nghiên cứu xác định marker để nhận dạng một số giống cam bản địa quý của việt nam làm cơ sở cho việc đăng kí bản quyền marker phân tử trong nước và quốc tế.

Khoá luận tốt nghiệp GVHD: ThS. Khuất Hữu Trung

Vũ Văn Huy Công nghệ sinh học 06-05
1

MỞ ðẦU
ðẶT VẤN ðỀ
Việt Nam ñược thế giới ghi nhận là nơi phát sinh của nhiều loại cây
trồng, vật nuôi và cũng là một trong 13 trung tâm sinh học phong phú nhất thế
giới (FAO, 1995). Với ñặc ñiểm khí hậu ña dạng gồm nhiệt ñới gió mùa, á
nhiệt ñới và ôn ñới cùng với nền văn minh nông nghiệp lâu ñời Việt Nam có
nguồn tài nguyên di truyền thực vật rất ña dạng và phong phú. Cho ñến nay,
hệ thống bảo tồn tài nguyên di truyền thực vật phục vụ cho mục tiêu lương
thực và nông nghiệp của nước ta ñang bảo tồn hơn 20.000 giống của 200 loài
cây trồng trong ñó có nhiều loài cây trồng quan trọng như lúa, chuối, khoai
sọ, vải, nhãn, nhiều loài cây họ ñậu, nhiều tập ñoàn hoa lan và nhiều loài cam
- bưởi thuộc chi Citrus là những cây trồng bản ñịa của Việt Nam. Với một số
lượng tập ñoàn cây trồng bản ñịa phong phú như vậy nhưng chúng ta vẫn
chưa có một hệ thống nghiên cứu ñánh giá, tư liệu hoá ở mức ñộ phân tử về
ña dạng di truyền các tập ñoàn cây bản ñịa Việt Nam một cách sâu rộng và
bài bản. Do ñó, việc ñặt tên cho từng giống vẫn rất lộn xộn từ những tên
giống ñược dịch sang từ tiếng Anh và tiếng Latinh, cách gọi tên theo ñịa
phương có rất nhiều tên giống trùng nhau. Bên cạnh ñó, việc di chuyển các
giống cây trồng giữa các vùng, ñịa phương khác nhau ñã gây ra sự nhầm lẫn
và hiểu sai về xuất xứ, nguồn gốc bản ñịa và mối quan hệ di truyền giữa các
giống cây trồng.
Trong hệ thống thực vật rất ña dạng và phong phú của Việt Nam, nhóm
cây ăn quả có múi như các giống cam và bưởi ñang rất ñược quan tâm và là
những loại cây ăn quả chính ở nước ta. Các giống cam, bưởi ngon và có tiếng
từ lâu như: cam Vân Canh, cam Bố Hạ, bưởi ðoan Hùng, bưởi Diễn, bưởi
Phúc Trạch, bưởi Da Xanh, bưởi Năm Roi vv. ñang ñược nhân lên và trồng

tại nhiều ñịa phương ñể phục vụ cho nhu cầu nội tiêu và xuất khẩu. Nhưng
việc ñăng kí bản quyền, xây dựng thương hiệu và quảng bá sản phẩm chưa
ñược thực hiện một cách ñầy ñủ nên việc xuất khẩu còn gặp nhiều khó khăn
Khoá luận tốt nghiệp GVHD: ThS. Khuất Hữu Trung

Vũ Văn Huy Công nghệ sinh học 06-05
2

và hạn chế, việc trồng các giống cam còn bị lẫn giống. Trước thực trạng như
hiện nay, việc tạo lập cơ sở dữ liệu ADN (ADN fingerprinting) của các
giống/loài cam bản ñịa, ñăng kí ở ngân hàng gen thế giới, khẳng ñịnh chủ
quyền quốc gia về tài nguyên di truyền thực vật của nước ta cũng như việc
xác ñịnh bản quyền ñối với giống cam và thực hiện quyền sở hữu trí tuệ về
tên các giống cây trồng quý này của Việt Nam ñang là vấn ñề cấp bách cần
sớm ñược triển khai.
Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu xác ñịnh marker ñể nhận
dạng một số giống cam bản ñịa quý của Việt Nam làm cơ sở cho việc ñăng kí
bản quyền marker phân tử trong nước và quốc tế.
Khoá luận tốt nghiệp GVHD: ThS. Khuất Hữu Trung

Vũ Văn Huy Công nghệ sinh học 06-05
3

I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. MỘT SỐ NÉT KHÁI QUÁT VỀ NHÓM CÂY ĂN QUẢ CÓ MÚI
1.1.1. Tên khoa học và vị trí của cây cam trong hệ thống phân loại
Ngành: Hạt kín (Ngọc Lan) - Angiospermae (Magnoliophyta)
Lớp: 2 lá mầm (Ngọc Lan) - Dicotyledoneae (Magnoliopsida)
Phân lớp: Hoa hồng - Rosidae
Liên bộ: Cam - Rutanae

Bộ: Cam - Rutales
Họ: Cam - Rutaceae
Chi: Citrus
1.1.2. Nguồn gốc, phân bố của nhóm cây ăn quả có múi
Nhóm cây ăn quả có múi và họ hàng hoang dại của chúng có nguồn gốc
từ Nam hay ðông Nam Châu Á, trung tâm chính thuộc Tây Ấn ðộ. Nhóm cây
này tồn tại trong tự nhiên từ Ấn ðộ, Nam Trung Quốc ñến Bắc Việt Nam và
Nam Indonexia. Cây ăn quả có múi là nhóm cây ñược trồng ở ðông Nam Á từ
rất xa xưa (International Plant Genetic Resources Institute (IPGRI), 2000) [30].
Nhóm cây ăn quả có múi ñược di cư sang ñịa Trung Hải, từ ñó chúng ñược ñưa
sang thế giới mới. Những giống cây ăn quả có múi quan trọng ñược di cư sang
thế giới mới vào cuối thế kỷ 19 và vào ñầu thế kỷ 20. Cây ăn quả có múi phát
triển ñược ở hầu hết các vùng nhiệt ñới và cận nhiệt ñới khoảng từ 44
0
vĩ tuyến
Bắc ñến 35
0
vĩ tuyến Nam [31].
Trước ñây cam quýt sản xuất chủ yếu ở các vùng á nhiệt ñới ở vào vĩ
tuyến 30
0
- 35
0
(Mỹ, ðịa Trung Hải, Brazil, Achentina). Hiện nay, sản lượng
cây ăn quả có múi ở các vùng nhiệt ñới ñã phát triển lên gần bằng các vùng á
nhiệt ñới [2].
1.1.3. Tình hình sản xuất và vai trò của nhóm cây ăn quả có múi trong
nền kinh tế
Cây ăn quả có múi là một trong những cây ăn quả chính ở các vùng
nhiệt ñới và cận nhiệt ñới. Chúng ñược sử dụng chủ yếu ñể làm hoa quả tươi,

Khoá luận tốt nghiệp GVHD: ThS. Khuất Hữu Trung

Vũ Văn Huy Công nghệ sinh học 06-05
4

nước ép, các loại mứt hoặc sử dụng như là các loại hương liệu. Nước ép của
quả cây ăn quả có múi thường chứa axit citric (vitamin C) và nhiều hợp chất
hóa học có lợi cho sức khỏe khác như là flavonoids, an-thocyanins, lycopenes,
và các chất chống oxi hóa (Jayaprakasha và Patil 2007) [39].
Quả của cây ăn quả có múi cũng có vai trò quan trọng trong nền văn
hóa ở một số nước trên thế giới. Ví dụ, cây Thanh Yên - ñặc biệt là giống
Etrog - ñược sử dụng trong các nghi lễ của người Do thái [43]. Ở nước ta có
rất nhiều giống bưởi ñược sử dụng trong nghi lễ thờ tổ tiên vào dịp tết, các
ngày rằm, mồng một …vv.
Quả có múi ñã trở thành loại quả quan trọng nhất với sản lượng 65 triệu
tấn/năm và chiếm 27% giá trị chung của các cây ăn quả quan trọng (Vũ Công
Hậu, 2000) [2]. Năm 2005 - 2006, nước sản xuất sản lượng trái cây ăn quả có
múi cao nhất là Braxin (20.6 triệu tấn), Trung Quốc (15 triệu tấn), Mĩ (10.4
triệu tấn), tiếp theo ñến là Tây Ban Nha và Mêxicô. Trong một số vùng, sản
xuất các sản phẩm của cây ăn quả có múi là ngành công nghiệp riêng bao gồm
nhiều công ñoạn như sản xuất, ñóng gói, vận chuyển, xử lý và các ngành công
nghiệp bổ trợ khác [39].
Ở nước ta, cây ăn quả có múi ñã ñược trồng từ rất lâu, phân bố khắp cả
nước nhưng diện tích trồng còn mang tính nhỏ lẻ [2]. Năm 1999 diện tích cây
ăn quả có múi là 63.400 ha với sản lượng là 405100 tấn (Nguyễn Văn Kế,
2001) [4]. Hiện nay có rất nhiều các dự án khôi phục, mở rộng và phát triển
các cây ăn quả có múi bản ñịa có giá trị kinh tế và giá trị văn hoá cao như
Quýt Hương - Hà Nam, bưởi Phúc Trạch - Hà Tĩnh, bưởi Sửu Chí ðám - Phú
Thọ, Cam Sành - Hà Giang, Tuyên Quang v.v. Nhưng do tình hình dịch bệnh
nên diện tích và sản lượng cây ăn quả có múi ở nước ta luôn có sự thay ñổi và

