SPE)

1.2

Trong quá trình phân tích dƣợc phẩm trong mẫu môi trƣờng, vì nồng độ các
dƣợc phẩm rất nhỏ, để giảm đƣợc giới hạn phát hiện của phƣơng pháp, các tác giả
thƣờng kết hợp quá trình làm giàu bẳng chiết pha rắn với các phƣơng pháp phân tích.

Chiết pha rắn là một dạng của sắc kí lỏng đƣợc cải tiến thành hấp thụ pha rắn
với các cơ chế khác nhau. Mục đích của chiết pha rắn là lấy các chất phân tích một
cách định lƣợng từ dung dịch, loại tạp chất và thu hồi toàn bộ nó. Sau khi làm sạch,
chất phân tích đƣợc rửa giải vào một thể tích nhỏ dung dịch và lấy một cách định
lƣợng khỏi dung dịch nên có hệ số làm giàu cao [2, 4].
Chiết pha rắn có các ƣu điểm sau:
-

Thu hồi các chất phân tích với hiệu suất cao.

-

Chiết phân tích và làm sạch tạp chất dễ dàng.

-

Dễ tự động, phù hợp với sắc ký.

-

Giảm lƣợng dung môi hữu cơ dẫn đến hạ giá thành.

12


Các loại chiết pha rắn thƣờng đƣợc sử dụng bao gồm: Chiết pha thƣờng, chiết pha
đảo, chiết trao đổi ion, chiết rây phân tử. Trong đó chiết pha đảo với việc sử dụng pha
tĩnh với các nhóm C2, C18, một số gốc hydrocacbon với độ dài mạch khác nhau thích
hợp để tách các chất không phân cực trong pha nƣớc giống nhƣ các loại dƣợc phẩm.
Pha động hay chất rửa giải là dung môi phân cực, thƣờng là nƣớc + metanol,

acetonitrile … Quá trình chiết nhƣ hình 1.3.

Hình 1.3 Sơ đồ quá trình chiết pha rắn
1.3

Tổng quan về phƣơng pháp điện di mao quản

1.3.1 Sơ lược về phương pháp điện di mao quản
Điện di mao quản là phƣơng pháp tách chất dựa trên sự di chuyển khác nhau
của các ion dƣới tác dụng của điện trƣờng, trong lòng mao quản hẹp. Có nhiều kĩ thuật
khác nhau trong CE, tuy nhiên, điện di mao quản vùng (CZE) là phƣơng pháp đƣợc sử
dụng phổ biến nhất do đơn giản trong vận hành và hiệu quả trong phân tích. Trong
nghiên cứu này, thuật ngữ CE đƣợc hiểu là CZE.
13