không ổn ñịnh.
1.1.4. Một số ñặc ñiểm nông sinh học chính của cây cam
1.1.4.1. ðặc ñiểm hình thái: Cây có kích thước nhỏ, cao từ 5 m ñến 8
m, phát triển tạo thành tán tròn. Hoa lưỡng tính, sinh ra ñơn ñộc hoặc một số
Khoá luận tốt nghiệp GVHD: ThS. Khuất Hữu Trung

Vũ Văn Huy Công nghệ sinh học 06-05
5

ít có cành hoa, ñược sinh ra từ nách lá. Quả hình bán cầu, ñường kính từ 4 cm
ñến 12 cm, màu vàng hơi lục ñến màu vàng tươi; Vỏ dày ñến 0.5 cm; các múi
có cùi thịt nhiều nước, có màu vàng ñến ñỏ - vàng.
1.1.4.2. ðặc ñiểm sinh thái: Giống với các thực vật cận nhiệt ñới, cam
sinh trưởng tốt nhất ở khí hậu lạnh ở miền bắc Việt Nam, ñặc biệt là các vùng
cao nguyên, miền núi. ðêm lạnh cho phép quả phát triển một màu vàng cam
ñậm trên cây trưởng thành và hương vị dễ chịu với sự kết hợp lý tưởng của vị
ngọt và vị chua.
Cam cũng ñược trồng ở miền Nam Việt Nam nơi có nhiệt ñộ, ñộ ẩm và
lượng mưa nhiều hơn rất nhiều ở miền Bắc…Cũng như các ñiều kiện khí hậu
có ảnh hưởng khác biệt trên cây cam. Bao gồm:
a) Thời kì sinh trưởng: Ở miền Nam, mất chỉ 6 ñến 6.5 tháng từ khi ra
hoa ñến khi quả chín trong khi ở miền Bắc cần 8 ñến 9 tháng.
b) Số vụ thu hoạch: Ở miền Nam, cam có thể ñược thu 2 vụ mỗi năm
nếu cung cấp ñủ nước, trong khi ñó ở miền Bắc chỉ thu hoạch ñược một vụ.
c) Kích thước quả: Nhiệt ñộ cao và ñộ ẩm ở miền Nam cho quả lớn hơn
ở miền Bắc.
d) Nước quả, hàm lượng ñường và axit: Cam miền Nam có hàm lượng
ñường cao hơn những giống trồng ở miền Bắc bởi vì chúng có ñược thời gian
chiếu sáng trong ngày dài hơn và ở nhiệt ñộ cao. Hàm lượng axít ít hơn, bởi vì
về ban ñêm ấm hơn, ñiều này làm cho các cây cam ít ñược người nước ngoài

ưa thích, vì họ thích cam với vị chua trung bình hơn.
e) Màu sắc quả: Do không có ñêm lạnh trong suốt thời gian trưởng
thành, nên không có sự hình thành các sắc tố nhuộm màu trong vỏ quả, vì vậy
chúng biểu lộ màu xanh và vàng xanh tương ứng. ðiều này trở nên tồi tệ nếu
trái vẫn mang màu xanh trong thời kì lượng mưa cao.
Khoá luận tốt nghiệp GVHD: ThS. Khuất Hữu Trung

Vũ Văn Huy Công nghệ sinh học 06-05
6

f) Vị và mùi thơm: Cây cam cần một khí hậu lạnh với ánh sáng và nhiệt
ñộ ấm vào ban ngày, lạnh vào ñêm ñể có hương vị, mùi thơm và màu sắc tốt
nhất. Nếu trồng ở vùng khí hậu ấm như miền Nam Việt Nam, cây sẽ phát
triển nhanh hơn và chất lượng quả kém .
Miền Bắc Việt Nam có lượng mưa trong năm từ khoảng 1500mm ñến
1700 mm, và ñược phân bố ñều. Vì vậy, không cần phải tưới nước ngay cả
vào mùa khô khi thỉnh thoảng mới có mưa. Tuy nhiên, có những năm không
có mùa mưa, vì vậy ñộ ẩm phải ñược duy trì bằng nước tưới. Ở vùng núi phía
Nam việc tưới nước là rất cần thiết ñể ñạt năng suất cao. Những nơi khác trên
thế giới, nước tưới và khí hậu chọn lọc ñược sử dụng ñể cảm ứng ra hoa và
chín quả, ñặc biệt là trong thời gian thu hoạch.
ðất màu mỡ là yêu cầu cần thiết ñể sản xuất trái ngon. Với ñất nghèo
dinh dưỡng nhưng với ñiều kiện khí hậu thuận lợi thì phải bổ sung nguồn
phân bón vô cơ và phân hữu cơ. ðiều này là cần thiết ở miền Bắc Việt Nam
nơi ñất thường nghèo dinh dưỡng, như là các vùng ñã trồng các cây lương
thực trong nhiều năm và ñộ màu mỡ ñã bị suy giảm.
Trong các ñiều kiện nhiệt ñới của miền Nam, nơi lượng mưa nhiều ñã
rửa trôi nguồn dinh dưỡng của ñất, bổ sung phân bón là cần thiết, ñặc biệt là
Kali ñể tránh cho cam trở lên quá chua ñối với sở thích của người ñịa phương.
1.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ðA DẠNG DI TRUYỀN

1.2.1 Phương pháp sử dụng các chỉ tiêu hình thái
Các ñặc ñiểm hình thái trong phân loại sinh vật ñược sử dụng từ rất
sớm. Nguyên tắc cơ bản của phương pháp này là: Hai ñơn vị phân loại
(taxon) càng có nhiều ñặc ñiểm chung, càng giống nhau, quan hệ giữa 2
taxon càng gần gũi với nhau. Bất cứ sự khác nhau nào giữa 2 cá thể ñều là
ñặc ñiểm, nhưng không phải bất cứ ñặc ñiểm nào cũng có thể dùng làm
ñặc ñiểm phân loại.
Khoá luận tốt nghiệp GVHD: ThS. Khuất Hữu Trung

Vũ Văn Huy Công nghệ sinh học 06-05
7

Những ñặc ñiểm phân loại ổn ñịnh, biến ñổi chậm (tiến hoá chậm),
liên quan ñến những cấu trúc ít biến ñổi của cơ thể sinh vật có tác dụng
phân biệt và xác ñịnh các taxon bậc cao, những biến ñổi nhanh hoặc liên
quan ñến cơ chế cách li sinh sản có tác dụng xác ñịnh các taxon bậc thấp.
Người ta thường kết hợp nhiều ñặc ñiểm ñể làm tăng giá trị tin cậy của
kết quả so sánh.
Mặc dù phương pháp sử dụng các chỉ tiêu hình thái có ưu ñiểm là
tiện lợi, nhanh chóng, kinh tế, có thể so sánh các ñặc ñiểm giữa các loài
hoá thạch với các loài ñang sống ñể tìm kiếm mối quan hệ họ hàng giữa
chúng. Nhưng việc lựa chọn và cân nhắc giá trị sử dụng của các ñặc ñiểm
phân loại là một trong những khâu khó nhất, nó không chỉ ñòi hỏi kiến
thức mà còn ñòi hỏi kinh nghiệm và sự khéo léo của các nhà phân loại
học. Bên cạnh ñó, phương pháp này nhiều khi không chính xác vì có hiện
tượng ñồng quy tính trạng và nó không phân biệt ñược các loài ñồng hình.
Theo viện nghiên cứu nguồn di truyền thực vật quốc tế IPGRI
(International Plant Genetic Resources Institute), ở nhóm cây ăn quả các chỉ
tiêu dùng ñể phân loại dựa vào hình thái dựa vào một số các ñặc ñiểm như
là:

- Hình dạng lá;
- Mô tả hình dạng gân lá;
- Kích thước quả;
- Hình dạng quả (hình dạng của quả trưởng thành);
- Màu sắc vỏ (màu sắc của vỏ trưởng thành);
- ðộ dày vỏ;
- ðộ dày cùi;
- Màu sắc cùi 10. Vị (cùi của cây trưởng thành);
Khoá luận tốt nghiệp GVHD: ThS. Khuất Hữu Trung

Vũ Văn Huy Công nghệ sinh học 06-05
8

- Hương vị;
- Bề mặt (Quả trưởng thành);
- ðộ mềm của quả;
- ðộ mọng nước của quả.
1.2.2. Phương pháp dựa vào các chỉ thị hóa sinh
Các isozyme ñược ñịnh nghĩa như các dạng khác nhau của một enzyme
(protein) có chức năng giống hay gần gũi nhau có ở cùng một cá thể [5].
Trong quá trình tiến hoá, các gen có thể bị ñột biến và hình thành các alen
khác nhau. Mỗi khu vực ñịa phương tạo nên các quần thể cùng loại ñược tiến
hoá, chọn lọc theo các alen khác nhau. Do các alen khác nhau nên cấu trúc
bậc I của protein enzyme là khác nhau. Do ñó, các enzyme khác nhau về
trọng lượng, kích thước.
Protein enzyme là chất ña ñiện ly nên ở dạng dung dịch nó ở trạng
thái phân cực về ñiện tích. Dưới tác dụng của dung dịch ñệm có pH khác
nhau, protein enzyme sẽ mang ñiện tích âm hoặc dương. Trong ñiện trường
của dòng ñiện 1 chiều các phân tử trong hỗn hợp protein sẽ chuyển ñộng về
phía catốt hoặc anốt theo tốc ñộ khác nhau. Nếu phân tử protein có kích thước

nhỏ, trọng lượng phân tử bé, lực hút tĩnh ñiện lớn thì sẽ chuyển ñộng nhanh
và ngược lại. Do ñó, chúng sẽ nằm ở các vị trí khác nhau trên bản gel khi
chạy ñiện di hỗn hợp protein, sự khác nhau của các cấu tử ñiện di của các
isozyme ñược dùng ñể so sánh, ñánh giá sự khác nhau về bản chất di truyền
của các loài. Sự khác nhau càng ít thì mối quan hệ họ hàng giữa chúng càng
gần và ngược lại.
Protein là chất không màu, ñể quan sát các băng ñiện di cần tiến hành
nhuộm màu. Quá trình nhuộm màu cần có các cơ chất ñặc hiệu, chất xúc tác,
coenzyme, chất kết tủa màu.
Khoá luận tốt nghiệp GVHD: ThS. Khuất Hữu Trung

Vũ Văn Huy Công nghệ sinh học 06-05
9

Việc phân tích isozyme cho ta những alen ñồng trội và là phương pháp
tương ñối rẻ, dễ tiến hành hơn phương pháp phân tích ADN. Tuy nhiên với số
lượng ít ỏi các isozyme và chúng chỉ thể hiện ở một giai ñoạn nhất ñịnh của
quá trình phát triển cá thể và thực tế nó cũng chỉ là sản phẩm của gen nên
chưa phản ánh thật chính xác bản chất di truyền của các cá thể. Do vậy việc
sử dụng chỉ thị isozyme còn có những hạn chế nhất ñịnh.
1.2.3. Phương pháp sử dụng chỉ thị phân tử ADN
ðể ñánh giá bản chất di truyền của các cá thể dựa vào hệ gen của
chúng, các marker ADN ñã ñược ứng dụng nhiều lĩnh vực nghiên cứu của
sinh học phân tử như: Xây dựng thư viện bộ gen, xác ñịnh cây phát sinh
chủng loại, ñánh giá ña dạng di truyền, xác ñịnh quan hệ họ hàng
Ở thực vật có nhiều loại marker phân tử ñã ñược ứng dụng trong các
nghiên cứu như: RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), SSR
(Simple Sequence Repeat hay Microsatellite), RAPD (Random Amplified
Polymorphic DNA), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism),
ISSR ( Inter-simple sequence repeats ), SPN, SCAR (sequence –

Characterized Amplified Region) Trong ñó, các marker ADN phổ biến
trong nghiên cứu sinh học phân tử ở thực vật là: RFLP, Microsatellite,
RAPD, AFLP và ISSR (Semagn và cs, 2006) [54].
Bảng 1: Sự so sánh các marker DNA ñược sử dụng rộng rãi nhất ở thực
vật (Theo Semagn và cs, 2006)
Chỉ tiêu so
sánh
RFLP SSR RAPD AFLP ISSR
Sự phong phú
Genome
Cao Trung bình Rất cao Rất cao Trung
bình
Các phần của
genome ñược
khảo sát
Bản sao ít của
các vùng mã
hóa

Toàn bộ
genome
Toàn bộ
genome
Toàn bộ
genome
Toàn bộ
genome
Lượng ADN cần
thiết
Cao Thấp Thấp Trung

bình
Thấp
Khoá luận tốt nghiệp GVHD: ThS. Khuất Hữu Trung

Vũ Văn Huy Công nghệ sinh học 06-05
10

Dạng ña hình Các thay ñổi
của bazơ ñơn
lẻ, chèn thêm,
bị loại bỏ
Các thay
ñổi trong
chiều dài
ñoạn lặp lại

Các thay
ñổi của
bazơ ñơn lẻ,
chèn thêm,
bị loại bỏ
Các thay
ñổi của
bazơ ñơn
lẻ, chèn
thêm, bị
loại bỏ
Các thay
ñổi của
bazơ ñơn

lẻ, chèn
thêm, bị
loại bỏ
Mức ñộ ña hình

Trung bình Cao Cao Rất cao Cao
Số locus ña hình
ñược phân tính
trong mỗi thí
nghiệm
Thấp Trung bình Trung bình Cao Trung
bình
Kết quả dị hợp
tử mong ñợi
trung bình và số
locus ña hình
Thấp Trung bình Trung bình Cao Trung
bình
ðặc tính di
truyền
ðồng trội ðồng trội Trội Trội Trội
Sự phát hiện các
alen
Có Có Không Không Không
Sử dụng dễ dàng

Lao ñộng
cường ñộ cao
Dễ dàng Dễ dàng Khó khăn
khi bắt ñầu

Dễ dàng
Sự tự ñộng hóa Thấp Cao Trung bình Trung
bình
Trung
bình
Khả năng tái sản
xuất (Tính ñáng
tin cậy)
Cao Cao Trung bình Cao Trung
bình ñến
cao
Dạng mẫu
dò/mồi
Hệ gen có ít
bản sao, ADN
hoặc các dòng
cDNA
Trình tự
ADN lặp
lại ñặc hiệu
Thường 10
bp các
nuclêôtit
ngẫu nhiên
Trình tự
ñặc hiệu
Trình tự
ADN lặp
lại ñặc

hiệu
Tách dòng
và/hoặc giải
trình tự
Có Có Không Không Không
Phát hiện nhờ
phóng xạ
Thường là có Không Không Có/Không Không
Sự triển khai/chi
phí khởi ñộng
Cao Cao Thấp Trung
bình
Trung
bình
Có ích trong xây
dựng bản ñồ di
truyền
ðặc hiệu loài ðặc hiệu
loài
ðặc hiệu lai
giống
ðặc hiệu
lai giống
ðặc hiệu
lai giống
Tình trạng
quyền sở hữu
Không Không
(một số có
giấy ñăng

kí)

Có giấy
ñăng kí
Có giấy
ñăng kí
Không

Khoá luận tốt nghiệp GVHD: ThS. Khuất Hữu Trung

Vũ Văn Huy Công nghệ sinh học 06-05
11

1.2.3.1. Chỉ thị RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)
Chỉ thị này ñược các nhà di truyền học lần ñầu tiên giới thiệu trong
nghiên cứu lập bản ñồ các gen liên quan ñến bệnh ở người [34]. Các ña hình
RFLP sinh ra bởi những ñột biến tự nhiên ở những ñiểm cắt enzyme giới hạn
trong ADN bộ gen, ví dụ như ñảo ñoạn, thêm ñoạn, mất ñoạn, hoặc sự mất ñi
hay thêm vào của một hay nhiều nucleotit khác nhau tuỳ thuộc vào ñặc ñiểm
riêng biệt của mỗi giống, loài, thậm chí mỗi cá thể. Mỗi một loài sinh vật có
một bộ ADN genom ñặc hiệu trong cấu trúc. Vì vậy khi sử dụng những
enzym giới hạn ñể cắt phân tử ADN của hệ gen, người ta có thể nhận biết
ñược những ñoạn ADN có chiều dài khác nhau bằng kĩ thuật lai ADN với
những mẫu dò (probe). ðó là nguyên lý kĩ thuật ña hình chiều dài các mảnh
phân cắt giới hạn AFLP. Ở thực vật, chỉ thị này lần ñầu tiên ñược áp dụng
trong nghiên cứu gen chịu trách nhiệm tổng hợp ARN ribosom trong vùng
cấu trúc nhân của lúa mì (Appels và Dvorak, 1982). Từ ñó, việc lập bản ñồ di
truyền sử dụng chỉ thị RFLP ñã ñược ứng dụng ñối với nhiều loại cây trồng
khác nhau bao gồm cà chua (Bernatzky và Tanksley, 1986), ngô (Helentjaris
và cs., 1986), cải bắp (Figdore và cs., 1985), khoai tây (Gebhardt và cs.,

1989) Chỉ thị RFLP còn ñược sử dụng trong lập bản ñồ QTLs cho tính trạng
chất lượng và năng suất lúa (Lin và cs., 1996), các gen kháng ñạo ôn
(Hittalmani và cs., 1994), gen kháng rầy nâu (Murata và cs., 1998) v.v…
Chỉ thị RFLP là chỉ thị ñồng trội nghĩa là có khả năng biểu hiện tất cả
các alen của cùng một locut gen. Do vậy, có thể phân biệt ñược các cá thể
ñồng hợp tử (AA hoặc aa) và các cá thể dị hợp tử (Aa). ðây là ñặc ñiểm ưu
việt của loại chỉ thị RFLP. Hạn chế của phương pháp này là tiêu tốn nhiều
thời gian và sức lực, ñòi hỏi nhiều trang thiết bị phòng thí nghiệm. ðặc biệt là
tiêu hao một lượng lớn ADN mà số lượng ña hình thu ñược rất ít ỏi, thậm chí
ở một số loài khó nhận ñược ña hình.

Khoá luận tốt nghiệp GVHD: ThS. Khuất Hữu Trung

Vũ Văn Huy Công nghệ sinh học 06-05
12

1.2.3.2. Chỉ thị RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)
Loại chỉ thị này ñược sinh ra bởi phản ứng PCR, do sự nhân bội những
ñoạn ADN hệ gen, sử dụng những ñoạn mồi ñơn lẻ, ngẫu nhiên (random
primer) dài khoảng 10 nucleotit dưới nhiệt ñộ kết cặp thấp (khoảng 37
0
C)
(Williams và cs., 1990). Sản phẩm của phản ứng ñược phân tách bằng ñiện di
trên gel agarose, nhuộm trong ethidium bromide và quan sát dưới ñèn tím.
RAPD sinh ra những chỉ thị trội bởi sự có mặt hay vắng mặt những băng
ADN ñặc trưng. Vì vậy không phân biệt ñược thể dị hợp tử. ðó là hạn chế của
loại chỉ thị này so với chỉ thị ñồng trội RFLP. Mặc dù vậy, chỉ thị này vẫn là
một công cụ hữu hiệu trong việc lập bản ñồ ở những dòng nhị bội, những
dòng cận phối hay các quần thể lai trở lại. Lợi thế của loại chỉ thị này là
không cần biết những thông tin về trình tự (William và cs., 1993). Chỉ thị

RAPD còn có thể sử dụng trong việc ñiền vào những chỗ trống trên bản ñồ
phân tử RFLP (Chang và Meyerowitz, 1991), lập bản ñồ gen kháng ñạo ôn ở
lúa (Naqvi và cs., 1995)… Chỉ thị RAPD còn có một hạn chế nữa là ñộ nhạy
của RAPD bị phụ thuộc vào ñiều kiện của phản ứng, ñôi khi kết quả không
lặp lại ñược, ñặc biệt là ở những cơ thể có bộ gen lớn như lúa mì.
ðể khắc phục hạn chế này, ñôi khi người ta nhân dòng những băng
RAPD ñặc hiệu, xác ñịnh trình tự của chúng rồi thiết kế những ñoạn mồi dài
khoảng 20 bp từ cả hai ñầu và gọi là chỉ thị SCARs (Sequence –
Characterized Amplified Region).
1.2.3.3. Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)
Loại chỉ thị này ñược sử dụng rộng rãi trong những nghiên cứu lập bản
ñồ gen và xác ñịnh chỉ thị phân tử liên kết gen. Kĩ thuật tạo ra các loại chỉ thị
này ñược gọi là nhân bội chọn lọc những mảnh cắt giới hạn (Selective
restriction Fragment Amplication = SRFA). Phương pháp linh hoạt này có thể
phát hiện ñược sự có mặt của những mảnh cắt giới hạn trong bất kỳ loại ADN
Khoá luận tốt nghiệp GVHD: ThS. Khuất Hữu Trung

Vũ Văn Huy Công nghệ sinh học 06-05
13

nào [62]. Nguyên lý của kĩ thuật AFLP dựa trên cơ sở nhân bội có chọn lọc
những mảnh cắt giới hạn từ ADN hệ gen. Kĩ thuật này bao gồm ba bước:
- Bước 1: ADN hệ gen ñược cắt bằng hai loại enzym, một enzym cắt
hiếm (a rare cutter) ví dụ như PstI hoặc EcoRI và một enzym cắt thường (a
frequent cutter) ví dụ MseI, TaqI. Kết quả là sinh ra những mảnh cắt có một
ñầu là trình tự cắt hiếm và một ñầu là trình tự cắt thường. Sau ñó gắn bộ thích
ứng (adapter) vào hai ñầu mảnh cắt. Các bộ thích ứng AFLP bao gồm hai
phần: phần cốt lõi (core sequence) và chuỗi trình tự ñặc hiệu của enzym. Vị
trí nhận biết của enzym giới hạn trên các bộ thích ứng ñược loại bỏ bằng cách
thay ñổi một gốc bazơ ở ñầu 5’. Ví dụ vị trí nhận biết của enzym giới hạn

EcoRI là 5’ –GAATTC-3’, nhưng G trên bộ thích ứng ñược thay bằng C, do
vậy mà sau khi ñã gắn bộ thích ứng vào mảnh ADN hệ gen thì vị trí này
không thể bị cắt một lần nữa vì ñã mất vị trí ñặc hiệu. Tương tự như vậy, vị trí
nhận biết của enzym giới hạn MseI là 5’-TTAA-3”. Nhưng gốc T ở ñầu 5’
trên bộ thích ứng ñược thay bằng G. Nhờ kĩ thuật này mà ADN hệ gen có thể
ñược cắt và gắn ñồng thời. Khi cắt ADN hệ gen bằng hai enzym EcoRI và
MseI, sẽ có 3 loại mảnh cắt gồm: mảnh có hai ñầu cắt bởi MseI, mảnh có hai
ñầu cắt bởi EcoRI, mảnh cắt có một ñầu là EcoRI và một ñầu là MseI.
- Bước 2: Nhân bội những mảnh cắt giới hạn sử dụng mồi ñặc hiệu bổ
sung với trình tự của bộ thích ứng và trình tự giới hạn của enzym. Bước này
ñược thực hiện nhằm giảm bớt số lượng quá lớn của các mảnh ADN sau khi
cắt và gắn bộ thích ứng. Sự nhận bội chọn lọc ñạt ñược bởi sử dụng những
mồi ñược kéo dài phía ñiểm cắt giới hạn bằng cách thêm các nucleotit vào vị
trí cắt. Do vậy mà chỉ có những mảnh ADN có trình tự bổ trợ với các bazơ
thêm vào mới ñược nhân bội. Phản ứng thứ nhất gọi là nhân bội sơ bộ (pre-
amplification) hay tiền nhân bội. Phản ứng thứ hai gọi là nhân bội chọn lọc
(selective PCR). Các mồi AFLP gồm có ba phần: Chuỗi cốt lõi (CORE),
chuỗi ñặc hiệu enzyme (ENZ) và phần thêm vào các nucleotit chọn lọc
Khoá luận tốt nghiệp GVHD: ThS. Khuất Hữu Trung

Vũ Văn Huy Công nghệ sinh học 06-05
14

(EXT). ðiều này ñược minh họa sau ñây với 3 nucleotit thêm vào ñược biểu
thị bằng N1N2N3:
Mồi EcoRI: 5’- GACTGCGTACC AATTC N1N2N3 -3’
Mồi MseI : 5’ – GATGAGTCCTGAG TAA N1N2N3 -3’
Các mồi AFLP cho các enzyme cắt hiếm khác (ví dụ PstI) cũng tương
tự như mồi EcoRI, và mồi TaqI cũng tương tự mồi MseI, chỉ khác ở chỗ phần
ñặc hiệu ENZ là tương ứng với trình tự cắt của mỗi loại enzyme.

Sử dụng phương pháp này có thể tạo ra một bộ tập hợp những mảnh cắt
giới hạn nhờ PCR mà không cần biết trình tự của chúng, cho phép nhân ñặc
hiệu một số lượng lớn những mảnh cắt giới hạn. Một bộ gồm tập hợp một số
lượng lớn những mảnh cắt ADN có thể phân tích ñồng thời, phụ thuộc vào ñộ
phân giải của hệ thống phát hiện.
- Bước 3: ðiện di các sản phẩm của phản ứng PCR nhờ hệ thống chạy
ñiện di trên gel polyacrylamit. Thường là từ 50 – 100 mảnh cắt giới hạn ñược
nhân lên và phát hiện trên gel polyacrylamit biến tính nhờ sử dụng ñồng vị
phóng xạ hoặc nhuộm bạc. Kĩ thuật AFLP cung cấp một lượng vân tay ADN
lý tưởng từ ADN của bất kỳ nguồn gốc nào. ðây là một kĩ thuật thiết thực và
ñáng tin cậy bởi sự nghiêm ngặt của ñiều kiện phản ứng.
Tính hợp lý của việc sử dụng hai enzyme cắt là ở chỗ:
1) Enzyme cắt thường sẽ sinh ra những ñoạn ADN ngắn, nằm trong
miền kích thước lý tưởng cho việc nhân bội và phân tách trên gel
polyacrylamit.
2) Số lượng các mảnh ADN ñược nhân bội sẽ giảm xuống nhờ sử dụng
enzyme cắt thường bởi vì chỉ có những mảnh cắt bởi một ñầu là enzyme cắt
hiếm và một ñầu là enzyme cắt thường mới ñược nhân lên.
3) Việc ñánh dấu một ñầu của mồi ngăn cản sự xuất hiện băng kép.
Khoá luận tốt nghiệp GVHD: ThS. Khuất Hữu Trung

Vũ Văn Huy Công nghệ sinh học 06-05
15

4) Sử dụng hai loại mồi sinh ra tính linh hoạt lớn trong việc ñiều chỉnh
số lượng ADN nhân bội.
5) Một lượng lớn ña hình khác nhau có thể ñược sinh ra khi nhân bội
bằng những tổ hợp mồi khác nhau.
Tính ñặc hiệu của loại ña hình này còn thể hiện bởi trình tự ñặc hiệu
và số lượng của các nucleotit ñược thêm vào ñầu 3’ của mỗi mồi. Theo tính

toán, cứ thêm một nucleotit vào mồi AFLP thì số lượng các chủng loại băng
ADN nhân bội trong phản ứng PCR lại giảm xuống 4 lần vì trong số các
mảnh ADN chỉ có một trong 4 nucleotit ñược chọn lọc và nhân bội. Như vậy
là thêm 2 nucleotit vào ñầu của mỗi mồi thì số lượng các chủng loại băng
ADN giảm xuống 42 lần, nếu thêm vào 3 nucleotit thì số lượng băng giảm
xuống 43 lần. Việc thêm các nucleotit vào 2 ñầu của các mồi AFLP dẫn ñến
kết quả là tạo ra những bộ phụ (subset) của bộ ña hình gốc. ðiều này chỉ ra
rằng việc cho thêm các nucleotit lựa chọn là con ñường chính xác và có hiệu
quả ñể lựa chọn một bộ ñặc hiệu những mảnh cắt cho quá trình nhân bội.
Bằng tất cả những kĩ thuật ñược mô tả ở trên, kĩ thuật AFLP có thể tạo ra số
lượng chỉ thị di truyền nhiều nhất so với các kĩ thuật khác ñối với mỗi tổ hợp
mồi. Lượng ADN tổng số tiêu tốn cho kĩ thuật này lại rất ít. ðây là một
phương pháp có hiệu quả cả trong nghiên cứu ña dạng di truyền, tìm chỉ thị
liên kết và lập bản ñồ gen. Tuy nhiên, mặt hạn chế của AFLP là chỉ thị di
truyền trội, không có khả năng phân biệt giữa thể ñồng hợp tử và dị hợp tử,
giá thành cho nghiên cứu tương ñối cao.
1.2.3.4. Chỉ thị SSR (Microsatellite hay Simple Sequence Repeates)
Chỉ thị vi vệ tinh, là những ñoạn ADN lặp lại một cách có trật tự, gồm
những ñơn vị lặp lại gồm từ 1 ñến 6 nucleotit, theo kiểu lặp lại ngắn [15].
Hiện tượng các SSR trong cơ thể sinh vật nhân chuẩn là khá phổ biến ở ñộng
vật và thực vật. Tuy nhiên, tuỳ từng loài mà số lượng các nucleotit trong mỗi
ñơn vị lặp lại có thể thay ñổi và số lượng ñơn vị lặp lại có thể biến ñộng từ
Khoá luận tốt nghiệp GVHD: ThS. Khuất Hữu Trung

Vũ Văn Huy Công nghệ sinh học 06-05
16

hai ñến hàng chục lần hoặc nhiều hơn. (Graziana T. et al, 1996) [21] SSR ñã
ñược nghiên cứu lần ñầu tiên trên người [45], và cho ñến nay nó ñược tìm
thấy trong các hệ gen của một số cơ thể Eukaryot khác như các gia cầm, ñộng

vật có vú [37], [55], cá và trên vài loài cây một lá mầm và hai lá mầm [59].
Bản chất ña hình của SSR có thể ñược sinh ra do sự nhân bội từ ADN tổng số
của hệ gen nhờ sử dụng 2 ñoạn mồi bổ trợ với trình tự gần kề hai ñầu của
vùng lặp lại. Giá trị của SSR là ở chỗ nó sinh ra ña hình từ rất nhiều vùng
tương ứng, bao phủ rộng khắp hệ gen và có bản chất ñồng trội, dễ dàng phát
hiện bằng PCR. Những chuỗi ña hình ñơn giản này ñã ñược ứng dụng trong
việc lập bản ñồ ở cả hai ñối tượng ñộng vật và thực vật [68]. Ở người, SSR
ñược gọi là thế hệ thứ hai của các chỉ thị phân tử. Ở thực vật, tần số và số
lượng SSR ñã ñược xác ñịnh trên các cây rừng nhiệt ñới, cây bắp cải, lúa mì,
và 34 giống cây trồng khác [59]. Những kết quả nghiên cứu này ñã chỉ ra rằng
ở thực vật, SSR mang trình tự lặp lại (AT)n nhiều hơn so với ở ñộng vật,
trong khi ở những loài ñộng vật thì lại giàu SSR kiểu (GT)n hơn. Những
nghiên cứu trên lúa, ngô và Arabidopsis cũng cho kết quả tương tự. Nghiên
cứu sàng lọc (screening) thư viện genome lúa cho thấy có khoảng 5.700-
10.000 vi vệ tinh ở lúa [57].
Ưu ñiểm và hạn chế của phương pháp microsatellite
Thuận lợi to lớn của sự phân tích microsatellite là phương pháp này
biểu hiện số lượng lớn sự ña hình. Hơn nữa, khả năng phân biệt các cá thể khi
có sự kết hợp các locus ñược kiểm tra làm cho phương pháp này rất hữu dụng
trong các thí nghiệm dòng chảy gene, xác ñịnh cây trồng và phân tích mối
quan hệ cha con (Hokanson và cs, 1998) [27].
Microsatellite là marker ñồng trội, do ñó dị hợp tử có thể dễ dàng ñược
xác ñịnh và có khả năng tự ñộng hóa trong quá trình thực nghiệm. Tính ñồng
trội của microsatllite sẽ gia tăng sự hiệu quả và ñộ chính xác của những phép
tính toán di truyền quần thể dựa trên những marker này so với những marker
Khoá luận tốt nghiệp GVHD: ThS. Khuất Hữu Trung

Vũ Văn Huy Công nghệ sinh học 06-05
17

khác, như AFLP và RAPD. Hơn nữa, việc xác ñịnh dị hợp tử ở thế hệ F1 sẽ
làm cho những phân tích phả hệ, sự lai giống, dòng chảy gen trở nên dễ dàng
hơn (Schlotterer và Pemberton, 1994) [52]. SSR là công cụ hữu hiệu ñể chọn
lọc giống, ña dạng hoá về các vật liệu di truyền và dùng trong thiết lập bản ñồ
di truyền. Chẳng hạn, Parasnis (1998) [44] phát hiện ñoạn lập lại GATA kích
thước 5 kb chỉ có ở cây ñu ñủ ñực không có ở cây ñu ñủ cái bằng marker
SSR.
Khi các primer SSR ñã ñược xác ñịnh, việc sàng lọc các vật liệu sử
dụng kỹ thuật này hoàn toàn không ñắt tiền. Hơn nữa, sự khuếch ñại SSR
giữa các loài nghĩa là sự xác ñịnh những primer SSR thích hợp không cần
thiết trong những loài có quan hệ gần (Guilford và cs, 1997; Gianfranceschi
và cs, 1998; Hokanson và cs, 1998) [22]; [44]; [27].
Tuy nhược ñiểm của chỉ thị này là quá trình thiết kế primer quá ñắt,
mỗi loại primer chỉ ñặc trưng cho một loài và không thể áp dụng phân tích
trên một hệ thống lớn bao gồm nhiều loài có quan hệ di truyền xa nhau.
1.2.3.5. Chỉ thị ISSRs (Inter-simple sequence repeats)
Kỹ thuật ISSR là một phương pháp dựa trên chuỗi phản ứng PCR, mà
nó liên quan ñến sự khuếch ñại của ñoạn ADN hiện diện ở một khoảng cách
có thể khuếch ñại ở bên trong giữa hai vùng lặp lại vi vệ tinh giống hệt nhau
hướng theo hướng ñối diện nhau. Kỹ thuật sử dụng những vi vệ tinh, thông
thường có chiều dài 16 - 25 bp, như các mồi trong một phản ứng PCR mồi
ñơn có ñích ñến là nhân các locus hệ gen ñể phần lớn khuếch ñại các trình tự
bên trong các vi vệ tinh của các kích thước khác nhau. Các mồi có thể là di -
nucleotide, trinucleotide, Tetra - nucleotide hoặc penta - nucleotide. Các mồi
ñược sử dụng có thể không có dạng hình mỏ neo ( Gupta et al., 1994; Meyer
et al., 1993; Wu et al., 1994) hoặc thường có dạng hình mỏ neo ñầu 3 ' hoặc
ñầu 5 ' với 1 tới 4 bazơ bị suy thoái mở rộng vào trong các trình tự bên
Khoá luận tốt nghiệp GVHD: ThS. Khuất Hữu Trung

Vũ Văn Huy Công nghệ sinh học 06-05

18

(Zietkiewicz et al., 1994) [63]. Kỹ thuật kết hợp hầu hết các ưu ñiểm của phân
tích AFLP và sự phân tích vi vệ tinh với sự phổ biến của RAPD. ISSRs có thể
tái khả năng sản xuất cao nhờ ñó sử dụng các mồi dài hơn ( 16 - tới 25 – mer)
khi ñược so sánh với các mồi của RAPD ( 10 – mer) mà nó cho phép sử dụng
tiếp theo ở nhiệt ñộ gắn mồi cao hơn ( 45- 60
0
C ) nên tính chính xác cao hơn.
Polyacrylamide ñược sử dụng ñể phát hiện các sản phẩm của ISSR.
Các ISSR tách riêng phần lớn như những marker trội tuân theo quy luật
di truyền ñơn giản của Mendel ( Gupta et al., 1994; Tsumura et al., 1996;
Ratnaparkhe et al., 1998). Tuy nhiên, chúng cũng ñã chỉ ra sự phân tách như
các marker ñồng trội trong một vài trường hợp cho phép phân biệt giữa ñồng
hợp tử và dị hợp tử ( Wu et al., 1994; Akagi et al., 1996; Sankar Và Moore,
2001).
Các marker ISSR có sự ña hình cao và hữu ích trong các nghiên cứu ña
dạng di truyền, phát sinh chủng loại, ñánh dấu gen, lập bản ñồ bộ gen và sinh
học tiến hóa (Gupta et al., 1994; Becker and Heun, 1995; Wolff et al., 1995;
Akagi et al., 1996; Wolfr et al., 1998; Charters and Wilkinson, 2000; Joshi et
al., 2000; Sankar and Moore, 2001; Reddy et al., 2002).
1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU ðA DẠNG DI TRUYỀN, PHÂN LOẠI
TRÊN ðỐI TƯỢNG NHÓM CÂY ĂN QUẢ CÓ MÚI
1.3.1. Tình hình nghiên cứu ña dạng di truyền của nhóm cây có múi trên
thế giới
1.3.1.1. Nghiên cứu ña dạng di truyền, phân loại nhóm cây ăn quả có múi
dựa trên chỉ thị hình thái
Mối quan hệ phân loại của các loài thuộc chi Citrus ñã ñưa ra một số
lượng lớn sự nhầm lẫn khi chúng sinh ra con cháu ở cả dạng sinh sản hữu tính
và sinh sản vô tính ñược gọi là các cây phôi tâm (Barrett và Rhodes, 1976)

[9]. Hai hệ thống phân loại ñã ñược ñề xuất cho chi này là hệ thống của
Khoá luận tốt nghiệp GVHD: ThS. Khuất Hữu Trung

Vũ Văn Huy Công nghệ sinh học 06-05
19

Swingle (Swingle, 1943) [58] bao gồm 16 loài và hệ thống khác của Tanaka
(Tanaka, 1977) [60] bao gồm 162 loài.
Nguyên tắc phân loại và nguồn gốc ñịa lí của chi Citrus ñã ñược xem
xét lại bởi Swingle và Reece (1967) [59]. Theo Swingle và Reece cây ăn quả
có múi và các giống liên quan với nhóm cây ăn quả có múi có nguồn gốc từ
Nam Á (Bắc Ấn ðộ, Nam Trung Quốc, Peninsula Inñonexia). ðây là trung
tâm của sự ña dạng của các loài này. Hầu hết các nhà nghiên cứu sử dụng hệ
thống phân loại Swingle (Swingle, 1943; Swingle và Reece, 1967), công nhận
16 loài, hoặc các hệ thống phân loại chỉnh sửa của hệ thống phân loại trên
công nhận 17 loài (Bhattacharya và Dutta, 1956) [10] hoặc 36 loài (Hodgson,
1967) [26], hoặc 31 loài (Singh and Nath, 1969) [56]. Gần ñây nguyên tắc
phân loại của Mabberly (1997, 1998) [36] cơ bản là sự cải biến của hệ thống
phân loại của Swingle với một vài giống bị rút lại vào nhóm cây có múi.
Tương phản với nguyên tắc phân loại của Swingle, hệ thống phân loại của
Tanaka thừa nhận lên ñến 162 loài (Tanaka, 1977) [60]. Do thiếu sự ñồng ý
về phương diện phản ánh sự khác biệt trong quan ñiểm về mức ñộ khác biệt
và tính xác minh các loài, thêm vào ñó nó cũng không hỗ trợ cây lai giữa các
dạng xảy ra trong tự nhiên khi dạng này phải phân chia xuất xứ các loài nên
không ai hoàn thiện công việc phân loại trong nguyên tắc phân loại nhóm cây
có múi, nhiều người ñã sử dụng một dạng trung gian giữa hai hệ thống trên.
Hệ thống phân loại của Tanaka ñược sử dụng rỗng rãi trong hầu hết các nước
bên ngoài nước Mĩ, và hữu ích trong nhận dạng các ñặc tính và các giống
nông nghiệp quan trọng. ðiều này ñưa ra giả thuyết chỉ có ba loài (C. medica,
C. reticulata, C. maxima) là có căn cứ tạo thành loài (Scora, 1975; Barrett and

Rhodes, 1976) [53], [9], ñiều này trùng hợp với ý kiến của những người làm
công tác phân loại sớm nhất, cho rằng chỉ có ba hoặc bốn loài có căn cứ xác
ñịnh loài trong chi Citrus (Linnaeus, 1753; Hooker, 1875) [34], [28].
Nhận dạng các cây ăn quả có múi lai thường ñược thực hiện thông qua
các chỉ thị hình thái. Các cây lai nhận ñược từ các giống ña phôi ñược nhận
Khoá luận tốt nghiệp GVHD: ThS. Khuất Hữu Trung

Vũ Văn Huy Công nghệ sinh học 06-05
20

dạng dễ dàng khi các kiểu gen xuất hiện các tính trạng trội, ñược sử dụng như
các cây bố. Ví dụ, tính trạng lá có ba thuỳ, một tính trạng trội ñơn gen mà
phân biệt hầu hết các giống Poncirus trifoliata (L.) Raf., là một ñặc ñiểm
phân loại ñược sử dụng như chỉ thị hình thái của các cây lai của loài này với
các loài Citrus khác (Cooper và cs., 1962). Tuy nhiên, kết quả nhận dạng cây
lai từ lai giống giữa các kiểu gen cây ăn quả có múi ña phôi trở lên cực kì khó
khăn khi cả cây bố và cây mẹ có một tính trạng trội thích hợp.
IPGRI ñã xây dựng các bảng mô tả ñối với các loài cụ thể dùng trong
việc mô tả và nhận dạng các giống, loài, chi thực vật khác nhau, trong ñó có
nhóm cây ăn quả có múi ñể phân loại các giống thuộc nhóm cây ăn quả này
[33]. ðó là một công cụ hữu hiệu cho các mô tả hình thái và phân loại các
giống, loài thuộc chi Citrus dựa vào các chỉ tiêu hình thái.
1.3.1.2. Nghiên cứu ña dạng di truyền, phân loại nhóm cây ăn quả có múi
dựa trên chỉ thị isozyme
Việc phân biệt và phân loại các giống cây ăn quả có múi nếu chỉ dựa
vào ñặc ñiểm hình thái, sinh lý và các ñặc tính nông học sẽ rất phức tạp và
khó khăn. Các dạng marker phân tử khác nhau ñã ñược sử dụng ñể mô tả ñặc
ñiểm ña dạng di truyền của các giống cây có múi, thu thập bảo quản nguồn
gen cây có múi.
Các nghiên cứu về isozyme ñược sử dụng lần ñầu ở cây ăn quả có múi do

Torres và cs (1978) thực hiện ñánh giá sự ña dạng di truyền ở 33 giống quýt
[61]. Có khá nhiều hướng nghiên cứu ñối tượng nhóm cây ăn quả có múi ñược
kiểm tra bằng chỉ thị isozyme (Soost và Torres, 1981). Một vấn ñề ñược tập
trung nghiên cứu là nguồn gốc phôi. Phôi có thể hình thành từ hai nguồn di
truyền khác nhau. Từ tế bào dinh dưỡng hay từ tế bào thụ tinh do sự kết hợp của
giao tử ñực và giao tử cái. Lý do ñể sử dụng chỉ thị isozyme trong phân biệt cây
con thụ tinh bởi vì: isozyme là chỉ thị phân tử ñồng trội, sự có mặt của gen bố
trong phôi hay cây con có thể dễ xác ñịnh bằng chỉ thị này. Soost và cộng sự
(1981) ñã thành công khi giải quyết vấn ñề này nhờ phân tích hai hệ isozyme
Khoá luận tốt nghiệp GVHD: ThS. Khuất Hữu Trung

Vũ Văn Huy Công nghệ sinh học 06-05
21

PGI (Phosphogluco isomerase) và PGM (Phosphoglucomutase). Phân tích tính
hiệu quả của kỹ thuật này thì thấy rằng 86% trường hợp hạt thụ tinh ñược phân
biệt khỏi hạt tự giao phối và hơn 99% hạt thụ tinh từ tất cả các cặp tổ hợp trong
loài ñược phân biệt bằng phân tích tế bào dinh dưỡng [58].
Isozyme cũng ñã cung cấp một cách ñúng ñắn về nguồn gốc các giống
khác nhau trong loài. Sự kiểm tra các vùng hoạt tính isozyme từ vài ñến nhiều
giống của mỗi loài (Torres và cs., 1978) ñã chứng tỏ mỗi loài có một tổ hợp các
kiểu gen và hầu hết các giống khác nhau trong một loài ñều có các kiểu tổ hợp
gen giống nhau [58]. Nghiên cứu isozyme từ lá cây ăn quả có múi từ lâu ñược
tiến hành trên những giống khác nhau của một quần thể F1 ñã biết nguồn gốc bố
mẹ cũng như quần thể F1 sinh ra từ sự lai chéo có kiểm chứng [58]. Sáu hệ
enzyme là: MDH (malate dehydrogenase); IDH (isocitrate dehydrogenase);
GOT (glutamate oxaloacetate transaminase); PGM (phosphoglucomutase); PGI
(phosphogluco isomerase); và LAP (leucine amine peptidase) ñược Elisiario và
cộng sự sử dụng ñể phân biệt cây phôi tâm và cây sinh sản hữu tính trong quá
trình lai tạo giống quýt bản ñịa của Bồ ðào Nha. Elisiario ñã chỉ ra sự sai khác

của các cây sinh ra từ sinh sản hữu tính và cây phôi tâm nhưng theo nhóm tác giả
thì trong quá trình phát triển của cá thể có thể xảy ra ñột biến và có thể có 12.5%
các cây con thu ñược là do quá trình tự tụ phấn và ñể xác ñịnh chính xác các cá
thể con tạo ra từ các phép lai thì có thể bổ sung sử dụng các marker dựa trên
phản ứng PCR [17].
Isozyme cũng là một công cụ tốt trong việc lai tạo giống. King và cộng sự
ñã phân biệt thành công cây ăn quả có múi tam bội ñược sinh ra trong quá trình
lai giống với cây ăn quả có múi lưỡng bội nhờ 4 hệ enzyme: MDH, 6PGD,
SKDH (Shikimate dehydrogenase) và PGI phục vụ chọn tạo các giống cây ăn
quả có múi không hạt [34].
Rahman và cs. ñã phân biệt ñược chính xác 16 giống, các giống còn lại
ñược phân thành bốn nhóm, mỗi nhóm có từ 2 ñến 4 giống trong tổng số 27
giống `Yuzu' và các giống cam chua có họ hàng bằng kĩ thuật isozyme . Sự khác
Khoá luận tốt nghiệp GVHD: ThS. Khuất Hữu Trung

Vũ Văn Huy Công nghệ sinh học 06-05
22

nhau giữa các giống cho thấy isozyme vẫn là một marker hữu ích trong việc
nhận dạng các giống [46].
Những sự khác nhau trong kích thước của các tiểu ñơn vị ribulose 1, 5
bisphosphate carboxylase ñược thu nhận bởi Handa et al. (1986), và trong hơn
mười hệ thống enzymatic khác (Ashari và cs., 1989) gợi ý rằng các loài quýt
bao gồm vài dạng lai. Machado et al. (1996) phát hiện khả năng phát hiện ña
hình di truyền thấp giữa các giống quýt bổ sung của ðịa Trung Hải
(Willowleaf), và gợi ý rằng những giống quýt ðịa Trung Hải là các giống lại
ñúng của C. Reticulata [38]. ADN “fingerprinting” bởi Luro và cs (1992) hỗ
trợ giả thuyết rằng quýt (C. reticulata Blanco), bưởi (C. grandis [L.] Osbeck),
và thanh yên (C. medica L.) là những các loài phân biệt và là các loài ñúng,
giống như ñề xuất ban ñầu của Scora (1975), Barret và Rhodes (1976). Quan hệ

của các loài này cũng ñược hỗ trợ từ các nghiên cứu với kĩ thuật RFLP (Green
và cs., 1986; Roose, 1988).
Gulson và Roose (2001) ñã sử dụng kỹ thuật ñiện di isozyme, RAPD,
RFLP và SSR ñể nghiên cứu sự ña dạng và quan hệ họ hàng của Chanh (Citrus
limon) với các kiểu gen của những cây ăn quả có múi khác. Các mẫu ñược ñưa
vào nghiên cứu bao gồm 86 mẫu ñể nguyên cứu isozyme, 72 cho SSRs và 83
cho ISSRs: Bốn hệ enzyme ñược sử dụng cho nghiên cứu này là GOT (AAT),
IDH, MDH và SKDH. Từ phân tích 12 alen của 5 locut ña hình ở Citrus limon
và 5 locut SSR ñã cho thấy mức ñộ biến ñổi di truyền cao giữa các họ hàng xa
của nhóm cây ăn quả có múi [27].
Bên cạnh ñó, Jarrell và cộng sự ñã sử dụng kỹ thuật isozyme và RFLP
trong việc xây dựng bản ñồ di truyền của hệ gen cây có múi. Bản ñồ di truyền
dựa trên sự phân tách của 8 isozyme, 1 protein và 37 locus RFLP ở 60 cá thể
con cháu của phép lai trong cùng chi là (Citrus paradisi Macf. X Poncirus
trifoliata (L.) Raf.) và (C. sinensis (L.) Osbeck x P. Trifoliata). Bản ñồ chứa 38
locus trog số 46 locus ñược nghiên cứu phân bố trên mười nhóm liên kết. Kích
thước của bộ gen là 1700 cM ñã ñược thiết lập từ các dữ liệu liên kết ñặc biệt.
Khoá luận tốt nghiệp GVHD: ThS. Khuất Hữu Trung

Vũ Văn Huy Công nghệ sinh học 06-05
23

Ước tính 35% hệ gen phải nằm trong 10 cM và 58% hệ gen phải nằm trong 20
cM của bản ñồ các marker, 8 locus trong 3 nhóm liên kết và 1 locus không liên
kết không tuân theo sự phân li theo qui luật của Mendel [35].

1.3.1.3. Nghiên cứu ña dạng di truyền, phân loại nhóm cây ăn quả có múi
dựa trên chỉ thị phân tử ADN
Các marker phân tử nghiên cứu trên nhóm cây ăn quả có múi tập trung
chủ yếu vào các hướng chính là: Phân biệt các giống, xác ñịnh cây phát sinh

chủng loại và nghiên cứu ña dạng di truyền.
Salvo và cs ñã sử dụng hệ gen lục lạp ñể tìm mối liên quan về cây phát
sinh chủng loại của họ Rutaceace và so sánh với các dự liệu phân loại không
dựa vào các dữ liệu phân tử [53]. Trong các kĩ thuật phân tử, khuếch ñại ISSR
là một phương pháp dựa trên PCR mà nó có thể nhanh chóng nhận ra các cá thể
có họ hàng gần gũi (Zietkiewicz và cs., 1994) [63]. Fang và Roose (1997) sử
dụng 22 mồi ISSR ñể tìm sự khác biệt giữa các mẫu của 94 cây của 68 giống
cây ăn quả có múi và chia các giống này thành 6 nhóm giống. Fang và Roose
cho rằng khó có thể phân biệt các giống trong 6 nhóm giống này bởi các kỹ
thuật phân tử khác bởi chúng có quan hệ họ hàng rất gần gũi [18]. Nicolosi và
cs sử dụng kết hợp cả 3 kĩ thuật phân tử là RAPD, SCAR và phân tích cpADN
bằng kĩ thuật AFLP ñể nghiên cứu phát sinh chủng loại của cây có múi. Trong
ñó phân tích cpADN ñược coi hữu ích trong việc nghiên cứu phát sinh chủng
loại. Qua phân tích sử dụng 262 mồi RAPD và 14 mồi SCAR và phân tích
cpADN, nhóm citrus nghiên cứu ñược chia làm tám nhóm trong ñó thì C.
grandis và C. sinensis ñược xếp chung vào cùng nhóm Bưởi [42]. Cây phát
sinh chủng loại của nhóm cây ăn quả này cùng ñược Shahsavar và cs nghiên
cứu bằng kĩ thuật ISSR [48]. Các giống chanh có quan hệ họ hàng gần gũi và
có giá trị kinh tế cao ñã ñược phân tích bằng ISSR phục vụ công tác bảo tồn và
phát triển các giống chanh ñược trồng tại miền nam Italia (Capparelli và cs.,
2004) [12].
Khoá luận tốt nghiệp GVHD: ThS. Khuất Hữu Trung

Vũ Văn Huy Công nghệ sinh học 06-05
24

Kỹ thuật ISSR – PCR ñã ñược sử dụng thành công ñể mô tả dạng tứ
bội hình thành từ lai tế bào soma của bưởi (Citrus paradisi Macfadyen)
(Scarano và cs., 2002) [51] và quýt (Tusa và cs., 2002) [62] và nhận biết
cây tam bội trong việc chọn tạo các giống quýt tam bội không hạt (Bosco

và cs., 2007) [11]. Bên cạnh ñó ISSR còn ñược dùng ñể xây dụng bản ñồ
liên kết của nhóm cây ăn quả có múi (Sankar và Moore., 2001) [50].
Chỉ thị RAPD cũng ñã ñược sử dụng rộng rãi ñể phân tích mối quan hệ
di truyền giữa các giống cây có múi: Deng ñã sử dụng kĩ thuật RAPD ñể phân
loại các ñột biến (Deng và cs., 1995) [16], thể khảm (Sugarawa và Oowada,
1995), thể lai soma (Guo và cs., 2000) [24] và ña phôi ở các giống Chanh
(Ramalho và cs., 2000). Với 36 mồi RAPD, Cabrita ñã ñánh giá ña dạng di
truyền của 22 giống Citrus và kết quả thu ñược chỉ ra rằng có 48.4 % cho ña
hình (Cabrita L. và cs., 2003). Ngoài ra, mối quan hệ di truyền của 204 giống
thu ñược từ 34 cây lai bố mẹ cũng ñã ñược nghiên cứu nhờ sử dụng chỉ thị
phân tử RAPD và EST-SSR. Kết quả thu ñược cho thấy các phân tích RAPD
và EST-SSR ñã thành công trong việc xác ñịnh hệ gen nhân giữa các thế hệ thu
ñược từ phép lai chéo của các giống Bưởi và Bưởi chùm, vì vậy giúp chọn lọc
một cách chính xác trong chương trình nhân giống Citrus (Rao, 2007).
Trong ñó, chỉ thị SSR có tính ñồng trội, cho ña hình cao và ñược sử
dụng nhiều ñể phân tích ña dạng di truyền các loài thuộc chi Citrus ở mức ñộ
cùng loài, khác loài và cùng quẩn thể (Froelicher và cs., 2007) [20]; xác ñịnh
nhanh chóng các cây con sinh ra từ cây hợp và cây phôi tâm dùng trong lai tạo
nhằm loại bỏ các kiểu gen không mong muốn. Kết quả thu ñựơc chỉ ra rằng kĩ
thuật SSR có hiệu quả hơn kĩ thuật isozyme trong phân biệt sự khác nhau giữa
các cây dị hợp (Ruiz và cs., 2000) [47]; nhận dạng các dạng cây ăn quả có múi
lai thông qua chỉ thị SSR kết hợp với các chỉ tiêu hình thái (Oliveira và cs.,
2002) [43]. Chỉ thị SSR cũng ñã ñược sử dụng trong phân tích mối liên kết và
sự phát sinh loài ở Citrus và Poncirus (Kijas và cs., 1997) [32], phân tích ñặc
tính của Bưởi (Koehler-Santos và cs., 2003) và tính ña dạng của Bưởi chùm
Khoá luận tốt nghiệp GVHD: ThS. Khuất Hữu Trung

Vũ Văn Huy Công nghệ sinh học 06-05
25

(Corazza-Nunes và cs., 2002) [15]. Gần ñây, Froelicher cũng ñã sử dụng 43 chỉ
thị SSR phân lập ñược ở C. reticulata ñể ñánh giá ña dạng di truyền của loài C.
reticulata hoang dại thu thập ñược ở vùng núi phía bắc Việt Nam (Froelicher
và cs, 2007) [20]. Việc phát triển và ñặc tính hóa các marker SSR ở các ñối
tượng khác nhau trong nhóm cây ăn quả có múi tạo ra một số lượng lớn mồi
SSR dùng trong các nghiên cứu về nhóm ñối tượng này (Froelicher và cs.,
2007) [20], (Ahmad và cs., 2003) [9], (Novelli và cs., 2006) [42].
ðể thu ñược các kết quả chính xác và xác ñịnh bản ñồ liên kết thì một số nhóm
tác giả ñã kết hợp ñồng thời các kĩ thuật phân tử khác nhau trong nghiên cứu
của mình. Garcia và cs (1999) ñã sử dụng tổng số 69 marker, trong ñó có 8 mồi
SSR, 43 mồi RAPD, 13 mồi RFLP, và một mồi CAPs ñể xây dựng bản ñồ liên
kết và phân tích di truyền của sự tiếp hợp vô tính giữa citrus và Poncirus sử
dụng trong lai giống. Các phân tích SSR, cpSSR và AFLP dùng trong phân tích
hệ gen di truyền tế bào chất ở các thể lai sinh chất liên quan ñến các cây tự tứ
bội, nhị bội và bát bội ở cây ăn quả có múi (Guo và cs., 2006) [25]. Kết quả
phân tích dựa trên chỉ thị phân tử RAPD và ISSR tương tự như phân tích cấu
tạo các loại dầu cần thiết trong lá trong nghiên cứu tính ñặc trưng của năm
dòng cam chua có sự khác biệt về mặt hình thái (Pasquale và cs., 2006) [45].
ðiều ñó gợi ý rằng có thể sử dụng việc phân tích cấu tạo các loại dầu có trong
lá của cây có múi có thể xác ñịnh các ñặc trưng riêng của các cây ăn quả có
múi giống như việc sử dụng các chỉ thị phân tử [45].
1.3.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam
Việt Nam là một trong những nơi phát sinh nguồn gốc của cây có múi
và nhóm cây ăn quả có múi là một trong những cây ăn quả quan trọng nhất ở
nước ta. Các ñặc tính nông học của nhóm cây này cũng như kĩ thuật canh tác
và phòng trừ sâu bệnh ñã ñược tiến hành (Vũ Công Hậu, 1999; Phạm Văn
Côn, 2003; Nguyễn Thị Thu Cúc 2002; Dương Tấn Lợi, 2002; ). Nhiều vùng